alterazione proteomica in adenocarcinomi gastic da pazienti giapponesi

alterazione proteomica in adenocarcinomi gastic da pazienti giapponesi
Abstract
sfondo
adenocarcinoma gastrico comprendono uno dei più comuni tipi di tumori nei paesi asiatici, tra cui il Giappone. profiling proteina completa di campioni chirurgici accoppiati di adenocarcinomi gastrici primari e non tumorali mucose derivati ​​da pazienti giapponesi è stata effettuata mediante elettroforesi bidimensionale (2D-EP) e spettrometria di massa cromatografia liquida-elettrospray ionico tandem (LC-ESI-MS) per stabilire le proteine ​​cancro-specifica gastrico come biomarcatori clinici putativi e bersagli molecolari per la chemioterapia.
Risultati
alterazioni relativamente comune nei espressione della proteina sono stati rivelati nei tessuti tumorali. Sono stati osservati aumenti di superossido manganese e non istoniche cromosomica proteine ​​HMG-1 (HMG-1), mentre i decrementi in anidrasi carboniche I e II, glutatione-S-transferasi e precursore foveolin (gastrokine-1) (FOV), stomaco 18-kDa proteine ​​SPECIFICI con putativa attività soppressore del tumore, sono stati rilevati. analisi RT-PCR ha anche rivelato significativo down-regolazione dell'espressione FOV mRNA nei tessuti tumorali.
Conclusione
Un possibile ruolo patologico per la down-regolazione del FOV in stato dimostrato carcinogenesi gastrica. Valutazione delle diminuzioni specifici geni e proteine ​​espressione del FOV nei pazienti può essere utilizzato come biomarker clinici per la diagnosi e la valutazione di cancro gastrico efficace.
Sfondo
adenocarcinoma gastrico comprendono uno dei più comuni tipi di tumori nei paesi asiatici, tra cui Giappone, essendo secondo solo al cancro del polmone per il numero di morti che provoca. Nonostante il recente sviluppo di tecniche diagnostiche, la maggior parte dei pazienti affetti da cancro gastrico sono diagnosticati in fase avanzata e hanno un tasso molto basso sopravvivenza a cinque anni (meno del 10%) [1]. Questo è in parte dovuto alla mancanza di biomarcatori specifici e sensibili per la diagnosi e il monitoraggio dei progressi della malattia in una fase precoce, anche se alcuni marcatori tumorali gastrici, tra cui l'antigene carcinoembrionario, sono stati utilizzati e sono in parte efficace. Come carcinogenesi gastrica è un processo a più fasi, è necessaria anche un'analisi completa per i singoli casi, in cui si verificano diversi eventi molecolari in ogni processo cancerogeno.
Recentemente, analisi proteomica è stata utilizzata per esaminare globalmente l'espressione della proteina nei fluidi corporei, tessuti e cellule [ ,,,0],2-4]. Questo approccio, come proteomica clinica, è molto utile per identificare le proteine ​​associate alla malattia che mostrano cambiamenti nell'espressione e modifica corrispondenti ad una condizione di malattia [5, 6]. Queste proteine ​​correlati alla malattia dovrebbero essere biomarcatori per la diagnosi e le proteine ​​target putativi per il trattamento [7-9]. D'altra parte, analisi complete di transcriptomes in tessuti tumorali da vari pazienti affetti da cancro utilizzando DNA microarray e gene chip sono stati effettuati negli ultimi anni [10]. Tuttavia, la mancanza di correlazione tra le variazioni di mRNA e cancerogenesi è stata dimostrata, e cambiamenti quantitativi e qualitativi di post-traduzionali proteine ​​modificate come prodotti genici finali sono considerati più informativi di quelli di mRNA nei tessuti tumorali per studiare gli eventi molecolari in cancerogenesi. studi di proteomica per l'individuazione di proteine ​​associate al tumore nel cancro gastrico sono in aumento, e le banche dati proteoma per i tessuti gastrici [11] e le linee cellulari [12] sono stati costruiti. La maggior parte di essi riguardano proteine ​​o antigeni specifici che riflettono le proprietà chemioterapia e termo-resistente di cancro allo stomaco [13-15], e che sono associati con Helicobactor pylori
[16, 17]. Nel presente studio, abbiamo effettuato un'analisi completa del proteoma del tumore e dei tessuti non tumorali nei pazienti giapponesi con carcinomi gastrici, e identificato diverse proteine ​​i cui livelli di espressione sono comunemente alterati in casi clinici. In particolare, l'espressione di gastrokine-1 (GKN-1) è stato suggerito di essere sia sotto controllo trascrizionale e traslazionale.
Risultati
separazione delle proteine ​​e l'identificazione
figura 1A mostra una panoramica immagine di un gel tipico maestro per un tessuto tumorale gastrica. Circa 200 spot proteici colorati con Coomassie blu brillante (CBB) R-250 erano ben separati in gel. I punti numerati in figura 1B e 1C sono state tagliate dal gel, trattate con tripsina e quindi sottoposti a cromatografia spettrometro di massa-elettronico spruzzo ionizzazione tandem liquida (LC-ESI-MS /MS) analisi. Settanta-due di loro in rappresentanza di 69 diverse specie di proteine ​​sono stati identificati. La tabella 1 elenca tutte le proteine ​​identificate attraverso peptide di corrispondenza con l'algoritmo di ricerca mascotte. L'accuratezza nella profilazione delle proteine ​​è stato valutato come il valore punteggio (sopra 37). Figura 1 (A) Una panoramica delle immagini di un gel maestro 2D per il tessuto tumorale derivato da un paziente con un adenocarcinoma gastrico. (B) e (C) Gli spot proteici numerate sono stati identificati mediante LC-ESI-MS /MS e corrispondenti proteine, come indicato come figure ingrandita.
Table profilo 1 Protein rilevata nel tessuto tumorale derivato da un paziente giapponese con un gastrica adenocarcinoma.
Spot No.
numero adesione
identificazione delle proteine ​​

Messa
SC (%)
PI
Punteggio
1
24.308.169
axonemal catena pesante dynein tipo 3
473.776
0
6.04
37 2
15.010.550
calore shock protein precursore gp96
90309 7
4.73
62 3
72222
shock termico proteina 90 -β
83.584
14
4,97
176 4
5.729.877
heat shock 70 kDa proteina 8 isoforma 1
71082
19
5.37
283
5
38.044.288
gelsolin isoforma b
80.876
5
5.58
63
6
4.826.960
glutaminyl-tRNA sintetasi
88.655
1 6,71
44 7
4.501.867
aconitasi 2
86113
10
7.36
231
8
119717
ezrin
69470
7
5.94
75
9
4557871
transferrin
79280
9
6.81
97
10
16507237
heat scioccare 70 kDa proteina 5
72402
15
5,07
165
11
24.234.686
calore shock protein 70 kDa proteina 8
53598
16
5.62
160
12
4.885.431
heat shock 70 1B proteine ​​kDa
70267
11
5.48
143
13
1.082.886
tumore necrosis factor di tipo 1 proteina recettore-associata TRAP-1
75694
13
8.43
288
14
31.542.947
chaperonin, mitocondriale P1 proteina della matrice, P60 linfociti proteina
61187
13
5.7
299
15
28592
siero albumin
71316
23
6.05
292
16
340219
vimentin
53738
18
5.03
79
17
4503729
similar alla proteina FK506-binding 4
49031
5
5.6
36
18
32709
IFP53
53559
21
5.93
277
19
4502643
chaperonin-containing TCP1, subunit6A (zeta 1)
58444
6
6,23
79
20
7.106.439
tubulina, β5
50095
14
4.78
125
21
37492
α-tubulin
50810
13
5.02
94
22
125604
pyruvate chinasi, M2 isozyme
58447
5
7.95
234
23
4557014
catalase
59947
6
6.9
120
24
4503483
eukaryotic traduzione di allungamento fattore 2
96.246 4
6.41
56
25
179.279
ATP sintetasi subunità β
56861
5
5.39
59
26
7.657.041
down-regolato in metastasi
320846 2
7,07
40
27
4.504.169
glutatione sintetasi, GSH synthetase
52523
5
5.67
99
28
12017952
GE36
73327
2
5.2
37
29
34234
laminin-binding proteine ​​
31888
12
4.84
51
30
16.359.158
actina, beta
42078
14
5.29
171
31
6.635.125
KIAA0284 proteine ​​
161.473 2
6,36
47
32
5.803.225
14-3-3 epsilon
29326
8
4.63
49
33
4.504.707
inositolo polifosfato-4-fosfatasi, tipo II, 105 kD
105749
1 5,87
37
34
35.038.601
proteina ipotetica DKFZp761A078
74864
2
7.27
47
35
12017952
GE36
73327
1
5.2
38
36
4505877
plectin 1 isoforma 1
520.111
1 5,57
44
37
38.158.018
centrosomica proteina 1, centriolo associati proteine, centriolin
269.874
1 5.44
39
38
30.157.438
CTD-binding SR-come rA9 proteina
180240
1 9.15
41
39
4.503.471
traduzione eucariotica fattore di allungamento 1 α1
50451
12
9.1
191
40
4.757.810
ATP sintasi
59828
17
9.16
178
41
693.933
2-phosphopyruvate-idratasi α-enolasi
47421
22
7.01
240
42
123.576
47 kDa calore shock protein precursore
46352
14
8.27
177
43
5.032.069
splicing fattore 3b, subunità 4
44414 3
8.54
58
44
4.503.471
eucariotica traduzione allungamento fattore 1 α1
50451 4
9.1
47
45
5.921.789
citrato sintasi, precursore mitocondriale
51959
12
8.13
114
46
4.505.763
fosfoglicerato chinasi 1
44985
14
8.3
87
47
4.504.069
aspartato aminotransferasi 2 precursore
47844
6
9.14
52
48
7.669.492
gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi
36201
13
8.57
49
49
4.757.756
annexin A2
38808
9
7.57
87
50
6.648.067
malato deidrogenasi, mitocondriale precursore
35965 7
8.92
60
51
5.031.857
lattato deidrogenasi
a 36950
6
8.44
43
52
238427
porin 31 HM
30737
29
8.63
124
53
5.174.447
guanina nucleotide-binding protein
35511 Pagina 8
7.6
65
54
34.740.329
eterogenea ribonucleoprotein nucleare A3
39799
7
9.1
43
55
4504983
galectin-3
26229
12
8.58
42
56
4504447
heterogeneous ribonucleoprotein nucleare A2 /B1 isoforma A2
36041 7
8.67
40
57
86901
ATP-dipendente DNA elicasi RAP30 /74 catena RAP30
26350
3
9.46
41
58
230.445
carbonica I
28903
12
6.44
67
59
455739
carbonica II
29285 Pagina 8
6,87
82
60
26.892.090
beta-globina variante catena
16101
40
7.86
121
61
34709
manganese superossido dismutasi
24891 10
8.35
111
62
4.507.645
triosephosphate isomerase 1
26938
17
6,45
47
63
38.488.935
foveolin precursore
20546
16
5,65
95
64
478813
proteine ​​non istoniche cromosomica HMG-1
25139
13
5.41
60
65
2.204.207
glutatione S-transferase
23595
34
5.43
73
66
178755
proapolipoprotein
28944
8
5.45
103
67
37267
transketolase
68435
4
7.9
59
68
189998
M2-type piruvato chinasi
58447 10
7,95
157
69
825.605
glutatione S-transferasi
25650 10
8.51
65
Queste proteine ​​possono essere classificati in diverse categorie in base alle loro funzioni, tra cui proteine ​​del citoscheletro, proteine ​​legate allo stress e chaperoning, proteine ​​della fase acuta, enzimi glicolitici, enzimi coinvolti nel metabolismo e la proliferazione delle cellule, proteine ​​soppressori tumorali e proteine ​​specifiche di stomaco . sono stati rilevati alterazioni
comuni di espressione della proteina tra tumore e non tumorali tessuti nel cancro gastrico pazienti
alterazioni Diverse in proteomi tra il tumore e non tumorali tessuti dagli stessi pazienti. Come mostrato in figura 2, sono stati osservati tra in cinque pazienti con cancro gastrico giapponesi (cause A a E) le diverse alterazioni comuni. Manganese superossido dismutasi (MnSOD), non istoniche cromosomica proteine ​​HMG-1 (HMG-1), chinasi fosfoglicerato 1 (PGK-1), anidrasi carbonica I e II (CA I e II), foveolin precursore FOV (gastrokine-1), aspartato aminotransferasi 2 precursore (AST), e glutatione S-transferasi (GST) hanno mostrato variazioni comuni nell'espressione tra tessuti tumorali e non tumorali, anche tra le proteine ​​identificate. L'espressione della proteina di MnSOD e HMG-1 ha dimostrato di essere up-regolata nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti non tumorali in. D'altra parte, il CA I e II, FOV, AST e proteine ​​GST sono stati rivelati da down-regolato nei tessuti tumorali. I cambiamenti piega nell'espressione di queste proteine ​​relative a quella della GAPDH sono riassunti nella Tabella 2. Il più notevole calo è stato mostrato nel livello di FOV in tutti i casi. Il grado della diminuzione dell'espressione della proteina GST era quasi la stessa di quella in FOV (cause B, D, ed E), anche se non è stato osservato negli altri due casi. D'altra parte, l'aumento della HMG-1 è stato contrassegnato in tre casi (A, C, e D), anche se una tale differenza di espressione non è stata osservata in altri due casi. MnSOD mostrato una tendenza ad aumentare nei tessuti tumorali di pazienti (casi A, C, e D), ma una diminuzione relativa è stata osservata anche nel caso di B. Per quanto riguarda PGK-1, una significativa relazione tra i cambiamenti piega in espressione della proteina e la classificazione patologica dei tumori è stata appena osservato. Figura 2 modelli alterazione dettagliate delle proteine. (A) non tumorali e (B) proteine ​​tumorali tra cui CAI (No.58), CAII (No.59), MnSOD (No.61), FOV (No.63), HMG-1 (No.64), e GST (No.65). (C) non tumorali e (D) le proteine ​​tumorali tra cui PGK-1 (No.46), AST (No.47), e GST (No.69). GAPDH, cerchiata, è stato utilizzato come proteina di riferimento.
Tabella 2 modifiche volte in espressione della proteina tra i tessuti non tumorali e tumorali derivati ​​da cinque pazienti con adenocarcinoma gastrico.
proteine ​​
caso A
caso B
causa C
caso D
causa E

CA I
-6.5 -1.6

-3.3 -4.3

-2.6
CA II
-2.6
-1.3
-26
-4.3
-13
FOV
-13
-13
-26
*
-26
MnSOD
+1.7
-2.6
+6.5
+1.4
+1.1
HMG-1
+13
*
+3.7
+13
*
PGK1
+1.6
+1.1
-1.2
+2.6
-1.4
AST
-13
-1.6
-6.5
-3.7
-2.6
GST
*
-26
*
-13
-13
CA I, anidrasi carbonica I.
CA II, carbonica II.
FOV, precursore foveolin.
MnSOD, manganese superossido dismutasi.
HMG-1, non istoniche proteina cromosomica.
PGK1, fosfoglicerato chinasi 1.
AST, aspartato aminotransferasi 2 precursore.
GST, glutatione S-transferasi.
*, non determinato.
RT-PCR analisi
mediante RT-PCR, cambiamenti di mRNA espressione in tumore e tessuti non tumorali derivate da pazienti affetti da cancro gastrico sono stati analizzati per le proteine ​​che mostravano alterazioni nell'espressione delle proteine, tra cui FOV, MnSOD e HMG-1. Come mostrato in figura 3, FOV mRNA era significativamente ridotta nei tessuti tumorali in quattro a tutti i pazienti (casi A, B, C ed E), mentre non è stata rilevata sia in tessuti non tumorali o tumorali dell'altra paziente (caso D) . D'altra parte, MnSOD mRNA era marcatamente aumentata in quattro pazienti (casi B, C, D, ed E), anche se è stato rilevato poca differenza nel livello di mRNA tra i tessuti non tumorali e tumorali in caso A. Tuttavia, un rapporto tra HMG-1 espressione di mRNA e i fenotipi patologici dei tumori è stata appena osservato. Figura 3 Confronto di espressione di mRNA di proteine, eventualmente associata a carcinogenesi tra non tumorali e tumorali tessuti derivati ​​da cinque pazienti con adenocarcinoma gastrico (casi da A a E) mediante RT-PCR. N e T indicano tessuti non tumorali e tumorali, rispettivamente,
. Discussione
In questo studio abbiamo effettuato analisi proteomica di tumore e dei tessuti non tumorali derivati ​​da pazienti con adenocarcinoma gastrico giapponesi. Sessantanove diverse proteine ​​nel tessuto tumorale da un caso di cancro gastrico sono stati identificati da 2D-EP e LC-ESI-MS /MS, che comprendeva proteine ​​da stress, Hsp70, Hsp90 e chaperonine contenenti TCP1 (CCT), per l'auto-protezione; enzimi glicolitici, triose fosfato isomerasi 1, α-enolasi e PGK-1, per il fabbisogno energetico in crescita; proteine ​​del citoscheletro, Ezrin, b isoforma gelsolin e vimentina; proteine ​​coinvolte nella differenziazione cellulare e la proliferazione, galectina-3 e transferrina; e le proteine ​​esibendo putativo attività soppressore del tumore, FOV. Molte di queste proteine ​​sono stati segnalati per essere associate con la tumorigenesi degli adenocarcinomi gastrici coinvolgono più passaggi e fattori [18, 19].
Abbiamo inoltre dimostrato che i livelli di espressione di diverse proteine ​​nei tessuti tumorali erano comunemente alterati in cinque pazienti giapponesi con adenocarcinomi gastrici, rispetto a quelle nei tessuti non tumorali. Un aumento comune in espressione della proteina nei tessuti tumorali si è verificato per MnSOD, HMG-1 e PGK-1, mentre una diminuzione comune nei tessuti tumorali si è verificato per FOV, GST e AST
superossido (O 2 . - ), un radicale libero, è essenziale per l'azione antimicrobica di granulociti e monociti. Superossido dismutasi (SOD) rimuove rapidamente la quantità in eccesso di superossido prodotto nelle reazioni di stress e biologici in vivo
attraverso la catalisi della conversione di superossido con H + per H 2O 2 e O 2. MnSOD, uno dei SOD, si trova nei mitocondri e contribuisce alla protezione del DNA mitocondriale da danni. E 'stato riportato che una maggiore espressione di MnSOD nel carcinoma gastrico progressiva dovrebbe essere correlato al tasso di sopravvivenza a 5 anni dopo l'intervento [20] e la sensibilità alla chemioterapia [21]. In questo studio, l'espressione della proteina di MnSOD era up-regolato in 4 su 5 pazienti affetti da cancro gastrico, suggerendo una risposta auto-tutela. D'altra parte, l'up-regulation della MnSOD nei tessuti tumorali è stata considerata per interferire con la chemioterapia efficace basato su produzione di radicali, che può provocare una diminuzione della sensibilità ai farmaci anti-cancro e determinare la gravità del cancro.
HMG-1 regola la trascrizione di vari geni e la stabilizzazione strutturale dei cromosomi come proteina legante il DNA. HMG-1 è stato segnalato per essere associato con la carcinogenesi e metastasi nel colon-retto e della mammella [22]
. Trascrizionale up-regolazione di HMG-1 nel cancro gastrico è stato anche dimostrato [23]. L'espressione di HMG-1 nei tessuti tumorali stato suggerito essere correlato alla resistenza al cisplatino [24]. Abbiamo dimostrato qui un aumento di questa proteina in tre casi.
GST è un enzima metabolizzano i farmaci che catalizza la coniugazione del glutatione ridotto ai farmaci e metaboliti, e contribuisce anche alla disintossicazione di sostanze cancerogene. Pertanto, una diminuzione dell'attività può essere un fattore di rischio per carcinogenesi. L'infezione da Helicobacter pylori è stata segnalata per causare una diminuzione dell'espressione di GST [25], suggerendo che una diminuzione dell'attività GST potrebbe essere causa di carcinogenesi gastrica. In questo studio, una diminuzione dell'espressione della proteina GST è stata osservata in tre casi. Una diminuzione dell'espressione della proteina GST può essere utilizzato come biomarker per la diagnosi di tumori gastrici.
AST è un aminotransferasi che agisce su aminoacidi e acido α-cheto, che è ampiamente distribuito in organi umani. AST viene rilasciato nel flusso sanguigno a causa di una maggiore permeabilità e la distruzione dei tessuti. Una elevata concentrazione di proteine ​​AST è stata riportata nel sangue di pazienti affetti da epatite, tumori maligni compresi epatomi e leuchemia. L'espressione genica di GST è stato anche dimostrato di essere up-regolata nei tessuti tumorali del colon-retto [26]. Tuttavia, una diminuzione dell'espressione della proteina AST era comunemente osservato in tutti i tessuti tumorali derivate dagli attuali cinque pazienti con adenocarcinoma gastrico. Ulteriore studio deve essere eseguito per chiarire se una diminuzione della proteina AST è specificamente osservata nei tessuti tumorali gastriche o meno.
Espressione Veduta di PGK-1, che è uno degli enzimi nella via glicolitica e che catalizza la defosforilazione 1,3-bisphosphoglycerate per produrre ATP, è stato osservato in molti tessuti tumorali maligne che dipendono ATP come fonte di energia maggiore. tumori solidi sono pensati per bisogno della sovrapproduzione di ATP per mantenere la proliferazione migliorata. L'up-regolazione di enzimi glicolitici, tra cui PGK-1 nel cancro del polmone [27] e M2 di tipo piruvato chinasi nel tumore del colon-retto [28], è stata riportata e ha suggerito di essere utile per lo screening del cancro. Tuttavia, nel presente studio, una relazione significativa tra PGK-1 espressione proteica e le fenotipi di adenocarcinomi gastrici era appena rilevato. Pertanto, PGK-1 è stato considerato come non adatto per la diagnosi di cancro gastrico.
Anidrasi carboniche (CAS) sono enzimi contenenti zinco che sono distribuiti ampiamente in vari organi e che costituiscono una grande famiglia compresa CA-I a CA -IX. Essi catalizzano l'idratazione della CO 2 per metabolismo intermedio, e mantenere il pH e l'equilibrio ionico nel corpo. Finora un rapporto diretto è stata dimostrata tra la trasformazione maligna e l'espressione di proteine ​​per CAS I a VII [29]. Due studi precedenti hanno rivelato che l'espressione sia di CA-I e CA-II è risultata significativamente ridotta nei tumori del colon-retto rispetto al normale epiteli del colon-retto o mucose [30]. Un altro rapporto ha presentato i risultati mostra che ha ridotto l'espressione di CA-I e CA-II è stata correlata con l'aggressività biologica del cancro del colon-retto e metastasi a distanza sincrona [31]. Come suggerito in precedenza [32], carcinomi gastrici e del colon-retto può condividere un simile meccanismo di proliferazione cellulare e della mucosa malignità, e può diventare un biomarker per questi carcinomi, perché sono state anche osservate diminuzioni comuni nel espressione della proteina di CA-I e CA-II in questo studio.
FOV, che è identico a un 18-kDa antro proteina mucosa specifici per lo stomaco! (AMP-18) [33, 34], GKN1 [35], e le interazioni tra fattori trifoglio (z) (TFIZ) [36], ha dimostrato di essere drammaticamente down-regolato o assente nei pazienti con adenocarcinoma gastrico in questo studio. L'umano AMP-18 e prodotto genico CA11 carcinoantigenic umana, che codifica una sequenza di amminoacidi che differisce da quella di AMP-18 in un solo residuo [37, 38], funzionano come fattori di crescita secreti in parte responsabili per il mantenimento di un normale gastrica funzionale epitelio [33]. Sia AMP-18 e il prodotto genico CA11 sono stati segnalati per essere intensamente espressa in tessuto normale stomaco, ma non in tumori più gastrico [33, 37, 38]. studi di immunoistochimica hanno dimostrato che AMP-18 sembra essere presente nelle cellule epiteliali della mucosa del normale gastrico umano e del duodeno [33]. Recentemente, è stato dimostrato TFIZ agire come regolatore della crescita delle cellule epiteliali gastriche attraverso la formazione di un eterodimero con fattore di trifoglio 1 (TFF1) [36]. I nostri dati attuali confermano ulteriormente l'elevata espressione di FOV in tessuti non tumorali gastriche e significativa soppressione della proteina in adnocarcinomas gastrici, indicando che FOV giocano un ruolo nel mantenimento della normale differenziazione delle cellule epiteliali e soppressione del tumore, ma non nei tessuti tumorali. Inoltre, abbiamo dimostrato che la trascrizione del FOV mRNA era anche comunemente down-regolato nei pazienti affetti da cancro gastrico, indicando che una marcata diminuzione di proteine ​​FOV è stato causato dalla soppressione dell'espressione genica FOV. Inoltre, in un paziente la proteina non è stato rilevato in tessuti non tumorali, suggerendo che il livello di espressione di proteine ​​FOV in individui possono determinare il fenotipo adenocarcinoma gastrico. Di conseguenza, il livello di espressione di FOV come biomarker può essere informativo per la valutazione del cancro gastrico.
Conclusione
Profilo delle proteine ​​di tumore e non tumorali tessuti derivati ​​da pazienti giapponesi con adenocarcinoma gastrico è stata effettuata utilizzando 2D-EP e LC ESI-MS /MS. Le proteine ​​identificate inclusi chaperon molecolari, enzimi che producono energia, proteine ​​citoscheletriche e così via. alterazioni delle proteine ​​comuni sono stati rilevati nei pazienti affetti da cancro gastrico. L'espressione proteica di MnSOD e HMG-1 era regolato up-mentre quello di GST, AST e FOV è stato down-regolato nei tessuti tumorali gastriche. Una correlazione tra l'alterazione di queste proteine ​​e la loro espressione trascrizionale nel cancro gastrico è stato appena osservato in questo studio, eccetto nel caso del FOV. Sia l'espressione proteica e genica di FOV, un fattore di crescita secretoria specifiche stomaco per normali cellule epiteliali gastriche, era marcatamente down-regolato nei tessuti tumorali derivate da pazienti giapponesi con adenocarcinoma gastrico. Il monitoraggio dei livelli di espressione di questa proteina specifica per lo stomaco in campioni clinici può fornire informazioni utili per la diagnosi di cancro gastrico come biomarker specifico e per una migliore comprensione della carcinogenesi gastrica.
Metodi
Materiali
DNasi I, RNasi A, 2-mercaptoetanolo (2-ME), perle di vetro (212-300 micron), Nonidet P-40, acrilammide, N, N, N ', N'
-tetramethylenediamine (TEMED), sodio dodecilsolfato (SDS ), iodoacetamide e ditiotreitolo (DTT) sono stati acquistati da Sigma (St. Louis, MO). Agarosio per isoelettronico messa a fuoco (IEF), e Pharmalyte pI 3-10, 4-6.5 e 8-10.5 erano da Amersham Bioscience (Piscataway, NJ). Tripsina (sequenziamento grado) è stato da Roche (Manheim, Germania). Phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), tiourea, sorbitolo, pirofosfato di sodio, persolfato di ammonio, acido D, L-aspartico, acido tricloroacetico, diidrato acido salicilsolfonico, acido acetico, acetonitrile, acido formico e acido trifluoroacetico (TFA) erano da Wako Chemicals Pure (Osaka , Giappone). L'urea è stato da Katayama sostanze chimiche (Osaka, Giappone). Pepstatin A e leupeptina erano dalla Peptide Institute (Osaka, Giappone). NH 4HCO 3 e N, N'-Methylenebisacrylamide erano da Nacalai Tesque (Kyoto, Giappone). CBB R-250 era da ICN Biomedicals Inc. (Aurora, OH). standard di massa molecolare sono stati da APRO Science, Inc. (Tokushima, Giappone). Reagente Trizol era da Life Technologies (Frederick, MD). Oligo (dT) 12-18 Primer, deoxynucleotides (dNTP), e RNaseOUT erano da Invitrogen (Carlsbad, CA). M-MLV trascrittasi inversa e polimerasi Taq DNA erano da Promega (Madison, WI).
Tessuti e la preparazione dei campioni
adenocarcinomi gastrici primarie e mucose non tumorali adiacenti sono stati raccolti su gastrectomia e forniti dal Dipartimento di Chirurgia, Graduate School di Medicina, Università di Tokushima, Tokushima, in Giappone. La ricerca è stata effettuata in conformità con la Dichiarazione di Helsinki della World Medical Association, ed è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Tokushima. Il consenso informato è stato dato anche da tutti i pazienti che hanno fornito i campioni clinici. I tessuti sono stati congelati in un bagno di ghiaccio-metanolo secco appena possibile dopo la dissezione e conservati in un congelatore (-80 ° C) prima dell'uso. Per l'analisi di mRNA, i tessuti sono stati immersi in RNAlater (Takara, Tokyo, Giappone) prima del congelamento. dati clinicopatologica dettagliata compresa la fase del tumore (secondo il sistema AJCC), sito e la differenziazione, e dati istologici sui campioni di tessuto sono elencate nella Tabella 3. Nessuno di questi casi sono stati classificati nella categoria tipo scirrhous e tessuto tumorale era chiaramente distinguishted da non tumorali uno in ciascun caso. Per elettroforesi bidimensionale (2D-EP), estrazione di proteine ​​da tessuti è stata effettuata secondo la seguente procedura. I blocchi congelati (20-30 mg di peso umido) sono stati omogeneizzati con un pestello di plastica (Toyobo, Tokyo, Giappone), in presenza di perle di vetro a 10 vol /peso fresco di tampone di dialisi che comprende 5 M urea, 1 M tiourea, 10 mM Nappi , 1,67 microlitri /ml 2-ME, 0,005% DNasi I, 0,05 mg /ml RNasi a, 20 leupeptina mM, EDTA 1 mM, 2 mM PMSF e 20 pM pepstatinA e quindi centrifugati a 50.000 rpm per 30 minuti a 4 ° C (Beckman -Coulter, Fullerton, CA). Il supernatante risultante è stato utilizzato come estratto tissutale. concentrazioni di proteine ​​sono stati determinati con un Bradford kit di analisi delle proteine ​​(Bio-Rad, Hercules, CA) utilizzando bovina gamma-globuline come standard.Table 3 caratteristiche cliniche dei pazienti con adenocarcinoma gastrico.
Case

Age

Sex

Locationa

Gradeb

Stage


A
63
Male
UM
G3
IIIA
T2N2M0H0
B
68
Female
L
G2
II
T2N2M0
C
76
Male
ML
G2
IV
T4N3M0
D
78
Female
L
G2
III
T2N0M0H0
E
77
Male
ML
G2
II
T2N1M0
aU: superiore, M: medio, L:
inferiori bg2: moderatamente differenziato, G3:. scarsamente differenziato
elettroforesi su gel a due dimensionale anche
2D-EP è stata effettuata come descritto in precedenza [39]. Il primo-dimensionale focalizzazione isoelettrica è stata eseguita in un 1% (w /v) di gel di agarosio (φ 2,6 × 180 mm) con un pH 3-10 gradiente a 700 V per 18 ore a 4 ° C, e la seconda dimensione SDS gel elettroforesi è stata eseguita con un 5-15% (w /v) acrilammide gradiente (M
gamma r, 6-200 kDa) in un gel lastra standard (20 × 13 cm) a 15 mA per 3 ore, e poi a 70 mA per 2 ore a temperatura ambiente. I gel sono state colorate con CBB R-250.
Campioni proteici (500 mg) estratti dal centro tumore e che circonda la mucosa istologicamente normale sono stati sottoposti a 2D-EP ed eseguire in parte coppie a fianco.
Alcuni dei luoghi macchiati sono stati asportati dal 2D-gel, in-gel digerito con tripsina e quindi sottoposto ad analisi LC-ESI-MS /MS come precedentemente descritto [40]. La miscela di peptidi è stata separata con un sistema di fase nanoLC inversa (Noto, Swichos II, ultimo, LC Imballaggio, Sunnyvale, CA). I peptidi eluiti sono stati spruzzati direttamente in uno spettrometro di massa ESI (Esquire3000 Inoltre, Bruker-Daltonics, Fremont, CA).
Un grande volume di dati MS /MS è stata acquisita con DataAnalysis 3.1 software (Bruker-Daltonics), convertiti in testo file che elencano i valori di massa degli ioni genitore, e le intensità e le masse di ioni frammento, e poi elaborati con l'algoritmo Mascot (Matrix Science Ltd, London, UK) per assegnare i peptidi nel database di sequenze NCBI non ridondante utilizzando una restrizione tassonomica, 'umano'. La ricerca del database è stata eseguita con i parametri descritti da Yoshimura et al. [40]. Analisi Immagine Stock e MS peptide sequenziamento
acquisizione di immagini e analisi sono state effettuate con Molecular Imager FXProPlus (Bio-Rad) e il software ImageMaster (Bio-Rad). I confronti sono stati fatti tra le immagini di gel di tumore e abbinato coppia campioni non tumorali per coppia. differenze di volume normalizzati sono stati statisticamente calcolate per tutti e cinque i casi. Il contenuto di gliceraldeide 3-phosphodehydrogenase proteine ​​(GAPDH) è stato utilizzato come riferimento per valutare l'alterazione piega dell'espressione proteica tra tumore e abbinati non tumorali tessuti come i livelli di GAPDH mRNA e proteine ​​che non sono stati modificati tra tessuti derivati ​​da pazienti. Costantemente ed ampiamente diversi punti sono stati selezionati per l'analisi LC-ESI-MS /MS. spot proteici! sono stati tagliati fuori dal gel in piccoli pezzi, e sottoposti a in-gel digestione trittico durante la notte [40]. sono stati registrati spettri di massa peptidica e parametri per l'acquisizione degli spettri sono stati usati come affermato in precedenza [40]. La precisione in corrispondenza proteine ​​database utilizzando mascotte Cerca [41] è stato giudicato come un punteggio su 37, che è stato ottenuto nella maggior parte delle analisi. Isolamento
RNA e analisi RT-PCR
tumore e abbinato non tumorali campioni (circa. 50 mg di peso umido) sono state macinate e quindi omogeneizzata manualmente in 1 ml di reagente TRIZOL (Invitrogen) su ghiaccio. L'RNA è stato isolato in assenza di trattamento DNasi I secondo il protocollo del produttore. Brevemente, 0,2 ml di CHCl 3 è stato aggiunto al omogenato, seguita da centrifugazione a 20.600 xg per 15 min. Un volume uguale di 2-propanolo è stato aggiunto al supernatante risultante per precipitare l'RNA. Dopo centrifugazione, il pellet è stato lavato con 75% di acqua -treated etanolo /diethylpyridylchloride (DEPC), seguito da essiccamento. Il pellet è stato disciolto in un volume adeguato di acqua DEPC trattati come frazione dell'RNA totale. Per la trascrizione inversa (RT), 2 mg di RNA da ciascun campione è stato trascritto a 37 ° C per 1 h in presenza di 200U di Molony virus della leucemia trascrittasi inversa (Promega), oligo (dT) 12-18 primer 0,5 mm dNTP e 50U di RNaseOUT. Le PCR per anidrasi carbonica-I e II, glutatione-S-transferasi, FOV, e GAPDH sono stati eseguiti in un intervallo lineare di amplificazione utilizzando il set selezionato di primer e condizioni, e la dimensione prevista dei prodotti, come riassunto nella tabella 4. La PCR

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