Proteomický zmena v gastic adenokarcinómov u japonských pacientov

Proteomický zmena v gastic adenokarcinómov u japonských pacientov
abstraktné
pozadia
žalúdočné adenokarcinómov zahŕňať jeden z bežných typov rakoviny v ázijských krajinách vrátane Japonska. Komplexné proteín profilovanie párových chirurgických vzoriek primárnych žalúdočných adenokarcinómov a nontumor sliznice odvodených z japonských pacientov bolo vykonané pomocou dvojrozmerného gélovej elektroforézy (2D-EP) a kvapalinová chromatografia s elektrosprejová iónovej tandemovou hmotnostnej spektrometrie (LC-ESI-MS) na zriadenie žalúdočnej proteíny s rakovinou špecifické ako domnelé klinických biomarkerov a molekulárnych cieľov pre chemoterapiu.
Výsledky
pomerne časté zmeny v expresii proteínu boli odhalené v nádorových tkanivách. Zvýšenie mangánovej dismutázy a nehistonové chromozomálne proteín HMG-1 (HMG-1) bolo pozorované, zatiaľ čo pokles uhličité anhydrases I a II, glutatión-S-transferázu a foveolin prekurzor (gastrokine-1) (FOV), 18-kDa žalúdku -specifické proteín s domnelým nádorového supresor aktivity, boli zistené. RT-PCR analýza tiež odhalila významné down-reguláciu expresie FOV mRNA v nádorovom tkanive.
Záver
možnú patologickú úlohu pre down-reguláciu zorného poľa v žalúdku bola preukázaná karcinogenézy. Vyhodnotenie konkrétnych poklesu génovej a proteínové expresie zorného poľa u pacientov môžu byť použité ako klinických biomarkerov pre efektívnu diagnostiku a stanovenie rakoviny žalúdka.
Pozadie
žalúdočné adenokarcinóm zahŕňať jeden z bežných typov rakoviny v ázijských krajinách, vrátane Japonsko, pričom na druhom mieste rakoviny pľúc, čo sa týka počtu úmrtí, ktoré vyvoláva. Napriek nedávnemu vývoju diagnostických metód, väčšina pacientov s karcinómom žalúdka je diagnostikovaná v pokročilom štádiu a majú mieru prežitia veľmi nízku päťročnú (menej ako 10%) [1]. Je to čiastočne kvôli nedostatku špecifických a citlivých biomarkerov pre diagnostiku a sledovanie pokroku ochorenie v ranom štádiu, aj keď niektoré žalúdočné nádorové markery, vrátane karcinoembryonálneho antigénu, boli použité a sú čiastočne účinné. Ako žalúdočné karcinogenézy je viacstupňový proces, je tiež potrebné komplexnej analýzy pre jednotlivé prípady, v ktorých sa používajú rôzne molekulárnej udalosti sa vyskytujú v každej karcinogénneho procesu.
Nedávno proteomická analýza bola využitá komplexne skúmať expresiu proteínu v telesných tekutín, tkanív a buniek [ ,,,0],2-4]. Tento prístup, ako klinické proteomiky, je veľmi užitočná pre identifikáciu proteínov ochorení asociovaných, ktoré ukazujú zmeny v expresii a modifikáciu, ktoré zodpovedajú stavu ochorenia [5, 6]. Tieto proteíny vzťahujúce sa k ochorenie sa predpokladá, že markery pre diagnostiku a predpokladané cieľových proteínov pre liečbu [7-9]. Na druhej strane, ucelená analýza transkriptomu v nádorových tkanivách z rôznych pacientov s rakovinou s použitím DNA mikročipov a génové čipy boli vykonané v posledných rokoch [10]. Avšak, nedostatok korelácia medzi zmenami v mRNA a karcinogenézy bola preukázaná, a kvantitatívne a kvalitatívne zmeny posttranslačně modifikovaných proteínov ako konečné génových produktov sú považované za viac informatívny ako mRNA v nádorového tkaniva pre štúdium molekulárnej udalosti karcinogenézy. Proteomické štúdie pre identifikáciu proteínov súvisiacich s nádorom v karcinómu žalúdka sa zvyšuje, a proteomu databázy pre žalúdočné tkaniva [11] a bunkových línií [12] boli postavené. Väčšina z nich sa týkajú konkrétnych bielkoviny alebo antigény, ktoré odrážajú chemoterapia a tepelne odolné vlastnosti rakoviny žalúdka [13-15], a ktoré sú spojené s Helicobactor pylori
[16, 17]. V tejto štúdii sme vykonali komplexnú analýzu proteomu nádoru a nontumor tkanív v japonských pacientov s žalúdočnými karcinómy, a identifikovali niekoľko proteínov, ktoré sú hladiny expresie sú bežne zmenené v klinických prípadov. Najmä bolo navrhnuté expresie gastrokine-1 (GKN-1), že je ako pod transkripčný a translačný kontrolou. Výsledky
Protein separáciu a identifikáciu
obrázku 1 A ukazuje prehľad obrazu typické hlavné gélu pre žalúdočné nádorové tkanivá. Približne 200 proteínové škvrny zafarbené Coomassie brilantná modrá (CBB) R-250 boli dobre oddelené v géloch. Očíslované škvrny na obrázku 1B a 1C boli vyrezané z gélu, spracuje sa s trypsínom a potom sa podrobí kvapalinová chromatografia s elektronickým ionizácie tandemovou hmotnostný spektrometer (LC-ESI-MS /MS) analýzy. Sedemdesiat dva z nich reprezentovať 69 rôznych druhov proteínov boli identifikované. V tabuľke 1 sú uvedené všetky proteínov identifikovaných prostredníctvom peptidovej párovanie s vyhľadávací algoritmus maskota. Presnosť v proteínovej profilovanie bola vyhodnotená ako hodnota skóre (nad 37 ° C). Obrázok 1 (A) Prehľad gélu obrazu master 2D pre nádorovom tkanive odvodené od pacienta s adenokarcinómom žalúdka. (B) a (C) Číslované proteínové škvrny boli identifikované pomocou LC-ESI-MS /MS a prispôsobovanie proteínu, ako je znázornené ako zväčšenej obrázkoch.
Tabuľka 1 Proteín profil detekovaný v nádorovom tkanive odvodené z japonskej pacienta s žalúdočnej adenokarcinóm.
Spot č
Prírastkové číslo
identifikácia proteínov

Mass
SC (%)
Pí
Skóre
1
24308169
axonemal ťažký reťazec dynein typ 3
473.776
0
6,04
37
2
15010550
proteín tepelného šoku gp96 predchodcom
90309
7
4,73
62 Sims 3
72222
proteínu tepelného šoku 90 -β
83584
14
4,97
176
4
5729877
tepelného šoku 70 kDa proteín 8 izoforma 1
71082
19
5,37
283
5
38044288
gelsolin izoforma b
80876
5
5,58
63
6
4826960
glutaminyl-tRNA syntetázu
88655
1
6.71
44
7
4501867
akonitázy 2
86113
10
7.36
231
8
119717
ezrin
69470
7
5.94
75
9
4557871
transferrin
79280
9
6.81
97
10
16507237
heat šokovať 70 kDa proteín 5
72402
15
5,07
165
11
24234686
proteín tepelného šoku 70 kDa proteín 8
53598
16
5,62
160
12
4885431
tepelného šoku 70 kDa proteín 1B
70267
11
5,48
143
13
1082886
nádoru necrosis faktor typu 1 proteín receptor-spojený TRAP-1
75694
13
8,43
288
14
31542947
chaperonin, mitochondriálnej matrix proteínov P1, P60 lymfocytov proteínu
61187
13
5,7
299
15
28592
sérum albumin
71316
23
6.05
292
16
340219
vimentin
53738
18
5.03
79
17
4503729
similar na proteín viažuci FK506 4
49031
5
5.6
36
18
32709
IFP53
53559
21
5.93
277
19
4502643
chaperonin-containing TCP1, subunit6A (zeta 1)
58444
6
6,23
79
20
7106439
tubulín, β5
50095
14
4.78
125
21
37492
α-tubulin
50810
13
5.02
94
22
125604
pyruvate kináza, M2 isozyme
58447
5
7.95
234
23
4557014
catalase
59947
6
6.9
120
24
4503483
eukaryotic preklad predĺženie faktor 2
96246
4
6,41
56
25
179.279
ATP syntázy β podjednotky
56861
5
5,39
59
26
7657041
down-regulované v metastázy
320.846
2
7,07
40
27
4504169
glutatiónu syntetázy, GSH synthetase
52523
5
5.67
99
28
12017952
GE36
73327
2
5.2
37
29
34234
laminin-binding proteín
31888
12
4,84
51
30
16359158
aktínu, beta
42078
14
5,29
171
31
6635125
KIAA0284 proteín
161.473
2
6,36
47
32
5803225
14-3-3 epsilon
29326
8
4,63
49
33
4504707
inositol polyfosfát-4-fosfatáza typu II, 105 kD
105.749
1
5,87
37
34
35038601
hypotetický proteín DKFZp761A078
74864
2
7.27
47
35
12017952
GE36
73327
1
5.2
38
36
4505877
plectin 1 izoforma 1
520111
1
5,57
44
37
38158018
centrosomal proteín 1, centriola spojený proteín, centriolin
269874
1
5,44
39
38
30157438
CTD viažuci SR-like proteín rA9
180240
1
9,15
41
39
4503471
eukaryotic preklad predĺženie faktor 1 α1
50451
12
9,1
191
40
4757810
ATP syntázy
59828
17
9,16
178
41
693.933
2-phosphopyruvate-hydratáza α-enoláza
47421
22
7,01
240
42
123.576
47 kDa tepla prekurzor shock proteín
46352
14
8,27
177
43
5032069
zostrihu faktor 3b, podjednotky 4
44414 Sims 3
8,54
58
44
4503471
eukaryotic preklad predĺženie faktor 1 α1
50451
4
9,1
47 45
5921789
citrát syntázy, mitochondriálnej prekurzor
51959
12
8,13
114
46
4505763
fosfoglycerátkinázu 1
44985
14
8,3
87
47
4504069
aspartátaminotransferázy 2 predchodcom
47844
6
9,14
52
48
7669492
glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy
36201
13
8,57
49
49
4757756
annexinu A2
38808
9
7,57
87
50
6648067
malátdehydrogenáza, mitochondriálnej prekurzor
35965
7
8,92
60
51
5031857
laktátdehydrogenázy systémom
36950
6
8,44
43
52
238.427
Porin 31 HM
30737
29
8,63
124
53
5174447
guanín nukleotid viažuci proteín
35511
8
7,6
65
54
34740329
heterogénne jadrový ribonucleoprotein A3
39799
7
9.1
43
55
4504983
galectin-3
26229
12
8.58
42
56
4504447
heterogeneous nukleárna ribonucleoprotein A2 /B1 izoformy A2
36041
7
8,67
40
57
86901
ATP-dependentný DNA helikáza RAP30 /74 reťaz RAP30
26350
3
9,46
41
58
230.445
karboanhydrázy Aj
28903
12
6,44
67
59
455739
karboanhydráza II
29285
8
6,87
82
60
26892090
beta-globín variant reťazca
16101
40
7,86
121
61
34709
mangánovej superoxiddismutázy
24891
10
8,35
111
62
4507645
triosefosfát izomerázou 1
26938
17
6,45
47
63
38488935
foveolin predchodcom
20546
16
5,65
95
64
478813
nehistonové chromozomálne proteín HMG-1
25139
13
5,41
60
65
2204207
glutathionu S-transferase
23595
34
5.43
73
66
178755
proapolipoprotein
28944
8
5.45
103
67
37267
transketolase
68435
4
7.9
59
68
189998
M2-type pyruvátkinázy
58447
10
7,95
157
69
825.605
glutatión S-transferáza
25650
10
8,51
65
Tieto proteíny môžu byť rozdelené do niekoľkých kategórií na základe ich funkcie, vrátane cytoskeletu proteínov, súvisiacich so stresom a chaperoning proteínov, akútnej fázy proteínov, glykolytickej enzýmy, enzýmy zapojené do metabolizmu a proliferáciu buniek, nádorových supresorových proteínov a žalúdka špecifických proteínov . boli zistené
Časté zmeny proteínovej expresie medzi nádorom a nontumor tkanív v onkologickí pacienti žalúdočnej
Diverse zmenami v proteomu medzi nádorom a nontumor tkanív z rovnakých pacientov. Ako je znázornené na obrázku 2, sa niekoľko spoločných zmeny boli pozorované u piatich japonských pacientov s karcinómom žalúdka (veci A až E). Mangánu superoxiddismutáza (MnSOD), nehistonové chromozomálne proteín HMG-1 (HMG-1), fosfoglycerát kináza 1 (PGK-1), karboanhydrasa I a II (CA I a II), foveolin prekurzor FOV (gastrokine-1), aspartát aminotransferázy 2 prekurzor (AST) a glutatión S-transferáza (GST) vykazovali spoločné zmeny v expresii medzi nádorovými a nontumor tkanív, vrátane diskusie medzi identifikovaných proteínov. Expresie proteínu MnSOD a HMG-1 bolo preukázané, že up-regulované v nádorových tkanivách v porovnaní s v nontumor tkanivách. Na druhej strane, CA I a II, FOV, AST a GST proteíny boli odhalené byť down-regulovaná v nádorových tkanivách. Ohybové zmeny v expresii týchto proteínov, ktoré vzhľadom k GAPDH sú zhrnuté v tabuľke 2. Najvýznamnejšie pokles bol uvedený v úrovni FOV vo všetkých prípadoch. Stupeň poklesu expresie GST proteínu bol takmer rovnaký ako v FOV (Puzdrá B, D, a E), hoci jeden nebol pozorovaný v ďalších dvoch prípadoch. Na druhej strane, zvýšenie HMG-1 bol označený v troch prípadoch (A, C, a D), aj keď tento rozdiel v expresii nebolo pozorované v ďalších dvoch prípadoch. MnSOD vykazoval tendenciu k zvýšeniu v nádorovom tkanive troch pacientov (Prípady A, C a D), ale relatívny pokles bol pozorovaný tiež vo veci B. Pokiaľ ide o PGK-1, čo je významný vzťah medzi sklápacie zmeny v expresiu proteínu a patologický triedenie nádorov bola pozorovaná len ťažko. Obrázok 2 Detailné pozmeňovanie vzory proteínov. (A) Nontumor a (B) nádorové proteíny vrátane CAI (No.58), zavolaj (No.59), MnSOD (č.61), FOV (No.63), HMG-1 (No.64), a GST (No.65). (C) Nontumor a (D) nádorové proteíny vrátane PGK-1 (č.46), AST (No.47), a GST (No.69). GAPDH, krúžil, bol použitý ako referenčný bielkoviny.
Tabuľka 2 zmeny sa sklopí expresiu proteínov medzi nontumor a nádorového tkaniva odvodené z piatich pacientov so žalúdočnými adenokarcinómov.
Protein
Prípad A
Prípad B
Vec C
Prípad D
Prípad E

CA Aj
-6,5 -1,6
-3,3
-4,3 -2,6
CA II
-2.6
-1.3
-26
-4.3
-13
FOV
-13
-13
-26
*
-26
MnSOD
+1.7
-2.6
+6.5
+1.4
+1.1
HMG-1
+13
*
+3.7
+13
*
PGK1
+1.6
+1.1
-1.2
+2.6
-1.4
AST
-13
-1.6
-6.5
-3.7
-2.6
GST
*
-26
*
-13
-13
CA Aj, karboanhydráza I.
CA II, karboanhydráza II.
Zorné pole, foveolin prekurzor.
MnSOD, mangán superoxiddismutázu.
HMG-1, nehistonové chromozomálne proteín.
PGK1, fosfoglycerát kináza 1
AST, aspartátaminotransferázy 2 prekurzor.
GST, glutatión-S-transferázu.
*, nebolo stanovené.
RT-PCR analýza
podľa RT-PCR, zmeny v mRNA expresie v nádore a nontumor tkanív získaných od pacientov s karcinómom žalúdka boli analyzované na proteíny, ktoré vystavené zmeny v expresii proteínov, vrátane FOV, MnSOD a HMG-1. Ako je znázornené na obrázku 3, FOV mRNA bola významne znížili v nádorových tkanivách v štyroch na všetkých pacientov (veci A, B, C a E), pričom nebola detekovaná buď nontumor alebo nádorového tkaniva z iného pacienta (Case D) , Na druhej strane, MnSOD mRNA bola výrazne zvýšená u štyroch pacientov (veci B, C, D, a E), aj keď bol zistený malý rozdiel v úrovni mRNA medzi nontumor a nádorové tkanivá v prípade, že. Avšak, bolo sotva pozorovaný vzťah medzi HMG-1 mRNA expresie a patologické fenotypy nádorov. Obrázok 3 Porovnanie expresie mRNA proteínov prípadne spojené s karcinogenéze medzi nontumor a nádorové tkanivá odvodených od piatich pacientov so žalúdočnými adenokarcinómov (prípady A až E) pomocou RT-PCR. N a T označujú nontumor a nádorové tkanivá, v tomto poradí.
Diskusia
v tejto štúdii sme vykonali analýzu proteomickou nádoru a nontumor tkaniva derivované z japonských pacientov adenokarcinóme žalúdka. Šesťdesiat deväť rôznych proteínov v nádorovom tkanive od žalúdka prípade rakoviny boli identifikované 2D-EP a LC-ESI-MS /MS, ktorý zahŕňal stresové proteíny, Hsp70, Hsp90 a chaperonine obsahujúce TCP1 (SCS), pre vlastnú ochranu; glykolytickej enzýmy, trojosí fosfát izomeránu 1, α-enoláza a PGK-1, pre rastúce spotreby energie; cytoskeletu bielkoviny, Ezrin, gelsolin izoformy b a vimentin; proteíny zapojené do bunkovej diferenciácie a proliferácie, galektinu-3 a transferínu; a proteíny vykazujúce predpokladaný tumor potláčajúce aktivitu, zorné pole. Mnohé z týchto proteínov boli opísané, ktoré majú byť spojené s tumorigenezí žalúdočných adenokarcinómov zahŕňajúce viac krokov a faktory [18, 19].
Tiež preukázané, že hladiny expresie niekoľkých proteínov v nádorovom tkanive boli bežne zmenený v piatich japonských pacientov žalúdočné adenokarcinómov, v porovnaní s tými v nontumor tkanivách. Bežným zvýšenie expresie proteínu v nádorových tkanivách došlo k MnSOD, HMG-1 a PGK-1, zatiaľ čo spoločný pokles v nádorových tkanivách došlo k FOV, GST a AST
superoxidu (O 2 . - ), voľný radikál, je nevyhnutná pre antimikrobiálne pôsobenie granulocytov a monocytov. Superoxiddismutáza (SOD) rýchlo odstráni prebytočné množstvo superoxidu produkovaného v záťažových a biologických reakcií in vivo
cez katalýzu premeny superoxidu s H +, čím H 2O 2 a O 2. MnSOD, jeden z sods, sa nachádza v mitochondriách a prispieva k ochrane mitochondriálnej DNA pred poškodením. Bolo zistené, že zvýšená expresia MnSOD progresívna karcinómu žalúdka by mala byť vo vzťahu k prežitiu 5 rokov po operácii [20] a na citlivosť k chemoterapii [21]. V tejto štúdii expresie proteínov z MnSOD bola up-regulovaná v 4 z 5 pacientov s karcinómom žalúdka, čo naznačuje, self-chrániace odpoveď. Na druhej strane, up-regulácia MnSOD v nádorových tkanivách bol považovaný zasahovať účinnej chemoterapie založenej na radikály, ktoré môžu spôsobiť zníženie citlivosti na lieky proti rakovine a určiť závažnosť rakoviny.
HMG-1 reguluje transkripciu rôznych génov a štruktúrny stabilizácia chromozómov ako proteín viažuci DNA. HMG-1 bolo hlásené, že sú spojené s karcinogenézy a metastáz u hrubého čreva a rakoviny prsníka [22].
Transkripční up-regulácia HMG-1 u karcinómu žalúdka bola tiež preukázaná [23]. Expresie HMG-1 v nádorových tkanivách, bolo navrhnuté, aby sa v súvislosti s odolnosťou proti cisplatine [24]. Preukázali sme tu zvýšenie tohto proteínu v troch prípadoch.
GST je liek metabolizujúce enzým, ktorý katalyzuje konjugácii redukovaného glutatiónu k liekom a metabolitov, a tiež prispieva k detoxikácii karcinogénov. Z tohto dôvodu môže byť zníženie aktivity rizikový faktor pre vznik rakoviny. Infekcie Helicobacter pylori bolo hlásené, že spôsobuje zníženie GST expresie [25], čo naznačuje, že zníženie aktivity GST môže byť príčinou žalúdočné rakoviny. V tejto štúdii, bol pozorovaný pokles expresie GST proteínu v troch prípadoch. Zníženie expresie GST proteín môže byť použitý ako biomarker pre diagnostiku nádorov žalúdka.
AST je aminotransferázy, ktorý pôsobí na aminokyseliny a kyseliny α-keto, ktorý je distribuovaný v ľudských orgánov. AST sa uvoľňuje do krvného obehu v dôsledku zvýšenej priepustnosti a tkaniva. Zvýšené koncentrácie AST proteínu bola hlásená v krvi pacientov s hepatitídou, zhubných nádorov vrátane hepatómy a leuchemia. Génovej expresie GST bolo tiež preukázané, že up-regulovaný v nádorovom tkanive hrubého čreva [26]. Avšak, zníženie expresie proteínu AST sa bežne pozorovaná u všetkých nádorových tkanivách odvodených od súčasných piatich pacientov so žalúdočnými adenokarcinómov. Ďalšie štúdie by mali byť vykonávané zistiť, či sa k poklesu AST proteínu je špecificky pozorovať v žalúdočných nádorových tkanivách, alebo nie.
Zvýšené expresie PGK-1, ktorý je jedným z enzýmov v glykolýzy a ktorý katalyzuje defosforylácii 1,3-bisfosfoglycerát na výrobu ATP, bolo pozorované u mnohých malígnych nádorových tkanivách, ktoré sú závislé na ATP, ako hlavný zdroj energie. Solídne nádory sú považované za potrebovať nadprodukciu ATP zachovať zvýšenú proliferáciu. Up-regulácia glykolytických enzýmov, vrátane PGK-1 u rakoviny pľúc [27] a M2 typu pyruvátkinázy u kolorektálneho karcinómu [28], bolo hlásené, a navrhol, aby boli užitočné pre skríning rakoviny. Avšak, v tejto štúdii, významný vzťah medzi PGK-1 expresiu proteínu a fenotypmi žalúdočných adenokarcinóme bol ťažko detekovaná. Preto PGK-1 považovalo za nevhodné pre diagnózu rakoviny žalúdka.
Uhličité anhydrases (CAS) sú enzýmy obsahujúce zinok, ktoré sú distribuované široko v rôznych orgánoch, ktoré obsahujú veľké rodiny, vrátane CA-I na CA -IX. Katalyzujú hydratácie CO 2 na prípravu medziproduktu metabolizmus, a udržanie hodnoty pH a iónovej rovnováhy v tele. Doteraz priamy vzťah bola dokázaná medzi malígny transformáciu a expresiu proteínu pre CAS I až VII [29]. Dve predchádzajúce štúdie ukázali, že expresia oboch CA-I a CA-II bola významne znížená u kolorektálneho karcinómu v porovnaní s normálnym epitelu hrubého čreva alebo sliznice [30]. Ďalšia správa prezentované výsledky ukazujúce, že znížená expresia CA-I a CA-II bola korelované s biologickým agresivitou kolorektálneho karcinómu a synchrónne vzdialenej metastázy [31]. Ako už bolo napísané skôr [32], žalúdočné a kolorektálnych karcinómov môže zdieľať podobný mechanizmus bunkovej proliferácie a slizničnej malignity, a môže sa stať biomarker pre tieto karcinómy, pretože boli pozorované tiež spoločné pokles expresie proteínu CA-I a CA-II v tejto štúdii.
zorné pole, ktoré je totožné s žalúdka špecifické 18-kDa proteín antra sliznice! (AMP-18) [33, 34], GKN1 [35], a interakcie trefoil faktor (Z) (TFIZ) [36], bolo preukázané, že dramaticky down-regulované alebo chýba u pacientov s adenokarcinómom žalúdka v tejto štúdii. Ľudský AMP-18 a ľudský carcinoantigenic CA11 produkt génu, ktorý kóduje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa líši od toho AMP-18 iba v jednom pracovnom zvyšok [37, 38], funkciu ako vylučované rastové faktory čiastočne zodpovedný za udržiavanie normálnej funkčnej žalúdočnej epitel [33]. Ako AMP-18 a produkt génu CA11 boli hlásené sa intenzívne exprimovaný v normálnej žalúdočnej tkaniva, ale nie vo väčšine karcinómov žalúdka [33, 37, 38]. Imunohistochemické štúdie preukázali, že AMP-18 sa zdá byť prítomné v epitelu sliznice bunkách normálne ľudské žalúdočnej dutine a dvanástnika [33]. V poslednej dobe bolo preukázané, TFIZ pôsobiť ako regulátor rastu žalúdočných epiteliálnych buniek prostredníctvom vytvorenia heterodiméry s trojlístka faktor 1 (TFF1) [36]. Naše prezentovať dáta ďalej potvrdzujú vysokú expresiu FOV v nontumor žalúdočné tkaniva a významné potlačenie proteínu v žalúdku adnocarcinomas, čo naznačuje, že FOV hrajú úlohu v udržanie normálnej diferenciácii epitelových buniek a potláčanie nádorov, ale nie v nádorových tkanivách. Ďalej sme preukázali, že transkripcia FOV mRNA bola tiež bežne down-regulovaná u pacientov s rakovinou žalúdka, čo naznačuje, že k výraznému poklesu FOV proteínu bola spôsobená potlačenie génovej expresie FOV. Okrem toho u jedného pacienta sa proteín nebol detegovaný v nontumor tkanivách, čo naznačuje, že hladina expresie proteínu FOV u jedincov sa môže určiť adenokarcinóme žalúdka fenotyp. V súlade s tým, úroveň expresie FOV ako biomarker, môže byť informatívne pre stanovenie rakoviny žalúdka.
Záver
Protein profilovanie nádoru a nontumor tkaniva derivované z japonských pacientov s žalúdočnej adenokarcinóm bola vykonaná s použitím 2D-EP a LC ESI-MS /MS. Zistené proteíny zahrnuté molekulárnej chaperony a energeticky produkujúce enzýmy, cytoskeletární bielkoviny, a tak ďalej. Spoločné proteínové zmeny boli zistené u pacientov s rakovinou žalúdka. Expresia proteínu z MnSOD a HMG-1 bola up-regulovaná zatiaľ čo GST, AST a FOV bola down-regulované v žalúdočných nádorových tkanivách. Korelácia medzi zmenou týchto proteínov a ich transkripčný expresie v karcinómu žalúdka bol ťažko pozorovaná v tejto štúdii, s výnimkou v prípade FOV. Ako proteín a gén expresie FOV, sekrečnú rastového faktora žalúdka špecifický pre normálne žalúdočné epiteliálne bunky, bol výrazne down-regulovaná v nádorových tkanivách odvodených z japonských pacientov so žalúdočnými adenokarcinómov. Monitorovanie hladín expresie tohto žalúdka špecifických proteínov v klinických vzorkách môžu poskytnúť užitočné informácie pre diagnostiku rakoviny žalúdka ako špecifického biomarkeru a pre lepšie pochopenie žalúdočné rakoviny.
Metódy
Materials
DNase I, RNáza A, 2-mercaptoetanolu (2-ME), sklenené guľôčky (212 až 300 um), Nonidet P-40, akrylamid, N, N, N ', N'
-tetramethylenediamine (TEMED), dodecylsulfát sodný (SDS ), jodacetamid a dithiothreitol (DTT) boli zakúpené od firmy Sigma (St. Louis, MO). Agarose pre isoelectronic zaostrovanie (IEF) a Pharmalyte pí 3-10, 4-6,5 a 8-10,5 boli od Amersham Bioscience (Piscataway, NJ). Trypsín (sekvenčné čistoty) bol od Roche (Manheim, Nemecko). Fenylmetylsulfonyl fluorid (PMSF), tiomočovina, sorbitol, pyrofosforečnan sodný, persíran amónny, D, kyselina L-asparágová, kyselina trichlóroctová, dihydrát sulfosalicilovej, kyselina octová, acetonitril, kyselina mravčia a kyselina trifluóroctová (TFA) bola od Wako Pure Chemicals (Osaka , Japonsko). Močovina bola od Katayama Chemicals (Osaka, Japonsko). Pepstatin A a leupeptinu boli z peptidu inštitútu (Osaka, Japonsko). NH 4HCO 3 a N, N'-methylenbisakrylamid boli od Nacalai Tesque (Kyoto, Japonsko). CBB R-250 bol od ICN Biomedicals Inc. (Aurora, OH). Molekulová hmotnosť štandardy boli od APRO Science, Inc. (Tokushima, Japonsko). TRIzolu činidlá bola od Life Technologies (Frederick, MD). Oligo (dT) 12-18 priméru, deoxynukleotidového (dNTPs), a RNaseOUT boli od Invitrogen (Carlsbad, CA). M-MLV reverznej transkriptázy a Taq DNA polymerázy boli od Promega (Madison, WI).
Tkanivá a príprava vzorky
Základné žalúdočných adenokarcinómov a priľahlých nontumor sliznice boli zhromaždené na gastrektómii a poskytuje Ústavu chirurgia, Graduate School of Medicine, University of Tokushima, Tokushima, Japonsko. Výskum bol vykonaný v súlade s Helsinskou deklaráciou Svetovej lekárskej asociácie, a bola schválená etickou komisiou univerzity Tokushima. Informovaný súhlas bol daný aj všetci pacienti, ktorí poskytli klinické vzorky. Tkanivá boli mrazený na suchom ľade a metanolu kúpeli čo najskôr po sekcii a skladované v mrazáku (-80 ° C), pred použitím. Pre analýzu mRNA, tkanivá boli najprv ponorí do RNAlater (Takara, Tokyo, Japonsko) pred zmrazením. Podrobné údaje klinicko vrátane štádia tumoru (podľa AJCC systému), miesta a diferenciácie, a histologické údajov o tkanivových vzoriek sú uvedené v tabuľke 3. Žiadny z týchto prípadov boli zaradené do kategórie scirrhous typu a nádorové tkanivo bolo jasne distinguishted od nenádorových jednom v každom prípade. Pre dvojrozmernej gélovej elektroforézy (2D-EP), extrakcia proteínov z tkanív bola vykonaná nasledujúcim postupom. Mrazené bloky (20 - 30 mg vlhkej hmotnosti) boli homogenizované s plastovou paličkou (Toyobo, Tokyo, Japonsko) v prítomnosti sklenených guličiek do 10 obj /vlhké hmotnosti dialyzačného pufru obsahujúcom 5 M močoviny, 1 M tiomočoviny, 10 mM nappa , 1,67 ul /ml 2-ME, 0,005% DNázy aj, 0,05 mg /ml RNáza a, 20 uM leupeptinu, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF a 20 uM pepstatinA, a potom sa odstredí pri 50000 otáčkach za minútu počas 30 minút pri teplote 4 ° C (Beckman -Coulter, Fullerton, CA). Výsledný supernatant bol použitý ako extrakt tkaniva. Koncentrácie proteínu boli stanovené pomocou Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) za použitia hovädzieho gama-globulínu ako standard.Table 3 Klinické príznaky u pacientov so žalúdočnými adenokarcinómov.
Case

Age

Sex

Locationa

Gradeb

Stage


A
63
Male
UM
G3
IIIA
T2N2M0H0
B
68
Female
L
G2
II
T2N2M0
C
76
Male
ML
G2
IV
T4N3M0
D
78
Female
L
G2
III
T2N0M0H0
E
77
Male
ML
G2
II
T2N1M0
Au: horný, M: stredná, L: nižšia
BG2: stredne diferencovaný G3 :. zle diferencované
byt dimenziách gélovej elektroforézy
2D-EP bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [39]. Prvý Trojrozmerná izoelektrické fokusácie sa vykonáva v 1% (w /v) agarózovom géle (φ 2,6 x 180 mm) s 3-10 gradientu pH, pri 700 V po dobu 18 hodín pri teplote 4 ° C, a druhý trojrozmerné SDS gélová elektroforéza bola vykonaná s 5-15% (w /v) akrylamid gradientu (m
r rozsah, 6-200 kDa) v štandardnej dosky gélu (20 x 13 cm) pri 15 mA počas 3 hodín, a potom pri 70 mA po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti. Gély boli zafarbené CBB R-250.
Proteínových vzoriek (500 ug), získaný zo nádoru centrá a okolie histologicky normálne sliznicu boli podrobené 2D-EP a spustiť vo dvojiciach vedľa seba.
Niektoré z zafarbených miest boli vyrezané z 2D-gélu, in-gél štiepený trypsínom a potom sa podrobí LC-ESI-MS /MS analýzu, ako bolo opísané skôr [40]. Peptid zmes sa rozdelí sa fáza nanoLC systému obrátený (Famous, Swichos II, Ultimate LC balenie, Sunnyvale, CA). Eluovanej peptidy boli postriekané priamo do hmotnostného spektrometra ESI (Esquire3000 Plus, Bruker-Daltonics, Fremont, CA).
Veľký objem dát MS /MS boli nadobudnuté sa DataAnalysis 3,1 softvér (Bruker-Daltonics), prevedený na text súbory so záznamom o masovej hodnoty materských iónov a intenzity a hmotnosti iónov fragmentov, a potom spracované s maskotom algoritmu (Matrix Science Ltd, Londýn, Veľká Británia) priradiť peptidy v non-redundantné databázy sekvencií NCBI pomocou taxonomickej obmedzenia, "ľudský". Vyhľadávacie databázy bola vykonaná s parametrami opísanými Yoshimura a kol. [40]. Analýza Satelitné snímky a MS peptid sekvencovania
získania snímku a analýzy boli vykonané s Molecular Imager FXProPlus (Bio-Rad) a ImageMaster softvér (Bio-Rad). Bolo vykonané porovnanie gélových obrazy nádoru a uzavreté nontumor vzoriek dvojicou dvojicou. Normalizované rozdiely objemovej boli štatisticky vypočítané pre všetkých päť prípadov. Obsah glyceraldehyd 3-fosfodehydrogenázy (GAPDH) proteínu, bol použitý ako referencia pre hodnotenie násobné zmeny expresie proteínu medzi nádorom a uzavreté nontumor tkaniva, hladiny GAPDH mRNA a proteínu nebola zmenená medzi tkanivami odvodených od pacientov. Dôsledne a významne rôzne škvrny boli vybrané pre analýzu LC-ESI-MS /MS. Proteínové škvrny! Boli vyrezané z gélu na malé kúsky, a podrobí sa štiepenie trypsínom in-gél cez noc [40]. boli zaznamenané peptidové hmotnostnej spektra, a parametre pre získanie spektier boli použité, ako je uvedené už skôr [40]. Presnosť v párovaní databázy proteínov pomocou Maskot vyhľadávania [41] bol posúdený ako skóre nad 37 ° C, ktorý bol získaný vo väčšine analýz. Izolácia
RNA a RT-PCR analýza
nádoru a uzavreté nontumor vzorky (cca. 50 mg mokrej hmotnosti) boli mleté ​​a potom homogenizované ručne v 1 ml činidla TRIzolu (Invitrogen) na ľade. RNA bola izolovaná bez liečby DNase Aj podľa protokolu výrobcu. Stručne, 0,2 ml chloroformu 3 sa pridá k homogenátu a následne centrifugáciou pri 20,600 x g počas 15 min. Rovnaký objem 2-propanolu sa pridá k výslednému supernatantu k vyzrážaniu RNA. Po odstredení sa peleta sa premyje 75% etanolom /diethylpyridylchloride (DEPC) -treated vody, a následne sušením. Peleta sa rozpustí vo vhodnom objeme DEPC ošetrenej vode ako celková frakcie RNA. Pre reverznej transkripcie (RT), 2 ug RNA z každej vzorky bolo prepísané pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny v prítomnosti 200 U z Molony vírus leukémie reverznej transkriptázy (Promega), oligo (dT) 12-18 primeru, 0,5 mM dNTPs a 50U of RNaseOUT. Tieto PCR pre karbonátdehydrogenázy-I a II, glutatión-S-transferáza, FOV, a GAPDH boli vykonané v lineárnom rozsahu zosilnenia s použitím vybraného súboru primeru a podmienky a očakávané veľkosti produktov, ktoré sú zhrnuté v tabuľke 4. PCR

• Down regulácia Thrombospondin2 predpovedá zlú prognózu u pacientov so žalúdočnými cancer
• Katecholamín up-reguluje MMP-7 expresie aktiváciou AP-1 a STAT3 v žalúdku cancer