Proteomskimi sprememba gastic adenokarcinomov iz japonskih bolnikih

Proteomskimi sprememba gastic adenokarcinomov iz japonskih bolnikih
Abstract
ozadju
želodčnega adenokarcinoma obsegajo eno izmed pogostih vrst raka v azijskih državah, vključno z Japonsko. Celovito protein profiliranje seznanjenih kirurških osebkov primarnih želodca adenokarcinomov nontumor sluznice, ki izhajajo iz japonskih bolnikih, ki je bila izvedena s pomočjo dvodimenzionalnega gelsko elektroforezo (2D-EP) in tekočinsko kromatografijo-elektrosprejnem ionska tandemsko masno spektrometrijo (LC-ESI-MS) za vzpostavitev želodčne raka specifične beljakovine so domnevno kliničnih biomarkerjev in molekularnih tarč za kemoterapijo.
Rezultati
Razmeroma pogoste spremembe v izražanju proteinov so se pokazali v tumorskih tkivih. Opazili so povečanje mangan dismutaze in nonhistone kromosomsko proteina HMG-1 (HMG-1), medtem ko je zmanjšanje ogljikove anhydrases I in II, glutation-S-transferaza in foveolin prekurzor (gastrokine-1) (FOV), ki je 18-kDa želodec -specifične protein z domnevno zaviralnih dejavnosti, so bili odkriti. analizo RT-PCR je razkrila tudi znatno navzdol ureditev FOV mRNA izražanja v tumorskih tkivih.
Zaključek
Možni patološko vlogo zmanjšanjem števila FOV v so dokazali želodca nastanek raka. Vrednotenje posebnih znižanja genov in proteinov izražanje FOV pri bolnikih, ki se lahko uporabijo kot kliničnih biomarkerjev za učinkovito diagnostiko in oceno raka želodca.
Ozadju
želodcu adenokarcinomi obsegajo eno izmed pogostih vrst raka v azijskih državah, vključno Japonska, pri čemer drugi le pljučnega raka, kot na število smrtnih žrtev, ki jih povzroča. Kljub nedavni razvoj diagnostičnih tehnik, večina bolnikov z rakom želodca diagnosticirali v zaključni fazi in ima petletni stopnja zelo nizka preživetja (manj kot 10%) [1]. To je deloma posledica pomanjkanja specifičnih in občutljivih biomarkerjev za diagnozo in spremljanje napredka bolezni v zgodnji fazi, čeprav so bili uporabljeni nekateri želodca tumorski markerji, vključno z karcinoembrionski antigen, in so delno učinkoviti. Kot je želodca nastanek raka večstopenjski proces, je potrebna tudi celovita analiza za posamezne primere, v katerih se pojavljajo različne molekularne dogodki v vsaki rakotvoren procesu.
Pred kratkim je bila proteomskimi analiza uporabljena za celovito preuči beljakovin izraz v telesnih tekočinah, tkiv in celic [ ,,,0],2-4]. Ta pristop, kot klinične proteomika, je zelo koristen za identificiranje povezano bolezni proteine, ki kažejo spremembe v izražanju in modifikacije, ki ustrezajo bolezenskega stanja [5, 6]. Ti proteini povezane z boleznijo, ki naj bi biomarkerjev za diagnozo in domnevno usmerjenih proteinov za zdravljenje [7-9]. Po drugi strani pa so celovite analize transcriptomes v tumorskih tkiv različnih rakavih bolnikih z uporabo DNK mikromrež in genske žetone izvedemo v zadnjih letih [10]. Vendar pa je bilo pomanjkanje korelacije med spremembami v mRNA in rakotvornosti dokazana, in kvantitativne in kvalitativne spremembe v post-translacijsko spremenjenih beljakovin kot končnim genskih produktov, se šteje, da so bolj informativni, razen tistih iz mRNA v tumorskih tkivih za proučevanje molekularnih dogodkov v nastanek raka. Proteomskimi študije za identifikacijo tumor, povezanih proteinov pri bolnikih z rakom želodca se povečujejo, in proteinskih podatkovnih baz za zdravljenje želodčnih tkiva [11] in celičnih linij [12] so bili zgrajeni. Večina od njih zadevajo posebne beljakovine ali antigene, ki odražajo kemo- in termo odporna lastnosti raka na želodcu [13-15], in da so povezani z Helicobactor pylori
[16, 17]. V tej raziskavi smo izvedli celovito analizo proteoma tumorja in nontumor tkiva v japonskih bolnikih z želodca karcinomov, in ugotovila več beljakovin, od katerih so stopnje izraženosti navadno spremenjene v kliničnih primerih. Še posebej je bil izraz gastrokine-1 (GKN-1) predlagane, da je tako na podlagi transkripcijske in translacijske nadzorom.
Rezultati
ločevanje proteinov in identifikacijo
Slika 1A prikazuje pregled slik tipično glavnega gel za želodčno tumorsko tkivo. Okoli 200 proteinske lise obarvali s Coomassie briljantno modro (CBB) R-250 so bile ločene v gelov. Oštevilčene lise na sliki 1B in 1C smo izrezali iz gela, obdelali s tripsinom in nato podvržemo tekočinsko kromatografijo-elektronska aerosolna ionizacija tandemski masni spektrometer analize (LC-ESI-MS /MS). Dvainsedemdeset izmed njih predstavlja 69 različnih beljakovin vrste so bile ugotovljene. Tabela 1 vsebuje vse od beljakovin, opredeljene s peptida ujemanja s iskalnega algoritma Mascot. Natančnost pri beljakovin profiliranje je bila ocenjena kot vrednost rezultata (nad 37). Slika 1 (A) Pregled na centralni 2D gela podobi tumorsko tkivo, pridobljenega iz pacienta z adenokarcinomom želodca. (B) in (C) oštevilčene proteinske lise smo identificirali z LC-ESI-MS /MS in beljakovin ujemanja, kot je prikazano kot povečanimi slikah.
Tabela profilom 1 protein odkrili v tumorskem tkivu, pridobljenimi iz japonskega bolnika z želodca adenokarcinom.
Spot Ne
število pristop
identifikacija Protein

Mass
SC (%)
PI
Ocena
1
24308169
axonemal težka veriga dynein tip 3
473.776
0
6.04
37
2
15010550
protein toplotnega šoka gp96 predhodnik
90.309
7
4.73
62
3
72.222
toplotni šok protein 90 -β
83.584
14
4,97
176
4
5729877
toplotnega šoka 70 kDa protein 8 izooblika 1
71.082
19
5,37
283
5
38044288
gelsolin izooblika b
80.876
5
5,58
63
6
4826960
glutaminil-tRNA sintetazo
88.655
1
6,71
44
7
4501867
aconitase 2
86113
10
7.36
231
8
119717
ezrin
69470
7
5.94
75
9
4557871
transferrin
79280
9
6.81
97
10
16507237
heat šok 70 kDa protein 5
72402
15
5,07
165
11
24234686
toplotni šok protein 70 kDa protein 8
53.598
16
5.62
160
12
4885431
toplotnega šoka 70 kDa protein 1B
70.267
11
5.48
143
13
1082886
tumor nekroze dejavnik tipa 1 protein-receptor povezan TRAP-1
75694
13
8.43
288
14
31542947
šaperonina, mitohondrijske matrika beljakovin P1, P60 limfocitov beljakovine
61.187
13
5.7
299
15
28.592
serum albumin
71316
23
6.05
292
16
340219
vimentin
53738
18
5.03
79
17
4503729
similar za FK506-vezavo proteina 4
49031
5
5.6
36
18
32709
IFP53
53559
21
5.93
277
19
4502643
chaperonin-containing TCP1, subunit6A (zeta 1)
58444
6
6.23
79
20
7106439
tubulina, β5
50095
14
4.78
125
21
37492
α-tubulin
50810
13
5.02
94
22
125604
pyruvate kinaza, M2 isozyme
58447
5
7.95
234
23
4557014
catalase
59947
6
6.9
120
24
4503483
eukaryotic prevod raztezek faktor 2
96.246
4
6.41
56
25
179.279
ATP sintaza β podenote
56.861
5
5,39
59
26
7657041
navzdol urejeno v metastaz
320.846
2
7.07
40
27
4504169
glutation sintetaze, GSH synthetase
52523
5
5.67
99
28
12017952
GE36
73327
2
5.2
37
29
34234
laminin-binding protein
31.888
12
4,84
51
30
16359158
aktin, beta
42078
14
5.29
171
31
6635125
KIAA0284 protein
161.473
2
6.36
47
32
5803225
14-3-3 epsilon
29326
8
4.63
49
33
4504707
inozitol polifosfatov-4-fosfataze in tipa II, 105 kD
105.749
1
5,87
37
34
35038601
hipotetično protein DKFZp761A078
74864
2
7.27
47
35
12017952
GE36
73327
1
5.2
38
36
4505877
plectin 1 izoforma 1
520111
1
5,57
44
37
38158018
centrosomal protein 1, centriole povezan protein, centriolin
269874
1
5.44
39
38
30157438
CTD veže SR podobnih beljakovin Ra9
180240
1
9.15
41
39
4503471
evkariontskih prevod raztezek faktor 1 α1
50.451
12
9.1
191
40
4757810
ATP sintaza
59.828
17
9,16
178
41
693.933
2-phosphopyruvate-hydratase α-enolazni
47.421
22
7.01
240
42
123.576
47 kDa protein toplotnega šoka predhodnik
46.352
14
8.27
177
43
5032069
spajanje dejavnik 3b podenote 4
44.414
3
8,54
58
44
4503471
evkariontskih prevod raztezek faktor 1 α1
50.451
4
9,1
47
45
5921789
citrat sintaza, mitohondrijski predhodnik
51.959
12
8.13
114
46
4505763
fosfoglicerat kinaze 1
44.985
14
8.3
87
47
4504069
aspartat-aminotransferaze 2 predhodnik
47.844
6
9.14
52
48
7669492
gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze
36201
13
8.57
49
49
4757756
aneksin A2
38808
9
7.57
87
50
6648067
malat dehidrogenaze, mitohondrijsko predhodnik
35965
7
8.92
60
51
5031857
laktat-dehidrogenaze
36.950
6
8,44
43
52
238.427
Porin 31 HM
30.737
29
8.63
124
53
5174447
gvanin nukleotidov, ki veže protein
35.511
8
7.6
65
54
34740329
heterogena jedrske ribonucleoprotein A3
39799
7
9.1
43
55
4504983
galectin-3
26229
12
8.58
42
56
4504447
heterogeneous jedrska ribonucleoprotein A2 /B1 izooblika A2
36041
7
8.67
40
57
86901
ATP-odvisne DNA helikaza RAP30 /74 veriga RAP30
26350
3
9.46
41
58
230.445
karboanhidraze sem
28903
12
6.44
67
59
455739
karboanhidraze II
29285
8
6.87
82
60
26892090
beta-globin verige varianta
16.101
40
7.86
121
61
34.709
mangan superoksid dismutazo
24.891
10
8.35
111
62
4507645
triosefosfat izomeraza 1
26938
17
6.45
47
63
38488935
foveolin predhodnik
20.546
16
5.65
95
64
478.813
nonhistone kromosomskih protein HMG-1
25.139
13
5.41
60
65
2204207
glutation S-transferase
23595
34
5.43
73
66
178755
proapolipoprotein
28944
8
5.45
103
67
37267
transketolase
68435
4
7.9
59
68
189998
M2-type piruvat kinaze
58.447
10
7,95
157
69
825.605
glutation S-transferaza
25.650
10
8.51
65
Te beljakovine so razvrščene v več kategorij glede na njihove funkcije, vključno z citoskeleta proteinov, povezanih s stresom in chaperoning proteinov akutne faze proteinov, glikoliticna encimi, encimi, ki sodelujejo pri presnovi in ​​celični proliferaciji, zaviralnih proteinov in želodca specifičnih proteinov . so odkrili
Skupne spremembe izražanja proteina med tumorja in nontumor tkiv pri bolnikih z želodčnim rakom
raznolikih sprememb v proteinski med tumorja in nontumor tkiv iz istih bolnikov. Kot je prikazano na sliki 2, je bilo med pet japonskih bolnikih z rakom želodca (Primeri A do E) opazili nekaj skupnih spremembe. Mangan superoksid dismutaza (MnSOD), nonhistone kromosomsko protein HMG-1 (HMG-1), fosfoglicerat kinaze 1 (PGK-1), karboanhidraze I in II (CA I in II), foveolin prekurzor FOV (gastrokine-1), aspartat aminotransferaza 2 prekurzor (AST) in glutation s-transferaze (GST) razstavljena skupne spremembe v izražanju med tumorskih in nontumor tkivih, tudi med identificiranih proteinov. Izraz beljakovin MnSOD in HMG-1 je bilo dokazano, da se up-urejena v tumorskih tkivih, v primerjavi v nontumor tkivih. Po drugi strani pa smo CA I in II, FOV, AST in GST proteini pokazala, da se navzdol regulirano v tumorskih tkivih. Gube spremembe v ekspresijo teh proteinov relativnih tistemu GAPDH so povzeti v tabeli 2. najbolj izrazit padec je bil prikazan v stopnji FOV v vseh primerih. Stopnja zmanjšanja GST proteinske ekspresije je bila skoraj enaka kot v FOV (primeri B, D in E), čeprav je ena nismo opazili v drugih dveh primerih. Po drugi strani pa je povečanje HMG-1 označene v treh primerih (A, C in D), čeprav je taka razlika v izrazu ni bilo opaziti v drugih dveh primerih. MnSOD pokazal tendenco naraščanja v tumorskih tkivih treh bolnikov (zadevi A, C in D), vendar relativno zmanjšanje je bilo opaziti tudi v zadevi B. Kot je za Pgk-1 je pomemben odnos med kratnih sprememb v izražanju proteinov in je komaj opaziti patološko razvrščanje tumorjev. Slika 2 Podrobna sprememba vzorcev proteinov. (A) Nontumor in (B) tumorskih proteinov, vključno CAI (No.58), Pokliči (No.59), MnSOD (No.61), FOV (No.63), HMG-1 (No.64) in GST (No.65). (C) Nontumor in (D) tumorskih proteinov, vključno PGK-1 (No.46), AST (No.47) in GST (No.69). GAPDH, obkrožila, je bil uporabljen kot referenčni beljakovini.
Tabela 2-krat sprememb v izražanju proteinov med nontumor in tumorskih tkivih, ki izhajajo iz petih bolnikih s želodca adenokarcinome.
Protein
Primer A
Primer B
zadevi C
Case D
Case E

CA I
-6,5
-1,6
-3,3
-4,3
-2,6
CA II
-2.6
-1.3
-26
-4.3
-13
FOV
-13
-13
-26
*
-26
MnSOD
+1.7
-2.6
+6.5
+1.4
+1.1
HMG-1
+13
*
+3.7
+13
*
PGK1
+1.6
+1.1
-1.2
+2.6
-1.4
AST
-13
-1.6
-6.5
-3.7
-2.6
GST
*
-26
*
-13
-13
CA I, karboanhidraze I.
CA II, karboanhidraze II.
FOV, foveolin predhodnih sestavin.
MnSOD, mangan superoksid dismutaza.
HMG-1, nonhistone kromosomsko beljakovin.
PGK1, fosfoglicerat kinaze 1.
AST, aspartat-aminotransferaze 2 predhodnik.
DDV, glutation S-transferaza.
*, ni določena.
RT-PCR analizo
Z RT-PCR, spremembe v mRNA izraz v tumor in nontumor tkiv, pridobljenih pri bolnikih z rakom želodca so analizirali proteinov, ki razstavljena spremembe v izražanju proteinov, vključno s FOV, MnSOD in HMG-1. Kot je prikazano na sliki 3, je bil FOV mRNA bistveno zmanjšal v tumorskih tkiv štirih pri vseh bolnikih (Primeri A, B, C in E), medtem ko ni bila odkrita v obeh nontumor ali tumorskih tkiv drugega pacienta (Primer D) . Na drugi strani pa je MnSOD mRNA v štirih bolnikih (primeri B, C, D in E) izrazito povečala, čeprav je bila odkrita le malo razlik v ravni mRNA med nontumor in tumorskih tkivih, v zadevi A. Vendar pa so komaj opazili razmerje med HMG-1 mRNA izražanja in patoloških fenotipe tumorjev. Slika 3 Primerjava mRNA izražanja proteinov lahko povezana z rakotvornost med nontumor in tumorskih tkiv, pridobljenih od petih bolnikov s želodca adenokarcinome (primeri A do E) z RT-PCR. N in T kažejo nontumor in tumorskih tkivih, v tem zaporedju.
Razprava
V tej študiji smo izvedli proteomskimi analizo tumorja in nontumor tkiv, pridobljenih iz japonskih bolnikih adenokarcinomom želodca. Šestdeset devet različnih proteinov v tkivu tumorja iz želodčno primeru raka so označene z 2D-EP in LC-ESI-MS /MS, ki je vključevala stresne proteine, Hsp70, Hsp90 in TCP1 vsebujejo chaperonine (SCT), za samozaščito; glikoliticna encimi, trioza fosfat izomeraza 1, α-enolazni in PGK-1, na zahtevo naraščajočo energijo; citoskeletne proteine, ezrin, gelsolin izooblika b in vimentin; proteini, vključeni v diferenciacijo in proliferacijo celic, galektin-3 in transferina; beljakovine pa kažejo domnevnega tumor dušenje dejavnost, FOV. Mnoge od teh beljakovin so poročali, da so povezani z tumorigeneze želodca adenokarcinome vključujejo več korakov in dejavnikov [18, 19].
Tudi dokazali smo, da so bile stopnje izraženosti številnih proteinov v tumorskih tkivih pogosto spremeni v petih japonskih bolnikih z želodčno adenokarcinomov, v primerjavi s tistimi v nontumor tkivih. Skupno povečanje izražanja proteina v tumorskih tkivih pojavila MnSOD, HMG-1 in Pgk-1, medtem ko je skupno znižanje v tumorskih tkivih pojavila FOV, GST in AST
superoksid (O 2 . - ), prosti radikal, je bistvenega pomena za protimikrobno delovanje granulocitov in monocitov. Superoksid dismutaza (SOD), hitro odstrani odvečno količino superoksid, proizvedenega v stresnih in bioloških reakcij in vivo
s katalizo pretvorbo superoksid s H + H 2O 2 in O 2. MnSOD, eden od ruše, ki se nahaja v mitohondrijih in prispeva k varovanju mitohondrijske DNK pred poškodbami. Ugotovljeno je bilo, da bi morala biti povečana ekspresija MnSOD v progresivno raka želodca, povezanih s 5-letno stopnjo preživetja po operaciji [20] in občutljivost na kemoterapijo [21]. V tej študiji je bil protein izražanje MnSOD up-urejeno v 4 od 5 bolnikov z rakom želodca, da gre za samostojno zaščito odziv. Po drugi strani pa je bila obravnavana up-ureditev MnSOD v tumorskih tkivih motijo ​​učinkovito kemoterapijo temelji na radikalno proizvodnje, ki lahko povzroči zmanjšanje občutljivosti na zdravila proti raku ter za določitev resnosti raka.
HMG-1 uravnava transkripcijo različnih genov in strukturno stabilizacijo kromosomov kot proteina DNA, ki veže. HMG-1 so poročali, da je povezana z kancerogenosti in metastazami v debelega črevesa in raka dojke [22].
Transkripcijska up-regulacijo HMG-1 v rakom želodca, je bilo tudi dokazano, [23]. Izražanje HMG-1 v tumorskih tkivih, je predlagal, da je povezana z odpornostjo na cisplatin [24]. Smo pokazali tukaj povečanje tega proteina v treh primerih.
GST je drog metabolizma, encim, ki katalizira konjugacijo zmanjšane glutationa do zdravil in metabolitov, prispeva pa tudi k razstrupljanju rakotvornih snovi. Zato lahko zmanjšanje dejavnosti kot dejavnik tveganja za rakotvornost. Okužba s Helicobacter pylori, so poročali, da povzroči zmanjšanje GST izražanja [25], kar kaže, da bi lahko znižanje GST dejavnosti vzrok za želodčne rakotvornost. V tej študiji so opazili zmanjšanje GST beljakovin izražanja v treh primerih. Zmanjšanje GST proteinsko ekspresijo lahko uporabimo kot biomarker za diagnozo želodčnih tumorjev.
AST je aminotransferaza, ki deluje na aminokislin in α-keto kislino, ki se porazdeli po človeških organov. AST se sprosti v krvni obtok zaradi večje prepustnosti in uničenje tkiva. Povišana koncentracija AST beljakovin so poročali v krvi bolnikov s hepatitisom, malignih tumorjev, vključno z hepatomas in leuchemia. Gene izraz GST je prav tako pokazala, da je up-urejena debelega črevesa in tumorskih tkivih [26]. Vendar pa je bilo zmanjšanje AST beljakovin izražanja pogosto opazili pri vseh tumorskih tkivih, ki izhajajo iz sedanjih petih bolnikih s želodca adenokarcinome. Nadaljnje študije je treba izvesti za pojasnitev ali je zmanjšanje AST proteina specifično opazili v želodčnih tumorskih tkiv ali ne.
Povišano izražanje Pgk-1, ki je ena izmed encimov v glikolitski poti in ki katalizira defosforilacije v 1,3-bisphosphoglycerate za proizvodnjo ATP, je bilo opaziti v mnogih malignih tumorskih tkivih, ki so odvisne od ATP kot glavni vir energije. Trdni tumorji so mislili, da potrebujemo prevelike ATP za ohranjanje okrepljeno širjenje. Up-ureditev glikoliticna encimov, vključno Pgk-1 v pljučnega raka [27] in M2 tipa piruvat kinaze pri raku debelega črevesa in [28], so poročali in predlagal, da je koristno za raka. Vendar pa v tej študiji, so komaj zaznali pomemben odnos med PGK-1 proteinske ekspresije in fenotipe želodca adenokarcinomov. Zato je PGK-1 šteje, da niso primerni za diagnozo raka želodca.
Ogljikove anhydrases (CAS) so encimi, ki vsebujejo cink, ki se prodajajo široko v različnih organih in zajemajo veliko družino, vključno s CA-I, CA -ix. So katalizira hidracijo CO 2 za vmesno presnovo in vzdrževanje pH in ionsko ravnovesje v telesu. Doslej je bila neposredna povezava dokazana med maligno transformacijo in izražanja proteinov za CA I do VII [29]. Dve prejšnje študije so pokazale, da je izraz tako CA-I in CA-II bistveno zmanjša tumorjev debelega primerjavi s tistimi v normalnem kolorektalnega epitelij ali sluznice [30]. Drugo poročilo je predstavil rezultate, ki kažejo, da zmanjšano izražanje CA-I in CA-II je bila povezana z biološko agresivnosti kolorektalnega raka in sinhronim oddaljene metastaze [31]. Kot je bilo že predlagala [32], želodca in karcinomi lahko delijo podoben mehanizem celične proliferacije in sluznice maligne bolezni, in lahko postane biomarkerjev za te karcinomov, saj so opazili tudi skupna zmanjšanje izražanja proteinov CA-I in CA-II v tej študiji.
FOV, ki je identična želodčne specifične 18-kDa antruma sluznico proteina! (AMP-18) [33, 34] GKN1 [35] in triperesne deteljice faktorja interakcije (Z), (TFIZ) [36], je pokazalo, da so močno navzdol reguliranim ali odsotne v želodčnih bolnikov adenokarcinom v tej študiji. Človeški AMP-18 in humani carcinoantigenic CA11 genski produkt, ki kodira aminokislinsko sekvenco, ki se razlikuje od tistega AMP-18 v samo eni ostanka [37, 38] funkcijo izločajo rastne faktorje delno odgovorne za vzdrževanje normalne funkcionalno želodca epitel [33]. Tako AMP-18 in genski produkt CA11 Poročali so, da se intenzivno izražene v normalnem želodcu tkivu, vendar ne v večini želodčnih raka [33, 37, 38]. Imunohistokemične študije so pokazale, da se zdi, da je prisotna na sluzničnih epitelnih celic normalne človeške želodčne antruma in dvanajstnika [33] AMP-18. Nedavno je bil TFIZ dokazano, da deluje kot regulator rasti epitelijskih celic želodca skozi tvorbo heterodimer z deteljast faktorjem 1 (TFF1) [36]. Naš sedanji podatki dodatno potrjuje visoko ekspresijo FOV v nontumor želodčnih tkivih in znatno zadušitvi proteina v želodčnih adnocarcinomas, kar kaže, da FOV igrajo vlogo pri vzdrževanju normalne diferenciacije epitelnih celic in zatiranje tumorjev, vendar ne v tumorskih tkivih. Poleg tega smo pokazali, da je bil prepis FOV mRNA pogosto navzdol urejeno pri bolnikih z rakom želodca, kar kaže, da je bila izrazito zmanjšanje FOV beljakovin povzroča zatiranje FOV genske ekspresije tudi. Poleg tega je v enem bolniku protein ni bila odkrita v nontumor tkivih, kar kaže, da se stopnja izraz FOV proteina pri posameznikih določi adenokarcinomom želodca fenotip. Skladno s tem lahko stopnja izraz FOV kot biomarker informativne za oceno raka želodca.
Zaključek
Protein profiliranje tumorja in nontumor tkiv, pridobljenih iz japonskih bolnikih so želodca adenokarcinomov izvedli s pomočjo 2D-EP in LC- ESI-MS /MS. Ugotovljene proteini vključeni molekularne chaperones, encime za proizvodnjo energije, citoskeletne beljakovine, in tako naprej. Skupne proteinske spremembe so odkrili pri bolnikih, ki so želodca z rakom. Protein izraz MnSOD in HMG-1 je reguliran medtem ko je GST, AST in FOV je navzdol urejena v želodcu tumorskih tkivih. Korelacijo med spremembo teh proteinov in njihove transkripcijsko izražanja raka želodca so komaj opazili v tej študiji, razen v primeru FOV. Tako beljakovin in izražanje genov za FOV, želodčne specifično sekretorni rastni dejavnik za normalne želodčnih epitelnih celic, je izrazito navzdol urejeno v tumorskih tkiv, pridobljenih iz japonskih bolnikih z želodca adenokarcinome. Spremljanje ravni izražanja tega želodca specifičnih beljakovin v kliničnih vzorcih so lahko koristne informacije za diagnozo raka želodca kot poseben biomarkerja in za boljše razumevanje želodca rakotvornost.
Metode
Materiali
DNaze I, RNazo A, 2-merkaptoetanola (2-ME), steklene kroglice (212-300 um), Nonidet P-40, akrilamida, N, N, N ', N'
-tetramethylenediamine (TEMED), natrijev dodecilsulfat (SDS ), jodacetamid in ditiotreitol (DTT) smo dobili od Sigma (St. Louis, MO). Agarose za isoelectronic poudarkom (IEF), in Pharmalyte pI 10/03, 4-6,5 in 8-10,5 bili iz Amersham Bioscience (Piscataway, NJ). Tripsin (sekvenciranje razred) je bil iz Roche (Manheim, Nemčija). Fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF), tiosečnine, sorbitol, natrijev pirofosfat, amonijev persulfat, D, L-aspartinska kislina, trikloroocetna kislina, dihidrat sulfosalicilno kisline, ocetne kisline, acetonitril, mravljinčno kislino in trifluorocetne kisline (TFA) so od Wako Pure Chemicals (Osaka , Japonska). Urea je iz Katayama kemikalij (Osaka, Japonska). Lizocima A in leupeptina bila od peptidov inštituta (Osaka, Japonska). NH 4HCO 3 in N, N'-metilenbisakrilamid bilo iz Nacalai Tesque (Kjoto, Japonska). CBB R-250 je bil iz ICN Biomedicals Inc. (Aurora, OH). Molekulska masa standardi so bili iz APRO Science, Inc. (Tokushima, Japonska). TRIzola reagent je bil iz Life Technologies (Frederick, MD). Oligo (dT) 12-18 primer, deoksinukleotidi (dNTP), in RNaseOUT bilo iz Invitrogen (Carlsbad, CA). M-MLV reverzne transkriptaze in Taq DNA polimerazo so Promega (Madison, WI).
Tkiva in priprava vzorcev
Osnovne želodca adenokarcinome in sosednjih nontumor sluznice so bili zbrani na želodca in ki jih je oddelku za kirurgijo, Graduate School Medicinska fakulteta, Univerza v Tokushima, Tokushima, Japonska. Raziskava je bila izvedena v skladu s Helsinško deklaracijo Svetovne Medical Association, in ga je odobrila etični odbor Univerze v Tokushima. Privolitev je bila dana tudi vsi bolniki, ki so določene klinične vzorce. Tkiva smo čimprej zamrznili v suhi ledeni kopeli metanola po seciranje in shranjeni v zamrzovalnik (-80 ° C) pred uporabo. Za analizo mRNA smo tkiva prvi potopi RNAlater (Takara, Tokio, Japonska) pred zamrzovanjem. Podrobni clinicopathological podatki s stopnjo tumorja (po sistemu AJCC), mesta in diferenciacijo in histoloških podatkov o vzorcev tkiva so navedene v tabeli 3. Nobena od teh primerov so bili uvrščeni v kategorijo scirrhous tipa, in tumorsko tkivo je bilo jasno distinguishted od zunaj tumorja eno v vsakem primeru. Za dvodimenzionalna gelsko elektroforezo (2D-EP), je bila ekstrakcija beljakovine iz tkiv izvede po naslednjem postopku. Zamrznjeni bloki (20-30 mg mokre mase) smo homogenizirali s plastičnim batom (Toyobo, Tokyo, Japonska) v prisotnosti steklenih kroglic v 10 vol /mokre teže dializne pufru, ki vsebuje 5 M sečnino, 1 M tiosečnino, 10 mM NAPPI , 1,67 ml /ml 2-ME, 0,005% DNaze, 0,05 mg /ml RNaze A 20 uM leupeptina, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF in 20 uM pepstatinA in nato centrifugirali pri 50.000 obratih na minuto za 30 minut pri 4 ° C (Beckman -Coulter, Fullerton, CA). Dobljeno Supernatant smo uporabili kot ekstrakta tkiva. Koncentracije proteinske so bile določene z Bradfordu protein analiznega kompleta (Bio-Rad, Hercules, CA) z uporabo govejega gama-globulin kot standard.Table 3 kliničnih značilnosti bolnikov z želodčnega adenokarcinoma.
Case

Age

Sex

Locationa

Gradeb

Stage


A
63
Male
UM
G3
IIIA
T2N2M0H0
B
68
Female
L
G2
II
T2N2M0
C
76
Male
ML
G2
IV
T4N3M0
D
78
Female
L
G2
III
T2N0M0H0
E
77
Male
ML
G2
II
T2N1M0
AU: zgornja, M: srednja, L: nižje
BG2: zmerno razlikujejo, G3. slabo diferenciran
Two-dimesional gel elektroforeza
2D-EP je bila izvedena kot prej [39] opisano. Prva-dimenzionalni Izoelektrično fokusiranje je bila izvedena v 1% (m /v) agarozni gel (φ 2,6 x 180 mm) s pH 3-10 naklonu pri 700 V 18 ur pri 4 ° C, in druga-dimenzionalni SDS gelsko elektroforezo smo izvedli s 5-15% (m /v) akrilamid gradient (m
r razpon, 6-200 kDa) v standardnih ploščah gelu (20 x 13 cm) pri 15 mA 3 ure, nato pa pri 70 mA za 2 uri pri sobni temperaturi. Geli smo obarvali z CBB R-250.
Vzorce Protein (500 mikrogramov), pridobljenih iz tumorja središča in okoliških histološko normalno sluznico bili podvrženi 2D-EP in vodijo v pari strani s strani.
Nekatere obarvanih lis smo izrezali iz 2D gela v-gel razgradili s tripsinom in nato podvržemo analizo LC-ESI-MS /MS kot smo že prej [40] opisano. Zmes peptida ločimo z reverzno sistemom faza nanoLC (Famous, Swichos II, Ultimate, LC embalaži, Sunnyvale, CA). Eluirani peptide smo škropili neposredno v ESI masni spektrometer (Esquire3000 Plus, Bruker-Daltonics, Fremont, CA).
Veliko količino podatkov MS /MS je bila pridobljena z DataAnalysis 3,1 programske opreme (Bruker-Daltonics), pretvori v besedilo datoteke kotacijo mase vrednosti matičnih ionov ter intenzivnosti in mase fragmentov ionov, in nato obdelajo z maskoto algoritma (Matrix Science Ltd, London, Velika Britanija) dodeliti peptide v NCBI brez odvečnih zaporedje bazi podatkov z uporabo taksonomsko omejitev, 'človek'. Iskalna baza je bila opravljena s parametri, ki jih Yoshimura et al opisal. [40]. Analiza
slike in MS peptida sekvenciranje
pridobivanje slike in analize so bile izvedene z molekularno tipala FXProPlus (Bio-Rad) in ImageMaster programske opreme (Bio-Rad). Primerjave so bile narejene med gel podob tumorja in izravnane nontumor vzorcev par po parih. Normirane razlike obseg bile statistično izračunano za vseh petih primerih. Vsebnost gliceraldehidne 3-fosfodehidrogenaze (GAPDH) proteina smo uporabili kot referenco za oceno kratno spremembo proteinske ekspresije med tumorja in se ujema nontumor tkiva, ravni GAPDH mRNA in proteina, niso spremenile med tkivi, ki izhajajo iz pacientov. Dosledno in precej različni vložki so bili za analizo izbrala LC-ESI-MS /MS. Proteinske lise! Smo izrezali iz gela na majhne koščke, in izpostavi v-gel triptičnih prebavo čez noč [40]. zabeležili peptid masne spektre, in so bili uporabljeni parametri za pridobitev spektrov kot je navedeno prej [40]. Natančnost v podatkovne baze beljakovin ujemanje uporabo maskota iskanje [41] je bilo ocenjeno kot rezultat nad 37, ki je bilo pridobljeno v večini analiz.
RNA izolacija in analizo RT-PCR
tumorje in uskladiti nontumor vzorci (pribl. 50 mg mokre teže) je bilo mleto, nato pa homogenizirali ročno v 1 ml TRIzola reagenta (Invitrogen) na ledu. RNA smo izolirali brez zdravljenja DNaze I v skladu s protokolom proizvajalca. Na kratko, 0,2 ml CHCl 3 dodamo homogenata, ki mu sledi s centrifugiranjem pri 20.600 x g 15 minut. Enak volumen 2-propanola dodamo nastalega supernatantu da se obori RNA. Po centrifugiranju smo pelete splaknili z 75% etanolom /diethylpyridylchloride (DEPC) zdravljene vode, čemur sledi sušenje. Pelet smo raztopili v ustreznem volumnu-DEPC obdelano vodo kot celotne RNA frakcije. Za reverzne transkripcije (RT), 2 ug RNA iz vsakega vzorca je prepisana pri 37 ° C za 1 h v prisotnosti 200U od Molony virus levkemije reverzne transkriptaze (Promega), oligo (dT) 12-18 grundiranje 0,5 mM dNTP-jev in 50U od RNaseOUT. V PCRs za karboanhidraze-I in II, glutation-S-transferaze, FOV in GAPDH so bile izvedene v linearnem območju ojačanja z izbranim nizom osnovnega in pogoje, in pričakovano velikost proizvodov, kot je povzeto v tabeli 4. PCR

• Dol ureditev Thrombospondin2 napoveduje slabo prognozo pri bolnikih z razjedo cancer
• Kateholamina up-uravnava MMP-7 izražanje z aktiviranjem AP-1 in stat3 v želodčni cancer