Proteomic Veränderung in gastic Adenokarzinome aus der japanischen patients

Proteomic Veränderung in gastic Adenokarzinome von japanischen Patienten
Zusammenfassung
Hintergrund
Magenadenokarzinomen umfassen eine der häufigsten Krebsarten in asiatischen Ländern wie Japan. Umfassende Proteinprofilierungs gepaarter chirurgischen Proben von primären Magen-Adenokarzinome und Nicht-Tumor mucosae aus der japanischen Patienten abgeleitet wurde mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese (2D-EP) und Flüssigkeitschromatographie-Elektrosprüh-Ionen Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS) durchgeführt wird Magen-Krebs-spezifische Proteine ​​als mögliche klinische Biomarker und molekulare Ziele für die Chemotherapie zu etablieren.
Ergebnisse
relativ häufig Veränderungen in der Proteinexpression wurden in den Tumorgeweben ergab. Erhöhungen der Mangan-Dismutase und nonhistone chromosomalen Protein HMG-1 (HMG-1) wurden beobachtet, während Abnahmen in Carboanhydrasen I und II, Glutathion-S-transferase und foveolin Vorläufers (Gastrokine-1) (FOV), ein 18-kDa Magen -spezifischen Proteins mit putativen Tumorsuppressor-Aktivität nachgewiesen. RT-PCR-Analyse zeigte auch deutliche Herunterregulierung der FOV-mRNA-Expression in Tumorgeweben.
Fazit Eine mögliche pathologische Rolle für die Herunterregulierung von FOV
im Magen Karzinogenese demonstriert. Die Auswertung der spezifischen Abnahme der Gen- und Proteinexpression von FOV bei Patienten als klinische Biomarker für eine effektive Diagnose und Beurteilung von Magenkrebs verwendet werden.
Hintergrund
Magenadenokarzinomen umfassen eine der häufigsten Krebsarten in den asiatischen Ländern, darunter Japan, ist nur noch von Lungenkrebs als an die Zahl der Todesfälle sie verursacht. Trotz der jüngsten Entwicklung von diagnostischen Techniken werden die meisten Patienten mit Magenkrebs in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert und haben eine sehr geringe Fünfjahresüberlebensrate (weniger als 10%) [1]. Dies ist teilweise aufgrund des Fehlens von spezifischen und empfindlichen Biomarker für die Diagnose und Überwachung des Krankheitsfortschritt in einem frühen Stadium, obwohl einige Magentumormarker, einschließlich der carcinoembryonales Antigen, wurden verwendet und sind teilweise wirkungsvoll. Wie Magen Karzinogenese ist ein mehrstufiger Prozess, umfassende Analyse ist auch für den Einzelfall erforderlich, in denen unterschiedliche molekulare Ereignisse in jedem karzinogen Prozess auftreten.
Vor kurzem wurde Proteomanalyse verwendet, um die Proteinexpression in Körperflüssigkeiten, Geweben und Zellen umfassend untersuchen [ ,,,0],2-4]. Dieser Ansatz, der als klinische Proteomik, ist sehr nützlich für die Identifizierung von Krankheits-assoziierten Proteinen, die zu einem Krankheitszustand Veränderungen in der Expression und Modifikation zeigen entsprechende [5, 6]. Diese krankheitsbezogene Proteine ​​werden erwartet Biomarker für die Diagnose und mutmaßliche Zielproteine ​​für die Behandlung zu sein [7-9]. Auf der anderen Seite, umfassende Analysen von Transkriptomen in Tumorgeweben von verschiedenen Krebspatienten unter Verwendung von DNA-Mikroarrays und Genchips wurden in den letzten Jahren [10] durchgeführt. Es wurde jedoch ein Mangel an Korrelation zwischen den Veränderungen in mRNAs und Karzinogenese gezeigt worden und quantitative und qualitative Veränderungen von posttranslational modifizierten Proteinen als endgültige Genprodukte werden als informativer als die von mRNAs in Tumorgeweben zu sein, für die Untersuchung der molekularen Ereignisse in Karzinogenese. Proteom-Studien zur Identifizierung von Tumor-assoziierten Proteinen in Magenkrebs erhöhen und Proteom-Datenbanken für Magengewebe [11] und Zelllinien [12] konstruiert worden sind. Die meisten von ihnen betreffen spezifische Proteine ​​oder Antigene, die die Chemo- und thermoresistente Eigenschaften von Magenkrebs widerspiegeln [13-15], und die mit Helicobacter pylori assoziiert sind
[16, 17]. In der vorliegenden Studie führten wir umfassende Proteomanalyse von Tumor- und Nicht-Tumorgewebe in der japanischen Patienten mit Magenkarzinomen, und identifiziert mehrere Proteine, von denen die Expressionsniveaus in klinischen Fällen häufig verändert werden. Insbesondere wurde die Expression von Gastrokine-1 (GKN-1) vorgeschlagen, sowohl unter transkriptionalen und translationalen Kontrolle.
Ergebnisse
Protein Trennung und Identifizierung
1A zeigt eine Bildübersicht eines typischen Master-Gel für einen Magentumorgewebe. Rund 200 Proteinspots mit Coomassie Brilliantblau (CBB) R-250 wurden auch in den Gelen getrennt. Die numerierten Punkte in 1B und 1C wurden aus einem Gel, behandelt mit Trypsin ausgeschnitten und dann auf Flüssigchromatographie-electronic-Massenspektrometer (LC-ESI-MS /MS) -Analyse Spray Ionisation tandem unterzogen. Siebzig-zwei von ihnen auf die 69 verschiedenen Proteinspezies identifiziert wurden. In Tabelle 1 sind alle der Proteine ​​durch Peptidanpassung identifiziert mit dem Maskottchen-Suchalgorithmus. Die Genauigkeit bei der Proteinprofilierung wurde als Score-Wert (über 37) bewertet. Figur 1 (A) einen Überblick über ein Master-2D-Gel für die von einem Patienten abgeleitete Tumorgewebe mit einem Adenokarzinom des Magens. (B) und (C) Die numerierten Proteinspots wurden durch LC-ESI-MS /MS und Protein Anpassung identifiziert, wie vergrößerte Figuren gezeigt.
Tabelle 1 Proteinprofil in Tumorgewebe nachgewiesen, abgeleitet von einem japanischen Patienten mit einem magen Adenokarzinom.
Spot-Nr
Zugangsnummer
Protein Identifizierung

Massen
SC (%)
PI
Score
1 | 24.308.169
axonemal schwere Kette dynein Typ 3
473.776
0
6,04
37 2
15.010.550
Hitzeschock-Protein gp96 Vorläufer
90309
7
4,73
62
3
72222
Hitzeschockprotein 90 -β
83584
14
4,97
176
4 5.729.877
Hitzeschock-70 kDa-Protein 8 Isoform 1 | 71082
19
5,37
283
5
38.044.288
gelsolin Isoform b
80.876
5
5,58
63
6 4.826.960
Glutaminylgruppen-tRNA-Synthetase
88655
1 6,71
44
7
4.501.867
aconitase 2
86113
10
7.36
231
8
119717
ezrin
69470
7
5.94
75
9
4557871
transferrin
79280
9
6.81
97
10
16507237
heat Schock 70 kDa Protein 5
72402
15
5,07
165
11
24.234.686
Hitzeschockprotein 70 kDa Protein 8
53598
16
5,62
160
12
4.885.431
Hitzeschock-70 kDa-Protein 1B
70267
11
5,48
143
13
1.082.886
Tumor Nekrose-Faktor-Typ-1-Rezeptor-assoziierten Protein TRAP-1 | 75694
13
8,43
288
14
31.542.947
Chaperonins, Protein mitochondriale Matrix Protein P1, P60 Lymphozyten

13
5.7
299
15
28592
Serum albumin
71316
23
6.05
292
16
340219
vimentin
53738
18
5.03
79
17
4503729
similar FK506-bindende Protein 4
49031
5
5.6
36
18
32709
IFP53
53559
21
5.93
277
19
4502643
chaperonin-containing TCP1, subunit6A (zeta 1)
58444
6 6.23
79
20
7.106.439
Tubulin, β5
50095
14
4.78
125
21
37492
α-tubulin
50810
13
5.02
94
22
125604
pyruvate kinase, M2 isozyme
58447
5
7.95
234
23
4557014
catalase
59947
6
6.9
120
24
4503483
eukaryotic Translations-Elongationsfaktor 2
96246
4 6,41
56
25
179.279
ATP-Synthase-β-Untereinheit
56861
5
5,39

59 26
7.657.041
herunterreguliert bei der Metastasierung
320.846 2
7,07
40
27
4.504.169
Glutathion-Synthetase, GSH synthetase
52523
5
5.67
99
28
12017952
GE36
73327
2
5.2
37
29
34234
laminin-binding Protein
31888
12
4,84
51
30
16.359.158
Actin, beta
42078
14
5,29
171
31
6.635.125
KIAA0284 Protein
161.473 2
6,36
47
32
5.803.225
14-3-3 epsilon
29326
8
4,63
49
33
4.504.707
Inositol-Polyphosphat-4-Phosphatase, Typ II, 105 kD
105749
1 5,87
37
34
35.038.601
hypothetisches Protein DKFZp761A078
74864
2
7.27
47
35
12017952
GE36
73327
1
5.2
38
36
4505877
plectin 1 Isoform 1 | 520.111
1 5,57
44
37
38.158.018
zentrosomalen protein 1, centriole assoziiertes Protein, centriolin
269.874
1 5,44
39
38
30.157.438
CTD-Bindung SR-like protein RA9
180240
1 9.15
41
39
4.503.471
eukaryotischen Translations-Elongationsfaktor 1 α1
50451
12
9.1
191
40
4.757.810
ATP-Synthase
59828
17
9.16
178
41
693.933
2-phosphopyruvate-Hydratase α-Enolase
47421
22
7,01
240
42
123.576
47 kDa Hitzeschock-Protein-Vorläufer
46352
14
8,27
177
43
5.032.069
Spleißfaktors 3b Untereinheit 4
44414
3
8,54
58
44
4.503.471
eukaryotischen Faktor Translationselongation 1 α1
50451
4 9.1
47
45
5.921.789
Citratsynthase, mitochondriale Vorläufer
51959
12
8,13
114
46
4.505.763
Phosphoglyceratkinase 1 | 44985
14
8.3
87
47
4.504.069
Aspartat-Aminotransferase 2 Vorläufer
47844
6 9.14
52
48
7.669.492
Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
36201
13
8,57
49
49
4.757.756
Annexin A2
38808
9
7,57
87
50
6648067
Malat-Dehydrogenase, mitochondriale Vorläufer
35965
7
8,92
60
51
5.031.857
Lactatdehydrogenase A
36950
6 8.44
43
52
238427
porin 31 HM
30737
29
8,63
124
53
5.174.447
Guaninnucleotid--bindendes Protein
35511
8 7.6
65
54
34.740.329
heterogenen Kern ribonucleoprotein A3
39799
7
9.1
43
55
4504983
galectin-3
26229
12
8.58
42
56
4504447
heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 /B1 Isoform A2
36041
7
8,67
40
57
86901
ATP-abhängigen DNA-Helikase RAP30 /74 Kette RAP30
26350
3
9,46
41
58
230.445
Carboanhydrase I
28903
12
6,44
67
59
455.739
Carboanhydrase II
29285
8 6,87
82
60
26.892.090
beta-Globinkette Variante
16101
40
7,86
121
61
34709
Mangan Superoxid-Dismutase
24891 10
8,35
111
62
4.507.645
Triosephosphatisomerase 1 | 26938
17
6,45
47
63
38.488.935
foveolin Vorläufer
20546
16
5,65
95
64
478.813
nonhistone Chromatinprotein HMG-1 | 25139
13
5,41
60
65
2.204.207
Glutathion S-transferase
23595
34
5.43
73
66
178755
proapolipoprotein
28944
8
5.45
103
67
37267
transketolase
68435
4
7.9
59
68
189998
M2-type Pyruvatkinase
58447 10
7,95
157
69
825.605
Glutathion-S-Transferase
25650 10
8,51
65
Diese Proteine ​​können in mehrere Kategorien klassifiziert werden auf der Grundlage ihrer Funktionen, einschließlich der Zytoskelett-Proteine, Belastungs- und chaperoning Proteine, akute-Phase-Proteine, glykolytische Enzyme, Enzyme in den Stoffwechsel und die Zellproliferation, Tumor-Suppressor Proteine ​​und Magen-spezifische Proteine .
Häufige Veränderungen der Proteinexpression zwischen Tumor und Nicht-Tumorgewebe in Magenkrebs-Patienten
Diverse Veränderungen in Proteome wurden zwischen Tumor erkannt und Nicht-Tumorgewebe von den gleichen Patienten. Wie in Abbildung 2 gezeigt, wurden die verschiedenen gemeinsamen Veränderungen bei in fünf japanischen Magenkrebs-Patienten (Fälle A bis E) beobachtet. Mangan Superoxid Dismutase (MnSOD), nonhistone chromosomalen Protein HMG-1 (HMG-1), Phosphoglycerat-Kinase 1 (PGK-1), Carboanhydrase I und II (CA I und II), foveolin Vorläufer FOV (Gastrokine-1), Aspartat Aminotransferase 2 Vorläufers (AST) und Glutathion-S-Transferase (GST) zeigten häufige Änderungen in der Expression zwischen Tumor- und Nicht-Tumorgeweben, einschließlich der unter den identifizierten Proteine. Die Proteinexpression von MnSOD und HMG-1 wurde gezeigt, in Tumorgeweben im Vergleich zu in Nicht-Tumorgeweben hochreguliert werden. Auf der anderen Seite ist die CA I und II, FOV, AST und GST-Proteine ​​wurden offenbart in Tumorgewebe herunterreguliert werden. Die Falten Veränderungen in der Expression dieser Proteine ​​relativ zu der GAPDH sind in Tabelle 2 Der bemerkenswerteste Abnahme zusammengefasst wurde in der Ebene des FOV in allen Fällen angezeigt. Der Grad der Abnahme der GST-Protein-Expression war fast die gleiche wie die in FOV (Fall B, D und E), auch wenn man sich nicht in den beiden anderen Fällen beobachtet. Auf der anderen Seite wurde die Zunahme der HMG-1 in drei Fällen markiert (A, C und D), obwohl ein solcher Unterschied in der Expression nicht in den anderen beiden Fällen beobachtet. MnSOD zeigte eine Tendenz in Tumorgewebe von drei Patienten (Fälle A, C und D) zu erhöhen, aber eine relative Abnahme wurde auch bei B. Wie für PGK-1, eine signifikante Beziehung zwischen den Fold Change in Protein Expression beobachtet und die pathologische Einstufung von Tumoren wurde kaum beobachtet. Abbildung 2 Detaillierte Veränderung Muster von Proteinen. (A) Nicht-Tumor und (B) Tumorproteine ​​einschließlich CAI (No.58), CAII (No.59), MnSOD (No.61), FOV (No.63), HMG-1 (No.64) und GST (No.65). (C) Nicht-Tumor und (D) Tumorproteine ​​einschließlich PGK-1 (No.46), AST (No.47) und GST (No.69). GAPDH, eingekreist, wurde als Referenzprotein.
Tabelle 2 Falten Veränderungen in der Proteinexpression zwischen Nicht-Tumor und Tumorgewebe von fünf Patienten mit Magen-Adenokarzinome abgeleitet verwendet.
Protein
Fall A
Fall B
Rechtssache C
Fall D
Fall E

CA I
-6,5
-1,6
-3,3
-4,3
-2,6
CA II
-2.6
-1.3
-26
-4.3
-13
FOV
-13
-13
-26
*
-26
MnSOD
+1.7
-2.6
+6.5
+1.4
+1.1
HMG-1
+13
*
+3.7
+13
*
PGK1
+1.6
+1.1
-1.2
+2.6
-1.4
AST
-13
-1.6
-6.5
-3.7
-2.6
GST
*
-26
*
-13
-13
CA I, I. Carboanhydrase
CA II, Carboanhydrase II.
FOV, foveolin Vorläufer.
MnSOD, Mangan Superoxid-Dismutase.
HMG-1, nonhistone Chromatinprotein.
PGK1, Phosphoglyceratkinase 1.
AST, Aspartat-Aminotransferase 2 Vorläufer.
GST, Glutathion-S-Transferase.
*, nicht bestimmt.
RT-PCR-Analyse
mittels RT-PCR, Veränderungen in der mRNA Expression in Tumor und Nicht-Tumor von Magenkrebs-Patienten abgeleitet Gewebe wurden für Proteine ​​analysiert, die Veränderungen in der Proteinexpression, einschließlich FOV, MnSOD und HMG-1 ausgestellt. Wie in Figur 3 wurde FOV gezeigt mRNA signifikant in Tumorgeweben verringert in vier bei allen Patienten (Fälle A, B, C und E), während es entweder in nicht erkannt wurde Nicht-Tumor oder Tumorgewebe von dem anderen Patienten (Fall D) . Auf der anderen Seite wurde MnSOD mRNA bei vier Patienten (Fälle B, C, D und E) deutlich erhöht, obwohl wenig Unterschied in der mRNA-Ebene zwischen Nicht-Tumor und Tumorgewebe in Fall A nachgewiesen wurde. Jedoch wurde eine Beziehung zwischen HMG-1 mRNA-Expression und pathologischen Phänotypen von Tumoren kaum beobachtet. Figur 3: Vergleich der mRNA-Expression von Proteinen mit eventuell Karzinogenese zwischen Nicht-Tumor und Tumorgewebe von fünf Patienten mit Magen-Adenokarzinome (Fälle A bis E) durch RT-PCR abgeleitete verbunden. N und T zeigen Nicht-Tumor und Tumorgewebe sind.
Diskussion
In dieser Studie, die wir aus der japanischen Adenokarzinom des Magens Patienten abgeleitet Proteomanalyse von Tumor- und Nicht-Tumorgewebe durchgeführt. Neunundsechzig verschiedenen Proteinen im Tumorgewebe von einem Fall von Magenkrebs wurden durch 2D-EP und LC-ESI-MS /MS identifiziert, die Stressproteine ​​enthalten, Hsp70, Hsp90 und chaperonine haltigen TCP1 (CCT), zum Selbstschutz; glykolytische Enzyme, Triosephosphatisomerase 1, α-Enolase und PGK-1, für die wachsende Energiebedarf; Proteine ​​des Zytoskeletts, Ezrin, Gelsolin Isoform b und Vimentin; Proteine ​​in der Zelldifferenzierung und Proliferation beteiligt sind, Galectin-3 und Transferrin; und Proteine ​​mit mutmaßlichen Tumorsuppressor-Aktivität, FOV. Viele dieser Proteine ​​wurden berichtet mit der Tumorgenese von Magen-Adenokarzinome denen mehrere Schritte und Faktoren [18, 19] in Verbindung gebracht werden.
Wir zeigten auch, dass die Expression von mehreren Proteinen in Tumorgeweben häufig in fünf japanischen Patienten verändert wurden mit Magen-Adenokarzinome, in Nicht-Tumorgewebe im Vergleich zu denen. Eine gemeinsame Erhöhung der Proteinexpression in Tumorgeweben aufgetreten für MnSOD, HMG-1 und PGK-1, während eine gemeinsame Abnahme der Tumorgewebe für FOV, GST und AST aufgetreten
Superoxid (O 2 . - ein freies Radikal), ist wesentlich für die antimikrobielle Wirkung von Granulozyten und Monozyten. Superoxid-Dismutase (SOD) entfernt schnell die überschüssige Menge an Superoxid in den Stress und die biologischen Reaktionen in vivo produziert
durch Katalyse der Umwandlung von Superoxid mit H + zu H 2 O 2 und O 2. MnSOD, einer der SOD wird in den Mitochondrien befindet und trägt zum Schutz der Mitochondrien-DNA vor Schäden. Es wurde berichtet, dass gesteigerte Expression von MnSOD in progressive Magenkrebs sollte auf die 5-Jahres-Überlebensrate nach der Operation [20] und die Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapie [21] bezogen werden. In dieser Studie wurde die Proteinexpression von MnSOD war hochreguliert in 4 von 5 Patienten mit Magenkrebs, was auf eine selbstschützende Antwort. Auf der anderen Seite hat die Hochregulierung von MnSOD in Tumorgewebe wurde mit wirksamen Chemotherapie zu interferieren betrachtet basierend auf Radikale, die eine Abnahme der Empfindlichkeit gegenüber Antikrebsmitteln führen und der Schwere des Krebses zu bestimmen.
HMG-1 reguliert die Transkription verschiedener Gene und die strukturelle Stabilisierung der Chromosomen als ein DNA-bindendes Protein. HMG-1 ist berichtet worden, mit der Karzinogenese und Metastasierung in Dickdarm- und Brustkrebs [22].
Transcriptional Hochregulierung von HMG-1 bei Magenkrebs assoziiert zu sein ist auch gezeigt worden [23]. Expression des HMG-1 in Tumorgeweben wurde vorgeschlagen, um Resistenz gegenüber Cisplatin [24] bezogen werden. Wir zeigten hier eine Erhöhung dieses Proteins in drei Fällen.
GST ist ein Medikament-metabolisierende Enzym, das die Konjugation von reduziertem Glutathion auf Medikamente und Metaboliten katalysiert, und trägt auch zur Entgiftung von Karzinogenen. Daher kann eine Abnahme der Aktivität ist ein Risikofaktor für die Karzinogenese sein. Infektion durch Helicobacter pylori wurde berichtet, eine Abnahme der GST-Expression zu veranlassen, [25], was darauf hindeutet, dass eine Abnahme der GST-Aktivität könnte eine Ursache für Magen Karzinogenese sein. In dieser Studie wurde eine Abnahme der GST-Protein-Expression in drei Fällen beobachtet. Eine Abnahme der GST-Protein-Expression kann als ein Biomarker für die Diagnose von Magentumoren verwendet werden.
AST eine Aminotransferase ist, die auf die Aminosäuren und α-Keto-Säure wirkt, wird diese weit verbreitet in menschlichen Organen verteilt. AST wird in den Blutstrom freigesetzt aufgrund erhöhte Permeabilität und die Zerstörung von Gewebe. Eine erhöhte Konzentration von AST-Protein wurde im Blut von Patienten mit Hepatitis, maligne Tumoren wie Hepatome und leuchemia berichtet. Genexpression von GST wurde auch in colorectal Tumorgeweben hochreguliert zu sein [26] gezeigt. Es wurde jedoch eine Abnahme der AST-Proteinexpression häufig in allen Tumorgewebe von derzeit fünf Patienten mit Magen-Adenokarzinome abgeleitet beobachtet. Weitere Studie sollte aufzuklären durchgeführt werden, ob eine Abnahme in der AST Protein spezifisch in Magentumorgewebe beobachtet wird oder nicht.
Erhöhte Expression von PGK-1, die eines der Enzyme in dem glykolytischen Weg ist und katalysiert die Dephosphorylierung von 1,3-Bisphosphoglycerat ATP zu produzieren, wurde in vielen malignen Tumorgewebe beobachtet, der auf ATP als Hauptenergiequelle abhängig sind. Solide Tumoren sind gedacht, um die Überproduktion von ATP brauchen die verstärkte Proliferation zu halten. Die Hochregulierung von glykolytischen Enzymen, einschließlich der PGK-1 bei Lungenkrebs [27] und M2-Typ Pyruvatkinase in Kolorektalkrebs [28], wurde berichtet und vorgeschlagen für Krebs-Screening nützlich zu sein. Jedoch in der vorliegenden Studie eine signifikante Beziehung zwischen PGK-1-Protein-Expression und die Phänotypen von Magen-Adenokarzinome wurde kaum erkannt. Daher PGK-1 betrachtet wurde für die Diagnose von Magenkrebs nicht geeignet zu sein.
Carboanhydrasen (CAs) sind zinkhaltige Enzyme, die weit verbreitet in verschiedenen Organen verteilt sind und die eine große Familie, einschließlich CA-I CA umfassen -IX. Sie katalysieren die Hydrierung von CO 2 für intermediären Stoffwechsel und halten den pH-Wert und Ionengleichgewicht im Körper. Bisher eine direkte Beziehung wurde zwischen der malignen Transformation und Proteinexpression für CAs I bis VII [29] demonstriert. Zwei frühere Studien zeigten, dass die Expression von sowohl CA-I und CA-II signifikant in kolorektalen Tumoren reduziert wurde im Vergleich zu in normalen colorectal Epithelien oder mucosae [30]. Ein weiterer Bericht dargestellten Ergebnisse zeigt, dass die Expression von CA-I reduziert und CA-II mit der biologischen Aggressivität von Darmkrebs und synchrone Fernmetastasen [31] korreliert. Wie zuvor vorgeschlagen [32], Magen- und kolorektalen Karzinomen kann einen ähnlichen Mechanismus der Zellproliferation und Schleimhaut Malignität teilen, und kann ein Biomarker für diese Karzinome werden, weil gemeinsame Abnahme der Proteinexpression von CA-I und CA-II beobachtet wurden in dieser Studie.
FOV, die zu einem Magen-spezifische 18-kDa Antrum Schleimhaut Protein identisch ist! (AMP-18) [33, 34], GKN1 [35], und Dreiblatt Faktor Wechselwirkungen (z) (TFIZ) [36], wurde gezeigt, dramatisch zu sein, herunterreguliert oder abwesend in den Magen-Adenokarzinom-Patienten in dieser Studie. Der menschliche AMP-18 und Human carcinoantigenic CA11 Genprodukt, das eine Aminosäuresequenz codiert, die in nur einem einzigen Rückstand von der AMP-18 unterscheidet [37, 38], wirken als sezernierte Wachstumsfaktoren teilweise verantwortlich für eine normale funktionelle Magen beibehalten Epithel [33]. Sowohl AMP-18 und das CA11 Genprodukt berichtet intensiv in normalem Magengewebe exprimiert werden, aber nicht in den meisten Magenkarzinome [33, 37, 38]. Immunhistochemische Studien zeigten, dass AMP-18 in mukosalen Epithelzellen des normalen menschlichen Magen Antrum und Duodenum [33] vorhanden zu sein scheint. Kürzlich wurde TFIZ als Wachstumsregulator von Magen-Epithelzellen durch die Bildung eines Heterodimers mit Trefoil Factor 1 (TFF1) [36] handeln demonstriert. Unsere aktuellen Daten bestätigt weiterhin die hohe Expression von FOV in Nicht-Tumormagengewebe und die signifikante Unterdrückung des Proteins im Magen adnocarcinomas, was darauf hinweist, dass FOV Rollen bei der Aufrechterhaltung der normalen Differenzierung von Epithelzellen und Tumorsuppressions- spielen, aber nicht in Tumorgeweben. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Transkription von FOV mRNA auch in Magenkrebs-Patienten häufig herunterreguliert war, was darauf hinweist, dass eine deutliche Abnahme der FOV-Protein durch Unterdrückung des FOV Genexpression verursacht wurde. Weiterhin wurde bei einem Patienten das Protein nicht in Nicht-Tumorgeweben nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass der Expressionsgrad von FOV Protein in Individuen die Magen-Adenokarzinom Phänotyp bestimmen kann. Dementsprechend kann das Expressionsniveau von FOV als Biomarker für die Beurteilung von Magenkrebs informativ sein.
Fazit
Protein Profilierung von Tumor und Nicht-Tumor von japanischen Patienten abgeleitet Gewebe mit Magen-Adenokarzinome wurde unter Verwendung von 2D-EP und LC- ESI-MS /MS. Die identifizierten Proteine ​​enthalten molekulare Chaperone, Energie erzeugenden Enzyme, Cytoskelett-Proteine ​​und so weiter. Gemeinsame Proteinveränderungen wurden in den Magenkrebs-Patienten nachgewiesen. Die Proteinexpression von MnSOD und HMG-1 wurde hochreguliert, während die von GST, AST und FOV wurde herunterreguliert im Magentumorgewebe. Eine Korrelation zwischen der Veränderung dieser Proteine ​​und deren transkriptionelle Expression in Magenkrebs wurde kaum in dieser Studie beobachtet, außer im Fall von FOV. Sowohl das Protein und die Genexpression von FOV, ein Magen-spezifischen sekretorischen Wachstumsfaktor für normale Magenepithelzellen, war deutlich herunterreguliert in Tumor aus der japanischen Patienten mit Magen-Adenokarzinome abgeleiteten Geweben. Überwachung der Expressionsniveaus dieser Magen-spezifische Protein in klinischen Proben können nützliche Informationen für die Diagnose von Magenkrebs als spezifische Biomarker schaffen und für ein besseres Verständnis der Magen Karzinogenese.
Methods
Materials
DNase I, RNase A, 2-Mercaptoethanol (2-ME), Glasperlen (212-300 um), Nonidet P-40, Acrylamid, N, N, N ', N'
-tetramethylenediamine (TEMED), Natriumdodecylsulfat (SDS ), Iodacetamid und Dithiothreitol (DTT) wurden von Sigma (St. Louis, MO) erworben. Agarose für isoelektronischen Fokussierung (IEF) und Pharmalyte 3-10 pI, 4-6,5 und 8-10,5 wurden von Amersham Bioscience (Piscataway, NJ). Trypsin (sequencing grade) wurde von Roche (Manheim, Deutschland). Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Thioharnstoff, Sorbitol, Natriumpyrophosphat, Ammoniumpersulfat, D, L-Asparaginsäure, Trichloressigsäure, Sulfosalicylsäure Dihydrat, Essigsäure, Acetonitril, Ameisensäure und Trifluoressigsäure (TFA) wurden von Wako Pure Chemicals (Osaka , Japan). Harnstoff wurde von Katayama Chemicals (Osaka, Japan). Pepstatin A und Leupeptin wurden vom Peptide Institute (Osaka, Japan). NH 4HCO 3 und N, N'-Methylenbisacrylamid wurden von Nacalai Tesque (Kyoto, Japan). CBB R-250 war von ICN Biomedicals Inc. (Aurora, OH). Molekülmassenstandards waren von APRO Science, Inc. (Tokushima, Japan). Trizolreagenz war von Life Technologies (Frederick, MD). Oligo (dT) 12-18-Primer, Desoxynucleotide (dNTPs) und RNaseOUT wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA). M-MLV-Reverse Transkriptase und Taq-DNA-Polymerase wurden von Promega (Madison, WI).
Gewebe und Probenvorbereitung
primären Magen-Adenokarzinome und benachbarten Nicht-Tumor Schleimhäuten wurden auf Gastrektomie gesammelt und von der Abteilung für Chirurgie zur Verfügung gestellt, Graduate School of Medicine, der University of Tokushima, Tokushima, Japan. Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki des Weltärztebundes durchgeführt und wurde von der Ethikkommission der Universität Tokushima genehmigt. Informierte Zustimmung wurde von allen Patienten gegeben, die die klinischen Proben. Die Gewebe wurden in einem Trockeneis-Methanol-Bad so bald wie möglich nach der Sektion und gespeichert in einem Tiefkühlschrank (-80 ° C) vor der Verwendung eingefroren. Für mRNA-Analyse wurden die Gewebe zuerst vor dem Einfrieren in RNAlater (Takara, Tokyo, Japan) eingetaucht. Detaillierte clinicopathological Daten einschließlich der Tumorstadium (nach dem AJCC System), Standort und Differenzierung und histologischen Daten auf den Gewebeproben sind in Tabelle 3 Keiner dieser Fälle aufgeführt in der szirrhösen Typ Kategorie klassifiziert wurden, und das Tumorgewebe wurde deutlich distinguishted aus nicht-Tumor eine in jedem Fall. Für die zweidimensionale Gelelektrophorese (2D-EP), Proteinextraktion aus Geweben wurde durch das folgende Verfahren durchgeführt. Gefrorene Blöcke (20-30 mg Nassgewicht) wurden in 10 Vol /Naßgewicht Dialysepuffer enthaltend 5 M Harnstoff, 1 M Thioharnstoff, 10 mM NaPPi mit einem Kunststoff Pistill (Toyobo, Tokyo, Japan) in Gegenwart von Glasperlen homogenisierte , 1,67 &mgr; l /ml 2-ME, 0,005% DNase I, 0,05 mg /ml RNase A, 20 uM Leupeptin, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF und 20 &mgr; M pepstatinA und dann bei 50.000 rpm für 30 min bei 4 ° C zentrifugiert, (Beckman -Coulter, Fullerton, CA). Der resultierende Überstand wurde als die Gewebeextrakt verwendet. Proteinkonzentrationen wurden mit einem Bradford-Protein-Assay-Kits (Bio-Rad, Hercules, CA) unter Verwendung von Rinder-gamma-Globulin als klinische Merkmale der Patienten mit Magen-Adenokarzinome standard.Table 3 bestimmt.
Case

Age

Sex

Locationa

Gradeb

Stage


A
63
Male
UM
G3
IIIA
T2N2M0H0
B
68
Female
L
G2
II
T2N2M0
C
76
Male
ML
G2
IV
T4N3M0
D
78
Female
L
G2
III
T2N0M0H0
E
77
Male
ML
G2
II
T2N1M0
aU: obere, M: mittlere, L: untere
BG2: mäßig differenzierten, G3:. schlecht differenzierten
Zwei-dimesional Gelelektrophorese
2D-EP wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [39]. Die erste dreidimensionale isoelektrische Fokussierung wurde in einer 1% (w /v) Agarosegel (φ 2,6 x 180 mm) mit einem pH 3-10 Gradienten bei 700 V für 18 Stunden bei 4 ° C, und der zweite dreidimensionale SDS durchgeführt Gelelektrophorese wurde mit einem 5-15% (w /v) Acrylamid-Gradienten (M r
Bereich 6-200 kDa) in einem Standard-Slab-Gel (20 × 13 cm) bei 15 mA für 3 h durchgeführt und dann bei 70 mA für 2 h bei Raumtemperatur. Die Gele wurden mit CBB R-250 gefärbt.
Proteinproben (500 ug) aus dem Tumorzentrum extrahiert und histologisch normaler Schleimhaut Umgebung wurden 2D-EP unterworfen und paarweise nebeneinander laufen. Einige der gefärbten Flecken
aus dem 2D-Gel, im Gel mit Trypsin verdaut und dann einer LC-ESI-MS /MS-Analyse, wie zuvor beschrieben ausgeschnitten wurden [40]. Das Peptidgemisch wurde mit einer Umkehrphasen nanoLCs System (Famous, Swichos II, Ultimate LC Packings, Sunnyvale, CA) getrennt. Die eluierten Peptide wurden direkt in ein ESI-Massenspektrometer (Esquire3000 Plus Bruker-Daltonics, Fremont, CA) besprüht. Wurde mit DataAnalysis 3.1-Software (Bruker-Daltonics) erworben, ein großes Volumen von MS /MS-Daten
, in Text umgewandelt Dateien, die die Massewerte der Elternionen und Intensitäten und Massen von Fragmentionen Auflistung, und dann mit dem MASCOT-Algorithmus (Matrix Science Ltd., London, UK) verarbeitet, um Peptide, die in der NCBI nicht-redundante Sequenz-Datenbank zuordnen taxonomischen Einschränkung verwenden, "Mensch". Die Datenbanksuche wurde mit den Parametern beschrieben von Yoshimura et al. [40]. Bilder Bildanalyse und MS Peptidsequenzierung
Bildaufnahme und Analyse wurden mit Molecular Imager FXProPlus (Bio-Rad) und Imagemaster-Software (Bio-Rad) durchgeführt. Es wurden Vergleiche zwischen Gel Bilder von Tumor- und Nicht-Tumorproben angepasst Paar für Paar gemacht. Normalisiert Volumen Unterschiede waren statistisch für alle fünf Fälle berechnet. Der Gehalt an Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) Protein wurde als Referenz verwendet, um die Falte Veränderung der Proteinexpression zwischen Tumor zu bewerten und angepaßt Nicht-Tumorgeweben, wie der Höhe der GAPDH-mRNA und Protein wurden nicht zwischen den Geweben, die von Patienten verändert. Konsequent und deutlich verschiedenen Stellen wurden für die Analyse von LC-ESI-MS /MS ausgewählt. Protein-Spots! Wurden aus Gelen in kleine Stücke geschnitten und unterzogen, um in-Gel-Trypsin-Spaltung über Nacht [40]. Peptid-Massenspektren wurden aufgezeichnet, und die Parameter für die Spektrenaufnahme verwendet wurden, wie zuvor angegeben [40]. Genauigkeit in der Datenbank Protein Matching-Maskottchen Suche mit [41] wurde als Score über 37 beurteilt, die in den meisten der Analysen erhalten wurde.
RNA-Isolierung und RT-PCR-Analyse
Tumor und angepasst Nicht-Tumorproben (ca.. 50 Naßgewicht mg) wurden zerkleinert und dann manuell in 1 ml TRIZOL-Reagens (Invitrogen) auf Eis homogenisiert. RNA wurde ohne DNase I-Behandlung isoliert und nach dem Protokoll des Herstellers. Kurz gesagt, wurde für 15 min bei 20.600 × g durch Zentrifugation zum Homogenat, gefolgt von 0,2 ml CHCl 3 zugesetzt. Ein gleiches Volumen von 2-Propanol wurden zu dem erhaltenen Überstand gegeben RNA auszufällen. Nach der Zentrifugation wurde das Pellet mit 75% Ethanol /diethylpyridylchloride (DEPC) -behandeltem Wasser, gefolgt von Trocknen gespült. Das Pellet wurde in einem geeigneten Volumen von DEPC-behandeltem Wasser als die gesamte RNA-Fraktion, gelöst. Für die reverse Transkription (RT), 2 &mgr; g RNA aus jeder Probe bei 37 ° C für 1 h in Gegenwart von 200 U von Molony-Leukämievirus Reverse-Transkriptase (Promega) transkribiert wurde, Oligo (dT) 12-18 Primers, 0,5 mM dNTPs und 50U von RNaseOUT.

• Down-Regulation der Thrombospondin2 prognostiziert schlechten Prognose bei Patienten mit Magenkrebs
• Katecholamin hochreguliert MMP-7-Expression durch die Aktivierung AP-1 und STAT3 in Magen cancer