Karakterisointi geenin ilmentymisen profiilien eri syöttösolut yhdistettiin hiiren vatsan osa-alueiden RNA-monistus method

karakterisointi geeni-ilmentymisen profiilit eri syöttösolut yhdistettiin hiiren vatsan osa-alueiden RNA-monistus menetelmän
Abstract
tausta
Syöttösoluille (MC) pelata keskeisiä rooleja allergian ja luontaisen immuniteetin ja koostuvat heterogeeninen alaluokkien. Kuitenkin molekyylitasolla perusteella määritetään erilaiset ominaisuudet näiden useiden MC alaluokkien jää epäselväksi.
Tulokset
lähestyä tätä, olemme kehittäneet menetelmän RNA /vahvistus ehjänä in vivo
MC yhdistettiin pakastetusta kudosleikkeiden , joka mahdollisti meille mahdollisuuden saada globaalin geenin ilmentymisen mallia yhdistettyä MC kuuluvat samaan alaluokkaan. MC eristettiin submukoosassa (SMC) ja limakalvon (MMC-kortteja) hiiren vatsan osaan, vastaavasti, 15 solut yhdistettiin, ja niiden RNA uutettiin, monistettiin ja niille suoritettiin mikrosiruanalyysillä. Tunnetut markkerigeenejä spesifinen MMC-kortit ja SMCS osoitti odotettua ilmaisun trendejä, mikä osoittaa analyysin oikeellisuutta.
Havaitsimme 1272 geenit osoittavat merkittävästi erilaiset ekspressiotasot välillä SMCS ja MMC-kortteja, ja luokiteltu ne klusterit perusteella samankaltaisuutta niiden ekspressioprofiileja verrattuna luuytimestä peräisin MC, jotka ovat viljelty MC ns "epäkypsä" ominaisuuksia. Joukossa, huomasimme, että useita keskeisiä geenejä kuten Notch4
oli SMC-puolueellinen ilmaisun ja Ptgr1
oli MMC-puolueellinen ilme. Lisäksi on olemassa ero useiden geenien ekspression, kuten soluväliaineen proteiinin osia, adheesiomolekyylien, ja solun tukirangan proteiinit kahden MC alaluokkaa, jotka voivat heikentää toiminnallisia sovellutuksia kunkin MC limakalvon tai limakalvon alaista ympäristöä mahassa.
Johtopäätös
käyttämällä menetelmää RNA: n monistamista yhdistettiin ehjä MC, me tunnettu erillisten geenien ilmentymisen profiilit SMC ja MMC-kortit hiiren vatsassa. Meidän havainnot tarjoavat käsityksen mahdolliset tuntemattomat ominaisuudet spesifisiä kullekin MC alaluokan.
Tausta
Syöttösoluille (MC) ovat peräisin hematopoieettisten kantasolujen ja tärkeä rooli allergisia vasteita, luontaisen immuniteetin ja puolustus vastaan ​​loista infektio. Toisin kuin muut verisoluja, MCs kulkeutuvat ääreiskudoksiin epäkypsinä esisolujen ja erilaistua kypsiksi syöttösoluja. Yksi ainutlaatuiset piirteet MC on, että ne osoittavat erilaisia ​​fenotyyppejä riippuen eri kudosten microenvironment niiden kypsymistä [1]. MCS, eri MC-spesifisiä seriiniproteaasit tallennetaan eritysjyvästen, ja niiden geeni ja proteiini ilmaisuja muuttuu dramaattisesti kun niiden solun ympäristössä on muuttunut. Esimerkiksi Reynolds et ai.
Ovat osoittaneet, että vähintään kuusi erillistä jäsentä hiiren MC-spesifisten seriiniproteaasien ilmaistaan ​​eri yhdistelmiä eri syöttösolujen populaatioiden [2]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kypsät MC vaihtelevat sen suhteen, mitä pinnan reseptorien ja lipidivälittäjäaineita he ilmaisevat [3, 4]. Koska jokainen syöttösolujen populaatio in vivo
on erityinen tehtävä kehossa, on tärkeää määrittää, että kukin väestöstä MC.
Kattava geeniekspressioanalyysiä on tehokas tapa ymmärtää luonnehdinta eri MC osapopulaatioiden. Tähän mennessä useat tutkimukset mikrosiruanalyysi of MC on tehty [5-7], mutta useimmat niistä käsitellään MC viljellään in vitro
. Vaihtoehtoisesti geenien ilmentyminen profiilit MC eristyksissä iholta ja keuhkojen on analysoitu [3, 8-10]. Kuitenkin, määrää MC: analysoidaan yksi näyte oli suhteellisen korkea ja ne olivat alttiina fyysisten voimien, entsyymejä ja anti-Kit-vasta-aineen puhdistamista varten, jona aikana alkuperäisen ominaisuudet MC saattanut vaikuttaa.
Maha suolikanavan olemassa MCs jotka ovat pääasiassa luokitellaan kahteen alaluokkaan; limakalvon MC (MMC-kortteja) ja limakalvon alaista MC (SMC) perusteella niiden sijainti, morfologia (koko ja muoto) ja rae sisältö [11, 12]. MMC-kortit esiintyy lähinnä limakalvon ruoansulatuskanavan, jossa on kondroitiinisulfaatti sisältäviä rakeita, jotka on värjätty toluidiinisinisellä, mutta ei safraniinin, ja niiden aktivointi tapahtuu loisen infektion [13], kun taas SMC on lokalisoitu submucosa maha sairauksien ja niiden rakeet on runsaasti hepariinin ja värjättiin sekä toluidiinisinillä ja Safraniini [1, 11]. Kuitenkin molekyylitasolla perusteella määritetään erot biokemialliset ominaisuudet näiden kahden MC alaluokkaa edelleen epävarmaa, osittain johtuen vaikeudesta eristyksestä.
Näiden ongelmien voittamiseksi, tässä loimme menetelmän RNA-monistus ehjänä MC eristetty jäädytetty kudosleikkeiden, jonka avulla voimme saada mukavasti maailmanlaajuiseen geeniekspressiomalli of MC eri kudoksissa. Validoida tätä menetelmää, ensin määritetty vähimmäismäärä solujen määrä saavuttaminen edellyttää toistettavissa RNA vahvistusta. Sitten verrataan geeniekspressioprofiilien saatu pieni määrä MMC-kortit ja SMC hiiren vatsassa, ja löysi useita tärkeitä geenejä erikseen ilmaista yhdellä alaluokka MC, joka voi heijastaa joitakin erillisten ominaisuuksien välillä MC alaluokkaa vuonna ruoansulatuskanavassa.
tulokset ja pohdinta
kehittäminen RNA vahvistus protokollaa saada geeniekspressioprofiilien pienestä määrästä RNA
perehtyä toiminnalliset erot eri alaryhmiä MC, käytimme kolme kierrosta T7-pohjainen RNA vahvistusta menetelmällä. Alustavien kokeiden avulla vatsakalvon MC ja luuytimestä peräisin MC (BMMCs), arvioimme että yksi MC tuottaa 2 ug RNA: ta. Ennen kuin suoritetaan vertaileva analyysi MC eri kudoksista, ensin arvioitu tarkkuus ja toistettavuus kolmella kierroksella T7-pohjainen RNA amplifikaatiomenetelmän, alkaen RNA-määrä, joka voidaan saada yhdellä MC. Tämän arvioimiseksi ensin verrattuna mikromatriisi saatujen tulosten 5 ug BMMC RNA valmistetaan vakioprotokolla, jotka on saatu samasta RNA laimennettu 10 5- tai 10 6-kertaiseksi (30 s, 10 s ja 2 pg) ja altistettiin kolme kierrosta T7-pohjainen vahvistusta (kuvio 1 a-c). Vaikka kolme kierrosta vahvistus saatiin tarpeeksi määrä RNA: ta mikrosiruanalyysi (> 20 ug) vaikka kyseessä on 2 pg RNA, parvikuvio analyysi paljasti, että ominaisuuksia saadut tulokset olivat aivan erilaisia ​​näytteitä 5 ug ja 2 s RNA. Geenit arvostellaan "läsnäolo" sekä 30 pg ja 5 ug RNA: ta oli 8149 geenejä, mikä vastasi 72% geenien arvostellaan "läsnäolo" on 5 ug RNA: ta (11344-geenit, kuvio 1a), kun taas vain 4116-geenien taso arvioitiin "Presence" sekä 2 s ja 5 ug RNA: ta, mikä vastasi vain 36% geeneistä arvostellaan "Presence" in 5 ug RNA: ta (kuvio 1 c). Lasku määrän geenejä arvostellaan "Presence" laimennetussa näytteistä (30 s, 10 s ja 2 s) voi johtua menetys alhaisen kopioluvun RNA-lajeja monistamisen aikana. Kuva 1 Vertailut kolmen kierroksen monistetaan tuotteista alkaen hyvin pieniä määriä RNA: ta. (A-c) Monistaminen harhat tuotteita alkaen pieni määrä RNA: ta. Sirontakaavioissa signaalin voimakkuus saatiin 5 ug BMMC RNA valmistetaan vakioprotokolla ja 30 pg (a
), 10 s (b
) ja 2 s (c
) on BMMC RNA valmistettiin kolme kierrosta vahvistus näkyvät. (D, e) toistettavuus kolmen kierroksen monistaminen pieni määrä RNA: ta. Sirontakaavioissa signaalin intensiteettiä kahden itsenäisen tuotteita 30 ug BMMC RNA (BMMC 30 pg-1 ja BMMC 30 pg-2) (d
) tai 2 ug BMMC RNA (BMMC 2 pg-1 ja BMMC 2 pg-2) (e
), näytetään. Punaisia ​​pisteitä osoittavat koetinsarjojen arvostellaan "Presence", ja keltaiset pisteet edustavat koetinsarjojen arvostellaan "puuttuminen" molemmissa paneelit. Siniset pisteet osoittavat koetinsarjojen arvostellaan "Presence" vain joko array. Korrelaatiokertoimet (r) esitetään. Sama, nelinkertainen induktio ja tukahduttaminen kynnykset on merkitty vinoviivaa. Genes arvostellaan "Presence" sijoitetaan ryhmiin, jotka vastaavat pareittain päällekkäisyyksiä esitetty oheisessa Venn kaaviot.
Seuraavaksi me tarkasteltiin toistettavuus mikrosirun saatujen tulosten kaksi 30 pg BMMC RNA-näytteet (30 pg-1 ja 30 pg-2) tai kaksi 2 pg näytteistä (2 pg-1 ja 2 pg-2) (kuvio 1 d ja 1 e). Vuonna 30 pg RNA-näytteet, 7537 (30 pg-1) ja 8777 (30 pg-2) geenejä arvostellaan "Presence". Kuitenkin vain 4324 (2 pg-1) ja 4460 (2 pg-2) geenit arvostellaan "Presence" kussakin 2 pg RNA-näytettä, jälleen viittaa menetys alhaisen kopioluvun RNA- monistamista pieni määrä RNA: ta. Mitä tulee toistettavuus, 86% "Presence" geenien 30 pg-1 ja 74% "Presence" geenien 30 pg-2 näytettä taso arvioitiin "Presence" sekä 30 pg RNA-näytteet, kun taas vain 57 % of "Presence" geenien 2 pg-1 ja 55% on "Presence" geenien 2 pg-2 näytettä taso arvioitiin "Presence" molemmissa 2 s RNA-näytteet. Nämä tulokset viittaavat siihen, että monistettu tuotteet RNA yhdestä MC (noin 2 s) nykyisellä menetelmällä voi sisältää huomattavia vahvistusta artefakteja aiheuttavat ongelmia tarkkuus ja toistettavuus. Toisaalta, koska korkeamman toistettavuus (> 74%), päättelimme, että vahvistus 30 pg RNA kerättiin 15 MC sopisi käytännön analyysiä kudoksen MC. Näiden tulosten perusteella asetimme tavoitteemme tässä tutkimuksessa hankkia geeniekspressioprofiilien of MC yhdistettiin eri alueilta. Minimoida vaikutus solu-solu vaihtelu samaan luokkaan ja mahdolliset vahvistus esineitä, valmistimme kolmet 15 MC kullekin alueelle ja verrataan geenien merkittävästi erilainen ilme välillä MC eri alueilta (kuva 2b). Valitsimme vatsa lähteeksi elin, koska voimme eristää kahdenlaisia ​​MC peräisin limakalvon (MMC) ja submukoosassa (SMC) alueet samoja osia, ja MMC-kortit ja SMCS on epäilty olevan erilainen useissa MC ominaisuudet, kuten proteaasin ilmentyminen profiilin ja herkkyys Safraniini värjäystä [1, 11]. Kuvio 2 Geenien ilmentyminen profiileja SMCS ja MMC-kortit vatsaan kudoksesta. (A) eristäminen toluidiinisinillä-värjättyä MC on submukoosassa (SMC; ylemmät paneelit
) ja limakalvojen (MMC; alempi paneelit
) mahan kohdat. SMC (nuoli
) ja MMC (nuolenkärki
), joka metachromatically värjättiin toluidiinisinisellä ennen mikrodissektion (vasemmanpuoleiset paneelit
) katosi mikrodissektion laastari pipetillä (oikea paneeli
). Bars
, 10 um. (B) pääpiirteet kokeellisen strategiaa. (C) Merkityt ja hajanaista antisense-RNA: t kolmesta erillisestä SMC näytettä, kolme yksittäistä MMC näytettä ja "no cell" näytteet hybridisoitiin Hiiren Array. Sirontakaavioissa varten "no cell" (x-akseli) ja sMC1 (y-akseli) (ylhäällä vasemmalla
), "no cell" (x-akseli) ja mMC1 (y-akseli) (alhaalla vasemmalla
), sMC1 (x akseli) ja SMC2 (y-akseli) (ylempi keskus
), mMC1 (x-akseli) ja mMC2 (y-akseli) (alempi keskus
), sMC1 (x-akseli) ja mMC1 (y-akseli) (oikeassa yläkulmassa
) on esitetty. Korrelaatiokertoimet (r) vertailun sisällä sMC1-3 sisällä mMC1-3 välillä SMC ja MMC-kortteja on esitetty keskiarvoina ± S.D. Punaisia ​​pisteitä osoittavat koetinsarjojen arvostellaan "Presence", ja keltaiset pisteet edustavat koetinsarjojen arvostellaan "puuttuminen" molemmissa paneelit. Siniset pisteet osoittavat koetinsarjojen arvostellaan "Presence" vain joko array. Sama, kaksinkertainen induktio ja suppressio kynnykset on merkitty vinoviivat.
Geenien ilmentyminen profiilit submukoosisen ja limakalvon MC mahasta
havainnollistamiseksi kahdenlaisia ​​MC mahassa aiheuttamatta RNA: n hajoamisen, leikkeet kiinnitetään Carnoy fiksatiivi ja metachromatically värjättiin toluidiinisinisellä muutaman sekunnin. SMC ja MMC-kortit ovat microdissected käyttäen laastaria, pipetillä (kuvio 2a ja 2b). Me valmistaa kolme sarjaa 15 MC kunkin alueen, uutetaan niiden RNA ja yksilöllisesti monistetaan niitä (SMC 1, SMC 2, SMC 3, ja MMC 1, MMC 2, MMC 3). Parantaakseen elpyminen louhinta niin vähän kuin 30 ug RNA, käytimme "poly G" kantajana, joka ei häiritse seuraavia RNA vahvistus tai hybridisaatio monistetun tuotteen array (tuloksia ei ole esitetty). Vaikutusten tutkimiseksi spesifisesti monistetun artefakti tuotteita, olemme suorittaneet RNA /monistusmenetelmän lisäämättä mikropaloitelluista soluja ( "ei solu") negatiivisena kontrollina (kuvattu "Materiaalit ja menetelmät
"). Vahvistetut RNA: t SMCS, MMC-kortit ja "no solu" kontrolli oli erikseen hybridisoitiin hiiren mikrosirun. Signaali arvot "no cell" näyte olivat alhaiset yleensä ja samanlainen taustan tasolle (kuva 2c). Hajonta tontit näytteiden itsenäisesti valmistettu samassa ryhmässä (esim. SMC 1 vs SMC 2) osoitti vastaava ilmaisu kuvio; keskimääräinen korrelaatiokerroin kaikille koetin-setit oli 0,945 ± 0,004 ja 0,893 ± 0,019 in SMCS ja MMC-kortit, vastaavasti (n
= 3). Sen sijaan keskimääräinen korrelaatiokerroin SMCS ja MMC-kortteja oli 0,752 ± 0,034 (n
= 3), joka oli paljon alhaisempi kuin samassa ryhmässä, mikä viittaa siihen, että niiden geeniekspressiomalleja ovat erilaiset.
Arvioimme lisäksi tarkkuutta ja toistettavuutta menetelmämme muiden laajat analyysit (hierarkkinen klusterointi analysointi ja Pääkomponenttianalyysin [PCA]) käyttäen kaikkia koetinsarjojen. Microarray saadut SMCS, MMC-kortit, iho-johdettu MC, vatsakalvon MC, BMMCs ja ei-MC (makrofagit ja fibroblastit) levitettiin näihin analyyseihin. Ensin tarkistetaan, onko vahvistus prosessi meidän menetelmässä vaikuttaa maailmanlaajuiseen ilmaisun profiilin vuoksi epälineaarinen vahvistus. Saadut tulokset BMMC näytteitä RNA: ta valmistettiin tavallinen protokolla (BMMC-std) tai amplifikaatiomenetelmä (BMMC-amp) tehtiin nämä analyysit. Molemmat hierarkkinen klusterointi analyysi ja PCA paljasti, että microarray tietoja BMMC-std ja BMMC-amp ryhmittyivät samassa ryhmässä (kuvio 3a ja 3b), mikä viittaa siihen, että maailmanlaajuinen samankaltaisuus geeniekspressioprofiilien säilyy monistusprosessin aikana. Olemme ensi tutkinut samankaltaisuutta ekspressiokuvioita kolmessa riippumattomassa SMC tai MMC näytteitä. Kun klustereiden analyysi ja PCA, SMC 1-3 ja MMC 1-3 ryhmittyivät samassa ryhmässä, vastaavasti. PCA osoitti myös, että ilmaisu profiilit SMC, MMC-kortit ja BMMCs ovat keskenään erilaiset (kuvio 3b). Kuvio 3 Global geeniekspressioanalyysiä SMC 1-3 MMC 1-3. (A) hierarkkinen klusterointi globaalin geenin ilmentymisen eri valmisteiden MC ja ei-MC. Kolmen kierroksen monistettujen tuotteiden sMC1-3, mMC1-3, ihon MC ja BMMCs, ja standardi tuotteiden BMMCs, vatsakalvon MC, makrofagit ja fibroblastit analysoitiin. (B) Pääkomponenttianalyysin (PCA) paljastaa eri geenien ilmentyminen profiileja sMC1-3, mMC1-3, ja kaksi valmisteet BMMCs. Sininen pilkullinen neliö osoittaa MMC-kortit, punainen pilkullinen neliö osoittaa SMC, ja musta pilkullinen neliö osoittaa BMMCs.
Sitten verrataan mahan johdettuja MC (SMC ja MMC-kortteja) iholle johdettu MC, vatsakalvon MC, BMMCs ja non -MCs (makrofagit ja fibroblastit) ryhmittelemällä analyysi. Kudos-johdettu MC (vatsa MC ja ihon MC) ryhmittyivät erillään vatsakalvon MC ja BMMCs. Nämä tulokset voivat heijastaa erilaisia ​​ominaisuuksia välillä kudos johdettua MC kanssa yrityksen tarttuvuus naapurikennoon kelluva MC ilman tiukka kontakti. Mitä samankaltaisuus MC kanssa fibroblastit ja makrofagit, on kohtuullista, että fibroblastit ovat kauimpana MC ja makrofagit ovat lähempänä MC kuin valkosolujen perhe.
Validointi microarray tulosten reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi
Me tutkimme seuraavaksi hybridisaatiosignaalit tunnettujen markkerigeenien spesifinen SMC ja MMC-kortit osoitti odotetun ilmentymisen suuntauksia [12, 14]. MMC-geeneistä, syöttösolukasvainten proteaasi 1 (Mcpt1
) ja 2 (Mcpt2
) osoitti korkeampia arvoja MMC-kortit, kun taas SMC-erityisiä markkerigeeni, syöttösolukasvainten proteaasin 4 (Mcpt4
) ja kymaasia 2 (Cma2
), osoittivat suurempaa signaalin arvoja SMCS (taulukko 1 ja kuvio 4a) [15-29]. Toisaalta, MC-common markkereita, kuten kit onkogeenin (Kit
) ja Fcε reseptorin (Fcer1a
) osoitti merkittävää signaalin arvoja ilman bias välillä MMC-kortteja ja SMC. Edelleen tulosten arvioimiseksi mittasimme ekspressiotasot näiden markkerigeeni reaaliaikaisella RT-PCR: llä käyttämällä RNA itsenäisesti eristetyn MC (kuva 4b). Lisäksi olemme satunnaisesti valittu kolme geeniä, joka esittää "MMC-puolueellinen" ilmaisun ja toinen kolme geeniä, joka esittää "SMC-puolueellinen" ilmaisu; näiden geenien ilmentymistä in MC ei ole raportoitu aikaisemmin (kuvio 4a). Ei ollut merkittäviä eroja ekspressiotasot Kit
ja Fcer1a
välillä MMC-kortteja ja SMC. Sen sijaan, MMC-spesifisten Mcpt1
ja Mcpt2
ja "MMC-biasoitu" geenejä, ANXA10, CTSE
, ja Fos
osoitti suurempi ekspressio in MMC-kortit, ja SMC-spesifisten Mcpt4
ja Cma2
ja "SMC-puolueellinen" geenejä, Cnn1, Ces3
, ja Cpe
osoittivat korkeampia ilmentymistä SMCS. Nämä tulokset osoittavat, että mikrosiru tulokset ovat luotettavia ja heijastavat geeniekspressioprofiilien ehjän SMC ja MMC-kortit vatsassa. Kuva 4 validointi differentiaalisesti ilmentyvien geenien välillä SMCS ja MMC-kortteja. (A) SMC-spesifinen (Cma2
, Mcpt4
), MMC-erityinen (Mcpt1
, Mcpt2
) ja MC-yhteisiä markkereita (Fcer1a
ja Kit
) (vasen paneeli
) ja kuusi satunnaisesti valitun geenin (Ces3
, Cnn1
, Cpe
, ANXA10
, CTSE
ja Fos
) (oikea paneeli
) on osoitettu edustavan scatter korrelaatio kaaviot välillä sMC1 ja mMC1. Sama, kaksitahoinen induktio ja tukahduttaminen kynnykset ilmoitetaan keltaisena, sininen ja punainen viiva, vastaavasti. (B) ekspressiotasot geenien (a) tarkasti reaaliaikainen RT-PCR: llä. Arvot edustavat suhdetta suhteellisen ekspressiotasot MMC-kortit ja SMC, ja ne on esitetty keskiarvona ± S.D. (N = 3). Spesifisyys PCR-tuote varmistettiin geelielektroforeesilla ja analyysi sulamislämpötilan. Ilmaisu taso kunkin geenin normalisoitiin 28S ribosomien RNA: han.
Taulukko 1 Yhteenveto geenien tutkittiin reaaliaikainen PCR-analyysi.
Gene Symbol

Gene Name
RefSeq Transcript ID
Viite
Kit
kit onkogeeni
NM_021099
15
Fcer1a

Fc-fragmentti IgE, korkean affiniteetin I reseptori α polypeptidiä
NM_010184
16
Mcpt1
mastsolun proteaasi 1
NM_008570
17, 18
Mcpt2
mastsolun proteaasi 2
NM_008571
19
Mcpt4
mastsolun proteaasin 4
NM_010779
2, 20
Cma2

kymaasi 2, syöttösolu (syöttösolujen proteaasin 10) B NM_001024714
14 *
ANXA10
anneksiini A10
NM_011922
21
CTSE

katepsiini E
NM_007799
22
Fos
FBJ osteosarcoma onkogeeni
NM_010234
23
Ptgr1
Prostaglandiini reduktaasin 1 (leukotrieeni B4 12-hydroxydehydrogenase) B NM_025968
24 (sian) B Cnn1
calponin 1
NM_009922
25
Ces3
karboksyyliesteraasin 3
NM_053200
26
Cpe
karboksipeptidaasi E
NM_013494
27 (nauta) B Notch4
Notch-geenin homologi 4
NM_010929
28
28S rRNA
28S ribosomi-RNA
NR_003279
29
*, koodaava sekvenssi esitetään tässä paperissa on N-päässä katkaistun muodon Cma2
, kun taas RefSeq " NM_001024714 "on täydellinen sekvenssi Cma2
.
klusterointi analyysi geenien ilmentyminen ja toiminnallinen luokittelu välillä SMC ja MMC-kortit
Niistä ~ 12000 geenit edustettuina oligonukleotidin array, valitsimme 1272 geenejä, joiden ekspressiotasoja välillä SMC 1-3 ja MMC 1-3 olivat merkittävästi erilaiset (p
< 0,05, Limma t
testi). Ilmaisu taso kunkin geenin normalisoitiin sen tasoa BMMCs, jotka viljellään MC ns "epäkypsä" ominaisuuksia, ja valitut geenit jaetaan seitsemään klustereihin käyttämällä k
yhdistetty elin klusterointialgoritmi (CL1-7 Kuvio 5a ja Additional tiedosto 1). Olemme myös luokiteltu geenit toiminnallisiksi luokkia, ja edustaja geenit luetellaan (kuva 5b). Niistä 666 geenit (52,4%) osoitti SMC-puolueellinen lauseke (CL1-3
); 78% (519 geenit) SMC-rikas geenien ekspressiotasot olivat suhteellisen alhaiset BMMCs ja vahvistunut SMC (CL1 & 2
). Esimerkiksi ekspressiotaso Mcpt4
oli suhteellisen pieni BMMCs, ja jos ilmentymisen profiili BMMCs heijastaa epäkypsiä ominaisuudet MC esiasteita, Mcpt4
voidaan päätellä indusoituvan lopullisessa kypsymistä SMC. Mielenkiintoista on, että SMC markkerigeenit Mcpt5
ja Mcpt6
luokiteltiin CL2 /3
, mikä viittaa siihen, että nämä geenit ilmennettiin jossain määrin "epäkypsiä" BMMCs, mutta niiden ekspressio tukahdutetaan kypsymisen aikana osaksi MMC-kortteja. Toisaalta, 606 geenit (47,6%) osoitti MMC-puolueellinen lauseke (CL4-7
); 51% (334 geenit) on MMC-rikas geenit, niiden ekspressiotasot BMMCs olivat alhaisia, mutta oli vahvistunut MMC-kortteja (CL4 & 5
). Esimerkiksi ilmaus Mcpt1
oli vähäistä "epäkypsiä" BMMCs mutta rajusti aiheuttama kypsymisen aikana osaksi MMC-kortteja. Kuvio 5 klusterointi analyysi geeniekspressioprofiilien välillä SMC- ja MMC-kortteja. (A) edustus mRNA ekspressiotasot sMC1-3 ja mMC1-3 verrattuna BMMCs. Väri baareissa edustaa suhdetta signaalin voimakkuuden riippumattomien näytteiden ja BMMCs mukaan asteikon oikeassa yläkulmassa
. Geenit merkittävästi erilainen ilme välillä SMCS ja MMC-kortteja (p
< 0,05, Limma t
testi) valittiin (1272 geenit) ja luokitellaan 7 klustereihin käyttämällä k
yhdistetty elin algoritmia (CL1-7
). (B) toiminnallinen luokittelu edustajan geenejä (a).
Proteiinin ilmentymistä Notch4 vuonna SMCS ja Ptgr1 in MMC-kortit vatsassa kudosten
Niistä geenit osoittavat ero ilmentymistä (kuvio 5b), me edelleen keskittynyt ilmaus Notch4
in SMCS ja Ptgr1
in MMC-kortit, jotka molemmat eivät ole koskaan aiemmin tunnettu MC. Notch4
geenituote on jäsen Notch perheen, joka koostuu transmembraaninen reseptorit, jotka aktivoidaan solun pinnan ligandeihin viereisten solujen. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Notch signalointi liittyy lymfosyyttien ja syöttösolujen solujen erilaistumista [30, 31]. Ensin vahvisti, että Notch4
ilmentyminen on huomattavasti korkeampi erikseen, yhdistettiin SMC kuin MMC-kortit reaaliaikaisella RT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty). Me tutkimme seuraavaksi, onko Notch4 proteiini on yksinomaan läsnä SMCS immunovärjäyksellä vatsaan kudoksen (kuva 6a). Notch4 signaalit havaittiin tumassa kaltaisia ​​rakenteita SMC mutta ei niille MMC-kortteja. Lisäksi Notch4 signaaleja havaittiin myös ihon MC, jotka vierekkäin klusteroituja kanssa SMCS (kuva 3a). Nämä tulokset osoittavat, että Notch4 on läsnä SMCS muttei MMC-kortit, ja viittaavat siihen, että Notch4 osallistuu SMC-specific transkription Notch-kohdegeenien, joita voidaan tarvita joissakin SMC toimintoja. Hematopoieettisissa soluissa, on raportoitu, että konstitutiivisesti aktiivinen Notch4 edistää laajentaminen progenitorisolujen ja estää myelooisen erilaistumista [32]. Koska Notch ligandeja on osoitettu esiintyvän sidekudoksen kuten ihon verinahka [33], on mielenkiintoista tutkia, onko Notch4 on merkitystä erilaistumista SMC ja ylläpito SMC toimintoja. Kuva 6 immunohistokemiallinen analyysi Notch4 ja Ptgr1 vuonna SMCS ja MMC-kortit vatsassa kudoksessa. (A) Vatsa submukoosassa (SMC; vasen paneelit
), mahalaukun limakalvon (MMC-kortteja, keskimmäinen paneeli
) ja ihon (iho MC; oikea paneeli
) osat värjättiin anti-Notch4 vasta-aineella (alempi paneelit
) ja toluidiinisinisellä (ylempi paneeli
). SMC värjättiin anti-Notch4 vasta-aineen mahalaukun submukoosassa ja ihon verinahka on merkitty nuolilla. Ei värjäytymistä havaittiin MMC-kortteja (nuolenpäitä
) lokalisoitu mahalaukun limakalvon. SMC ja MMC-kortit olivat metachromatically värjättiin toluidiinisinisellä. (B) Vatsa submukoosassa (SMC; vasen paneelit
) ja mahan limakalvon (MMC-kortteja, oikea paneeli
) osat värjättiin anti-Ptgr1 vasta-aineella (alempi paneelit
) ja toluidiinisinisellä (ylempi paneeli
). Mitään värjäytymistä anti-Ptgr1-vasta-aineen havaittiin SMC (nuoli
). Pieniä signaaleja havaittiin MMC-kortit (nuolenpäät
). SMC ja MMC-kortit olivat metachromatically värjättiin toluidiinisinisellä. Bars
, 25 um (a, b).
Ptgr1
tuote, 15-okso-prostaglandiini-13-reduktaasin /leukotrieeni (LT) B 4 12-hydroxydehydrogenase on olennainen entsyymi inakti- eikosanoidien kuten prostaglandiini E 2 (PGE 2) ja LTB 4 [34]. Vaikka on raportoitu, että reitit eikosanoidisynteesissä vaihtelevat eri MC alaluokkien [1, 4], tulokset viittaavat siihen, että inaktivointi järjestelmä eikosanoidien myös vaihtelee MC alaluokkien. Ptgr1
ilmentyminen havaittiin olevan huomattavasti korkeampi erikseen yhdistettiin MMC-kortit reaaliaikaisella RT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty). Tutkimme myös Ptgr1 ilmentymistä vatsassa kohdissa immunovärjäyksellä. Signaalit Ptgr1 proteiinin havaittiin rakeiden kaltaisia ​​rakenteita MMC-kortit on mahalaukun limakalvon mutta ei SMCS (kuvio 6b), mikä viittaa siihen, että Ptgr1 entsyymi voidaan vapauttaa MMC-kortteja, kun degranulaation. Koska PGE 2 pelaa kriittinen rooli ylläpito suolen homeostaasin kautta limakalvon suojaa ja haponerityksen estosta, on mahdollista, että kun aktivoitu, MMC-kortit säädellä negatiivisesti cytoprotective toimia PGE 2 nopealla inaktivoituminen Ptgr1.
Geenien ilmentyminen kuvio soluväliaineen komponentteja, adheesiomolekyylien, ja solun tukirangan proteiinit SMC ja MMC-kortit
MC fenotyyppejä on osoitettu riippuu niiden vuorovaikutusta ympäröivän matriiseina (ECM) ja naapurisolujen [1]. Yksi merkittävimmistä havainnoista tässä tutkimuksessa on ero geenien ilmentyminen ECM proteiinin osien, adheesiomolekyylien, ja solun tukirangan proteiinit, jotka voivat heikentää toiminnallisia sovellutuksia kunkin MC limakalvon tai submukosaalisen ympäristöön vatsassa (kuvio 5b) . MMC-kortit ilmaista geenit limakalvoa erityistä ECM proteiinit, kuten MUC1
(Mucin) ja TFF1
(Trefoil tekijä), kun taas SMC ilmaista geenejä tavanomaisilla ECM proteiineja, kuten Col4a
(prokollageenin) ja Lama2
(laminiini). Lisäksi SMC ilmaista geenit adheesiomolekyylien, kuten Alcam
ja Vcam1
, ja geenit tavallisille sytoskeletaaliset proteiineja, kuten Acta2
(aktiini), kun taas MMC-kortit ilmaista Desmosomi-komponentti geenejä, kuten DSc2
( desmocollin) ja Dsg2
(desmogleiini), ja geenit keratiinin väli säikeitä kuten Krt8
ja Krt19
. Desmosomeja on raportoitu olevan läsnä mahassa epiteeli [35], ja todettiin, että Desmosomi kaltaisia ​​rakenteita havaitaan tietyn MC [36]. Näin ollen on mahdollista, että MMC-kortit ovat vuorovaikutuksessa viereisen epiteelin läpi desmosomien adheesion vatsassa. Sen sijaan, SMC näyttävät vuorovaikutuksessa naapurisolujen kautta adheesiomolekyylien, kuten VCAM-1, ALCAM ja VE-kadheriinin (Vcam1
, Alcam1
ja Cdh5
). Koska nämä adheesiomolekyylien on osoitettu olevan mukana dynaamisessa sääntely aktiinisytoskeletonin [37, 38], kuten molekyyli välittämä vuorovaikutus limakalvon alaista solut voivat olla kriittisiä ylläpitää toiminnallisia ja morfologisia ominaisuuksia SMC. Itse asiassa on huomattava, että useimmat SMCS ovat vaihtelevia muodoltaan, ja ne ovat usein venytetään ja mutkainen verrattuna MMC-kortit [1].
Johtopäätös
Olemme perustaneet menetelmän RNA-monistus yhdistettiin ehjänä MC eristetty pakastetusta kudoksesta osia, joka mahdollistaa saada mukavasti maailmanlaajuisen geeniekspressiomalli MC: eri kudosten, elinten ja lajien mukaan lukien ihmiset. Tällä menetelmällä, olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa erillisten geeniekspressioprofiilit submukoosisen ja limakalvon MC hiiren vatsassa. Meidän havainnot tarjoavat käsityksen mahdolliset tuntemattomat ominaisuudet spesifisiä kullekin MC alaluokan. Tool Menetelmät
Materiaalit
seuraavia materiaaleja saatiin lähteistä ilmoitettu: HPLC puhdistettu T7- (dT) 24 pohjamaali [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] GE Healthcare UK Ltd. (Buckinghamshire, Englanti), RNaasi-vapaata vettä, dNTP, SusperScript II, Escherichia coli
(E. coli
) RNaasi H, E . coli
DNA-polymeraasi I, E. coli
DNA-ligaasia, T4 DNA-polymeraasilla ja satunnaisia ​​heksameerejä Invitrogen (San Diego, CA), RNaasi-inhibiittori, glykogeenin ja Megascript T7 kit Ambion (Austin, TX). Balb /c-hiiret saatiin JapanClea (Hamamatsu, Japani). Tutkimus hyväksyi Committee on Animal Research of Kyoto University Graduate School of Pharmaceutical Sciences.
RNA vahvistusta ja oligonukleotidi mikrosirujen
Mouse interleukiini-3-riippuvaista BMMCs valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [39].

• Potilas, jolla mahasyövän vatsakalvon carcinomatosis hoidettu vatsaonteloon kemoterapiaa jotka selvisivät yli 5 vuoden vastaanottava toistuva laparoskooppisten tutkimukset: tapausselostus
• Immunisointi immunodominantille Helicobacter suis ureaasia alayksikköä B indusoi osittaisen suojan H. suis infektiota hiirimallissa