altération protéomique dans les adénocarcinomes gastic de patients japonais

altération protéomique dans les adénocarcinomes gastic de patients japonais
adénocarcinomes gastriques de résumé de l'arrière-plan comprend l'un des types courants de cancers dans les pays asiatiques, dont le Japon. Complète des profils de protéines des échantillons chirurgicaux paires de adénocarcinomes gastriques primaires et non tumorales muqueuses dérivées de patients japonais a été effectuée au moyen d'électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2D-EP) et chromatographie en phase liquide à électropulvérisation tandem ionique spectrométrie de masse (LC-ESI-MS) pour établir des protéines spécifiques de cancer gastrique comme biomarqueurs cliniques putatifs et les cibles moléculaires pour la chimiothérapie.: Résultats
modifications relativement commun dans l'expression des protéines ont été révélées dans les tissus tumoraux. Augmentation de la superoxyde de manganèse et non histones protéine chromosomique HMG-1 (HMG-1) ont été observés, alors que les diminutions dans les anhydrases carboniques I et II, glutathion-S-transférase et d'un précurseur foveolin (gastrokine-1) (FOV), un estomac 18 kDa une protéine ayant une activité spécifique de suppresseur de tumeur putatif ont été détectés. Analyse par RT-PCR a révélé une régulation négative significative de l'expression de l'ARNm FOV dans les tissus tumoraux.
Conclusion
Un rôle pathologique possible pour la régulation négative de FOV dans la carcinogenèse gastrique a été démontrée. L'évaluation des baisses spécifiques chez les patients dans le gène et l'expression des protéines de FOV peut être utilisé en tant que biomarqueurs cliniques pour le diagnostic et l'évaluation du cancer gastrique efficace.
Contexte de adénocarcinomes gastriques comprennent l'un des types courants de cancers dans les pays asiatiques, y compris Japon, étant le deuxième cancer du poumon que le nombre de décès qu'elle provoque. En dépit de l'évolution récente des techniques de diagnostic, la plupart des patients atteints de cancer gastrique sont diagnostiqués à un stade avancé et ont un taux de survie à cinq ans très faible (moins de 10%) [1]. Ceci est partiellement dû à un manque de biomarqueurs spécifiques et sensibles pour le diagnostic et le suivi des progrès de la maladie à un stade précoce, bien que certains marqueurs tumoraux gastriques, y compris l'antigène carcinoembryonnaire, ont été utilisés et sont partiellement efficaces. Comme la carcinogenèse gastrique est un processus en plusieurs étapes, une analyse complète est également nécessaire pour des cas individuels, dans lequel les événements moléculaires différents se produisent dans chaque processus cancérigène.
Récemment, l'analyse protéomique a été utilisé pour examiner globalement l'expression des protéines dans les fluides corporels, des tissus et des cellules [ ,,,0],2-4]. Cette approche, protéomique clinique, est très utile pour identifier des protéines associées à des maladies qui montrent des changements dans l'expression et les modifications correspondant à une condition de maladie [5, 6]. Ces protéines liées à la maladie sont censés être des biomarqueurs pour le diagnostic et les protéines cibles putatives pour le traitement [7-9]. D'autre part, des analyses complètes des transcriptomes dans les tissus tumoraux provenant de divers patients atteints de cancer à l'aide de puces à ADN et des puces à ADN ont été réalisées au cours des dernières années [10]. Cependant, l'absence de corrélation entre les variations des ARNm et la carcinogenèse a été démontrée, et les changements quantitatifs et qualitatifs de post-traductionnelle des protéines modifiées en tant que produits finaux de gènes sont considérés comme plus informatif que ceux des ARNm dans les tissus tumoraux pour étudier les événements moléculaires carcinogenèse. études protéomiques pour l'identification des protéines associées à des tumeurs dans le cancer gastrique sont en augmentation, et les bases de données protéomiques pour les tissus gastriques [11] et des lignées cellulaires [12] ont été construits. La plupart d'entre eux concernent des protéines ou des antigènes spécifiques qui reflètent les propriétés chimio- et thermo-résistante de cancer de l'estomac [13-15], et qui sont associés à Helicobacter pylori
[16, 17]. Dans la présente étude, nous avons effectué une analyse du protéome complet de la tumeur et les tissus non tumoraux chez les patients japonais atteints de carcinomes gastriques, et identifié plusieurs protéines dont les niveaux d'expression sont généralement modifiés dans les cas cliniques. Résultats de En particulier, l'expression de gastrokine-1 (GKN-1) a été suggéré d'être sous la fois le contrôle de la transcription et de la traduction.
séparation des protéines et l'identification
Figure 1A montre un aperçu de l'image d'un gel de maître typique pour un tissu de tumeur gastrique. Environ 200 spots de protéines colorées avec du bleu brillant Coomassie (CBB) R-250 ont été bien séparés dans les gels. Les points numérotés de la figure 1B et 1C ont été excisés à partir d'un gel, traités avec de la trypsine et ensuite soumis à une chromatographie en phase liquide par pulvérisation électronique, ionisation par spectrométrie de masse en tandem (LC-ESI-MS /MS) analyse. Soixante-deux d'entre eux représentant 69 espèces différentes de protéines ont été identifiées. Le tableau 1 énumère toutes les protéines identifiées par peptide correspondant à l'algorithme de recherche Mascot. La précision en protéines profilage a été évaluée comme étant la valeur de score (supérieur à 37). La figure 1 (A) Une vue d'ensemble d'une image en 2D sur gel maître pour le tissu tumoral provenant d'un patient atteint d'un adénocarcinome gastrique. (B) et (C) Les spots protéiques numérotés ont été identifiés par LC-ESI-MS /MS et de la protéine correspondante, comme représenté en figures agrandies.
Tableau 1 profil de la protéine détectée dans le tissu tumoral provenant d'un patient japonais avec un gastrique adénocarcinome.
spot n °
numéro d'accession
identification des protéines

Mass
SC (%)
PI
score
1
24308169
axonémale chaîne lourde de type dynein 3
473776
0
6,04
précurseur gp96 de la protéine de choc 37 2
15010550
thermique
90309
7
4,73
62 3
72222
protéine de choc thermique 90 -β
83584
14
4,97
176 4
5729877
choc thermique 70 kDa 8 isoforme 1
71082
19
5,37
283
5
38044288
gelsoline isoforme b
80876
5
5,58
63
6
4826960
glutaminyle-ARNt synthétase
88655 1
6,71
44
7
4501867
aconitase 2
86113
10
7.36
231
8
119717
ezrin
69470
7
5.94
75
9
4557871
transferrin
79280
9
6.81
97
10
16507237
heat choc 70 kDa 5
72402
15
5,07
165
11
24234686
protéine de choc thermique 70 kDa 8
53598
16
5,62
160
12
4885431
choc thermique 70 kDa 1B
70267
11
5,48
143
13
1082886
tumeur type de facteur de nécrose 1 protéine associée au récepteur TRAP-1
75694
13
8,43
288
14
31542947
chaperonine, mitochondrial protéine de la matrice P1, P60 protéines de lymphocytes
61187
13
5.7
299
15
28592
sérum albumin
71316
23
6.05
292
16
340219
vimentin
53738
18
5.03
79
17
4503729
similar à la protéine de liaison à FK506 4
49031
5
5.6
36
18
32709
IFP53
53559
21
5.93
277
19
4502643
chaperonin-containing TCP1, subunit6A (zeta 1)
58444
6
6,23
79
20
7106439
tubuline, β5
50095
14
4.78
125
21
37492
α-tubulin
50810
13
5.02
94
22
125604
pyruvate kinase M2 isozyme
58447
5
7.95
234
23
4557014
catalase
59947
6
6.9
120
24
4503483
eukaryotic traduction facteur d'élongation 2
96246 4
6,41
56
25
179279
ATP synthase β sous-unité
56861
5
5,39
59
26
7657041
régulé à la baisse dans les métastases
320846 2
7,07
40
27
4504169
glutathion synthétase, GSH synthetase
52523
5
5.67
99
28
12017952
GE36
73327
2
5.2
37
29
34234
laminin-binding protéines
31888
12
4,84
51
30
16359158
actine, bêta
42078
14
5,29
171
31
6635125 protéines
de KIAA0284
161473 2
6,36
47
32
5803225
14-3-3 epsilon
29326
8
4,63
49
33
4504707
inositol polyphosphate-4-phosphatase, type II, 105 kD
105749 1
5,87
37
34
35038601
protéine hypothétique DKFZp761A078
74864
2
7.27
47
35
12017952
GE36
73327
1
5.2
38
36
4505877
plectin 1 isoforme 1
520111 1
5,57
44
37
38158018
protéine centrosomale 1, centriole protéine associée, centriolin
269874 1
5,44
39
38
30157438
CTD liaison SR-like protein RA9
180240 1
9,15
41
39
4503471
traduction eucaryote facteur d'élongation 1 α1
50451
12
9.1
191
40
4757810
ATP synthase
59828
17
9.16
178
41
693.933
2-phosphopyruvate-hydratase α-énolase
47421
22
7.01
240
42
123576
47 kDa précurseur de la protéine de choc thermique
46352
14
8,27
177
43
5032069
épissage facteur 3b, sous-unité 4
44414 3
8,54
58
44
4503471
eucaryote traduction facteur d'élongation 1 α1
50451 4
9.1
47
45
5921789
citrate synthase, précurseur mitochondrial
51959
12
8.13
114
46
4505763
phosphoglycérate kinase 1
44985
14
8.3
87
47
4504069
aspartate aminotransférase précurseur 2
47844
6
9.14
52
48
7669492
glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
36201
13
8,57
49
49
4757756
annexine A2
38808
9
7,57
87
50
6648067
malate déshydrogénase, précurseur mitochondrial
35965
7
8,92
60
51
5031857
lactate déshydrogénase A
36950
6
8,44
43
52
238427
porine 30737
29
8,63
124
53
5174447
guanine nucléotide liant la protéine de 31 HM
35511 8
7.6
65
54
34740329
ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A3
39799
7
9.1
43
55
4504983
galectin-3
26229
12
8.58
42
56
4504447
heterogeneous ribonucléoprotéine nucléaire A2 /B1 isoforme A2
36041
7
8,67
40
57
86901
ATP-dépendante ADN hélicase RAP30 /74 chaîne RAP30
26350
3
9,46
41
58
230.445
anhydrase carbonique I
28903
12
6,44
67
59
455739
anhydrase carbonique II
29285 8
6,87
82
60
26892090
variante de la chaîne bêta-globine
16101
40
7,86
121
61
34709
superoxyde dismutase manganèse
24891
10
8,35
111
62
4507645
triosephosphate isomérase 1
26938
17
6,45
47
63
38488935
foveolin précurseur
20546
16
5,65
95
64
478813
protéines non histones chromosomique HMG-1
25139
13
5,41
60
65
2204207
glutathion S-transferase
23595
34
5.43
73
66
178755
proapolipoprotein
28944
8
5.45
103
67
37267
transketolase
68435
4
7.9
59
68
189998
M2-type pyruvate kinase
58447
10
7,95
157
69
825.605
glutathion S-transférase
25650
10
8,51
65
Ces protéines peuvent être classés en plusieurs catégories en fonction de leurs fonctions, y compris des protéines du cytosquelette, des protéines liées au stress et accompagnement en, des protéines de phase aiguë, des enzymes glycolytiques, les enzymes impliquées dans le métabolisme et la prolifération cellulaire, des protéines suppresseurs de tumeur et les protéines spécifiques de l'estomac . altérations
communs de l'expression des protéines entre la tumeur et les tissus non tumorales dans des altérations diverses des patients atteints de cancer gastrique dans protéomes ont été détectés entre la tumeur et les tissus non tumorales à partir des mêmes patients. Comme on le voit sur la figure 2, les différentes altérations communes ont été observés chez cinq patients japonais atteints de cancer gastrique (Cas A à E). Manganèse superoxyde dismutase (MnSOD), non histones protéine chromosomique HMG-1 (HMG-1), la phosphoglycérate kinase 1 (PGK-1), l'anhydrase carbonique I et II (CA I et II), foveolin précurseur FOV (gastrokine-1), l'aspartate aminotransférase 2 précurseur (AST), et de la glutathion S-transférase (GST) présentaient des changements communs dans l'expression entre les tissus tumoraux et non tumoraux, y compris parmi les protéines identifiées. L'expression de la protéine de MnSOD et HMG-1 a été démontrée pour être régulés à la hausse dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus non tumoraux. D'autre part, le CA I et II, FOV, AST et les protéines de la TPS ont été révélés être régulés à la baisse dans les tissus tumoraux. Les changements de pliage dans l'expression de ces protéines par rapport à celle de GAPDH sont résumés dans le tableau 2. La baisse la plus remarquable a été montré dans le niveau de FOV dans tous les cas. Le degré de la diminution de la TPS expression de la protéine était presque le même que celui dans FOV (Cas B, D et E), bien que l'on n'a pas été observée dans les deux autres cas. D'autre part, l'augmentation de la HMG-1 a été marqué dans trois cas (A, C et D), même si une telle différence d'expression n'a pas été observée dans les deux autres cas. MnSOD a montré une tendance à augmenter dans les tissus tumoraux de trois patients (Cas A, C et D), mais une baisse par rapport a également été observée dans l'affaire B. Quant à PGK-1, une relation significative entre les changements de pliage dans l'expression des protéines et le classement pathologique des tumeurs n'a guère été observée. Figure 2 modèles d'altération détaillées des protéines. (A) et non tumorales (B) protéines tumorales, y compris CAI (No.58), CAII (No.59), MnSOD (No.61), FOV (No.63), HMG-1 (No.64), et la TPS (No.65). (C) non tumorales et (D) des protéines tumorales, y compris PGK-1 (No.46), AST (No.47) et TPS (No.69). GAPDH, signalés par un cercle, a été utilisé comme une protéine de référence.
Tableau 2 changements Fold dans l'expression des protéines entre les tissus non tumoraux et tumorales dérivées de cinq patients atteints d'adénocarcinomes gastriques.
Protein
cas A
cas B
affaire C
Case D
Case E

CA I
-6.5 -1.6

-3.3
-4.3 -2.6

CA II
-2.6
-1.3
-26
-4.3
-13
FOV
-13
-13
-26
*
-26
MnSOD
+1.7
-2.6
+6.5
+1.4
+1.1
HMG-1
+13
*
+3.7
+13
*
PGK1
+1.6
+1.1
-1.2
+2.6
-1.4
AST
-13
-1.6
-6.5
-3.7
-2.6
GST
*
-26
*
-13
-13
CA I, carbonique I. anhydrase
CA II, l'anhydrase carbonique II.
FOV, précurseur foveolin.
MnSOD, le manganèse superoxyde dismutase.
HMG-1, la protéine non histones chromosomique.
PGK1, phosphoglycérate kinase 1.
AST, aspartate aminotransférase 2 précurseur.
TPS, glutathion S-transférase.
*, pas
déterminé. RT-PCR analyse
par RT-PCR, les changements dans l'ARNm l'expression dans des tissus tumoraux et non tumorales dérivées de patients atteints d'un cancer de l'estomac ont été analysés pour les protéines qui présentaient des altérations dans l'expression de protéines, y compris FOV, MnSOD et HMG-1. Comme on le voit sur la figure 3, FOV L'ARNm a été significativement réduite dans les tissus tumoraux dans les quatre à tous les patients (cas A, B, C et E), alors qu'elle n'a pas été détectée dans les tissus non tumoraux ou d'une tumeur de l'autre du patient (cas D) . D'autre part, MnSOD ARNm a été nettement augmentée chez quatre patients (Cas B, C, D et E), bien que peu de différence dans le niveau d'ARNm entre les tissus non tumoraux et tumorales dans le cas A a été détectée. Cependant, une relation entre HMG-1 expression de l'ARNm et les phénotypes pathologiques des tumeurs n'a guère été observée. Figure 3: Comparaison de l'expression de l'ARNm des protéines éventuellement associé à la cancérogenèse entre les tissus non tumoraux et tumorales dérivées de cinq patients atteints d'adénocarcinomes gastriques (cas A à E) par RT-PCR. N et T indiquent les tissus non tumoraux et tumoraux, respectivement Discussion de
. Dans cette étude, nous avons effectué une analyse protéomique des tissus tumoraux et non tumorales dérivées de patients atteints d'un adénocarcinome gastrique japonais. Soixante-neuf protéines différentes dans le tissu tumoral à partir d'un cas de cancer de l'estomac ont été identifiés par 2D-EP et LC-ESI-MS /MS, qui comprenait les protéines de stress, Hsp70, Hsp90 et TCP1 contenant chaperonine-(CCT), pour l'auto-protection; enzymes de la glycolyse, la triose phosphate isomérase 1, α-énolase et PGK-1, pour les besoins en énergie de plus en plus; protéines du cytosquelette, ezrine, gelsoline isoforme b et vimentine; les protéines impliquées dans la différenciation et la prolifération cellulaire, la galectine-3 et la transferrine; et les protéines présentant une activité de suppresseur de tumeur putatif, FOV. Un grand nombre de ces protéines ont été rapportées comme étant associé à la tumorigenèse des adénocarcinomes gastriques comportant plusieurs étapes et facteurs [18, 19].
Nous avons également démontré que les niveaux d'expression de plusieurs protéines dans les tissus tumoraux ont été fréquemment modifiés chez cinq patients japonais avec les adénocarcinomes gastriques, par rapport à celles des tissus non tumoraux. Une augmentation de courant dans l'expression des protéines dans les tissus tumoraux est produite pour MnSOD, HMG-1 et PGK-1, alors qu'une diminution commune dans les tissus tumoraux a eu lieu pour la FOV, la TPS et AST
superoxyde (O 2 . - ), un radical libre, est essentielle pour l'action anti-microbienne des granulocytes et des monocytes. Superoxyde dismutase (SOD) élimine rapidement l'excédent de la superoxyde produite dans les réactions de stress et biologiques in vivo
par catalyse de la conversion du superoxyde avec H + H 2O 2 et O 2. MnSOD, l'un des SODs, se trouve dans les mitochondries et contribue à la protection de l'ADN mitochondrial des dommages. Il a été rapporté que l'expression accrue de MnSOD dans le cancer gastrique progressif doit être liée au taux de survie à 5 ans après la chirurgie [20] et de la sensibilité à la chimiothérapie [21]. Dans cette étude, l'expression des protéines de la MnSOD était régulée à la hausse dans 4 des 5 patients atteints d'un cancer de l'estomac, ce qui suggère une réponse auto-protecteur. D'autre part, la régulation positive de la MnSOD dans les tissus tumoraux a été examinée pour interférer avec une chimiothérapie efficace sur la base de la production de radicaux, ce qui peut entraîner une diminution de la sensibilité aux médicaments anti-cancéreux et de déterminer la gravité du cancer.
HMG-1 régule la transcription de divers gènes et la stabilisation de la structure des chromosomes en tant que protéine de liaison à l'ADN. HMG-1 a été rapporté être associé à la carcinogenèse et les métastases dans le cancer colorectal et le cancer du sein [22].
Transcriptionnelle régulation à la hausse de l'HMG-1 dans le cancer gastrique a également été démontrée [23]. L'expression de l'HMG-1 dans les tissus tumoraux a été suggéré d'être lié à la résistance au cisplatine [24]. Nous avons démontré ici une augmentation de cette protéine dans trois cas.
TPS est une enzyme métabolisant drogue qui catalyse la conjugaison du glutathion réduit à des médicaments et des métabolites, et contribue également à la détoxification des carcinogènes. Par conséquent, une diminution de l'activité peut être un facteur de risque pour la carcinogénèse. L'infection par Helicobacter pylori a été signalé pour provoquer une diminution de l'expression de la TPS [25], ce qui suggère qu'une diminution de l'activité de la TPS pourrait être une cause de la cancérogenèse gastrique. Dans cette étude, une diminution de la TPS expression de la protéine a été observée dans trois cas. Une diminution de l'expression de la protéine GST peut être utilisée comme marqueur biologique pour le diagnostic des tumeurs gastriques.
AST est une aminotransférase qui agit sur les acides aminés et de l'acide α-céto, qui est largement distribué dans des organes humains. AST est libéré dans la circulation sanguine due à l'amélioration de la perméabilité et la destruction des tissus. Une concentration élevée de protéine AST a été rapportée dans le sang des patients atteints d'une hépatite, les tumeurs malignes, y compris les hépatomes et leuchemia. L'expression des gènes de la TPS a également été démontrée pour être régulée à la hausse dans les tissus de tumeur colorectale [26]. Cependant, une diminution de l'expression de la protéine AST était couramment observée dans tous les tissus tumoraux dérivés de la présente cinq patients atteints d'adénocarcinomes gastriques. Une étude plus poussée doit être effectuée pour élucider si une diminution de la protéine de l'AST est spécifiquement observée dans les tissus tumoraux gastriques ou non.
Une expression élevée de la PGK-1, qui est l'une des enzymes de la glycolyse et qui catalyse la déphosphorylation 1,3-bisphosphoglycérate pour produire de l'ATP, a été observée dans de nombreux tissus de tumeurs malignes qui dépendent de l'ATP en tant que source d'énergie importante. Les tumeurs solides sont censés avoir besoin de la surproduction de l'ATP pour maintenir la prolifération accrue. La régulation à la hausse des enzymes glycolytiques, y compris PGK-1 dans le cancer du poumon [27] et M2 de type pyruvatekinase dans le cancer colorectal [28], ont été rapportés et ont suggéré comme étant utile pour le dépistage du cancer. Toutefois, dans la présente étude, une relation significative entre PGK-1 expression de la protéine et les phénotypes des adénocarcinomes gastriques n'a guère été détectée. Par conséquent, PGK-1 a été considéré comme non convenable pour le diagnostic du cancer gastrique.
Anhydrases carboniques (AR) sont des enzymes contenant du zinc qui sont largement distribués dans divers organes et qui constituent une grande famille, y compris CA-I CA -IX. Elles catalysent l'hydratation du CO 2 pour le métabolisme intermédiaire, et à maintenir le pH et l'équilibre des ions dans le corps. Jusqu'à présent, une relation directe a été démontrée entre la transformation maligne et l'expression des protéines pour les CA I à VII [29]. Deux études antérieures ont révélé que l'expression à la fois l'AC-I et CA-II était significativement réduite dans les tumeurs colorectales comparativement à la normale dans l'épithélium du côlon ou des muqueuses [30]. Un autre rapport a présenté des résultats montrant que réduit l'expression de CA-I et CA-II a été corrélée avec l'agressivité biologique du cancer colorectal et des métastases à distance synchrone [31]. Comme suggéré précédemment [32], les carcinomes gastriques et colorectaux peuvent partager un mécanisme similaire de la prolifération cellulaire et de la muqueuse malignité, et peut devenir un biomarqueur de ces carcinomes, car des baisses communes dans l'expression de la protéine de CA-I et CA-II ont également été observées dans cette étude. Le plus FOV, qui est identique à une 18 kDa de la muqueuse antrale protéine spécifique à l'estomac! (AMP-18) [33, 34], GKN1 [35], et les interactions des facteurs trilobée (z) (TFIZ) [36], a été démontrée pour être considérablement régulé à la baisse ou absente chez les patients d'adénocarcinome gastrique dans cette étude. L'AMP-18 humaine et le produit carcinoantigenic humain du gène CA11, qui code pour une séquence d'acides aminés qui diffère de celle de l'AMP 18 dans un seul résidu [37, 38], fonctionnent comme des facteurs de croissance sécrétés en partie responsables du maintien d'une gastrique fonctionnelle normale épithélium [33]. Deux AMP-18 et le produit du gène CA11 ont été rapportés pour être intensément exprimée dans les tissus de l'estomac normal, mais pas dans la plupart des cancers gastriques [33, 37, 38]. Des études immunohistochimiques ont montré que l'AMP-18 semble être présent dans les cellules épithéliales de la muqueuse de l'antre gastrique humain normal et du duodénum [33]. Récemment, TFIZ a été démontrée d'agir en tant que régulateur de croissance des cellules épithéliales gastriques par la formation d'un hétérodimère avec le facteur trifolié 1 (TFF1) [36]. Nos données actuelles en outre confirmé l'expression élevée du FOV dans les tissus gastriques non tumorales et la suppression significative de la protéine dans adnocarcinomas gastrique, ce qui indique que FOV jouent un rôle dans le maintien d'une différenciation normale des cellules épithéliales et la suppression des tumeurs, mais pas dans les tissus tumoraux. De plus, nous avons démontré que la transcription de l'ARNm FOV est aussi couramment régulée à la baisse chez les patients atteints de cancer gastrique, ce qui indique une diminution marquée de la protéine FOV a été provoquée par la suppression de l'expression du gène CDV. En outre, chez un patient la protéine n'a pas été détectée dans des tissus non tumoraux, ce qui suggère que le niveau d'expression de la protéine chez des individus FOV peut déterminer le phénotype adénocarcinome gastrique. Par conséquent, le niveau d'expression du champ de vision en tant que biomarqueur peut être informatif pour l'évaluation du cancer gastrique.

Conclusion La protéine profilage de la tumeur et les tissus non tumoraux provenant de patients japonais avec les adénocarcinomes gastriques a été effectuée en utilisant 2D-EP et LC- ESI-MS /MS. Les protéines identifiées comprennent chaperons moléculaires, des enzymes produisant de l'énergie, les protéines cytosquelettiques, et ainsi de suite. les altérations de protéines communes ont été détectées chez les patients atteints d'un cancer gastrique. L'expression des protéines de MnSOD et HMG-1 a été régulée à la hausse tandis que celle de la TPS, AST et FOV a été régulée à la baisse dans les tissus tumoraux gastriques. Une corrélation entre l'altération de ces protéines et leur expression de la transcription dans le cancer gastrique a été à peine observée dans cette étude, à l'exception dans le cas de FOV. À la fois l'expression de la protéine et le gène de FOV, d'un facteur de croissance sécrétoire spécifique de l'estomac pour les cellules epitheliales gastriques normales, est nettement régulée à la baisse dans les tissus tumoraux provenant de patients japonais avec les adénocarcinomes gastriques. Surveillance des niveaux d'expression de cette protéine spécifique à l'estomac dans des échantillons cliniques peut fournir des informations utiles pour le diagnostic de cancer de l'estomac comme un biomarqueur spécifique et pour une meilleure compréhension de la cancérogenèse gastrique.
Méthodes
DNase I Matériaux, la RNase A, le 2-mercaptoéthanol (2-ME), des billes de verre (212-300 um), Nonidet P-40, l'acrylamide, le N, N, N ', N'
tétraméthylènediamine (TEMED), le dodécylsulfate de sodium (SDS ), iodoacétamide et dithiothréitol (DTT) ont été achetés auprès de Sigma (St. Louis, MO). Agarose pour la focalisation isoélectrique (IEF) et pI Pharmalyte 3-10, et 4-6,5 8-10,5 provenaient d'Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Trypsine (qualité de séquençage) était de Roche (Manheim, Allemagne). le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), la thiourée, le sorbitol, le pyrophosphate de sodium, le persulfate d'ammonium, le D, L-aspartique, l'acide trichloroacétique, dihydrate d'acide sulfosalicylique, l'acide acétique, l'acétonitrile, l'acide formique et de l'acide trifluoroacétique (TFA) provenaient de Wako Pure Chemicals (Osaka , Japon). Urée était de Katayama Chemicals (Osaka, Japon). Pepstatine A et de la leupeptine provenaient du Peptide Institute (Osaka, Japon). NH 4HCO 3 et le N, N'-méthylènebisacrylamide provenaient de Nacalai Tesque (Kyoto, Japon). CBB R-250 était de ICN Biomedicals Inc. (Aurora, OH). étalons de masse moléculaire étaient de APRO Science, Inc. (Tokushima, Japon). TRIZOL réactif était de Life Technologies (Frederick, MD). Oligo (dT) 12-18 amorce, désoxynucléotides (dNTP) et RNaseOUT provenaient d'Invitrogen (Carlsbad, CA). M-MLV transcriptase inverse et l'ADN polymérase Taq étaient de Promega (Madison, WI):. Tissues et la préparation
adénocarcinomes gastriques primaires et les muqueuses de non tumorales adjacentes échantillon ont été collectées sur gastrectomie et fournis par le Département de chirurgie, Graduate School de médecine, Université de Tokushima, Tokushima, Japon. La recherche a été effectuée conformément à la Déclaration d'Helsinki de l'Association médicale mondiale, et a été approuvé par le comité d'éthique de l'Université de Tokushima. Un consentement éclairé a également été donné par tous les patients qui ont fourni les échantillons cliniques. Les tissus ont été congelés dans un bain de glace-méthanol sec dès que possible après la dissection et stockés dans un congélateur (-80 ° C) avant utilisation. Pour l'analyse de l'ARNm, les tissus ont d'abord été immergées dans du RNAlater (Takara, Tokyo, Japon) avant la congélation. données clinico détaillées, y compris le stade de la tumeur (selon le système de AJCC), le site et la différenciation, et les données histologiques sur les échantillons de tissus sont répertoriés dans le tableau 3. Aucun de ces cas ont été classés dans la catégorie de type squirrheuse, et le tissu tumoral a été clairement distinguishted de la non-tumorale une dans chaque cas. Pour électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2D-PE), l'extraction des protéines à partir de tissus a été effectuée par la procédure suivante. Les blocs congelés (20-30 mg de poids humide) ont été homogénéisés avec un pilon en plastique (Toyobo, Tokyo, Japon) en présence de billes de verre dans 10 volumes en poids /humide de tampon de dialyse comprenant 5 M d'urée, 1 M thiourée mM Nappi 10 1,67 ul /ml de 2-ME, 0,005% de désoxyribonucléase I, 0,05 mg /ml RNAse A, 20 pM de leupeptine, 1 mM d'EDTA, 2 mM de PMSF et 20 uM pepstatinA, puis centrifugée à 50 000 tpm pendant 30 min à 4 ° C (Beckman -Coulter, Fullerton, CA). Le surnageant résultant a été utilisé comme extrait de tissu. Les concentrations en protéines ont été déterminées avec un kit de dosage de protéine Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) en utilisant gamma-globuline bovine comme un standard.Table 3 caractéristiques cliniques des patients atteints d'adénocarcinomes gastriques.
Case

Age

Sex

Locationa

Gradeb

Stage


A
63
Male
UM
G3
IIIA
T2N2M0H0
B
68
Female
L
G2
II
T2N2M0
C
76
Male
ML
G2
IV
T4N3M0
D
78
Female
L
G2
III
T2N0M0H0
E
77
Male
ML
G2
II
T2N1M0
aU: supérieure, M: milieu, L: baisse
BG2: modérément différencié, G3:. Deux-dimesional électrophorèse sur gel de mal différencié
2D-EP a été réalisée comme décrit précédemment [39]. La première dimension focalisation isoélectrique a été réalisée dans un 1% (p /v) d'un gel d'agarose (φ 2,6 x 180 mm) avec un gradient de pH 3-10 à 700 V pendant 18 heures à 4 ° C, et la deuxième dimension de SDS l'électrophorèse sur gel est réalisée avec un 5-15% (p /v) de gradient d'acrylamide (la gamme de r M 6-200 kDa) dans un gel en plaque standard (20 × 13 cm) à 15 mA pendant 3 h, puis à 70 mA pendant 2 h à température ambiante. Les gels ont été colorés avec CBB R-250.
Échantillons de protéines (500 ug) extrait du centre de la tumeur et entourant la muqueuse histologiquement normale ont été soumis à 2D-EP et exploités par paires côte à côte.
Certains des taches colorées ont été excisés du gel 2D, dans le gel digéré avec de la trypsine et ensuite soumis à une analyse LC-ESI-MS /MS comme décrit précédemment [40]. Le mélange de peptides a été séparé avec un système phase de nanoLC inversée (célèbre, Swichos II, Intégrale, LC Emballages, Sunnyvale, CA). Les peptides élues ont été pulvérisés directement dans un spectromètre de masse ESI (Esquire3000 Plus, Bruker-Daltonics, Fremont, CA).
Un grand volume de données MS /MS a été acquis avec DataAnalysis 3.1 logiciel (Bruker-Daltonics), convertis en texte fichiers répertoriant les valeurs de masse des ions parents, et des intensités et des masses d'ions fragments, puis traitées avec l'algorithme de MASCOT (matrice science Ltd, Londres, Royaume-Uni) pour attribuer des peptides dans la base de données de séquence non redondant NCBI en utilisant une restriction taxonomique, 'Humain'. La recherche de base de données a été réalisée avec les paramètres décrits par Yoshimura et al. [40]. Analyse
image et l'acquisition d'images de séquençage de peptide MS et l'analyse ont été réalisées avec Molecular Imager FXProPlus (Bio-Rad) et le logiciel de ImageMaster (Bio-Rad). Des comparaisons ont été faites entre les images de gel de la tumeur et appariés échantillons non tumorales deux par deux. les différences de volume normalisé ont été statistiquement calculés pour les cinq cas. Le contenu de la glycéraldéhyde-3 phosphodéhydrogénase (GAPDH), la protéine a été utilisée comme référence pour évaluer la modification de pliage de l'expression protéique entre la tumeur et les tissus non tumorales adaptée que les niveaux d'ARNm GAPDH et de la protéine n'a pas été modifié entre des tissus obtenus à partir de patients. Constamment et sensiblement différents endroits ont été choisis pour l'analyse par LC-ESI-MS /MS. les taches de protéines! ont été découpées à partir des gels en petits morceaux, et on les soumet à une digestion dans le gel pendant une nuit tryptique [40]. Les spectres de masse de peptides ont été enregistrés, et les paramètres pour l'acquisition des spectres ont été utilisés comme indiqué précédemment [40]. Précision en protéines de base de données correspondant en utilisant Mascot Recherche [41] a été jugée comme un score de plus de 37 ans, qui a été obtenu dans la plupart des analyses. Isolement
de l'ARN et l'analyse par RT-PCR
tumeur et appariés échantillons non tumorales (env. 50 mg de poids humide) ont été hachés, puis homogénéisé manuellement dans 1 ml de réactif TRIZOL (Invitrogen) sur la glace. L'ARN a été isolé sans traitement à la DNase I selon le protocole du fabricant. Brièvement, 0,2 ml de CHCl 3 ont été ajoutés à l'homogénat, suivie d'une centrifugation à 20 600 xg pendant 15 min. Un volume égal de 2-propanol a été ajouté au surnageant résultant pour précipiter l'ARN. Après centrifugation, le culot a été rincé avec de l'éthanol à 75% /diethylpyridylchloride (DEPC) de l'eau imprégnées, suivi par un séchage. Le culot a été dissous dans un volume approprié d'eau traitée par DEPC que la fraction d'ARN total. Pour la transcription inverse (RT), 2 ug d'ARN à partir de chaque échantillon a été transcrit à 37 ° C pendant 1 h, en présence de 200U du virus de la leucémie Molony transcriptase inverse (Promega), oligo (dT) 18/12 amorce, dNTP 0,5 mM et 50U de RNaseOUT. Les PCR pour l'anhydrase carbonique-I et II, glutathion-S-transférase, FOV et GAPDH ont été effectuées dans une plage linéaire de l'amplification en utilisant l'ensemble sélectionné amorce et les conditions, et la taille prévue de produits, tels que résumés dans le tableau 4. La PCR

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