Proteomik förändring i gastic adenokarcinom från japanska patients

proteomik förändring i gastic adenokarcinom från japanska patienter Bild Sammanfattning
Bakgrund
Gastric adenokarcinom utgör en av de vanligaste typerna av cancer i asiatiska länder, däribland Japan. Omfattande proteinprofilering av parade kirurgiska prov av primära gastriska adenokarcinom och nontumor slemhinnor härledda från japanska patienter utfördes med hjälp av två-dimensionell gelelektrofores (2D-EP) och vätskekromatografi-elektrospray jonisk tandemmasspektrometri (LC-ESI-MS) att etablera magcancer specifika proteiner som förmodade kliniska biomarkörer och molekylära mål för kemoterapi.
Resultat
relativt vanliga förändringar i proteinuttryck avslöjades i tumörvävnad. Ökningar av mangan dismutas och nonhistone kromosomalt protein HMG-1 (HMG-1) observerades, medan minskningar i kolsyra anhydrases I och II, glutation-S-transferas och foveolin prekursor (gastrokine-1) (FOV), en 18-kDa magen specifika protein med förmodad tumörsuppressoraktivitet, upptäcktes. RT-PCR-analys visade också signifikant nedreglering av FOV-mRNA-uttryck i tumörvävnad.
Slutsats Review, en möjlig patologisk roll för nedreglering av FOV i gastric cancer visades. Utvärdering av de specifika minskningar i gen- och proteinuttryck av FOV hos patienter kan användas som kliniska biomarkörer för effektiv diagnos och bedömning av magcancer.
Bakgrund
Gastric adenokarcinom utgör en av de vanligaste typerna av cancer i asiatiska länder, däribland Japan, som är näst till lungcancer att antalet dödsfall det orsakar. Trots den senaste tidens utveckling av diagnostiska metoder, de flesta gastric cancerpatienter diagnosen i ett framskridet stadium och har en mycket låg överlevnad fem år (mindre än 10%) [1]. Detta är delvis på grund av brist av specifika och känsliga biomarkörer för diagnos och övervakning av sjukdomens utveckling på ett tidigt stadium, även om vissa gastriska tumörmarkörer, inklusive karcinoembryonalt antigen, som har använts och är delvis effektiva. Som gastric cancer är en flerstegsprocess är omfattande analys krävs också för enskilda fall, där olika molekylära händelser inträffar i varje cancerframkallande processen.
Nyligen proteomik analys användes för att omfattande undersöka proteinuttryck i kroppsvätskor, vävnader och celler [ ,,,0],2-4]. Detta tillvägagångssätt, som kliniska proteomik, är mycket användbara för att identifiera sjukdomsassocierade proteiner som visar förändringar i uttryck och modifiering som motsvarar ett sjukdomstillstånd [5, 6]. Dessa sjukdomsrelaterade proteiner förväntas vara biomarkörer för diagnos och förmodade riktade proteiner för behandling [7-9]. Å andra sidan, har omfattande analyser av transcriptomes i tumörvävnad från olika cancerpatienter som använder mikromatris och genchips utförts under de senaste åren [10]. Emellertid har en brist på korrelation mellan förändringar i mRNA och karcinogenes visats, och kvantitativa och kvalitativa förändringar av post-translationellt modifierade proteiner som slut genprodukter anses vara mer informativ än de mRNA i tumörvävnad för att studera de molekylära händelserna i karcinogenes. Proteomikstudier för identifiering av tumörassocierade proteiner i magcancer ökar, och Proteome databaser för gastriska vävnader [11] och cellinjer [12] har byggts. De flesta av dem rör specifika proteiner eller antigener som återspeglar cellgifts- och termoresistenta egenskaper magcancer [13-15], och som är associerade med Helicobactor pylori
[16, 17]. I föreliggande studie utförde vi omfattande proteomanalys av tumör och nontumor vävnader i japanska patienter med gastriska karcinom, och identifierade flera proteiner av vilka expressionsnivåerna vanligen förändrade i kliniska fall. I synnerhet var uttrycket av gastrokine-1 (GKN-1) har föreslagits vara under både transkriptionell och translationell styrning.
Resultat
Protein separation och identifiering
Figur 1A visar en bild översikt över en typisk huvud gel för en gastric tumörvävnad. I närheten av 200 proteinfläckarna färgade med Coomassie brilliant blue (CBB) R-250 var väl separerade i gelerna. De numrerade fläckarna i figur 1B och 1C skars ut från en gel, behandlades med trypsin och utsattes därefter för vätskekromatografi-elektronisk sprej jonisering tandem masspektrometer (LC-ESI-MS /MS) -analys. Sjuttiotvå av dem representerar 69 olika proteintyper identifierades. Tabell 1 visar alla de proteiner som identifierats genom peptid matchning med Mascot sökalgoritm. Noggrannheten i proteinprofilering utvärderades som poängvärdet (över 37). Figur 1 (A) En översikt över en mästare 2D gel bild för tumörvävnad från en patient med en gastrisk adenokarcinom. (B) och (C) De numrerade proteinfläckar identifierades genom LC-ESI-MS /MS och protein matchning, såsom visas som förstorade siffror.
Tabell 1 Protein profil detekteras i tumörvävnad från en japansk patient med en gastrisk adenocarcinom.
Spot nr
antal anslutnings
Protein identifiering

Mass
SC (%)
Pl
Betyg
ett 24.308.169
axonemal tung kedja dynein typ 3
473.776
0
6,04
37 2
15.010.550
värmechockprotein gp96 prekursor
90.309 7
4,73
62
3
72222
värmechockprotein 90 -β
83.584
14
4,97
176 4
5.729.877
värmechock 70 kDa protein 8 isoform en
71.082
19
5,37
283
5
38.044.288
gelsolin isoform b
80.876 5
5,58
63
6
4.826.960
glutaminyl-tRNA-syntetas
88655 1
6,71
44
7
4501867
aconitase 2
86113
10
7.36
231
8
119717
ezrin
69470
7
5.94
75
9
4557871
transferrin
79280
9
6.81
97
10
16507237
heat chock 70 kDa-protein 5
72402 15
5,07
165
11
24234686
värmechockprotein 70 kDa-protein 8
53598
16
5,62
160
12
4885431
värmechock 70 kDa protein 1B
70267 11
5,48
143
13
1082886
tumör necrosis factor typ 1 receptor-associerat protein TRAP-1
75.694
13
8,43
288
14
31.542.947
chaperonin, mitokondrie matrixprotein P1, P60 lymfocyter protein
61187
13 5,7
299
15
28592
serum albumin
71316
23
6.05
292
16
340219
vimentin
53738
18
5.03
79
17
4503729
similar till FK506-bindande protein 4
49031
5
5.6
36
18
32709
IFP53
53559
21
5.93
277
19
4502643
chaperonin-containing TCP1, subunit6A (zäta 1)
58444
6
6,23
79
20
7.106.439
tubulin, β5
50095
14
4.78
125
21
37492
α-tubulin
50810
13
5.02
94
22
125604
pyruvate kinas, M2 isozyme
58447
5
7.95
234
23
4557014
catalase
59947
6
6.9
120
24
4503483
eukaryotic översättning förlängningsfaktor
2 96.246 4
6,41
56
25
179.279
ATP-syntas β-subenheten
56861
5
5,39
59
26
7657041
nedregleras i metastasis
320846 2
7,07
40
27
4504169
glutationsyntetas, GSH synthetase
52523
5
5.67
99
28
12017952
GE36
73327
2
5.2
37
29
34234
laminin-binding protein
31888 12
4,84
51
30
16.359.158
aktin, beta
42.078
14
5,29
171
31
6635125
KIAA0284-protein
161473 2
6,36
47
32
5803225
14-3-3 epsilon
29326
8
4,63
49
33
4.504.707
inositol polyfosfat-4-fosfatas, typ II, 105 kD
105749 1
5,87
37
34
35038601
hypotetiskt protein DKFZp761A078
74864
2
7.27
47
35
12017952
GE36
73327
1
5.2
38
36
4505877
plectin En isoform 1
520111 1
5,57
44
37
38158018
centrosomal protein 1, centriol associerat protein, centriolin
269874 1
5,44
39
38
30157438
CTD bindande SR-liknande protein rA9
180240 1
9,15
41
39
4503471
eukaryot översättning förlängningsfaktor 1 α1
50451
12
9,1
191
40
4.757.810
ATP-syntas
59828
17
9,16
178
41
693933
2-phosphopyruvate-hydratas α-enolas
47421
22
7,01
240
42
123576
47 kDa värmechockproteinet prekursor
46352
14
8,27
177
43
5032069
skarvning faktor 3b, subenhet 4
44414
3
8,54
58
44
4.503.471
eukaryot översättning förlängningsfaktor 1 α1
50451 4
9,1
47
45 5.921.789
citrat syntas,
mitokondriell prekursor 51959
12
8,13
114
46
4505763
fosfoglyceratkinas en
44985
14
8,3
87

47 4504069
aspartataminotransferas 2 prekursor
47844 6
9,14
52
48
7669492
glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas
36201
13
8,57
49
49
4757756
annexin A2
38808
9
7,57
87
50
6648067
malatdehydrogenas, mitokondrie föregångare
35.965 7
8,92
60
51
5.031.857
laktatdehydrogenas A
36950
6
8,44
43
52
238.427
porin 31 HM
30737 29
8,63
124
53
5.174.447
guanin nukleotid-bindande protein
35511
8
7,6
65
54
34740329
heterogen nukleär ribonukleoprotein A3
39799
7
9.1
43
55
4504983
galectin-3
26229
12
8.58
42
56
4504447
heterogeneous nukleär ribonukleoprotein A2 /B1 isoform A2
36041
7
8,67
40
57
86901
ATP-beroende DNA-helikas RAP30 /74 kedjan RAP30
26350
3
9,46
41
58
230445
karbonanhydras I
28903
12
6,44
67
59
455739
karbanhydras II
29285 8
6,87
82
60
26.892.090
beta-globin kedja variant
16101
40
7,86
121
61
34709
mangansuperoxiddismutas
24891 10
8,35
111
62
4507645
triosfosfatisomeras en
26938
17
6,45
47
63
38488935
foveolin prekursor
20546
16
5,65
95
64
478.813
nonhistone kromosomalt protein HMG-1
25139
13
5,41
60
65 2.204.207
glutation S-transferase
23595
34
5.43
73
66
178755
proapolipoprotein
28944
8
5.45
103
67
37267
transketolase
68435
4
7.9
59
68
189998
M2-type pyruvatkinas
58447
10
7,95
157
69
825605
glutation S-transferas
25650
10
8,51
65
Dessa proteiner kan delas in i flera kategorier baserat på deras funktioner, inklusive cytoskelettsystemen proteiner, stressrelaterade och chaperoning proteiner, akutfasproteiner, glykolytiska enzymer, enzymer som är involverade i ämnesomsättningen och celltillväxt, tumörhämmande proteiner och mage specifika proteiner .
Vanliga förändringar av proteinuttryck mellan tumör och nontumor vävnader i magcancer patienter
Diverse förändringar i proteom upptäcktes mellan tumör och nontumor vävnader från samma patienter. Som visas i figur 2, har flera gemensamma förändringar observerades bland fem japanska gastric patienter (Fall A till E) cancer. Mangansuperoxiddismutas (MnSOD), nonhistone kromosomalt protein HMG-1 (HMG-1), fosfoglyceratkinas 1 (PGK-1), karbonanhydras I och II (CA I och II), foveolin prekursor FOV (gastrokine-1), aspartat aminotransferas två föregångare (AST), och glutation-S-transferas (GST) uppvisade gemensamma förändringar i uttryck mellan tumör och nontumor vävnader, däribland bland de identifierade proteinerna. Proteinuttryck av MnSOD och HMG-1 visade sig vara uppreglerat i tumörvävnad jämfört med i nontumor vävnader. Å andra sidan, var CA I och II, FOV, AST och GST-proteinerna avslöjade att nedregleras i tumörvävnad. Veck förändringar i uttrycket av dessa proteiner i förhållande till den hos GAPDH är sammanfattade i tabell 2. Den mest anmärkningsvärd minskning visades i nivån av FOV i samtliga fall. Graden av minskningen i GST proteinuttryck var nästan densamma som i FOV (målen B, D och E), även om man inte observerades i de två andra fallen. Å andra sidan, var ökningen i HMG-1 markeras i tre fall (A, C, och D), även om en sådan skillnad i uttryck inte observerades i de två andra fallen. MnSOD uppvisade en tendens att öka i tumörvävnad av tre patienter (fall A, C och D), men en relativ minskning observerades också i mål B. När det gäller PGK-1, en signifikant samband mellan faldig förändringar i proteinuttryck och patologiska gradering av tumörer knappast observeras. Figur 2 Detaljerade ändringsmönster proteiner. (A) Nontumor och (B) tumörproteiner inklusive CAI (No.58), CAII (No.59), MnSOD (No.61), FOV (No.63), HMG-1 (No.64), och GST (No.65). (C) Nontumor och (D) tumör proteiner inkluderande PGK-1 (No.46), ASAT (No.47), och GST (No.69). GAPDH, inringade, användes som ett referensprotein.
Tabell 2 gånger förändringar i proteinuttryck mellan nontumor och tumörvävnader erhållna från fem patienter med gastriska adenokarcinom.
Protein
Fall A
Fall B
mål C
Fall D
mål E

CA jag
-6,5
-1,6
-3,3
-4,3
-2,6
CA II
-2.6
-1.3
-26
-4.3
-13
FOV
-13
-13
-26
*
-26
MnSOD
+1.7
-2.6
+6.5
+1.4
+1.1
HMG-1
+13
*
+3.7
+13
*
PGK1
+1.6
+1.1
-1.2
+2.6
-1.4
AST
-13
-1.6
-6.5
-3.7
-2.6
GST
*
-26
*
-13
-13
CA I karbanhydras I.
CA II, karbanhydras II.
FOV, foveolin föregångare.
MnSOD, mangansuperoxiddismutas.
HMG-1, nonhistone kromosomprotein.
PGK1, fosfoglyceratkinas 1.
AST, aspartataminotransferas 2 prekursor.
GST, glutation-S-transferas.
*, ej bestämd.
RT-PCR-analys
med RT-PCR, förändringar i mRNA uttryck i tumör och nontumor vävnader som härrör från mag cancerpatienter analyserades för proteiner som uppvisade förändringar i proteinuttryck, inklusive FOV, MnSOD och HMG-1. Såsom visas i figur 3, var FOV-mRNA minskade avsevärt i tumörvävnader i fyra på alla patienter (fall A, B, C och E), medan den inte hittades i antingen nontumor eller tumörvävnader från den andra patienten (Fall D) . Å andra sidan, var MnSOD mRNA märkbart ökad hos fyra patienter (fall B, C, D, och E), även om liten skillnad i mRNA-nivån mellan nontumor och tumörvävnader i mål A detekterades. Emellertid ett förhållande mellan HMG-1-mRNA-expression och de patologiska fenotyper av tumörer var knappast observeras. Figur 3 Jämförelse av mRNA-expression av proteiner eventuellt samband med cancer mellan nontumor och tumörvävnad som härrör från fem patienter med mag adenokarcinom (fall A till E) genom RT-PCR. N och T indikerar nontumor och tumörvävnad, respektive.
Diskussion
I denna studie vi utförde proteomik analys av tumör och nontumor vävnader som härrör från japanska magsäckscancerpatienter. Sextio-nio olika proteiner i tumörvävnad från en magcancer fall identifierades genom 2D-EP och LC-ESI-MS /MS, som ingår stressproteiner, Hsp70, Hsp90 och chaperonine innehållande TCP1 (CCT), för att skydda sig själva; glykolytiska enzymer, triosfosfatisomeras 1 α-enolas och PGK-1, för det växande energibehovet; cytoskelettproteiner, Ezrin, gelsolin isoform b och vimentin; proteiner involverade i celldifferentiering och proliferation, galektin-3 och transferrin; och proteiner som uppvisar förmodade tumörsuppressoraktivitet, FOV. Många av dessa proteiner har rapporterats i samband med tumörbildning av gastric adenokarcinom involverar flera steg och faktorer [18, 19].
Vi visade också att de expressionsnivåer av flera proteiner i tumörvävnad var vanligt ändrats på fem japanska patienter med gastric adenokarcinom, jämfört med dem i nontumor vävnader. En vanlig ökning av proteinuttryck i tumörvävnad inträffade för MnSOD, HMG-1 och PGK-1, medan en vanlig minskning i tumörvävnad inträffade för FOV, GST och AST
superoxid (O 2 . - ), en fri radikal, är viktigt för den antimikrobiella verkan av granulocyter och monocyter. Superoxiddismutas (SOD) snabbt avlägsnar överskott av superoxid som produceras i stress och biologiska reaktioner in vivo
genom katalys av omvandlingen av superoxid med H + H 2O 2 och O 2. MnSOD, en av SOD, ligger i mitokondrier och bidrar till skyddet av mitokondrie-DNA från skador. Det har rapporterats att ökat uttryck av MnSOD i progressiv magsäckscancer bör relateras till den 5-års överlevnad efter operation [20] och känslighet för kemoterapi [21]. I denna studie, proteinuttryck av MnSOD var uppreglerat i fyra av fem gastric cancerpatienter, vilket tyder på en självskyddande svar. Å andra sidan har den uppreglering av MnSOD i tumörvävnader ansetts störa effektiv kemoterapi baserat på radikalproduktion, vilket kan orsaka en minskning i känslighet för anti-cancerdroger och avgöra hur allvarlig cancern.
HMG-1 reglerar transkriptionen av olika gener och den strukturella stabiliseringen av kromosomer som ett DNA-bindande protein. HMG-1 har rapporterats vara förknippad med cancer och metastaser i kolorektalcancer och bröstcancer [22].
Transkriptions uppreglering av HMG-1 i magsäckscancer har också visats [23]. Expression av HMG-1 i tumörvävnader föreslogs vara relaterad till resistens mot cisplatin [24]. Vi visade här en ökning av detta protein i tre fall.
GST är ett drog metaboliserande enzym som katalyserar konjugering av reducerat glutation till droger och metaboliter, och bidrar också till avgiftning av cancerframkallande ämnen. Därför kan en minskning av aktiviteten vara en riskfaktor för cancer. Infektion av Helicobacter pylori har rapporterats orsaka en minskning av GST uttryck [25], vilket tyder på att en minskning av GST-aktivitet kan vara en orsak till gastric cancer. I denna studie observerades en minskning i GST-protein uttryck observeras i tre fall. En minskning i GST-protein uttryckning kan användas som en biomarkör för diagnos av gastriska tumörer.
AST är ett aminotransferas som verkar på aminosyror och α-ketosyran, är den som distribueras i stor utsträckning i mänskliga organ. AST frisätts in i blodströmmen på grund av förbättrad permeabilitet och förstörelse av vävnader. En förhöjd koncentration av AST-protein har rapporterats i blodet hos patienter med hepatit, maligna tumörer inklusive hepatom och leuchemia. Genuttryck av GST har också visats vara uppreglerat i kolorektala tumörvävnader [26]. Men en minskning av AST-protein uttryck vanligt förekommande i alla tumörvävnad som härrör från de nuvarande fem patienter med magsäcks adenokarcinom. Ytterligare studier bör utföras för att klarlägga om en minskning av AST-proteinet specifikt observeras i gastriska tumörvävnader eller inte.
Förhöjd expression av PGK-1, som är en av de enzymer i den glykolytiska vägen och som katalyserar defosforylering av 1,3-bisfosfoglycerat att producera ATP, har observerats i många maligna tumörvävnader som är beroende av ATP som en viktig energikälla. Fasta tumörer tros behöva överproduktionen av ATP för att bibehålla den förbättrade proliferation. Den uppreglering av glykolytiska enzymer, inklusive PGK-1 i lungcancer [27] och M2-typ pyruvatkinas i kolorektal cancer [28], har rapporterats och föreslagits vara användbar för cancerscreening. Men i den aktuella studien, en signifikant relation mellan PGK-1 proteinuttryck och fenotyper av gastriska adenokarcinom knappast upptäckas. Därför var PGK-1 anses vara olämpligt för diagnos av magcancer.
Av kolsyra anhydrases (CAS) är zinkhaltiga enzymer som distribueras i stor utsträckning i olika organ och som utgör en stor familj inklusive CA-I till CA -IX. De katalyserar hydrering av CO 2 för mellan metabolism och upprätthålla pH och jon jämvikt i kroppen. Hittills har direkt samband har påvisats mellan malign transformation och proteinuttryck för CA I till VII [29]. Två tidigare studier visat att uttrycket av både CA-I och CA-II reducerades signifikant i kolorektala tumörer jämfört med normal kolorektal epitel eller slemhinnor [30]. En annan rapport presenteras resultat som visar att minskat uttryck av CA-I och CA-II korrelerad med den biologiska aggressiviteten hos kolorektal cancer och synkron fjärrmetastaser [31]. Som tidigare föreslagits [32], mag- och kolorektal karcinom kan dela en liknande mekanism för celltillväxt och mucosal malignitet, och kan bli en biomarkör för dessa karcinom, eftersom gemensamma minskningar i proteinuttryck av CA-I och CA-II observerades också i denna studie.
FOV, som är identisk med en mage specifika 18-kDa antrum slemhinna protein! (AMP-18) [33, 34], GKN1 [35], och trefoil faktor interaktioner (Z) (TFIZ) [36], visade sig vara dramatiskt nedregleras eller frånvarande i magsäckscancerpatienter i denna studie. Den humana AMP-18 och humant carcinoantigenic CA11 genprodukt, som kodar för en aminosyrasekvens som skiljer sig från den hos AMP-18 i endast en enda rest [37, 38], funktion som utsöndrade tillväxtfaktorer delvis ansvariga för upprätthållande av en normal funktionell gastrisk epitel [33]. Både AMP-18 och CA11 genprodukten har rapporterats vara intensivt uttryck i normal mage vävnad men inte i de flesta gastric cancer [33, 37, 38]. Immunohistokemiska studier visade att AMP-18 verkar vara närvarande i mukosala epitelceller i den normala humana gastrisk antrum och duodenum [33]. Nyligen var TFIZ visat sig fungera som en tillväxtregulator av gastriska epitelceller genom bildning av en heterodimer med trefoil factor 1 (TFF1) [36]. Våra nuvarande data bekräftade ytterligare den höga expressionen av FOV i nontumor gastriska vävnader och signifikant undertryckande av proteinet i gastriska adnocarcinomas, vilket indikerar att FOV spela roller i bibehållande av normal differentiering av epitelceller och tumörsuppression, men inte i tumörvävnader. Dessutom visade vi att transkription av FOV-mRNA var också vanligt nedregleras i gastric cancerpatienter, vilket tyder på att en markant minskning i FOV protein orsakades av undertryckande av FOV genuttryck. Dessutom i en patient proteinet inte upptäcktes i nontumor vävnader, vilket tyder på att uttrycksnivån för FOV protein hos individer kan bestämma adenocarcinom fenotypen. Följaktligen kan uttrycksnivån för FOV som biomarkör vara informativ för bedömningen av magcancer.
Slutsats
Protein profilering av tumör och nontumor vävnader härledda från japanska patienter med gastrisk adenokarcinom utfördes med användning av 2D-EP och LC- ESI-MS /MS. De identifierade proteinerna ingår molekylära chaperoner, energiproducerande enzymer, cytoskelettproteiner, och så vidare. Vanliga protein förändringar upptäcktes i mag cancerpatienter. Protein uttryck för MnSOD och HMG-1 uppreglerade medan den för GST, AST och FOV var nedregleras i gastriska tumörvävnader. En korrelation mellan förändringen av dessa proteiner och deras transkriptions uttryck i magcancer knappast observerades i denna studie, med undantag för i fallet med FOV. Både protein och genuttryck i FOV, en mage specifika sekretoriska tillväxtfaktor för normala gastric epitelceller, var märkbart nedreglerade i tumörvävnad som härrör från japanska patienter med gastric adenokarcinom. Övervakning av expressionsnivåer av denna mage-specifikt protein i kliniska prover kan ge värdefull information för diagnos av magcancer som en specifik biomarkör och för bättre förståelse av gastric cancer.
Metoder
Material
DNas I, RNas A, 2-merkaptoetanol (2-ME), glaspärlor (212-300 fim), Nonidet P-40, akrylamid, N, N, N ', N'
-tetramethylenediamine (TEMED), natriumdodecylsulfat (SDS ), jodacetamid och ditiotreitol (DTT) inköptes från Sigma (St. Louis, MO). Agaros för isoelektronisk fokusering (IEF), och Pharma pl 3-10, 4-6,5 och 8-10,5 var från Amersham Bioscience (Piscataway, NJ). Trypsin (sekvensekvalitet) var från Roche (Manheim, Germany). Fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), tiourea, sorbitol, natriumpyrofosfat, ammoniumpersulfat, D, L-asparaginsyra, triklorättiksyra, sulfosalicylsyra-dihydrat, ättiksyra, acetonitril, myrsyra och trifluorättiksyra (TFA) var från Wako Pure Chemicals (Osaka , Japan). Urea var från Katayama Chemicals (Osaka, Japan). Pepstatin A och leupeptin var från Peptide Institute (Osaka, Japan). NH 4HCO 3 och N, N'-metylenbisakrylamid var från Nacalai Tesque (Kyoto, Japan). CBB R-250 var från ICN Biomedicals Inc. (Aurora, OH). Molekylmassa för var från APRO Science, Inc. (Tokushima, Japan). TRIZOL-reagens var från Life Technologies (Frederick, MD). Oligo (dT) 12-18-primer, deoxinukleotider (dNTPs), och RNaseOUT var från Invitrogen (Carlsbad, CA). M-MLV omvänt transkriptas och Taq DNA-polymeras var från Promega (Madison, WI).
Vävnader och provberedning
Primära gastric adenokarcinom och angränsande nontumor slemhinnor samlades på gastrektomi och tillhandahålls av Institutionen för kirurgi, Graduate School of Medicine, University of Tokushima, Tokushima, Japan. Forskningen genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen av World Medical Association, och godkändes av den etiska kommittén vid universitetet i Tokushima. Informerat samtycke gavs också av alla de patienter som har lämnat de kliniska prover. Vävnader frystes i ett torrt is-metanolbad så snart som möjligt efter dissektion och lagrades i en frys (-80 ° C) före användning. För mRNA-analys, var vävnader först nedsänkt i RNAlater (Takara, Tokyo, Japan) före frysning. Detaljerad klinisk-patologisk data inklusive tumörstadiet (enligt AJCC systemet), plats och differentiering, och histologiska data på vävnadsprover är listade i tabell 3. Ingen av dessa fall klassificerades i scirrhous typ kategori, och tumörvävnad var tydligt distinguishted från icke-tumör en i varje fall. För två-dimensionell gelelektrofores (2D-EP), fram proteinextraktion från vävnader som utförs genom följande förfarande. Frysta block (20-30 mg våtvikt) homogeniserades med en plast mortelstöt (Toyobo, Tokyo, Japan) i närvaro av glaspärlor i 10 vol /våtvikt av dialysbuffert innefattande 5 M urea, 1 M tiourea, 10 mM NaPPi , 1,67 | il /ml 2-ME, 0,005% DNas i, 0,05 mg /ml RNas A, 20 | iM leupeptin, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF och 20 ^ iM pepstatinA, och centrifugerades sedan vid 50000 rpm under 30 min vid 4 ° C (Beckman -Coulter, Fullerton, CA). Den erhållna supernatanten användes som vävnadsextraktet. Proteinkoncentrationerna bestämdes med en Bradford-proteinanalyssatsen (Bio-Rad, Hercules, CA) med användning av bovint gammaglobulin som en standard.Table 3 Kliniska egenskaper hos patienterna med gastriska adenokarcinom.
Case

Age

Sex

Locationa

Gradeb

Stage


A
63
Male
UM
G3
IIIA
T2N2M0H0
B
68
Female
L
G2
II
T2N2M0
C
76
Male
ML
G2
IV
T4N3M0
D
78
Female
L
G2
III
T2N0M0H0
E
77
Male
ML
G2
II
T2N1M0
au: övre, M: mitt, L: lägre
BG2: måttligt differentierade, G3. dåligt differentierad
Två dimesional gelelektrofores
2D-EP utfördes såsom beskrivits tidigare [39]. Den första dimensionella isoelektrisk fokusering utfördes i en 1% (vikt /volym) agarosgel (φ 2,6 x 180 mm) med ett pH-värde 3-10 gradient vid 700 V under 18 h vid 4 ° C, och den andra dimensionella SDS gelelektrofores utfördes med en 5-15% (vikt /volym) akrylamid-gradient (M
r intervall, 6-200 kDa) i en standard gelplatta (20 × 13 cm) vid 15 mA under 3 h, och sedan vid 70 mA under 2 h vid rumstemperatur. Geler färgades med CBB R-250.
Proteinprover (500 | j, g) extraheras från tumör centrum och omgivande histologiskt normal slemhinna utsattes för 2D-EP och köra i par sida vid sida.
Någon av de färgade fläckarna skars ut från 2D-gel, i-gel-digererad med trypsin och utsattes därefter för LC-ESI-MS /MS-analys såsom beskrivits tidigare [40]. Peptidblandningen separerades med en omvänd fas nanoLC systemet (känd, Swichos II, Ultimate, LC Packings, Sunnyvale, CA). De eluerade peptiderna sprutas direkt in i en ESI masspektrometer (Esquire3000 Plus, Bruker-Daltonics, Fremont, CA). Review, en stor volym av MS /MS-data förvärvades med dataanalysmetoder 3,1 programvara (Bruker-Daltonics), omvandlas till text filer notering massvärdena för moderjoner och intensiteter och massor av fragmentjoner, och sedan bearbetas med MASCOT-algoritmen (Matrix Science Ltd, London, UK) att tilldela peptider i NCBI non-redundant sekvensdatabas med hjälp av en taxonomisk begränsning, 'mänsklig'. Databassökningen utfördes med de parametrar som beskrivs av Yoshimura et al. [40].
Bildanalys och MS peptidsekvensering Review, Bild insamling och analys utfördes med molekylär Imager FXProPlus (Bio-Rad) och Imagemaster mjukvara (Bio-Rad). Jämförelser gjordes mellan gel bilder av tumörer och matchad nontumor prover par av par. Normaliserade volymskillnader statistiskt beräknas för alla fem fall. Halten av glyceraldehyd 3-fosfodehydrogenas (GAPDH) -proteinet användes som en referens för att utvärdera den faldig förändring av proteinexpression mellan tumör och matchas nontumor vävnader som nivåerna av GAPDH-mRNA och protein kunde inte ändras mellan vävnader erhållna från patienter. Konsekvent och väsentligt olika platser valdes ut för analys av LC-ESI-MS /MS. Proteinfläckar! Skars ut från geler i små bitar och utsattes för in-gel tryptic digestion över natten [40]. Peptid masspektra registrerades, och parametrar för spektra förvärv användes som tidigare nämnts [40]. Noggrannhet i databasen proteinmatchning med användning av Mascot sökning [41] bedömdes som en poäng över 37, som erhölls i de flesta av de analyser.
RNA-isolering och RT-PCR-analys
tumör- och matchat nontumor prover (ung. 50 mg våtvikt) maldes och homogeniserades sedan manuellt i 1 ml av TRIZOL-reagens (Invitrogen) på is. RNA isolerades utan DNas I-behandling i enlighet med tillverkarens protokoll. I korthet, 0,2 ml CHCl 3 sattes till homogenatet, följt av centrifugering vid 20600 x g under 15 min. En lika stor volym av 2-propanol tillsattes till den resulterande supernatanten för att fälla ut RNA. Efter centrifugering, pelleten sköljdes med 75% etanol /diethylpyridylchloride (DEPC) -behandlat vatten, följt av torkning. Pelleten upplöstes i en lämplig volym av DEPC-behandlat vatten som den totala RNA-fraktionen. För omvänd transkription (RT), 2 | j, g RNA från varje prov transkriberades vid 37 ° C under 1 h i närvaro av 200 U av Molony leukemivirus omvänt transkriptas (Promega), oligo (dT) 12-18-primer, 0,5 mM dNTP och 50 U av RNaseOUT.

• Nedreglering av Thrombospondin2 förutspår dålig prognos hos patienter med magcancer
• Katekolamin uppreglerar MMP-7 uttryck genom att aktivera AP-1 och STAT3 i magcancer