alteración de proteómica en los adenocarcinomas de gastic patients

japonesa proteómicos alteración en los adenocarcinomas gastic de pacientes japoneses
Resumen Antecedentes

adenocarcinomas gástricos comprenden uno de los tipos más comunes de cáncer en los países asiáticos, incluyendo Japón. perfiles de proteínas integral de especímenes quirúrgicos pareadas de adenocarcinomas gástricos primarios y no tumoral mucosas derivados de pacientes japoneses se llevó a cabo por medio de electroforesis bidimensional en gel (2D-EP) y tándem iónico espectrometría de masas de cromatografía de electrospray líquido (LC-ESI-MS) para establecer las proteínas específicas del cáncer gástrico como biomarcadores clínicos putativos y dianas moleculares para la quimioterapia.
: resultados de la alteraciones relativamente común en la expresión de proteínas fueron reveladas en los tejidos tumorales. Se observaron aumentos en la superóxido de manganeso y la proteína cromosómica nonhistone HMG-1 (HMG-1), mientras que las disminuciones en anhidrasas carbónicas I y II, glutatión-S-transferasa y precursor foveolin (gastrokine-1) (FOV), con el estómago 18-kDa proteínas específicos de la actividad supresora de tumores putativo, se detectaron. RT-PCR análisis también reveló significativa baja regulación de la expresión de ARNm FOV en los tejidos tumorales.
Conclusión
Un posible papel patológico de la baja regulación de FOV en la carcinogénesis gástrica se demostró. Evaluación de las disminuciones específicas en el gen y la proteína de expresión de FOV en pacientes se puede utilizar como biomarcadores clínicos para el diagnóstico y evaluación del cáncer gástrico eficaz.
Antecedentes
adenocarcinomas gástricos comprenden uno de los tipos comunes de cáncer en los países asiáticos, incluyendo Japón, siendo sólo superada por el cáncer de pulmón en cuanto al número de muertes que provoca. A pesar del reciente desarrollo de técnicas de diagnóstico, la mayoría de los pacientes con cáncer gástrico se diagnostica en una etapa avanzada y tienen una tasa de supervivencia a cinco años es muy baja (menos del 10%) [1]. Esto se debe en parte a la falta de biomarcadores específicos y sensibles para el diagnóstico y seguimiento de progreso de la enfermedad en una etapa temprana, a pesar de algunos marcadores tumorales gástricas, incluyendo el antígeno carcinoembrionario, se han utilizado y son parcialmente eficaces. Como la carcinogénesis gástrica es un proceso de múltiples pasos, también se requiere un análisis exhaustivo de los casos individuales, en los que diferentes eventos moleculares que ocurren en cada proceso carcinogénico.
Recientemente, se utilizó el análisis proteómico para examinar exhaustivamente la expresión de proteínas en los fluidos corporales, tejidos y células [ ,,,0],2-4]. Este enfoque, como la proteómica clínica, es muy útil para la identificación de proteínas asociadas a la enfermedad que muestran cambios en la expresión y modificación correspondientes a una condición de la enfermedad [5, 6]. Se espera que estas proteínas relacionadas con la enfermedad que ser biomarcadores para el diagnóstico y proteínas específicas para el tratamiento putativo [7-9]. Por otro lado, el análisis exhaustivo de transcriptomes en los tejidos tumorales de varios pacientes con cáncer utilizando microarrays de ADN y chips de genes se han realizado en los últimos años [10]. Sin embargo, la falta de correlación entre los cambios en los ARNm y la carcinogénesis se ha demostrado, y los cambios cuantitativos y cualitativos de-traduccionalmente enviar proteínas modificadas como productos génicos finales se considera que es más informativo que los de los ARNm en los tejidos tumorales para el estudio de los acontecimientos moleculares en carcinogénesis. Los estudios proteómicos para la identificación de proteínas asociadas a tumores en el cáncer gástrico están aumentando, y las bases de datos del proteoma de los tejidos gástricos [11] y las líneas celulares [12] se han construido. La mayoría de ellos se refieren a proteínas o antígenos específicos que reflejan las propiedades quimio y termo-resistentes de cáncer de estómago [13-15], y que están asociadas con Helicobacter pylori
[16, 17]. En el presente estudio, se realizó el análisis del proteoma completo de tejidos tumorales y no tumorales en pacientes japoneses con carcinomas gástricos, y se identificaron varias proteínas de las que los niveles de expresión son comúnmente alterados en casos clínicos. En particular, se sugirió la expresión de gastrokine-1 (GKN-1) estar bajo el control tanto de la transcripción y traducción.
Resultados
Separación de proteínas y la identificación
Figura 1A muestra una perspectiva general de imagen de un gel típico maestro para un tejido tumoral gástrico. Alrededor de 200 puntos de proteínas teñidas con azul brillante de Coomassie (CBB) R-250 estaban bien separados en los geles. Los puntos numerados en la Figura 1B y 1C se escindieron de un gel, se trató con tripsina y se sometieron después a espectrómetro de masas de cromatografía de electrónica de ionización por pulverización tándem líquido análisis (LC-ESI-MS /MS). Se identificaron setenta y dos de ellos en representación de 69 especies diferentes de proteínas. La Tabla 1 enumera todas de las proteínas identificadas mediante el cotejo de péptido con el algoritmo de búsqueda de la mascota. La precisión en perfiles de proteínas se evaluó como el valor de puntuación (por encima de 37). Figura 1 (A) Una visión general de una imagen de gel 2D maestro para tejido tumoral derivada de un paciente con un adenocarcinoma gástrico de. (B) y (C) Las manchas de proteínas numeradas se identificaron mediante LC-ESI-MS /MS y la coincidencia de proteínas, como se muestra como figuras agrandadas.
Tabla perfil 1 proteína detectada en el tejido tumoral derivada de un paciente japonés con un gástrico adenocarcinoma.
número de acceso del punto Nº
identificación de proteínas

masa
SC (%) Guía empresas pI
Puntuación
1 | 24308169
axonémica cadena pesada dineína tipo 3
473.776
0
6,04
37
2 15010550
proteína de choque térmico precursora gp96
90309 página 7
4,73
62 página 3
72222
proteína de choque térmico 90 -β
83584 página 14
4,97
176
4 de 5.729.877
choque térmico de 70 kDa proteína isoforma 8 1 | 71082 página 19
5,37
283 página 5
38044288
gelsolina isoforma b
80876 página 5
5,58
63 página 6
4826960
glutaminil-ARNt sintetasa
88.655
1 | 6,71
44 página 7
4501867
aconitasa 2
86113
10
7.36
231
8
119717
ezrin
69470
7
5.94
75
9
4557871
transferrin
79280
9
6.81
97
10
16507237
heat choque 70 kDa proteína 5
72402
15
5,07
165 página 11
24234686
proteína de choque térmico de 70 kDa proteína 8
53598
16
5,62
160 página 12
4885431
choque térmico de 70 kDa proteína 1B
70267 página 11
5,48
143 página 13
1082886
tumoral necrosis factor de tipo 1 receptores asociados a proteínas TRAP-1 | 75694 página 13
8,43
288 página 14
31542947
chaperonina, proteína de la matriz mitocondrial P1, la proteína P60 de linfocitos
61187 página 13
5,7
299
15
28592
suero albumin
71316
23
6.05
292
16
340219
vimentin
53738
18
5.03
79
17
4503729
similar a la proteína de unión a FK506- 4
49031
5
5.6
36
18
32709
IFP53
53559
21
5.93
277
19
4502643
chaperonin-containing TCP1, subunit6A (zeta 1)
58444 página 6
6,23
79
20
7106439
tubulina, β5
50095
14
4.78
125
21
37492
α-tubulin
50810
13
5.02
94
22
125604
pyruvate quinasa, M2 isozyme
58447
5
7.95
234
23
4557014
catalase
59947
6
6.9
120
24
4503483
eukaryotic factor de elongación de la traducción 2
96.246
4 de 6,41
56
25
179.279
ATP sintasa β subunidad
56861 página 5
5,39
59
26
7657041
las reguladas en la metástasis
320846
2 7,07
40
27
4504169
glutatión sintetasa, GSH synthetase
52523
5
5.67
99
28
12017952
GE36
73327
2
5.2
37
29
34234
laminin-binding
proteína 31888 página 12
4,84
51
30
16359158
actina, beta
42078 página 14
5.29
171
31
6.635.125 proteína KIAA0284

161.473
2 6,36
47
32
5803225
14-3-3 épsilon
29326
8
4,63
49
33
4504707
inositol polifosfato-4-fosfatasa, tipo II, 105 kD
105749
1 | 5,87
37
34
35038601
proteína hipotética DKFZp761A078
74864
2
7.27
47
35
12017952
GE36
73327
1
5.2
38
36
4505877
plectin 1 isoforma 1 | 1 | 520111
5,57
44
37
38158018
proteína centrosómicas 1, proteína asociada centríolo, centriolin
269.874
1 | 5.44
39
38
30157438
CTD-unión SR-como la proteína RA9
180.240
1 | 9.15
41
39
4503471
traducción eucariótica factor de elongación 1 α1
50451 página 12
9.1
191
40
4757810
ATP sintasa
59828
17
9.16
178
41
693,933 página 2-fosfopiruvato-hidratasa α-enolasa
47421
22
7,01
240
42
123576
47 kDa precursor de la proteína de choque térmico
46352 página 14
8,27
177
43
5032069
empalme del factor 3b, 4 subunidad
44414 página 3
8,54
58
44
4503471
eucariótica factor de elongación de la traducción 1 α1
50451
4 de 9.1
47
45
5921789
citrato sintasa, precursor mitocondrial
51959 página 12
8.13
114
46
4505763
fosfoglicerato quinasa 1 | 44985 página 14
8.3
87
47
4504069
aspartato aminotransferasa 2 precursora
47844 página 6
9.14
52
48
7669492
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
36201 página 13
8,57
49
49
4757756
anexina A2
38808 página 9
7,57
87
50
6648067
malato deshidrogenasa, precursor mitocondrial
35965 página 7
8,92
60
51
5031857
lactato deshidrogenasa Un
36950 página 6
8,44
43
52
238.427
porina 31 HM 30737

29
8,63
124
53
5174447
guanina nucleótidos vinculante proteínas
35511 página 8
7,6
65
54
34740329
ribonucleoproteína nuclear heterogénea A3
39799
7
9.1
43
55
4504983
galectin-3
26229
12
8.58
42
56
4504447
heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 /B1 A2 isoforma
36041 página 7
8,67
40
57
86901
dependiente de ATP ADN helicasa RAP30 /74 RAP30 cadena
26350
3
9,46
41
58
230.445
anhidrasa carbónica I
28903 página 12
6,44
67
59
455739
anhidrasa carbónica II
29285 página 8
6,87
82
60
26892090
variante de la cadena beta-globina
16101
40
7,86
121
61
34709
manganeso superóxido dismutasa
24891
10
8,35
111
62
4507645
triosafosfato isomerasa 1 | 26938
17
6,45
47
63
38488935
foveolin precursor
20546
16
5,65
95
64
478 813
proteína no histona cromosómica de la HMG-1 | 25139 página 13
5,41
60
65
2204207
glutatión S-transferase
23595
34
5.43
73
66
178755
proapolipoprotein
28944
8
5.45
103
67
37267
transketolase
68435
4
7.9
59
68
189998
M2-type piruvato quinasa
58447
10
7,95
157
69
825.605
glutatión S-transferasa
25650
10
8,51
65
Estas proteínas se pueden clasificar en varias categorías en función de sus funciones, incluyendo proteínas del citoesqueleto, proteínas relacionadas con el estrés y chaperones, proteínas de fase aguda, las enzimas glucolíticas, enzimas implicadas en el metabolismo y la proliferación celular, proteínas supresoras de tumores y proteínas-estómago específica . se detectaron alteraciones
comunes de la expresión de la proteína entre tumor y no tumoral tejidos en pacientes con cáncer gástrico
diversas alteraciones en proteomas entre tumor y no tumoral tejidos de los mismos pacientes. Como se muestra en la Figura 2, se observaron las varias alteraciones comunes entre en cinco pacientes con cáncer gástrico japoneses (casos A a E). El manganeso superóxido dismutasa (MnSOD), proteína cromosómica nonhistone HMG-1 (HMG-1), fosfoglicerato quinasa 1 (PGK-1), la anhidrasa carbónica I y II (CA I y II), foveolin precursor FOV (gastrokine-1), aspartato aminotransferasa 2 precursor (AST), y glutatión S-transferasa (GST) exhibieron cambios comunes en la expresión entre los tejidos tumorales y no tumorales, incluso entre las proteínas identificadas. La expresión de la proteína de MnSOD y HMG-1 se demostró que hasta reguladas en los tejidos tumorales en comparación con tejidos no tumorales en. Por otro lado, el CA I y II, FOV, AST y proteínas GST se revela como las reguladas en los tejidos tumorales. Los cambios veces en la expresión de estas proteínas con respecto a la de GAPDH se resumen en la Tabla 2. La más notable disminución se muestra en el nivel de FOV en todos los casos. El grado de la disminución de la expresión de la proteína GST fue casi el mismo que el de FOV (Casos B, D, y E), aunque no se observó en los otros dos casos. Por otro lado, el aumento de la HMG-1 fue marcado en tres casos (A, C, y D), aunque tal diferencia en la expresión no se observó en los otros dos casos. MnSOD mostró una tendencia a aumentar en los tejidos tumorales de tres pacientes (casos A, C, y D), pero una disminución relativa también se observó en el asunto B. En cuanto a PGK-1, una relación significativa entre los cambios veces en la expresión de proteínas y apenas se observó la clasificación patológica de los tumores. Figura 2 patrones de alteración detalladas de las proteínas. (A) no tumoral y (b) las proteínas de tumores incluyendo CAI (No.58), CAII (No.59), MnSOD (No.61), FOV (No.63), HMG-1 (N ° 64), y GST (No.65). (C) no tumoral y (D) las proteínas de tumores incluyendo PGK-1 (No.46), AST (No.47) y GST (No.69). GAPDH, marcadas con un círculo, se utilizó como proteína de referencia.
Tabla 2 veces los cambios en la expresión de proteínas entre los tejidos no tumorales y tumorales derivadas de cinco pacientes con adenocarcinomas gástricos.
proteína Venta de CASE Una Venta de CASE B Venta de CASE C Venta de CASE D Venta de CASE E

CA I
-6.5 -1.6

-3.3 -4.3

-2.6 hotels, CA II
-2.6
-1.3
-26
-4.3
-13
FOV
-13
-13
-26
*
-26
MnSOD
+1.7
-2.6
+6.5
+1.4
+1.1
HMG-1
+13
*
+3.7
+13
*
PGK1
+1.6
+1.1
-1.2
+2.6
-1.4
AST
-13
-1.6
-6.5
-3.7
-2.6
GST
*
-26
*
-13
-13
CA I, anhidrasa carbónica I. II hotels, CA, anhidrasa carbónica II.
FOV, precursor de foveolin.
MnSOD, manganeso superóxido dismutasa.
HMG-1, proteínas cromosómicas no histona.
PGK1, fosfoglicerato quinasa 1.
AST, aspartato aminotransferasa 2 precursora.
GST, glutatión S-transferasa.
*, no determinado.
análisis RT-PCR fotos: por RT-PCR, los cambios en el ARNm expresión en tejidos tumorales y no tumorales derivadas de pacientes con cáncer gástrico se analizaron para las proteínas que exhiben alteraciones en la expresión de proteínas, incluyendo FOV, MnSOD y HMG-1. Como se muestra en la Figura 3, FOV ARNm se redujo significativamente en los tejidos tumorales en cuatro en todos los pacientes (casos A, B, C, y E), mientras que no se detectó en cualquiera de los tejidos no tumorales o tumorales de otro paciente (caso D) . Por otro lado, MnSOD mRNA se incrementó notablemente en cuatro pacientes (casos B, C, D, y E), aunque se detectó una pequeña diferencia en el nivel de mRNA entre los tejidos no tumorales y tumores en el caso A. Sin embargo, apenas se observó una relación entre la HMG-1 la expresión de ARNm y los fenotipos patológicos de tumores. Figura 3 Comparación de la expresión de mRNA de las proteínas, posiblemente asociado con la carcinogénesis entre los tejidos no tumorales y tumorales derivadas de cinco pacientes con adenocarcinomas gástricos (casos A a E) por RT-PCR. N y T indican los tejidos no tumorales y tumorales, respectivamente.
Discusión En este estudio se realizó un análisis proteómico de tejidos tumorales y no tumorales derivadas de pacientes con adenocarcinoma gástrico japoneses. Sesenta y nueve proteínas diferentes en el tejido tumoral de un caso de cáncer gástrico fueron identificados por 2D-EP y LC-ESI-MS /MS, que incluye proteínas de estrés, Hsp70, Hsp90 y TCP1 contiene chaperonine-(CCT), de autoprotección; enzimas glucolíticas, triosa fosfato isomerasa 1, α-enolasa y PGK-1, por la creciente demanda de energía; proteínas del citoesqueleto, ezrin, gelsolina isoforma b y vimentina; proteínas implicadas en la diferenciación celular y la proliferación, la galectina-3 y transferrina; y las proteínas que presentan actividad supresora de tumores putativo, FOV. Muchas de estas proteínas se han notificado a estar asociado con la tumorigénesis de los adenocarcinomas gástricos que implican múltiples pasos y factores [18, 19].
También demostramos que los niveles de expresión de varias proteínas en los tejidos tumorales fueron comúnmente alterados en cinco pacientes japoneses con adenocarcinomas gástrico, en comparación con los tejidos no tumorales. Un aumento común en la expresión de proteínas en los tejidos tumorales se produjo por MnSOD, inhibidores de la HMG-1 y PGK-1, mientras que una disminución común en los tejidos tumorales se produjo por FOV, GST y AST
superóxido (O 2 . - ), un radical libre, es esencial para la acción anti-microbiana de los granulocitos y monocitos. La superóxido dismutasa (SOD) elimina rápidamente el exceso de cantidad de superóxido producido en las reacciones de estrés y biológicos in vivo
a través de la catálisis de la conversión de superóxido con H + para H 2O 2 y O 2. MnSOD, uno de los SOD, se encuentra en las mitocondrias y contribuye a la protección del ADN mitocondrial de los daños. Se ha informado de que el aumento de la expresión de MnSOD en el cáncer gástrico progresiva debe estar relacionada con la tasa de supervivencia a los 5 años después de la cirugía [20] y la sensibilidad a la quimioterapia [21]. En este estudio, la expresión de proteínas de MnSOD fue regulada hasta en 4 de 5 pacientes con cáncer gástrico, lo que sugiere una respuesta auto-protección. Por otra parte, la sobre regulación de MnSOD en los tejidos tumorales se ha considerado para interferir con la quimioterapia eficaz, basado en la producción de radicales, lo que puede causar una disminución en la sensibilidad a fármacos contra el cáncer y determinar la gravedad del cáncer.
HMG-1 regula la transcripción de diversos genes y la estabilización estructural de los cromosomas como una proteína de unión a ADN. HMG-1 Se ha informado de estar asociado con la carcinogénesis y la metástasis en el cáncer colorrectal y de mama [22].
Transcripcional regulación de HMG-1 en el cáncer gástrico también se ha demostrado [23]. Se sugirió Expresión de HMG-1 en los tejidos tumorales que estar relacionado con la resistencia a cisplatino [24]. Hemos demostrado aquí un aumento de esta proteína en tres casos.
GST es una enzima que metaboliza fármacos que cataliza la conjugación de glutatión reducido a los fármacos y metabolitos, y también contribuye a la desintoxicación de carcinógenos. Por lo tanto, una disminución en la actividad puede ser un factor de riesgo de carcinogénesis. La infección por Helicobacter pylori se ha reportado que causa una disminución en la expresión de GST [25], lo que sugiere que una disminución en la actividad GST podría ser una causa de la carcinogénesis gástrica. En este estudio, se observó una disminución en la expresión de la proteína GST en tres casos. Una disminución en la expresión de la proteína GST se puede utilizar como un biomarcador para el diagnóstico de tumores gástricos.
AST es una aminotransferasa que actúa sobre los aminoácidos y el ácido α-ceto, que se distribuye ampliamente en órganos humanos. AST se libera en el torrente sanguíneo debido a una mayor permeabilidad y la destrucción de los tejidos. Una concentración elevada de proteína AST se ha informado en la sangre de pacientes con hepatitis, tumores malignos incluyendo hepatomas y leuchemia. La expresión de genes de GST también se ha demostrado para estar regulado en los tejidos tumorales de colon [26]. Sin embargo, una disminución en la expresión de la proteína AST se observa comúnmente en todos los tejidos tumorales derivadas de las presentes cinco pacientes con adenocarcinomas gástricos. El estudio adicional se debe realizar para dilucidar si una disminución en la proteína AST se observa específicamente en los tejidos tumorales gástricas o no.
Expresión elevada de PGK-1, que es una de las enzimas en la vía glucolítica y que cataliza la desfosforilación de 1,3-difosfoglicerato para producir ATP, se ha observado en muchos tejidos tumorales malignas que son dependientes de ATP como fuente de energía importante. Se cree que los tumores sólidos a necesitar la sobreproducción de ATP para mantener la proliferación mejorada. La sobre regulación de las enzimas glucolíticas, incluyendo PGK-1 en el cáncer de pulmón [27] y de tipo M2 piruvato quinasa en el cáncer colorrectal [28], se ha informado y sugirió que sea útil para el cribado del cáncer. Sin embargo, en el presente estudio, casi no se detectó una relación significativa entre PGK-1 expresión de la proteína y los fenotipos de los adenocarcinomas gástricos. Por lo tanto, PGK-1 se considera que no es adecuado para el diagnóstico de cáncer gástrico.
Anhydrases carbónica (CAS) son enzimas que contienen zinc que se distribuyen ampliamente en varios órganos y que forman una gran familia, incluyendo la AC-I a CA IX-. Ellos catalizan la hidratación de CO 2 para el metabolismo intermedio, y mantener el pH y el equilibrio de iones en el cuerpo. Hasta ahora una relación directa se ha demostrado entre la transformación maligna y la expresión de proteínas para CAs I a VII [29]. Dos estudios anteriores revelaron que la expresión tanto de CA-I y CA-II se redujo significativamente en los tumores de colon en comparación con en el epitelio colorrectal normal o mucosas [30]. Otro informe presenta resultados que muestran que la reducción de la expresión de CA-I y CA-II se correlaciona con la agresividad biológica del cáncer colorrectal y metástasis a distancia síncrona [31]. Como se ha sugerido anteriormente [32], los carcinomas gástricos y colorrectales pueden compartir un mecanismo similar de la proliferación celular y los tumores malignos de la mucosa, y puede ser un marcador biológico para estos carcinomas, porque disminuye comunes en la expresión de la proteína de CA-I y CA-II, también se observaron en este estudio.
FOV, que es idéntica a una proteína de la mucosa del antro de 18 kDa-estómago específico! (AMP-18) [33, 34], GKN1 [35], y las interacciones factor trébol (z) (TFIZ) [36], se demostró que ser drásticamente reducido regulado o ausente en los pacientes con adenocarcinoma gástrico en este estudio. El AMP-18 humana y producto del gen CA11 carcinoantigenic humano, que codifica una secuencia de aminoácidos que difiere de la de AMP-18 en un solo residuo [37, 38], la función como factores de crecimiento secretados en parte responsable de mantener un gástrico funcional normal epitelio [33]. Tanto AMP-18 y el producto del gen CA11 se ha informado que se expresa intensamente en el tejido de estómago normal, pero no en la mayoría de cánceres gástrico [33, 37, 38]. Los estudios inmunohistoquímicos demostraron que AMP-18 parece estar presente en las células epiteliales de la mucosa del antro gástrico y el duodeno humano normal [33]. Recientemente, se demostró TFIZ para actuar como un regulador del crecimiento de las células epiteliales gástricas mediante la formación de un heterodímero con factor trébol 1 (TFF1) [36]. Nuestros datos actuales confirman aún más la alta expresión de FOV en los tejidos gástricos no tumoral y la supresión significativa de la proteína en adnocarcinomas gástricos, lo que indica que FOV juegan un papel en el mantenimiento de la diferenciación normal de las células epiteliales y la supresión de tumores, pero no en los tejidos tumorales. Además, hemos demostrado que la transcripción de mRNA FOV era también comúnmente el regulado en pacientes con cáncer gástrico, lo que indica que una marcada disminución de la proteína FOV fue causada por supresión de la expresión de genes FOV. Además, en un paciente la proteína no se detectó en los tejidos no tumorales, lo que sugiere que el nivel de expresión de la proteína en individuos FOV puede determinar el fenotipo adenocarcinoma gástrico. De acuerdo con ello, el nivel de expresión del campo de visión como un biomarcador puede ser informativo para la evaluación del cáncer gástrico.
Conclusión
perfiles de proteínas de tumor y no tumorales tejidos derivados de pacientes japoneses con adenocarcinomas gástricos se realizó mediante 2D-EP y LC- ESI-MS /MS. Las proteínas identificadas incluyen chaperones moleculares, enzimas productoras de energía, proteínas del citoesqueleto, y así sucesivamente. alteraciones comunes de proteínas se detectaron en los pacientes con cáncer gástrico. expresión de la proteína de MnSOD y HMG-1 fue hasta reguladas, mientras que la de GST, AST y FOV se había reducido regulado en los tejidos tumorales gástricas. Una correlación entre la alteración de estas proteínas y su expresión de la transcripción en el cáncer gástrico apenas se observó en este estudio, excepto en el caso de FOV. Tanto la expresión de la proteína y el gen del campo de visión, un factor de crecimiento-secretora del estómago específico para las células epiteliales gástricas normales, era marcadamente reducido regulado en los tejidos tumorales derivadas de pacientes japoneses con adenocarcinomas gástricos. El monitoreo de los niveles de expresión de esta proteína-estómago específica en muestras clínicas puede proporcionar información útil para el diagnóstico de cáncer gástrico como un biomarcador específico y para una mejor comprensión de la carcinogénesis gástrica.
Métodos Materiales

DNasa I, RNasa A, 2-mercaptoetanol (2-ME), perlas de vidrio (212-300 micras), Nonidet P-40, acrilamida, N, N, N ', N'
-tetramethylenediamine (TEMED), dodecilsulfato de sodio (SDS ), yodoacetamida y ditiotreitol (DTT) se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO). Agarosa para enfocar isoelectrónico (IEF), y Pharmalyte pI 3-10, 4-6,5 y 8-10,5 eran de Amersham Bioscience (Piscataway, NJ). Tripsina (grado de secuenciación) era de Roche (Mannheim, Alemania). fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), tiourea, sorbitol, pirofosfato de sodio, persulfato de amonio, ácido D, L-aspártico, ácido tricloroacético, dihidrato de ácido sulfosalicílico, ácido acético, acetonitrilo, ácido fórmico y ácido trifluoroacético (TFA) eran de Wako Pure Chemicals (Osaka , Japón). La urea fue de Katayama Químicos (Osaka, Japón). Pepstatina A y leupeptina eran del Peptide Institute (Osaka, Japón). NH 4HCO 3 y N, N'-metilenbisacrilamida eran de Nacalai Tesque (Kyoto, Japón). CBB R-250 fue de ICN Biomedicals Inc. (Aurora, OH). patrones de masa molecular eran de APRO Science, Inc. (Tokushima, Japón). TRIZOL reactivo era de Life Technologies (Frederick, MD). Oligo (dT) 12-18 cebador, desoxinucleótidos (dNTP), y RNaseOUT eran de Invitrogen (Carlsbad, CA). M-MLV transcriptasa inversa y ADN polimerasa Taq eran de Promega (Madison, WI).
Tejidos y la preparación de muestras
adenocarcinomas gástricos primarios y mucosas nontumor adyacentes se recogieron en la gastrectomía y proporcionados por el Departamento de Cirugía, Escuela de Graduados de Medicina de la Universidad de Tokushima, Tokushima, Japón. La investigación se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial, y fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Tokushima. El consentimiento informado también estuvo a cargo de todos los pacientes que proporcionaron las muestras clínicas. Los tejidos se congelaron en un baño de hielo-metanol seco tan pronto como sea posible después de la disección y se almacenaron en un congelador (-80 ° C) antes de su uso. Para el análisis de mRNA, los tejidos se sumergieron primero en RNAlater (Takara, Tokio, Japón) antes de la congelación. los datos clínico-detallada, incluyendo el estadio del tumor (de acuerdo con el sistema AJCC), el sitio y la diferenciación, y los datos histológicos de las muestras de tejido se enumeran en la Tabla 3. Ninguno de estos casos fueron clasificados en la categoría de tipo escirrosa, y el tejido tumoral fue claramente distinguishted de no tumoral uno en cada caso. Para dos dimensiones-electroforesis en gel (2D-EP), la extracción de proteínas a partir de tejidos se llevó a cabo mediante el siguiente procedimiento. Los bloques congelados (20-30 mg de peso húmedo) se homogeneizaron con una mano de mortero de plástico (Toyobo, Tokio, Japón), en presencia de perlas de vidrio en 10 vol peso /húmedo de tampón de diálisis que comprende 5 M de urea, tiourea 1 M, 10 mM Nappi , 1,67 l /ml 2-mE, 0,005% de DNasa I, 0,05 mg /ml de RNasa a, 20 leupeptina mu M, EDTA 1 mM, PMSF 2 mM y 20 mM pepstatinA, y luego se centrifugó a 50.000 rpm durante 30 min a 4 ° C (Beckman -Coulter, Fullerton, CA). El sobrenadante resultante se usó como el extracto de tejido. Las concentraciones de proteínas se determinaron con un kit de ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) usando gamma-globulina bovina como un standard.Table 3 Características clínicas de los pacientes con adenocarcinomas gástricos.
Case

Age

Sex

Locationa

Gradeb

Stage


A
63
Male
UM
G3
IIIA
T2N2M0H0
B
68
Female
L
G2
II
T2N2M0
C
76
Male
ML
G2
IV
T4N3M0
D
78
Female
L
G2
III
T2N0M0H0
E
77
Male
ML
G2
II
T2N1M0
au: superior, M: media, L: más bajos
BG2: moderadamente diferenciado, G3:. electroforesis en gel de dos dimesional pobremente diferenciado
2D-EP se llevó a cabo como se describe anteriormente [39]. El primero dimensiones isoelectroenfoque se realizó en un 1% (w /v) en gel de agarosa (φ 2,6 x 180 mm) con un gradiente de 3-10 pH a 700 V durante 18 horas a 4 ° C, y la segunda dimensiones SDS electroforesis en gel se realizó con un 5-15% (w /v) gradiente de acrilamida (M
rango r, 6-200 kDa) en un gel de placa estándar (20 × 13 cm) a 15 mA durante 3 h, y luego a 70 mA durante 2 h a temperatura ambiente. Los geles se tiñeron con CBB R-250. Las muestras de proteína
(500 mg) se extrae desde el centro del tumor y la mucosa que rodea histológicamente normales fueron sometidos a 2D-EP y se ejecutan en el lado pares al lado del otro.
Algunos de los lugares manchados fueron extirpados de la 2D-gel, en gel se digirió con tripsina y después se sometieron a análisis de LC-ESI-MS /MS como se describe anteriormente [40]. La mezcla de péptidos se separó con un sistema nanoLC en fase inversa (famoso, Swichos II, Ultimate, LC Embalajes, Sunnyvale, CA). Los péptidos eluidos se rociaron directamente en un espectrómetro de masas ESI (Esquire3000 Plus, Bruker-Daltonics, Fremont, CA).
Un gran volumen de datos de MS /MS fue adquirido con DataAnalysis 3.1 del software (Bruker-Daltonics), convierten a texto archivos se enumeran los valores de masa de los iones de los padres, y las intensidades y las masas de los fragmentos de iones y, a continuación, procesadas con el algoritmo de MASCOT (Matrix Science Ltd, Londres, Reino Unido) para asignar péptidos en la base de datos de secuencia no redundante NCBI utilizando una restricción taxonómica, 'humano'. La búsqueda de base de datos se realizó con los parámetros descritos por Yoshimura et al. [40]. El análisis Imagen editorial y secuenciación de péptidos MS
La adquisición de imágenes y análisis se realizaron con Molecular Imager FXProPlus (Bio-Rad) y el software ImageMaster (Bio-Rad). Se realizaron comparaciones entre las imágenes de gel de tumor y emparejado muestras no tumorales dos en dos. las diferencias de volumen normalizados fueron calculados estadísticamente para los cinco casos. El contenido de proteína de 3-phosphodehydrogenase gliceraldehído (GAPDH) se utilizó como referencia para evaluar la alteración veces de la expresión de proteínas entre tumor y no tumoral coincide tejidos como los niveles de GAPDH ARNm y proteínas no cambiaron entre los tejidos derivados de pacientes. Se seleccionaron consistente y significativamente diferentes puntos para análisis por LC-ESI-MS /MS. manchas de proteínas! se cortaron de los geles en trozos pequeños, y se sometieron a digestión en gel con tripsina durante la noche [40]. Los espectros de masas de péptidos se registraron, y se utilizaron los parámetros de adquisición de espectros como se ha indicado anteriormente [40]. La exactitud en la coincidencia de la proteína base de datos utilizando la mascota de búsqueda [41] se juzgó como una puntuación de más de 37, que se obtuvo en la mayoría de los análisis. Aislamiento
RNA y análisis RT-PCR
tumoral y no tumoral coincide muestras (aprox. 50 mg de peso húmedo) se picada, y luego homogeneizó manualmente en 1 ml de reactivo de TRIZOL (Invitrogen) en hielo. Se aisló el ARN sin tratamiento con DNasa I de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, 0,2 ml de CHCl 3 se añadió al homogenado, seguido de centrifugación a 20.600 xg durante 15 min. Se añadió un volumen igual de 2-propanol al sobrenadante resultante para precipitar el ARN. Después de la centrifugación, el sedimento se enjuagó con 75% de etanol /diethylpyridylchloride (DEPC) de agua tratada, seguido de secado. El sedimento se disuelve en un volumen apropiado de agua tratada con DEPC como la fracción de ARN total. Para la transcripción inversa (RT), 2 g de ARN de cada muestra se transcribió a 37 ° C durante 1 h en presencia de 200 U de Molony virus de la leucemia transcriptasa inversa (Promega), oligo (dT) primer 12 a 18, 0,5 mM dNTPs y 50 U de RNaseOUT.

• regulación a la baja de Thrombospondin2 predice un mal pronóstico en pacientes con cáncer gástrico
• Catecolaminas hasta regula MMP-7 expresión mediante la activación de AP-1 y STAT3 en el cáncer gástrico