PROTEOMIKOS pakeitimą, gastic adenokarcinomos iš Japonijos patients

PROTEOMIKOS pokyčiui gastic adenokarcinomos iš Japonijos pacientų
tezės
Background pervežimas skrandžio adenokarcinomos sudaro vienas iš paplitusių rūšių vėžio Azijos šalių, įskaitant Japoniją. Išsami baltymų profiliavimas suporuotas chirurginių egzempliorių pirminių skrandžio adenokarcinomos ir nontumor gleivinės, gautų iš Japonijos pacientams buvo atliktas taikant dvimatę gelio elektroforezės (2D-EP) ir skysčių chromatografija-elektropurkštuviniu joninės tandemo masių spektrometrijos (LC-ESI-MS) įsteigti skrandžio vėžys konkrečių baltymų, kaip tariamų klinikinių biologinių žymenų ir molekulinės tikslų chemoterapija.
rezultatai
gana paplitusi pakitimai baltymų ekspresijos buvo atskleista naviko audiniuose. buvo nustatytas padidėjęs mangano dismutazės ir nonhistone chromosomų baltymų HMG-1 (HMG-1), o jų skaičiaus mažėjimas, esantys karboanhidrazės I ir II, glutationą-S-transferazės ir foveolin pirmtakas (gastrokine-1) (FOV), 18-kDa skrandžio specifinę baltymų su spėjamą auglio slopinamojo aktyvumo, buvo aptikta. AT-PGR analizė taip pat parodė, kad daug žemyn reguliavimą FOV iRNR raiška navikų audiniuose.
Išvada
galimo patologinę vaidmenį žemyn reguliavimo FOV yra įrodyta skrandžio Kancerogeninis. Įvertinusios konkrečias sumažėja genų ir baltymų raiškos FOV pacientams gali būti naudojamas kaip klinikinių biologinių žymenų, skirtų veiksmingai diagnozuoti ir vertinimo skrandžio vėžio.
Fone
Skrandžio adenokarcinoma sudaro vienas iš paplitusių rūšių vėžio Azijos šalyse, įskaitant Japonija, kuri yra antra tik plaučių vėžį, kad mirčių jis sukelia numerį. Nepaisant neseniai plėtros diagnostikos metodus, dauguma skrandžio vėžiu sergančių pacientų diagnozuojama vėlyvos stadijos ir turi labai mažą penkerių metų išgyvenamumas (mažiau nei 10%) [1]. Tai iš dalies dėl to, kad konkrečių ir jautriai biologinių žymenų, skirtų diagnostikos ir monitoringo ligos eigą ankstyvoje stadijoje trūksta, nors kai skrandžio naviko žymenys, įskaitant karcinoembrioninius antigeno, buvo naudojami ir yra iš dalies veiksmingos. Kaip skrandžio Kancerogeninis yra daugiapakopį procesą, išsamią analizę taip pat yra reikalingas atskirų atvejais, kai skirtingų molekulinių įvykių įvyksta kiekvieno kancerogeninio procese.
Neseniai PROTEOMIKOS analizė buvo panaudota visapusiškai išnagrinėti baltymų raišką kūno skysčiai, audinių ir ląstelių [ ,,,0],2-4]. Šis požiūris, kaip klinikinių proteomikos, yra labai naudinga nustatant ligos susijusios baltymus, kurie atspindėtų pokyčius saviraiškos ir modifikacijos atitinkančius ligos būklę [5, 6]. Šios ligos susijusios baltymai turėtų būti biologiniai žymenys diagnostikos ir spėjamo tikslinių baltymų gydymo [7-9]. Kita vertus, išsamūs analizės transcriptomes tik navikų audiniuose, iš įvairių vėžio pacientams, vartojantiems mikrotablic DNR ir genų lustai buvo atlikti per pastaruosius metus [10]. Tačiau koreliacijos tarp pokyčių mRNR ir kancerogeninio poveikio nebuvimas buvo įrodyta, ir yra manoma, kiekybiniai ir kokybiniai pokyčiai po translationally modifikuotų baltymų kaip galutinis genų produktų, kad būtų informatyvesnis nei mRNR naviko audiniuose studijuoti molekulinius įvykius Kancerogeninis poveikis. Proteominiai tyrimai dėl naviko susijusių baltymų skrandžio vėžio nustatymo didėja, o proteomos duomenų bazės skrandžio audinių [11] ir ląstelių linijų [12] buvo pastatytas. Dauguma jų susiję su specifinių baltymų ar antigenų, kad atspindėtų chemoterapijoje ir termo atsparus savybes skrandžio vėžio [13-15] ir kurios yra susijusios su Helicobactor pylori
[16, 17]. Šioje studijoje, mes atliekame išsamią proteomos analizę naviko ir nontumor audinių Japonijos pacientams, sergantiems skrandžio karcinoma, ir nustatė keletą baltymų, iš kurių išraiška lygiai paprastai pakeista klinikinių atvejų. Visų pirma, iš gastrokine-1 (GKN-1) išraiška buvo pasiūlyta būti tiek pagal transkripcijos ir transliacijos kontrolę.
Rezultatai
baltymų atskyrimo ir identifikavimo pervežimas 1A pav rodo vaizdo apžvalga tipiškas meistras geliu už skrandžio naviko audinyje. Maždaug 200 baltymų dėmes tamsintas su Coomassie briliantinis mėlynasis (CBB) R-250 buvo gerai atskiriami gelių. Sunumeruoti dėmės 1b paveiksle ir 1C buvo pašalintų iš gelio, gydomi tripsino ir tada taikomos skysčių chromatografija-elektroninis purškimo jonizacijos tandemine masės spektrometru (LC-ESI-MS /MS) analizės. buvo identifikuoti septyniasdešimt du iš jų sudaro 69 skirtingų baltymų rūšių. 1 lentelėje išvardytos Visi baltymų nustatytų peptidų atitikimo su Mascot paieškos algoritmą. Į baltymų profiliavimo tikslumas buvo įvertintas kaip rezultato vertę (virš 37). 1 pav (a) iš laivo kapitonas 2D gelio atvaizdas naviko audinyje, gautų iš pacientų, kurių skrandžio adenokarcinoma apžvalga. (B) ir (C) Sunumeruotos baltymų dėmės buvo žymimas LC-ESI-MS /MS ir baltymų atitikimas, kaip parodyta, kaip išsiplėtusios skaičiai.
1 lentelė Baltymų profilis aptikta naviko audinio, gautos iš Japonijos pacientui su skrandžio adenokarcinoma.
Taškinis Nr
prisijungimas skaičius

Baltymai identifikavimo

mišios
AB (%)
Pi
balas
1
24.308.169
axonemal sunkioji grandinė dynein tipo 3
473.776
0
6,04
37
2
15.010.550
šilumos šoko baltymas gp96 pirmtakas
90309
7 pervežimas 4.73
62 3 72.222
šilumos šoko baltymų 90 -β
83584
14
4,97
176
4
5.729.877
šilumos šoko 70 kDa baltymas 8 izoformos 1
71.082
19
5,37
283
5
38.044.288
gelsolin izoformos b
80.876
5
5.58
63
6 4.826.960
glutaminilo-tRNR
88.655
1
6.71
44
7
4.501.867
aconitase 2
86113
10
7.36
231
8
119717
ezrin
69470
7
5.94
75
9
4557871
transferrin
79280
9
6.81
97
10
16507237
heat šoko 70 kDa baltymą 5
72402 15
5.07
165
11 24.234.686
šilumos šoko baltymas 70 kDa baltymas 8
53.598
16
5.62
160
12
4.885.431
šilumos šoko 70 kDa baltymas 1B
70.267 11
143
13
1.082.886 pervežimas 5.48 naviko nekrozės faktoriaus 1 tipo receptorius susijęs baltymas TRAP-1
75694
13
8.43
288
14
31.542.947
chaperonin, mitochondrijų matrica baltymų P1, P60 limfocitų baltymų
61187
13
5,7
299
15
28.592
serumas albumin
71316
23
6.05
292
16
340219
vimentin
53738
18
5.03
79
17
4503729
similar į FK506 surišančio baltymo 4
49031
5
5.6
36
18
32709
IFP53
53559
21
5.93
277
19
4502643
chaperonin-containing TCP1, subunit6A (Dzeta 1)
58444
6
6.23
79
20 7.106.439
tubulino, β5
50095
14
4.78
125
21
37492
α-tubulin
50810
13
5.02
94
22
125604
pyruvate kinazės, M2 isozyme
58447
5
7.95
234
23
4557014
catalase
59947
6
6.9
120
24
4503483
eukaryotic vertimas pailgėjimo faktorius 2
96.246
4
6.41
56
25
179.279
ATF sintezės β subvieneto
56.861
5
5.39 pervežimas 59
26
7.657.041
žemyn reguliuojama metastazių
320.846
2
7,07 40 27 4.504.169
glutationo sintetazė, GSH synthetase
52523
5
5.67
99
28
12017952
GE36
73327
2
5.2
37
29
34234
laminin-binding baltymų
31.888 12
4,84
51
30
16.359.158
aktino, beta
42078
14
5.29
171
31
6.635.125
KIAA0284 baltymų
161.473
2
6.36
47
32
5.803.225
14-3-3 Epsilon
29326
8
4.63
49
33
4.504.707
inozitolis polifosfatas-4-fosfatazės, II tipo, 105 kDa
105.749
1
5.87
37
34
35.038.601
hipotetinę baltymų DKFZp761A078
74864
2
7.27
47
35
12017952
GE36
73327
1
5.2
38
36
4505877
plectin 1 izoformos 1
520111 1
5,57 38158018
44
37
centrosomal baltymas 1, Centriolė susijęs baltymas, centriolin
269874
1
5.44
39
38
30.157.438
BTD privalomas SR-kaip baltymų rA9
180240 pervežimas 1 pervežimas 9.15
41
39
4503471
eukariotinių vertimas pailgėjimo faktorius 1 α1
50.451 ATF sintezės
59.828
12
9,1
191
40
4.757.810
17
9,16
178
41
693.933
2-phosphopyruvate-hidratazės α-enolase
47421
22
7.01
240
42
123.576
47 kDa šilumos šoko baltymas pirmtakas
46352
14
8.27 pervežimas 177
43
5.032.069
sandūrų veiksnys 3B, subvieneto 4
44414
3
8,54
58
44
4.503.471
eukariotinių vertimas pailgėjimo faktorius 1 α1
50.451
4
9,1 pervežimas 47
45 5.921.789
citratas sintezės, mitochondrijų pirmtakas
51.959
12
8.13
114
46
4.505.763
phosphoglycerate kinazės 1
44.985
14
8,3
87
47
4.504.069
aspartato aminotransferazės 2 pirmtakas
47.844
6 pervežimas 9.14
52
48
7.669.492 pervežimas gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės
36201
13
8.57
49
49
4.757.756
aneksino A2
38808
9
7.57
87
50
6648067
malatas dehidrogenazės, mitochondrijų pirmtakas
35965 7
8.92
60
51
5.031.857
laktatdehidrogenazės
36950
6
8.44
43
52
238.427
Porin 31 HM
30.737
29
8.63
124
53
5.174.447
guaninas nukleotidų surišančio baltymo
35511
8
7,6
65 54 34.740.329
nevienalytė atominės ribonucleoprotein
A3
39799
7
9.1
43
55
4504983
galectin-3
26229
12
8.58
42
56
4504447
heterogeneous branduolinės ribonucleoprotein A2 /B1 izoformos A2
36041
7
8.67
40
57
86901
ATF priklausomus DNR helikazė RAP30 /74 grandininis RAP30
26350
3
9.46
41
58
230.445
karboanhidrazės Aš
28903
12
6.44
67
59
455739
karboanhidrazės II
29285 8
6.87
82 60
26.892.090
beta Gylių grandinės variantas
16101
40
7,86
121
61
34.709
mangano superoksido dismutazės
24.891 10
8.35
111
62
4.507.645
triosephosphate izomerazę 1
26.938
17
6.45
47
63
38.488.935
foveolin pirmtakas
20546
16
5.65
95
64
478.813
nonhistone chromosomų baltymų HMG 1
25.139
13
5.41 60
65
2.204.207
glutationo S-transferase
23595
34
5.43
73
66
178755
proapolipoprotein
28944
8
5.45
103
67
37267
transketolase
68435
4
7.9
59
68
189998
M2-type piruvato kinazės
58.447
10
7.95
157
69
825.605
glutationo S-transferazės
25650
10
8.51
65
Šie baltymai gali būti suskirstyti į keletą kategorijų, atsižvelgiant į jų funkcijas, įskaitant Citoskeletas baltymų, streso ir chaperoning baltymų, ūmios fazės baltymų, glikolizinių fermentų, fermentų, dalyvaujančių metabolizme ir ląstelių proliferaciją, naviko slopintuvas baltymų ir skrandžio-specifinių baltymų .
Bendros pakitimai baltymų raiškos tarp naviko ir nontumor audinių skrandžio vėžiu sergantiems pacientams
įvairovės pokyčių proteomes buvo aptikta tarp naviko ir nontumor audinius nuo pačių pacientų. Kaip parodyta 2 paveiksle, keletas paplitusių pakitimai buvo pastebėti tarp penkių Japonijos skrandžio vėžiu sergančių pacientų (bylos A iki E). Mangano superoksido dismutazės (MnSOD), nonhistone chromosomų baltymų HMG-1 (HMG-1), phosphoglycerate kinazės 1 (PGK-1), karboanhidrazės I ir II (CA I ir II), foveolin pirmtakas FOV (gastrokine-1), aspartato aminotransferazės 2 pirmtakas (AST) ir glutationo S-transferazės (PVM) eksponuojama bendrus pokyčius išraiškos tarp naviko ir nontumor audiniuose, įskaitant tarp nustatytų baltymų. buvo įrodyta baltymų ekspresija MnSOD ir HMG-1 turi būti iki reguliuojama tik navikų audiniuose, palyginti su į nontumor audiniuose. Kita vertus, CA I ir II, FOV, AST ir GST baltymai buvo atskleista būti žemyn reguliuojama naviko audiniuose. Kartus pokyčiai šių baltymų, lyginant su GAPDH išraiškos apibendrinti 2 lentelėje Ryškiausias sumažėjimas buvo parodyta FOV lygio visais atvejais. Dalyvavimo darbuotojų GST baltymų ekspresijos sumažinimo lygis, buvo beveik toks pat kaip, kad FOV (bylos B, D ir E), nors vienas nebuvo pastebėta, kad kitų dviejų atvejais. Kita vertus, į HMG-1 padidėjimas buvo pažymėta trimis atvejais (A, C, ir D), nors tokia išraiška skirtumas nebuvo pastebėtas kitų dviejų atvejais. MnSOD eksponuojami tendenciją didėti navikų audiniuose trijų pacientų (bylų A, C, ir D), bet santykinis sumažėjimas taip pat buvo pastebėtas byloje B. Kaip PGK-1, didelė santykių klosčių pokyčius baltymo raiškos ir buvo sunkiai pastebima patologinės rūšiavimas navikų. 2 pav Detali pakeitimo modelius baltymų. (A), Nontumor ir (B) naviko baltymų, įskaitant CAI (Nr.58), CAII (No.59), MnSOD (No.61), FOV (No.63), HMG-1 (No.64) ir GST (Nr.65). (C) Nontumor ir (D) naviko baltymų, įskaitant PGK-1 (46-ojoje), AST (Nr.47), ir GST (No.69). GAPDH, ratą, buvo naudojamas kaip pamatinio baltymo.
2 lentelė Fold pokyčius baltymų raiškos tarp nontumor ir navikų audiniuose, gautų iš penkių pacientų, sergančių skrandžio adenokarcinomos.
Baltymai

atvejis A
B atvejis
C
Byla D
Byla E

CA Aš
-6,5
-1,6
-3,3
-4,3
-2,6
CA II
-2.6
-1.3
-26
-4.3
-13
FOV
-13
-13
-26
*
-26
MnSOD
+1.7
-2.6
+6.5
+1.4
+1.1
HMG-1
+13
*
+3.7
+13
*
PGK1
+1.6
+1.1
-1.2
+2.6
-1.4
AST
-13
-1.6
-6.5
-3.7
-2.6
GST
*
-26
*
-13
-13
CA aš, karboanhidrazės I.
CA II, karboanhidrazės II.
FOV, foveolin pirmtako.
MnSOD, mangano superoksido dismutazės.
HMG-1, nonhistone chromosomų baltymų.
PGK1, phosphoglycerate kinazės 1.
AST aspartato aminotransferazės 2 pirmtakas.
PVM, glutationo S-transferazės.
*, nenustatyta.
RT-PGR analizė
pagal RT-PCR, pokyčius mRNR raiška navikas ir nontumor audinių gautų iš skrandžio vėžiu sergantiems pacientams buvo analizuojami baltymų, eksponavo pakeitimus baltymų raiškos, įskaitant FOV, MnSOD ir HMG-1. Kaip parodyta 3 paveiksle, FOV mRNR buvo žymiai sumažėjo navikų audiniuose, iš keturių ne visiems pacientams (bylos A, B, C ir E), o tai nebuvo aptikta arba nontumor arba navikų audiniuose, iš kitos pacientui (D variantas) , Kita vertus, MnSOD mRNR buvo žymiai padidėjusi keturių pacientų (bylos B, C, D ir E), nors buvo aptikta mažai skirtumas mRNR lygiu tarp nontumor ir navikų audiniuose, tuo atveju, jei. Tačiau buvo sunkiai pastebimas tarp HMG 1 mRNR ekspresijos ir patologinių fenotipų auglių santykiai. 3 pav palyginimas mRNR ekspresijos baltymų, greičiausiai susijusių su kancerogenezėje tarp nontumor ir navikų audiniuose, gautų iš penkių pacientų su skrandžio adenokarcinomos (atvejai nuo A iki E) RT-PCR metodu. N ir T nurodyti nontumor ir navikų audiniuose, atitinkamai.
Diskusijų
Šiame tyrime mes atlikto proteo analizę naviko ir nontumor audinių gautų iš Japonijos skrandžio adenokarcinoma sirgusių pacientų. Šešiasdešimt devyni skirtingi baltymai naviko audinyje nuo skrandžio vėžio atveju buvo identifikuojama 2D-EP ir LC-ESI-MS /MS, kuriame dalyvavo streso baltymų, HSP70, Hsp90 ir chaperonine turinčių TCP1 (BMT), savigynai; glikolitinių fermentai, triose fosfatas izomerazę 1, α-enolase ir PGK-1, augantis energijos poreikis; Citoskeletas baltymai, ezrin, gelsolin izoformos B ir vimentin; baltymų, dalyvaujančių ląstelių diferenciacijos ir proliferacijos, galectin-3 ir transferino; ir baltymų eksponuoti spėjamą navikas slopinamąjį aktyvumą, FOV. Daugelis iš šių baltymų buvo odurzeń su skrandžio adenokarcinomos, susijusių su kelis veiksmus ir veiksnius [18, 19] tumorigenezei.
Mes taip pat parodė, kad ekspresijos lygis kelių baltymų vėžinių audinių buvo paprastai pakeista penkių Japonijos pacientams, su skrandžio adenokarcinomos, palyginti su tais, į nontumor audiniuose. Bendras padidėjimas baltymų raiškos navikų audiniuose pasireiškė MnSOD, HMG-1 ir PGK-1, o bendras sumažėjimas navikų audiniuose pasireiškė regos lauko, GST ir AST
superoksido (O 2 . - ), laisvųjų radikalų, yra būtina, kad antimikrobinio veikimo granulocitų ir monocitų skaičių. Superoksido dismutazė (SOD) greitai pašalina perteklinį kiekį superoksido pagamintą streso ir biologinių reakcijų in vivo
per katalitinio superoksido konvertavimo H + H 2O 2 ir O 2. MnSOD, viena iš bausmė, yra mitochondrijoje ir prisideda prie mitochondrijų DNR apsaugos nuo sugadinimo. Buvo pranešta, kad didesnė raiška MnSOD į laipsnišką skrandžio vėžiu turėtų būti susijęs su 5 metų išgyvenamumas po operacijos [20] ir jautrumą chemoterapijai [21]. Šiame tyrime, baltymų ekspresija MnSOD buvo reguliuojama 4 iš 5 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, rodo į save apsaugoti atsakymą. Kita vertus, aukštyn-reguliavimas MnSOD navikų audiniuose, buvo manoma, kad trukdyti su veiksmingu chemoterapijos remiantis radikalų gamybos, kuri gali sukelti jautrumas, į vaistai nuo vėžio sumažėjimą ir nustatyti vėžio sunkumą.
HMG-1 reguliuoja įvairių genų transkripciją ir struktūrinę stabilizavimą chromosomų kaip DNR-surišančio baltymo. HMG-1 buvo pranešta būti susijęs su kancerogeninio poveikio ir metastazių gaubtinės ir tiesiosios žarnų bei krūties vėžio [22].
Transkripcinis iki-reguliavimo HMG-1 skrandžio vėžio taip pat buvo įrodyta [23]. Išraiška HMG-1 navikų audiniuose, buvo pasiūlyta, kad tai susiję su atsparumu ir cisplatinos [24]. Mes čia parodė į šio baltymo padidėjimas trimis atvejais.
PVM yra vaistas-metabolizmą fermentas, kuris katalizuoja redukuoto glutationo konjugacijos su narkotikais ir metabolitų, taip pat prisideda prie kancerogenų detoksikacijos. Todėl į aktyvumo mažėjimas gali būti rizikos veiksnys kancerogenezėje. Infekcija Helicobacter pylori buvo pranešta sukelti į GST išraiška [25] sumažėjimą, o tai rodo, kad į GST aktyvumo mažėjimas gali būti skrandžio kancerogenezėje priežastis. Šiame tyrime, A GST baltymo raiškos sumažėjimas buvo stebimas trimis atvejais. A GST baltymų ekspresijos sumaZejimas gali būti naudojamas kaip, skirto skrandžio navikų diagnostikos biožymens.
AST yra aminotransferazės, kad veikia amino rūgščių ir α-keto rūgšties, kad yra išplatintos žmogaus organais. AST išleistas į kraują dėl glaudesnio pralaidumą ir sunaikinimo audiniuose. Padidėjusi koncentracija AST baltymų buvo pranešta pacientams, sergantiems hepatitu, piktybiniais navikais, įskaitant hepatoma ir leuchemia kraujyje. Genų ekspresija GST taip pat buvo įrodyta, kad iki-reguliuojami storosios žarnos navikų audiniuose [26]. Tačiau AST baltymų raiškos sumažėjimas paprastai stebimas visų navikų audiniuose, gautų iš šių penkių pacientų, sergančių skrandžio adenokarcinomos. Toliau tyrimas turėtų būti atliktas išsiaiškinti, ar AST baltymų sumažėjimas yra specialiai pastebėtas skrandžio navikų audiniuose, ar ne.
Padidėjusi išraiška PGK-1, kuris yra vienas iš glikolizinių mechanizmo fermentų ir kuris katalizuoja dephosphorylation 1,3-bisphosphoglycerate gaminti ATP, buvo pastebėta, daugelyje piktybinių navikų audiniuose, kurie yra priklausomi nuo ATP kaip vienos iš pagrindinių energijos šaltinio. Solidinių navikų yra manoma, kad reikia ATF perprodukcija palaikyti sustiprintą platinimu. Up-reguliavimas glikolizinių fermentų, įskaitant PGK-1 plaučių vėžiu [27] ir P2 tipo piruvato kinazės kolorektalinio vėžio [28], buvo pranešta ir pasiūlė būti naudinga vėžio. Tačiau šiame tyrime, didelė santykis PGK-1 baltymo raiškos ir skrandžio adenokarcinomos fenotipų buvo sunkiai aptinkamas. Todėl PGK-1 buvo laikomas, kad būtų netinka su skrandžio vėžio diagnozę.
Karboanhidrazės (CA), yra cinko, kurių sudėtyje yra fermentų, kurie yra paskirstyti plačiai įvairiuose organuose, sudaryti didelę šeimą, įskaitant CA-I CA -IX. Jie katalizuoja CO 2 už tarpinį metabolizmą hidrataciją ir išlaikyti pH ir jonų pusiausvyrą organizme. Iki šiol tiesioginis ryšys buvo įrodyta, tarp piktybinę transformaciją ir baltymų išraiškos KI I per VII [29]. Du ankstesni tyrimai atskleidė, kad tiek CA-I ir CA-II išraiška buvo žymiai sumažintas storosios žarnos navikų, palyginti su įprastu storosios žarnos epitelyje ar gleivinės [30]. Kitoje ataskaitoje pateikti rezultatai parodo, kad sumažintas išraiška CA-I ir CA-II buvo susietas su biologinės agresyvumo tiesiosios žarnos vėžio ir sinchroninio tolimoje metastazių [31]. Kaip siūloma anksčiau [32], skrandžio ir storosios žarnos karcinomos gali keistis mechanizmas toks pat, ląstelių proliferaciją ir gleivinės piktybinių navikų, ir gali tapti biologinis už šių karcinomų, nes bendros sumažėjęs baltymų ekspresijos CA-I ir CA-II taip pat buvo pastebėta šiame tyrime.
FOV, kuri yra identiška skrandžio konkrečių 18-kDa Ertmė gleivinės baltymo! (MVP-18) [33, 34], GKN1 [35], ir trilapis faktorius sąveika (Z) (TFIZ) [36], buvo įrodyta, kad žymiai žemyn reguliuojama arba nėra skrandžio adenokarcinoma sirgusių pacientų, šiame tyrime. Žmogaus AMP-18 ir žmogaus carcinoantigenic CA11 geno produktas, kuris koduoja aminorūgščių seką, kuri skiriasi nuo AMP-18 tik vieną liekaną [37, 38], funkciją kaip išskiriami augimo faktorių iš dalies, atsakingų už išlaikyti normalų funkcinį skrandžio epitelio [33]. Tiek AMP-18 ir CA11 geno produktas buvo pranešta, kad intensyviai išreikštas įprastais skrandžio audinio, bet ne dauguma skrandžio vėžio [33, 37, 38]. Imunohistocheminiais tyrimai parodė, kad AMP-18 atrodo esantis gleivinės epitelio ląstelių normaliam žmogaus skrandžio ir dvylikapirštės žarnos antralinėje dalyje [33]. Neseniai TFIZ buvo įrodyta, kad veikia kaip augimo reguliatorius skrandžio epitelinių ląstelių sukuriant heterodimero formavimo su trilapis 1 faktoriaus (TFF1) [36]. Mūsų pateikti duomenys dar kartą patvirtino aukštą raišką FOV į nontumor skrandžio audinių ir didelį kritimą iš skrandžio adnocarcinomas baltymų, nurodant, kad FOV žaisti vaidmenis normalaus diferenciacijos epitelio ląstelių ir navikų slopinimo priežiūros, bet ne tik navikų audiniuose. Be to, mes parodė, kad transkripcija regos lauko mRNR taip pat buvo dažniausiai žemyn reguliuoja skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, nurodant, kad žymiai sumažėjo regos lauko baltymų sukėlė slopinimo regos lauko genų ekspresiją. Be to, vienam pacientui baltymas nebuvo aptikta nontumor audiniuose, o tai rodo, kad pasakymas lygis regos lauko baltymų asmenims gali nustatyti skrandžio adenokarcinoma fenotipą. Todėl pasakymas lygis FOV kaip biologinis žymuo gali būti informatyvus, kad skrandžio vėžio vertinimą.
Išvada
baltymų profiliavimo naviko ir nontumor audinių gautų iš Japonijos pacientams su skrandžio adenokarcinoma buvo atliekama naudojant 2D-EP ir LC- "ESI-MS /. Nustatyti baltymų įtraukti molekulinius šaperonų, energijos gamybos fermentus, citoskeleto baltymus, ir taip toliau. Dažnas baltymų pakitimai buvo aptikti skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Baltymų išraiška MnSOD ir HMG-1 buvo iki reguliuojama, o kad GST, AST ir FOV buvo žemyn reguliuoja skrandžio navikų audiniuose. Koreliacijos tarp šių baltymų pakeitimo ir jų transkripcijos raiškos skrandžio vėžio buvo sunkiai pastebima šiame tyrime, išskyrus į FOV atveju. Tiek baltymų ir genų ekspresija FOV, skrandžio konkrečių sekretuojančia augimo faktoriaus įprastoms skrandžio epitelinių ląstelių, buvo ženkliai žemyn reguliuojama navikų audiniuose, gautų iš Japonijos pacientams su skrandžio adenokarcinomos. Monitoringas raiškos lygių šiame skrandžio-specifinio baltymo klinikinių mėginių gali suteikti naudingos informacijos dėl skrandžio vėžio diagnozę kaip specifinės biologinis žymuo ir geriau suprasti skrandžio kancerogenezėje.
Metodai
medžiagos
dezoksiribonukleazė aš, RNazės A, 2-merkaptoetanolio (2-ME), stiklo karoliukų (212-300 mkm), Nonidet P-40, akrilamido, N, N, N-', N'
-tetramethylenediamine (TEMED), natrio dodecilsulfatas (SDS ), iodoacetamide ir DTT (DTT) buvo nupirkta iš Sigma (St Louis, MO). Agarozės už izoelektroninėje dėmesio (ief) ir Pharmalyte pi 3-10, 4-6,5 ir 8-10,5 buvo iš Amersham biologijos mokslų (Piscataway, NJ). Tripsino (sekos laipsnio) buvo iš Roche (Manheim, Vokietija). Fenilmetilsulfonilfluoridą (PMSF), tiokarbamidas, sorbitolis, natrio pirofosfato, amonio persulfatas, D, L-asparto rūgštis, trichloracto rūgšties, sulfosalicilo rūgšties dihidratas, acto rūgštis, acetonitrilo, skruzdžių rūgštis ir trifluoracto rūgšties (TFA) buvo iš WAKO Pure cheminių medžiagų (Osaka , Japonija). Karbamidas buvo iš Katayama Cheminės medžiagos (Osaka, Japonija). Pepstatin A ir leupeptiną buvo iš peptido instituto (Osaka, Japonija). NH 4HCO 3 ir N, N-metilenbisakrilamido buvo iš Nacalai Tesque (Kiotas, Japonija). CBB R-250 buvo iš TKT Biomedicals Inc. "(Aurora, OH). Molekulinė masė standartai buvo iš APRO mokslo, Inc (Tokushima, Japonija). TRIZOL reagentas buvo iš Gyvosios technologijų (Frederick, MD). Oligo (dT) 12-18 gruntas, deoksinukleotidai (dNTP) ir RNaseOUT buvo iš Invitrogen (Carlsbad, CA). M-MLV atvirkštinės transkriptazės ir Taq DNR polimerazė buvo iš PROMEGA (Madison, WI).
Audinių ir bandinių paruošimas
pirminis skrandžio adenokarcinomos ir gretimų nontumor gleivinės buvo surinkti pašalintas skrandis ir teikia Chirurgijos katedros, aukštosios mokyklos medicinos, iš Tokushima universitetas, Tokushima, Japonija. Tyrimas buvo atliktas laikantis Helsinkio Pasaulio medicinos asociacijos deklaracijos ir buvo patvirtintas etikos komiteto prie Tokushima universitete. Informuotas sutikimas taip pat buvo suteiktas visų pacientų, kurie pateikė klinikinius mėginius. Audiniai buvo įšaldyti sausoje ledo metanolio vonioje kaip galima greičiau po skrodimo ir saugomi šaldiklis (-80 ° C), prieš naudojimą. Dėl iRNR analizės, audiniai buvo pirmas panardintas RNAlater (TAKARA, Tokijas, Japonija) Prieš užšalimo. Detali klinikos duomenis, įskaitant naviko stadijos (pagal AJCC sistemos), svetainėje ir diferenciacijos ir histologinių duomenų apie audinių pavyzdžių yra išvardytos lentelėje 3. Nė vienas iš šių atvejų buvo suskirstyti į Tarpikliai tipo kategorijos ir vėžinių audinių aiškiai distinguishted iš ir ne auglio vieną kiekvienu atveju. Dvimatis gelio elektroforezės (2D-EP), baltymų išsiurbti iš audinių atliko šią procedūrą. Šaldytos blokai (20-30 mg drėgno produkto svorio) buvo homogenizuoti su plastikiniu grūstuvu (Toyobo, Tokijas, Japonija) į stiklo karoliukų akivaizdoje 10 vol /šlapio svorio dializės buferiu, kurį sudaro 5 m karbamido, 1 m tiokarbamido 10 mm NAPPI , 1.67 pL /ml 2-ME, 0,005% dezoksiribonukleazė I 0,05 mg /ml RNazės A, 20 mkm leupeptiną, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF ir 20 pM pepstatinA, ir tada centrifuguojamas 50,000 apsisukimų per minutę 30 min, esant 4 ° C (Beckman -Coulter Fullerton, CA). Gautas supernatantas buvo naudojamas kaip audinių ekstrakto. Baltymų koncentracija buvo nustatoma su Bradfordo baltymų bandymo komplektas (Bio-Rad, Heraklis, CA), naudojant galvijų gama globulino kaip standard.Table 3 klinikiniais požymiais pacientams, sergantiems skrandžio adenokarcinomos.
Case

Age

Sex

Locationa

Gradeb

Stage


A
63
Male
UM
G3
IIIA
T2N2M0H0
B
68
Female
L
G2
II
T2N2M0
C
76
Male
ML
G2
IV
T4N3M0
D
78
Female
L
G2
III
T2N0M0H0
E
77
Male
ML
G2
II
T2N1M0
Au: viršutinis M: viduryje L: mažesnės
BG2: vidutiniškai diferencijuoti, G3 ". prastai diferencijuotas
Dviejų dimesional gelio elektroforezės
2D-EP buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [39]. Pirmasis-matmenų izoelektrinio fokusavimo buvo atliekami išlaikant 1% (m /t) agarozės gelio (φ 2,6 × 180 mm), kurio pH 3-10 gradiento 700 V 18 val, esant 4 ° C, o antrasis-matmenų SDS gelio elektroforezės buvo atliekamas su 5-15% (m /t) akrilamido gradientas (m
r diapazonas, 6-200 kDa) standartiniame plokščių gelio (20 × 13 cm), esančio 15 mA 3 h, ir tada esant 70 mA 2 valandas kambario temperatūroje. Geliai buvo tamsintas su CBB R-250.
Baltymų mėginius (500 mikrogramų), gautas iš naviko centro ir aplinkinių histologiškai normalų gleivinę buvo atliktas 2D-EP ir paleisti poromis šalia kito.
Kai tamsintas dėmės buvo pašalintų iš 2D-gel, in-gelio suardomas su tripsino ir tada taikomos LC-ESI-MS /MS analizę, kaip aprašyta anksčiau [40]. Peptidas mišinys atskiriamas su atvirkštinių fazių nanoLC sistemos (Famous, Swichos II, "Ultimate" LC supakuotos, Sunnyvale, CA). Išplautos peptidai buvo purškiamas tiesiai į ESI masės spektrometru (Esquire3000 Plus, Brukher-Daltonics, Fremont, Kalifornija).
Didelės apimties MS /MS duomenimis buvo įsigyta su DataAnalysis 3.1 programinės įrangos (Brukher-Daltonics), konvertuoti į tekstą failai sąrašo masinius vertybes patronuojančių jonais ir intensyvumas ir mases fragmentui jonais, tada tvarkomi su Mascot algoritmas (Matrica Mokslas LTD, Londonas, Didžioji Britanija) priskirti peptidai į NCBI ne nereikalingas sekos duomenų bazę, naudojant taksonominė apribojimas, 'žmogus'. Duomenų bazė Paieška buvo atlikta su apibūdintų Yoshimura et al parametrus. [40].
Vaizdo analizė ir MS peptidas sekos
Vaizdo įgijimą ir analizę atlikti su molekulinės Rodymo FXProPlus (Bio-Rad) ir ImageMaster programinės įrangos (Bio-Rad). Buvo palygintos gelio vaizdų naviko ir suderinti nontumor pavyzdžių pora iki pora. Normalizuota apimties skirtumai statistiškai apskaičiuota visais penkiais atvejais. Iš gliceraldehid 3-phosphodehydrogenase (GAPDH) baltymų kiekis buvo naudojamas kaip nuoroda į įvertinti kartus keitimo baltymų raiškos tarp naviko ir suderinti nontumor audiniai kaip GAPDH mRNR ir baltymų lygių buvo nepasikeitė tarp audinių, gautų iš pacientų. Nuosekliai ir žymiai įvairių dėmių buvo atrinkti analizei LC-ESI-MS /MS. Baltymų dėmės! Buvo iškirpti iš geliai smulkiais gabaliukais, ir veikiamas in-gelis triptinio virškinimo nakties [40]. Peptidų masių spektrai buvo registruojami ir buvo naudojami parametrai spektrų įsigijimo, kaip nurodyta anksčiau [40]. Tikslumas duomenų baltymų atitikimo naudojant Mascot paiešką [41] buvo vertinami kaip rezultatas per 37, kurie buvo gautas dauguma analizių.
RNR išskyrimo ir PGR analizė
naviką ir atitiko nontumor 50 mėginiai (maždaug. mg šlapio svorio) buvo smulkinta, ir tada homogenizuojami rankiniu būdu 1 ml TRIZOL reagento (Invitrogen) ant ledo. RNR buvo išskirtas be gydymo dezoksiribonukleazė I pagal gamintojo protokolą. Trumpai, 0,2 ml CHCI 3 buvo įtraukta į homogenato, o po to centrifuguojant 20,600 × g 15 min. Tokį patį tūrį 2-propanolio buvo įtraukta į gauto skysčio virš nuosėdų nusodinti RNR. Po centrifugavimo, granulių praplautos 75% etanolio /diethylpyridylchloride (DEPC) gydomiems vandens, po to džiovinant. Granulių buvo tirpinamos atitinkamame tūrio DEPC apdoroto vandens, kaip bendra RNR frakciją. Už atvirkštinės transkripcijos (RT), 2 mikrogramai RNR nuo kiekvieno mėginio buvo užprotokoluojami 37 ° C temperatūroje 1 h, kai 200U iš Molony leukemijos viruso atvirkštinės transkriptazės buvimą (Promega), oligo (dT) 12-18 gruntas, 0.5 mm dNTP ir 50U iš RNaseOUT.

• Žemyn reguliavimas Thrombospondin2 prognozuoja prastą prognozę pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu
• Katecholaminų iki-reguliuoja MMP-7 išraišką aktyvuojant AP-1 ir stat3 skrandžio vėžio