Proteomisk ændring i gastic adenokarcinomer fra japanske patienter

Proteomisk ændring i gastic adenokarcinomer fra japanske patienter
Abstract
Baggrund
Gastric adenocarcinomer omfatter en af ​​de almindelige typer af kræft i de asiatiske lande, herunder Japan. Omfattende protein profilering af parrede kirurgiske prøver af primære gastriske adenokarcinomer og nontumor slimhinden afledt fra japanske patienter blev udført ved hjælp af todimensional gelelektroforese (2D-EP) og væskekromatografi-elektrospray ionisk tandem-massespektrometri (LC-ESI-MS) at etablere mavekræft-specifikke proteiner som formodede kliniske biomarkører og molekylære mål for kemoterapi.
Resultater
Relativt almindelige ændringer i proteinekspression blev afsløret i tumorvæv. Stigninger i mangan dismutase og nonhistone kromosomale protein HMG-1 (HMG-1) blev observeret, mens fald i kulsyre anhydrases I og II, glutation-S-transferase og foveolin precursor (gastrokine-1) (FOV), en 18-kDa mave -specifik protein med formodet tumorsuppressoraktivitet, blev påvist. RT-PCR-analyse afslørede også signifikant nedregulering af FOV mRNA-ekspression i tumorvæv.
Konklusion
En mulig patologisk rolle for nedregulering af FOV i gastrisk carcinogenese blev demonstreret. Evaluering af de specifikke fald i gen og protein udtryk for FOV i patienter kan anvendes som kliniske biomarkører for effektiv diagnosticering og vurdering af mavekræft.
Baggrund
Gastric adenocarcinomer omfatter en af ​​de almindelige typer af kræft i de asiatiske lande, herunder Japan, bliver kun overgået af lungekræft, at antallet af dødsfald, den forårsager. På trods af den seneste udvikling af diagnostiske teknikker, er de fleste gastric kræftpatienter diagnosticeret på et fremskredent stadium og har en meget lav fem års overlevelse (mindre end 10%) [1]. Dette er delvist på grund af mangel på specifikke og følsomme biomarkører for diagnose og overvågning af fremskridt sygdom på et tidligt stadium, selv om nogle gastrisk tumormarkører, herunder carcinoembryonisk antigen, er blevet brugt og er delvis effektive. Som gastrisk carcinogenese er en flertrinsproces, er også påkrævet omfattende analyse for de enkelte tilfælde, hvor forskellige molekylære begivenheder forekommer i hvert kræftfremkaldende proces.
Nylig blev proteomisk analyse udnyttes til omfattende undersøge proteinekspression i kropsvæsker, væv og celler [ ,,,0],2-4]. Denne fremgangsmåde, som kliniske proteomics, er meget nyttige til identifikation sygdomsassocierede proteiner, som viser ændringer i ekspression og modifikation svarende til en sygdomstilstand [5, 6]. Disse sygdomsrelaterede proteiner forventes at være biomarkører for diagnose og formodede målrettede proteiner til behandling [7-9]. På den anden side har omfattende analyser af transcriptomes i tumorvæv fra forskellige cancerpatienter anvendelse af DNA microarrays og genchips blevet udført i de senere år [10]. Imidlertid har en mangel på sammenhæng mellem ændringer i mRNA og carcinogenese blevet påvist, og kvantitative og kvalitative ændringer af posttranslationelt modificerede proteiner som endelige genprodukter anses for at være mere informativ end mRNA i tumorvæv for at studere de molekylære begivenheder i carcinogenese. Proteomisk undersøgelser til identifikation af tumor-associerede proteiner i mavekræft er stigende, og proteomanalyse databaser for gastrisk væv [11] og cellelinjer [12] er blevet bygget. De fleste af dem vedrører specifikke proteiner eller antigener, der afspejler kemo- og termo-resistente egenskaber af mavekræft [13-15], og som er forbundet med Helicobactor pylori
[16, 17]. I den foreliggende undersøgelse, udførte vi omfattende proteomanalyse af tumor- og ikke væv i japanske patienter med gastriske carcinomer, og identificeret adskillige proteiner, som ekspressionsniveauerne er almindeligt ændret i kliniske tilfælde. Især blev ekspressionen af ​​gastrokine-1 (GKN-1) foreslået at være under både transkriptionel og translationel kontrol.
Resultater Salg Protein separation og identifikation
Figur 1A viser et billede oversigt over en typisk mester gel for en gastrisk tumor væv. Omkring 200 protein spots farvet med Coomassie brilliant blå (CBB) R-250 blev godt adskilt i geler. De nummererede pletter i figur 1B og 1C blev udskåret fra en gel, behandlet med trypsin og derefter underkastet væskekromatografi-elektronisk spray ionisering tandem massespektrometer (LC-ESI-MS /MS) analyse. Tooghalvfjerds af dem repræsenterer 69 forskellige proteinarter blev identificeret. Tabel 1 viser alle de proteiner identificeret ved peptid matching med Mascot søgealgoritme. Nøjagtigheden på protein profilering blev evalueret som score-værdi (over 37). Figur 1 (A) En oversigt over en master 2D gel image for tumorvæv stammer fra en patient med en gastrisk adenocarcinom. (B) og (C) De nummererede proteinpletter blev identificeret ved LC-ESI-MS /MS og protein matching, som vist som forstørrede figurer.
Tabel 1 Protein profil detekteres i tumorvæv afledt fra en japansk patient med en gastrisk adenocarcinom.
Spot No.
tiltrædelse nummer
Protein identifikation

Mass
SC (%)
PI
Score
1
24.308.169
axonemal tung kæde dynein type 3
473.776
0
6,04
37
2
15.010.550
varmechockproteinet gp96 forløber
90.309
7
4,73
62
3
72222
varmechokprotein 90 -β
83.584
14
4,97
176
4
5.729.877
varme shock 70 kDa protein 8 isoform 1
71.082
19
5,37
283
5
38.044.288
gelsolin isoform b
80.876
5
5,58
63
6
4.826.960
glutaminyl-tRNA syntetase
88.655
1
6,71
44
7
4.501.867
aconitase 2
86113
10
7.36
231
8
119717
ezrin
69470
7
5.94
75
9
4557871
transferrin
79280
9
6.81
97
10
16507237
heat shock 70 kDa protein 5
72.402
15
5,07
165
11
24.234.686
varmechockproteinet 70 kDa protein 8
53598
16
5.62
160
12
4.885.431
varme shock 70 kDa protein 1B
70267
11
5,48
143
13
1.082.886
tumor nekrose faktor type 1 receptor-associeret protein TRAP-1
75.694
13
8,43
288
14
31.542.947
chaperonin, mitokondrielle matrix protein P1, P60 lymfocyt protein
61.187
13
5,7
299
15
28592
serum albumin
71316
23
6.05
292
16
340219
vimentin
53738
18
5.03
79
17
4503729
similar til FK506-bindende protein 4
49031
5
5.6
36
18
32709
IFP53
53559
21
5.93
277
19
4502643
chaperonin-containing TCP1, subunit6A (zeta 1)
58.444
6
6.23
79
20
7.106.439
tubulin, β5
50095
14
4.78
125
21
37492
α-tubulin
50810
13
5.02
94
22
125604
pyruvate kinase, M2 isozyme
58447
5
7.95
234
23
4557014
catalase
59947
6
6.9
120
24
4503483
eukaryotic oversættelse elongeringsfaktor 2
96.246
4
6,41
56
25
179.279
ATP syntase β underenheden
56861
5
5,39
59
26
7.657.041
nedreguleret i metastase
320.846
2
7.07
40
27
4.504.169
glutathionsyntetase, GSH synthetase
52523
5
5.67
99
28
12017952
GE36
73327
2
5.2
37
29
34234
laminin-binding protein
31.888
12
4,84
51
30
16.359.158
actin, beta
42.078
14
5.29
171
31
6.635.125
KIAA0284 protein
161.473
2
6,36
47
32
5.803.225
14-3-3 epsilon
29326
8
4,63
49
33
4.504.707
inositol polyphosphatfremmet 4-fosfatase, type II, 105 kD
105.749
1
5,87
37
34
35.038.601
hypotetisk protein DKFZp761A078
74864
2
7.27
47
35
12017952
GE36
73327
1
5.2
38
36
4505877
plectin 1 isoform 1
520.111
1
5,57
44
37
38.158.018
centrosomal protein 1, centriole protein, centriolin
269.874
1
5.44
39
38
30.157.438
CTD-bindende SR-lignende protein rA9
180.240
1
9.15
41
39
4.503.471
eukaryote oversættelse elongeringsfaktor en α1
50.451
12
9,1
191
40
4.757.810
ATP syntase
59828
17
9.16
178
41
693.933
2-phosphopyruvate-hydratase α-enolase
47421
22
7,01
240
42
123.576
47 kDa varmechokprotein forløber
46352
14
8,27
177
43
5.032.069
splejsning faktor 3b, underenhed 4
44.414
3
8,54
58
44
4.503.471
eukaryote oversættelse elongeringsfaktor en α1
50.451
4
9,1
47
45
5.921.789
citratsynthase, mitokondrie forløber
51.959
12
8.13
114
46
4.505.763
phosphoglyceratkinasepromotor 1
44.985
14
8,3
87
47
4.504.069
aspartataminotransferase 2 forløber
47.844
6
9.14
52
48
7.669.492
glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase
36201
13
8.57
49
49
4.757.756
annexin A2
38.808
9
7,57
87
50
6.648.067
malat dehydrogenase, mitokondrie forløber
35.965
7
8.92
60
51
5.031.857
lactatdehydrogenase A
36950
6
8,44
43
52
238.427
porin 31 HM
30.737
29
8,63
124
53
5.174.447
guanin nukleotid-bindende protein
35.511
8
7,6
65
54
34.740.329
heterogen nukleare ribonucleoprotein A3
39799
7
9.1
43
55
4504983
galectin-3
26229
12
8.58
42
56
4504447
heterogeneous nuklear ribonucleoprotein A2 /B1 isoform A2
36041
7
8.67
40
57
86.901
ATP-afhængige DNA helicase RAP30 /74 kæde RAP30
26350
3
9.46
41
58
230.445
kulsyreanhydrase jeg
28903
12
6,44
67
59
455.739
kulsyreanhydrase II
29.285
8
6,87
82
60
26.892.090
beta-globin-kæden variant
16101
40
7,86
121
61
34.709
mangan superoxiddismutase
24891
10
8,35
111
62
4.507.645
triosephosphatisomerase 1
26.938
17
6,45
47
63
38.488.935
foveolin forløber
20546
16
5.65
95
64
478.813
nonhistone kromosomal protein HMG-1
25139
13
5.41
60
65
2.204.207
glutathion S-transferase
23595
34
5.43
73
66
178755
proapolipoprotein
28944
8
5.45
103
67
37267
transketolase
68435
4
7.9
59
68
189998
M2-type pyruvat kinase
58.447
10
7.95
157
69
825.605
glutathion S-transferase
25650
10
8,51
65
Disse proteiner kan klassificeres i flere kategorier baseret på deres funktioner, herunder cytoskeleton proteiner, stress-relaterede og chaperoning proteiner, akut-fase proteiner, glycolytiske enzymer, enzymer involveret i metabolisme og celleproliferation, tumor suppressor proteiner og mave-specifikke proteiner .
fælles ændringer af proteinekspression mellem tumor- og ikke væv i gastriske kræftpatienter Salg Diverse ændringer i proteomer blev påvist mellem tumor- og ikke væv fra de samme patienter. Som vist i figur 2 blev flere fælles ændringer observeret blandt i fem japanske gastriske kræftpatienter (kasser A til E). Mangan superoxiddismutase (MnSOD), nonhistone kromosomal protein HMG-1 (HMG-1), phosphoglyceratkinase 1 (PGK-1), carbonanhydrase I og II (CA I og II), foveolin precursor FOV (gastrokine-1), aspartat aminotransferase 2 precursor (AST), og glutathion-S-transferase (GST) udviste almindelige ændringer i ekspression mellem tumor- og ikke væv, herunder blandt de identificerede proteiner. Proteinet ekspression af MnSOD og HMG-1 blev påvist at være opreguleret i tumorvæv sammenlignet med i nontumor væv. På den anden side blev de CA I og II, FOV, AST og GST-proteiner afslørede at blive nedreguleret i tumorvæv. Folden ændringer i ekspressionen af ​​disse proteiner i forhold til den for GAPDH er opsummeret i tabel 2. Det mest bemærkelsesværdige fald blev vist i niveauet af FOV i alle tilfælde. Graden af ​​faldet i GST-protein ekspression var næsten den samme som i FOV (sagerne B, D, og ​​E), selv om man ikke blev observeret i de to andre tilfælde. På den anden side blev stigningen i HMG-1 mærket i tre tilfælde (A, C, og D), selv om en sådan forskel i ekspression ikke blev observeret i de to andre tilfælde. MnSOD udstillet en tendens til at stige i de tumorvæv af tre patienter (sagerne A, C og D), men et relativt fald blev også observeret i sag B. Som for PGK-1, en signifikant sammenhæng mellem fold ændringer i protein-ekspression og den patologiske sortering af tumorer blev næppe observeret. Figur 2 Detaljerede ombygning mønstre af proteiner. (A) Nontumor og (B) tumor proteiner, herunder CAI (No.58), CAII (No.59), MnSOD (No.61), FOV (No.63), HMG-1 (No.64), og GST (No.65). (C) Nontumor og (D) tumor proteiner, herunder PGK-1 (No.46), AST (No.47), og GST (No.69). GAPDH, cirklede, blev anvendt som reference protein. Salg Tabel 2 Fold ændringer i proteinekspression mellem nontumor og tumorvæv afledt fra fem patienter med gastriske adenokarcinomer.
Protein
Case A
Case B
sag C
Case D
Case E

CA jeg
-6,5
-1,6
-3,3
-4,3
-2,6
CA II
-2.6
-1.3
-26
-4.3
-13
FOV
-13
-13
-26
*
-26
MnSOD
+1.7
-2.6
+6.5
+1.4
+1.1
HMG-1
+13
*
+3.7
+13
*
PGK1
+1.6
+1.1
-1.2
+2.6
-1.4
AST
-13
-1.6
-6.5
-3.7
-2.6
GST
*
-26
*
-13
-13
CA I, kulsyreanhydrase I.
CA II, carbonanhydrase II.
FOV, foveolin forløber.
MnSOD, mangan superoxiddismutase.
HMG-1, nonhistone kromosomal protein.
PGK1, phosphoglyceratkinase 1.
AST, aspartataminotransferase 2 precursor.
GST, glutathion S-transferase.
*, ikke bestemt.
RT-PCR-analyse
ved RT-PCR, ændringer i mRNA ekspression i tumor- og ikke væv hidrørende fra mavecancerpatienter blev analyseret for proteiner, som udviste ændringer i proteinekspression, herunder FOV, MnSOD og HMG-1. Som vist i figur 3, blev FOV mRNA signifikant reduceret i tumorvæv i fire på alle patienter (tilfælde A, B, C og E), mens det ikke blev påvist i enten nontumor eller tumorvæv fra den anden patient (Sag D) . På den anden side blev MnSOD mRNA markant forøget hos fire patienter (sagerne B, C, D, og ​​E), selv om der blev påvist lidt forskel i mRNA-niveauet mellem nontumor og tumorvæv i sag A. Imidlertid blev en sammenhæng mellem HMG-1 mRNA-ekspression og de patologiske fænotyper af tumorer næppe overholdes. Figur 3 Sammenligning af mRNA-ekspression af proteiner, der muligvis er forbundet med carcinogenese mellem nontumor og tumorvæv afledt fra fem patienter med gastriske adenokarcinomer (tilfælde A til E) ved RT-PCR. N og T angiver nontumor og tumorvæv, henholdsvis.
Diskussion
I dette studie udførte vi proteomisk analyse af tumor- og ikke væv hidrørende fra japanske gastrisk adenocarcinom patienter. Sixty-nine forskellige proteiner i tumorvævet fra en gastrisk cancer sag blev identificeret ved 2D-EP og LC-ESI-MS /MS, som omfattede stressproteiner, Hsp70, Hsp90 og chaperonine-holdige TCP1 (FTT), for selvbeskyttelse; glycolytiske enzymer, triosephosphatisomerase 1, α-enolase og PGK-1, til den voksende energibehov; cytoskeletale proteiner, ezrin, gelsolin isoform B og vimentin; proteiner involveret i celle differentiering og proliferation, galectin-3 og transferrin; og proteiner udviser formodede tumorsuppressoraktivitet, FOV. Mange af disse proteiner er blevet rapporteret at være forbundet med tumorigenese af gastriske adenokarcinomer involverer flere trin og faktorer [18, 19].
Vi viste også, at ekspressionsniveauerne for adskillige proteiner i tumorvæv almindeligvis blevet aendret i fem japanske patienter med gastrisk adenocarcinomer, sammenlignet med dem i nontumor væv. En almindelig stigning i protein-ekspression i tumorvæv indtraf for MnSOD, HMG-1 og PGK-1, hvorimod en almindelig nedgang i tumorvæv indtraf for FOV, GST og AST
Superoxide (O 2 . - ), en fri radikal, er afgørende for den antimikrobielle virkning af granulocytter og monocytter. Superoxiddismutase (SOD) fjerner hurtigt det overskydende beløb af superoxid produceres i stress og biologiske reaktioner in vivo
gennem katalyse af omdannelsen af ​​superoxid med H + til H 2O 2 og O 2. MnSOD, en af ​​SOD'er, ligger i mitokondrier og bidrager til beskyttelsen af ​​mitokondrie-DNA mod beskadigelse. Det er blevet rapporteret, at en øget ekspression af MnSOD i progressiv mavekræft bør være relateret til den 5-årige overlevelsesrate efter kirurgi [20] og følsomhed over for kemoterapi [21]. I denne undersøgelse protein ekspression af MnSOD var opreguleret i 4 af 5 mavecancerpatienter, hvilket antyder en selvbeskyttende respons. På den anden side har den opregulering af MnSOD i tumorvæv blevet overvejet at interferere med effektiv kemoterapi baseret på radikal produktion, hvilket kan forårsage en nedsættelse af følsomhed over for anticancerlægemidler og bestemme sværhedsgraden af ​​kræft.
HMG-1 regulerer transskriptionen af ​​forskellige gener og strukturelle stabilisering af kromosomer som en DNA-bindende protein. HMG-1 er blevet rapporteret at være associeret med carcinogenese og metastase i tyktarms- og brystkræft [22].
Transkriptionel opregulering af HMG-1 i gastrisk cancer er også blevet påvist [23]. Ekspression af HMG-1 i tumorvæv blev foreslået at være relateret til resistens over for cisplatin [24]. Vi demonstrerede her en stigning i dette protein i tre tilfælde.
GST er en narkotika-metaboliserende enzym, der katalyserer konjugation af reduceret glutathion til lægemidler og metabolitter, og bidrager også til afgiftning af kræftfremkaldende stoffer. Derfor kan et fald i aktiviteten være en risikofaktor for carcinogenese. Infektion med Helicobacter pylori er blevet rapporteret at forårsage et fald i GST-ekspression [25], hvilket tyder på, at et fald i GST-aktivitet kan være en årsag til gastrisk carcinogenese. I denne undersøgelse blev et fald i GST-protein-ekspression observeret i tre tilfælde. Et fald i GST-protein-ekspression kan anvendes som biomarkør til diagnosticering af gastriske tumorer.
AST er et aminotransferase, der virker på aminosyrer og α-ketosyre, er der distribueres bredt i menneskelige organer. AST frigives i blodstrømmen skyldes forøget permeabilitet og ødelæggelse af væv. En forhøjet koncentration af AST protein er blevet rapporteret i blodet hos patienter med hepatitis, maligne tumorer, herunder hepatomer og leuchemia. Genekspressionen af ​​GST er også blevet påvist at være opreguleret i kolorektale tumor-væv [26]. Imidlertid blev et fald i AST proteinekspression almindeligt observeret i alle tumorvæv afledt fra de nuværende fem patienter med gastrisk adenokarcinomer. Yderligere undersøgelse skal udføres for at belyse, om et fald i AST-proteinet specifikt observeret i gastriske tumorvæv eller ej.
Forhøjet ekspression af PGK-1, som er et af enzymerne i den glycolytiske pathway og som katalyserer dephosphorylering af 1,3-bisphosphoglycerate at producere ATP, er blevet observeret i mange maligne tumorvæv, der er afhængige af ATP som en væsentlig energikilde. Solide tumorer menes at brug overproduktionen af ​​ATP til at opretholde den forøgede proliferation. Opreguleringen af ​​glycolytiske enzymer, herunder PGK-1 i lungecancer [27] og M2-typen pyruvatkinase i colorektal cancer [28], er blevet rapporteret og foreslog at være nyttige til screening af kræft. Men i den foreliggende undersøgelse, en signifikant relation mellem PGK-1-protein-ekspression og fænotyper af gastriske adenokarcinomer blev næppe påvises. Derfor PGK-1 blev anset for at være uegnet til diagnosticering af mavekræft.
Carbonsyre anhydrases (CAS) er zinkholdige enzymer, der distribueres bredt i forskellige organer og som omfatter en stor familie, herunder CA-I til CA -IX. De katalyserer hydratiseringen af ​​CO 2 for mellemliggende metabolisme, og opretholde pH og ion balance i kroppen. Indtil videre en direkte sammenhæng er påvist mellem malign transformation og proteinekspression til CAS I gennem VII [29]. To tidligere undersøgelser viste, at ekspression af både CA-I og CA-II blev reduceret betydeligt i kolorektale tumorer sammenlignet med i normal colorektal epitel eller slimhinder [30]. En anden rapport resultater viser, at reduceret ekspression af CA-I og CA-II blev korreleret med den biologiske aggressivitet kolorektal cancer og synkron fjernmetastaser [31]. Som tidligere foreslået [32], gastriske og colorektale carcinomer kan dele en lignende mekanisme af celleproliferation og mucosal malignitet og kan blive en biomarkør for disse carcinomer, fordi fælles fald i protein ekspression af CA-I og CA-II også blev observeret i denne undersøgelse.
FOV, som er identisk med en mave-specifik 18-kDa antrum mucosa protein! (AMP-18) [33, 34], GKN1 [35], og trefoil-faktor interaktioner (z) (TFIZ) [36], viste sig at være drastisk nedreguleres eller fraværende i de gastrisk adenocarcinom patienterne i denne undersøgelse. Det humane AMP-18 og humant carcinoantigenic CA11 genprodukt, der koder for en aminosyresekvens, der adskiller sig fra AMP-18 i kun en enkelt rest [37, 38], funktion som secernerede vækstfaktorer delvis ansvarlig for opretholdelse af en normal funktionel gastrisk epitel [33]. Både AMP-18 og CA11 genproduktet er blevet rapporteret at være intensivt udtrykkes i normalt mavevæv men ikke i de fleste gastriske cancere [33, 37, 38]. Immunhistokemiske undersøgelser viste, at AMP-18 synes at være til stede i mucosale epitelceller i normal human gastrisk antrum og duodenum [33]. For nylig TFIZ blev demonstreret at fungere som en vækstregulator af gastriske epitelceller gennem dannelsen af ​​en heterodimer med trefoil-faktor 1 (TFF1) [36]. Vores nuværende data bekræftede yderligere den høje ekspression af FOV i nontumor gastriske væv og signifikant undertrykkelse af proteinet i gastriske adnocarcinomas, hvilket indikerer, at FOV spille roller ved opretholdelse af normal differentiering af epitelceller og tumor suppression, men ikke i tumorvæv. Endvidere har vi vist, at transkription af FOV-mRNA var også almindeligt nedreguleret i mavecancerpatienter, hvilket indikerer, at et markant fald i FOV protein blev forårsaget ved undertrykkelse af FOV genekspression. Endvidere hos én patient proteinet ikke blev detekteret i nontumor væv, hvilket antyder, at ekspressionsniveauet af FOV-protein i individer kan bestemme gastrisk adenocarcinom fænotype. Følgelig kan ekspressionsniveauet af FOV som biomarkør være oplysende for vurderingen af ​​mavekræft.
Konklusion
Protein profilering af tumor- og ikke væv hidrørende fra japanske patienter med gastrisk adenokarcinomer blev udført under anvendelse 2D-EP og LC ESI-MS /MS. De identificerede proteiner inkluderet molekylære chaperoner, energiproducerende enzymer, cytoskeletale proteiner, og så videre. Fælles protein ændringer blev påvist i mavens kræftpatienter. Protein udtryk for MnSOD og HMG-1 blev opreguleret mens den for GST, AST og FOV blev nedreguleret i gastrisk tumorvæv. En sammenhæng mellem ændringen af ​​disse proteiner og deres transkriptionelle ekspression i gastrisk cancer var næppe observeret i denne undersøgelse, undtagen i tilfælde af FOV. Både protein og genekspression af FOV, en mave-specifik sekretorisk vækstfaktor for normale gastriske epitelceller, var markant nedreguleret i tumorvæv afledt fra japanske patienter med gastriske adenokarcinomer. Overvågning af ekspressionsniveauerne af denne mave-specifikt protein i kliniske prøver kan give nyttige oplysninger til diagnosticering af mavekræft som en specifik biomarkør og for en bedre forståelse af gastrisk carcinogenese.
Metoder
Materialer
DNase I, RNase A, 2-mercaptoethanol (2-ME), glasperler (212-300 um), Nonidet P-40, acrylamid, N, N, N ', N'
-tetramethylenediamine (TEMED), natriumdodecylsulfat (SDS ), iodacetamid og dithiothreitol (DTT) blev erhvervet fra Sigma (St. Louis, MO). Agarose for isoelektronisk fokusering (IEF), og Pharmalyte pI 3-10, 4-6,5 og 8-10,5 var fra Amersham Bioscience (Piscataway, NJ). Trypsin (sekventeringskvalitet) var fra Roche (Manheim, Tyskland). Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), thiourinstof, sorbitol, natriumpyrophosphat, ammoniumpersulfat, D, L-asparaginsyre, trichloreddikesyre, sulfosalicylsyre dihydrat, eddikesyre, acetonitril, myresyre og trifluoreddikesyre (TFA) var fra Wako Pure Chemicals (Osaka , Japan). Urea var fra Katayama kemikalier (Osaka, Japan). Pepstatin A og leupeptin var fra Peptide Institute (Osaka, Japan). NH 4HCO 3 og N, N'-methylenbisacrylamid var fra Nacalai Tesque (Kyoto, Japan). CBB R-250 var fra ICN Biomedicals Inc. (Aurora, OH). Molekylær masse standarder var fra APRO Science, Inc. (Tokushima, Japan). TRIZOL reagens var fra Life Technologies (Frederick, MD). Oligo (dT) 12-18-primer, deoxynukleotider (dNTP'er), og RNaseOUT var fra Invitrogen (Carlsbad, CA). M-MLV revers transkriptase og Taq DNA-polymerase var fra Promega (Madison, WI).
Væv og prøveforberedelse
Primære gastriske adenokarcinomer og tilstødende nontumor slimhinder blev indsamlet på gastrektomi og leveres af Dept. of Surgery, Graduate School of Medicine, University of Tokushima, Tokushima, Japan. Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen af ​​World Medical Association, og blev godkendt af den etiske komité ved University of Tokushima. Informeret samtykke blev også givet af alle de patienter, der har givet de kliniske prøver. Væv blev frosset i et tøris-methanol-bad snarest muligt efter dissektionen og opbevares i en dybfryser (-80 ° C) før brug. For mRNA analyse blev væv først nedsænket i RNAlater (Takara, Tokyo, Japan) før frysning. Detaljeret klinisk-patologisk data, herunder tumor fase (ifølge AJCC systemet), stedet og differentiering, og histologiske data om vævsprøverne er anført i tabel 3. Ingen af ​​disse tilfælde blev klassificeret i scirrhous typen kategori, og tumorvæv blev klart distinguishted fra ikke-tumor én i hvert tilfælde. For todimensional gelelektroforese (2D-EP), blev protein ekstraktion fra væv udføres ved den følgende fremgangsmåde. Frosne blokke (20-30 mg vådvægt) blev homogeniseret med en plast pistil (Toyobo, Tokyo, Japan) i nærværelse af glasperler i 10 vol /vådvægt dialysebuffer omfattende 5 M urinstof, 1 M thiourinstof, 10 mM Nappi , 1,67 pl /ml 2-ME, 0,005% DNase i, 0,05 mg /ml RNase A, 20 uM leupeptin, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF og 20 uM pepstatinA, og derefter centrifugeret ved 50.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C (Beckman -Coulter, Fullerton, CA). Den resulterende supernatant blev anvendt som vævsekstrakt. Proteinkoncentrationer blev bestemt med et Bradford protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA) under anvendelse af bovint gamma-globulin som en standard.Table 3 Kliniske træk ved de patienter med gastrisk adenocarcinomer.
Case

Age

Sex

Locationa

Gradeb

Stage


A
63
Male
UM
G3
IIIA
T2N2M0H0
B
68
Female
L
G2
II
T2N2M0
C
76
Male
ML
G2
IV
T4N3M0
D
78
Female
L
G2
III
T2N0M0H0
E
77
Male
ML
G2
II
T2N1M0
AU: øvre, M: midten, L: lavere
BG2: moderat differentieret, G3:. dårligt differentieret
To dimesional gelelektroforese
2D-EP blev udført som tidligere [39] beskrevet. Den første-dimensional isoelektrisk fokusering blev udført i en 1% (vægt /volumen) agarosegel (φ 2,6 x 180 mm) med en pH 3-10 gradient ved 700 V i 18 timer ved 4 ° C, og den anden-dimensional SDS gelelektroforese blev udført med en 5-15% (vægt /volumen) acrylamid gradient (M
R interval, 6-200 kDa) i et standard slab gel (20 × 13 cm) ved 15 mA i 3 timer, og derefter ved 70 mA i 2 timer ved stuetemperatur. Geler blev farvet med CBB R-250. Salg Proteinprøver (500 ug) ekstraheret fra tumoren centrum og omgivende histologisk normal slimhinde blev underkastet 2D-EP og køre i par ved siden af ​​hinanden.
Nogle af de farvede pletter blev udskåret fra 2D-gel, i-gel spaltet med trypsin og derefter underkastet LC-ESI-MS /MS-analyse som tidligere [40] beskrevne. Peptid blanding blev separeret med en omvendt fase nanoLC systemet (Berømt, Swichos II, Ultimate, LC Pakninger, Sunnyvale, CA). De eluerede peptider blev sprøjtet direkte ind i en ESI massespektrometer (Esquire3000 Plus, Bruker-Daltonics, Fremont, CA).
En stor mængde MS /MS-data blev erhvervet med dataanalyse 3.1 software (Bruker-Daltonics), konverteres til tekst filer med lister massen værdierne af moderioner, og intensiteter og masser fragmentioner, og derefter bearbejdes ved MASCOT-algoritmen (Matrix Science Ltd, London, UK) for at tildele peptider i NCBI non-redundant sekvens database under anvendelse af en taksonomisk begrænsning, 'human'. Databasen Søgningen blev udført med parametrene beskrevet af Yoshimura et al. [40].
Billedanalyse og MS peptidsekventering
Billede erhvervelse og analyse blev udført med Molecular Imager FXProPlus (Bio-Rad) og Image Master software (Bio-Rad). Der blev foretaget sammenligninger mellem gel billeder af tumor og matchet nontumor prøver par af par. Normaliserede forskelle volumen statistisk beregnet for alle fem tilfælde. Indholdet af glyceraldehyd 3-phosphodehydrogenase (GAPDH) protein blev anvendt som reference for at evaluere fold ændring af proteinekspression mellem tumor og matches nontumor væv som niveauerne af GAPDH mRNA og protein blev ikke ændret mellem væv afledt fra patienter. Konsekvent og betydeligt forskellige steder blev udvalgt til analyse ved LC-ESI-MS /MS. Proteinpletter! Blev udskåret fra gelerne i små stykker, og udsat for in-gel tryptisk fordøjelse natten [40]. Peptidmasse spektre blev registreret, og parametre for spektre erhvervelse blev anvendt som tidligere nævnt [40]. Nøjagtighed i databasen protein matching hjælp Mascot Search [41] blev bedømt som en score over 37, som blev opnået i de fleste af analyserne.
RNA-isolering og RT-PCR-analyse
Tumor og matches nontumor prøver (ca.. 50 mg vådvægt) blev hakket og derefter homogeniseret manuelt i 1 ml TRIZOL-reagens (Invitrogen) på is. RNA blev isoleret uden DNase I-behandling ifølge fabrikantens protokol. Kort beskrevet blev 0,2 ml CHC 3 blev tilsat til homogenatet, efterfulgt af centrifugering ved 20.600 x g i 15 minutter. Et tilsvarende volumen af ​​2-propanol blev tilsat til den resulterende supernatant til udfældning RNA. Efter centrifugering blev pelleten skyllet med 75% ethanol /diethylpyridylchloride (DEPC) -behandlet vand, efterfulgt af tørring. Pelleten blev opløst i et passende volumen DEPC-behandlet vand som det totale RNA fraktionen. Til revers transkription (RT), 2 ug af RNA fra hver prøve blev transkriberet ved 37 ° C i 1 time i nærvær af 200 U af Molony leukæmivirus revers transkriptase (Promega), oligo (dT) 12-18 primer, 0,5 mM dNTP'er og 50U af RNaseOUT. PCR'erne for carbonanhydrase-I og II, glutation-S-transferase, FOV, og GAPDH blev udført inden for et lineært område af amplifikation med den valgte primersæt og betingelser, og forventede størrelse af produkter, som sammenfattet i tabel 4. Det PCR

• Nedregulering af Thrombospondin2 forudser dårlig prognose hos patienter med gastrisk cancer
• Catecholamin opregulerer MMP-7-ekspression ved aktivering AP-1 og STAT3 i gastrisk cancer