Proteomic muutos gastic adenokarsinooman välillä Japani potilaista

Proteomic muutos gastic adenokarsinooman välillä Japani potilaista
tiivistelmä
tausta
Mahalaukun adenokarsinooman muodostavat yhden yhteisen syöpien Aasian maissa, mukaan lukien Japani. Kattava proteiini profilointi pariksi kirurgisista näytteistä ensisijaisen mahalaukun adenokarsinooman ja nontumor limakalvojen peräisin Japani potilaista suoritettiin avulla kaksiulotteinen geelielektroforeesi (2D-EP) ja nestekromatografia-sähkö- ioniset tandemmassaspektrometrian (LC-ESI-MS) perustaa mahasyövän-spesifisten proteiinien putatiivisiksi kliininen biomarkkereita ja molekyylitason tavoitteita kemoterapiaa.
tulokset
Suhteellisen yleinen muutoksia proteiiniekspressiossa paljastui kasvainkudoksessa. Kohonneita mangaani dismutase ja nonhistone kromosomi proteiini HMG-1 (HMG-1) havaittiin, kun taas laskua karbonianhydraasien I ja II, glutationi-S-transferaasin ja foveolin esiaste (gastrokine-1) (FOV), 18-kDa vatsa erityisiä proteiini otaksuttu kasvaimia estävä aktiivisuus, havaittiin. RT-PCR-analyysi paljasti myös huomattavia alas-säätely FOV mRNA ilmaisun kasvainkudoksissa.
Päätelmät
Mahdollinen patologinen rooli alas-säätely FOV vuonna mahasyövän osoitettiin. Arviointi erityisten pienenee geenien ja proteiinien ilmentyminen FOV potilailla voidaan hyödyntää kliininen biomarkkereita tehokkaan diagnosointiin ja arviointi mahasyövän.
Tausta
Mahalaukun adenokarsinooman muodostavat yhden yhteisen syöpien Aasian maissa kuten Japani, on toinen vain keuhkosyövän siitä kuolemien määrä se aiheuttaa. Huolimatta viimeaikainen kehitys diagnostisten menetelmien, useimmat mahasyöpäpotilaista diagnosoidaan edennyt pitkälle ja on hyvin alhainen viiden vuoden eloonjäämisaste (alle 10%) [1]. Tämä johtuu osittain puutteen spesifinen ja herkkä biomarkkereita diagnosointiin ja seurantaan sairauden edistymisen varhaisessa vaiheessa, vaikka jotkut mahakasvaimen markkereita, mukaan lukien syöpä -antigeeni, on käytetty ja ovat osittain tehokkaita. Kuten mahasyövän on monivaiheinen prosessi, kattava analyysi edellyttää myös yksittäisiä tapauksia, joissa eri molekyyli tapahtuvat kussakin karsinogeenisia prosessissa.
Äskettäin proteomiikka-analyysi käytettiin kattavasti tutkia proteiinin ilmentymistä kehon nesteiden, kudosten ja solujen [ ,,,0],2-4]. Tämä lähestymistapa, kuten kliininen proteomiikka, on erittäin hyödyllinen tunnistamisessa sairauteen liittyvän proteiineja, jotka osoittavat muutoksia ilmaisun ja muutos vastaa tautitilan [5, 6]. Nämä sairauteen liittyvien proteiinien odotetaan olevan biomarkkereita diagnosointiin ja oletettua suunnattu proteiinien hoitoon [7-9]. Toisaalta, laajat analyysit transcriptomes kasvainkudoksissa eri syöpäpotilasta DNA-mikrosiruja ja geenilastut on tehty viime vuosina [10]. Kuitenkin puute korrelaatio muutosten mRNA ja syövän syntymistä on osoitettu, ja määrällisiä ja laadullisia muutoksia muokattu translaation proteiineja lopullinen geenituotteiden pidetään enemmän informatiivinen kuin mRNA tuumorikudoksissa tutkimiseen molekyylitason tapahtumia syövän synty. Proteomic tutkimukset tunnistamiseksi kasvaimeen liittyvien proteiinien mahasyövässä lisääntyvät, ja proteomia tietokantoja mahan kudoksissa [11] ja solulinjat [12] on rakennettu. Useimmat niistä koskevat tiettyjen proteiinien tai antigeenien, jotka heijastavat kemo- ja Thermo-kestävät ominaisuudet mahasyöpä [13-15], ja jotka liittyvät Helicobacter pylori
[16, 17]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme suoritettiin kattava proteomianalyysi sekä kasvain- ja ei-kudoksissa japanilaisten potilaiden, joilla mahakarsinoomat, ja tunnistettiin useita proteiineja, joiden ekspressiotasoja on yleisesti muutetaan kliinisissä tapauksissa. Erityisesti ilmaus gastrokine-1 (GKN-1) on ehdotettu olevan alle sekä transkription ja translaation valvontaa.
Tulokset
Protein erottamisen ja tunnistamisen
Kuvio 1A esittää kuvaa yleiskatsaus tyypillisestä master geeli varten mahakasvaimen kudosta. Noin 200 proteiinitäplien värjättiin Coomassie brilliant blue (CBB) R-250 oli hyvin erotettu geelejä. Numeroidut paikkoja kuviossa 1B ja 1C leikattiin geelistä, käsitellään trypsiinillä ja alistetaan sitten nestekromatografia-sähköisiä tusionisaatiota tandem massaspektrometriä (LC-ESI-MS /MS) analyysi. Seitsemänkymmentä kaksi heistä edustavat 69 eri proteiinia lajia tunnistettiin. Taulukossa 1 luetellaan kaikki proteiinit tunnistettu peptidi matching kanssa Mascot hakualgoritmi. Tarkkuus proteiinia profilointi arvioitiin pisteet arvo (yli 37). Kuva 1 (A) yleiskuva Master 2D geeli kuvan kasvainkudoksen peräisin potilaasta, jolla on mahalaukun adenokarsinooma. (B) ja (C) numeroidut proteiini täplät tunnistettiin LC-ESI-MS /MS: n ja proteiinin vastaavia, kuten on esitetty suurennettuna kuvioissa.
Taulukko 1 Protein profiili havaittu tuumorikudoksessa peräisin japanilainen potilaan mahalaukun adenokarsinooma.
Spot nro
Liittymisnumero
Protein tunnistaminen

Mass
SC (%)
Pl
Pisteet
1
24308169
axonemal raskasketjun dynein tyyppi 3
473776
0
6,04
37
2
15010550
lämpöshokkiproteiiniin gp96 esiaste
90309
7
4,73
62
3
72222
lämpösokkiproteiini 90 -β
83584
14
4,97
176
4
5729877
lämmön shock 70 kDa proteiinia 8 isoformia 1
71082
19
5,37
283
5
38044288
gelsoliini isoformi b
80876
5
5,58
63
6
4826960
glutaminyyli-tRNA-syntetaasin
88655
1
6,71
44
7
4501867
aconitase 2
86113
10
7.36
231
8
119717
ezrin
69470
7
5.94
75
9
4557871
transferrin
79280
9
6.81
97
10
16507237
heat sokki 70 kDa proteiinia 5
72402
15
5,07
165
11
24234686
lämpöshokkiproteiini 70 kDa proteiini 8
53598
16
5.62
160
12
4885431
lämmön shock 70 kDa proteiini 1B
70267
11
5,48
143
13
1082886
kasvain Tuumorinekroositekijä tyypin 1 reseptoriin liittyvä proteiini TRAP-1
75694
13
8,43
288
14
31542947
chaperonin, mitokondrion matriisin proteiini P1, P60 lymfosyyttien proteiini
61187
13
5,7
299
15
28592
seerumin albumin
71316
23
6.05
292
16
340219
vimentin
53738
18
5.03
79
17
4503729
similar FK506 sitovan proteiinin 4
49031
5
5.6
36
18
32709
IFP53
53559
21
5.93
277
19
4502643
chaperonin-containing TCP1, subunit6A (zeta 1)
58444
6
6,23
79
20
7106439
tubuliinin, β5
50095
14
4.78
125
21
37492
α-tubulin
50810
13
5.02
94
22
125604
pyruvate kinaasi, M2 isozyme
58447
5
7.95
234
23
4557014
catalase
59947
6
6.9
120
24
4503483
eukaryotic käännös elongaatiotekijän 2
96246
4
6,41
56
25
179279
ATP nopaliinisyntaasin β-alayksikköä
56861
5
5,39
59
26
7657041
säädellä vähentävästi etäpesäkkeitä
320846
2
7,07
40
27
4504169
glutationin syntetaasin, GSH synthetase
52523
5
5.67
99
28
12017952
GE36
73327
2
5.2
37
29
34234
laminin-binding proteiini
31888
12
4,84
51
30
16359158
aktiini, beta
42078
14
5,29
171
31
6635125
KIAA0284 proteiini
161473
2
6,36
47
32
5803225
14-3-3 epsilon
29326
8
4.63
49
33
4504707
inositoli polyfosfaatiton 4-fosfataasi, tyypin II, 105 kD
105749
1
5,87
37
34
35038601
hypoteettinen proteiini DKFZp761A078
74864
2
7.27
47
35
12017952
GE36
73327
1
5.2
38
36
4505877
plectin 1 isoformi 1
520111
1
5,57
44
37
38158018
centrosomal proteiini 1, keskusjyvänen liittyvän proteiinin, centriolin
269874
1
5.44
39
38
30157438
CTD-sitovan SR-kaltainen proteiini Ra9
180240
1
9,15
41
39
4503471
eukaryoottitranslaatioon pidennystekijä 1 α1
50451
12
9,1
191
40
4757810
ATP nopaliinisyntaasin
59828
17
9,16
178
41
693933
2-phosphopyruvate-hydrataasia α-enolaasin
47421
22
7,01
240
42
123576
47 kDa lämpöshokkiproteiini esiaste
46352
14
8,27
177
43
5032069
liittämiseen tekijä 3b, alayksikön 4
44414
3
8,54
58
44
4503471
eukaryoottitranslaatioon pidennystekijä 1 α1
50451
4
9,1
47
45
5921789
sitraattisyntaasin, mitokondrioiden esiaste
51959
12
8,13
114
46
4505763
fosfoglyseraattikinaasille 1
44985
14
8,3
87
47
4504069
aspartaattiaminotransferaasi 2 prekursori
47844
6
9,14
52
48
7669492
glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin
36201
13
8,57
49
49
4757756
anneksiini A2
38808
9
7,57
87
50
6648067
malaattidehydrogenaasin, mitokondrio esiaste
35965
7
8,92
60
51
5031857
laktaattidehydrogenaasin
36950
6
8,44
43
52
238427
Porin 31 HM
30737
29
8,63
124
53
5174447
guaniininukleotidiä sitovan proteiinin
35511
8
7,6
65
54
34740329
heterogeeninen ydin- ribonukleoproteiinin A3
39799
7
9.1
43
55
4504983
galectin-3
26229
12
8.58
42
56
4504447
heterogeneous ydinaseiden ribonukleoproteiini- A2 /B1 isoformi A2
36041
7
8,67
40
57
86901
ATP-riippuvaisena DNA helikaasin RAP30 /74 ketju RAP30
26350
3
9,46
41
58
230445
hiilihappoanhydraasi I
28903
12
6,44
67
59
455739
hiilihappoanhydraasi II
29285
8
6,87
82
60
26892090
beeta-globiini ketjun variantti
16101
40
7,86
121
61
34709
mangaani superoksididismutaasi
24891
10
8,35
111
62
4507645
trioosifosfaatti-isomeraasi 1
26938
17
6,45
47
63
38488935
foveolin edeltäjä
20546
16
5,65
95
64
478813
nonhistone kromosomi proteiini HMG-1
25139
13
5,41
60
65
2204207
glutationi S-transferase
23595
34
5.43
73
66
178755
proapolipoprotein
28944
8
5.45
103
67
37267
transketolase
68435
4
7.9
59
68
189998
M2-type pyruvaattikinaasi
58447
10
7,95
157
69
825605
glutationi S-transferaasi
25650
10
8,51
65
Nämä proteiinit voidaan jakaa useisiin ryhmiin perustuu niiden toimintoja, kuten solun tukirangan proteiinit, stressiin liittyvät ja chaperoning proteiineja, akuutin faasin proteiinit, glykolyyttiset entsyymit, entsyymit osallistuvat aineenvaihduntaan ja solujen lisääntymisen, tuumorisuppressoriproteiinia proteiinit ja vatsa-spesifisten proteiinien .
yhteinen muutoksia proteiinin ilmentymisen välillä kasvain- ja ei-kudoksissa mahasyöpäpotilaista
Diverse muutoksia proteomeja välillä havaittiin kasvain- ja ei-kudoksissa samasta potilaista. Kuten kuviossa 2 on esitetty, useita yhteisiä muutoksia havaittiin joukossa viidestä Japanin mahasyöpäpotilaista (asiat A-E). Mangaani superoksididismutaasi (MnSOD), nonhistone kromosomaalista proteiini HMG-1 (HMG-1), fosfoglyseraattikinaasin 1 (PGK-1), hiilihappoanhydraasi I ja II (CA I ja II), foveolin esiaste FOV (gastrokine-1), aspartaatti aminotransferaasin 2 esiaste (ASAT) ja glutationi S-transferaasi (GST) näytteillä yhteisiä muutoksia ilmaisun välillä kasvain- ja ei kudoksissa, mukaan lukien yksi tunnistettu proteiineja. Proteiini ilmaus MnSOD ja HMG-1 osoitettiin olevan säädellään ylöspäin tuumorikudoksissa verrattuna vuonna nontumor kudoksiin. Toisaalta, CA I ja II, FOV, ASAT ja GST proteiinit paljastui olevan alassäädetty kasvainkudoksissa. Kansi muutokset näiden proteiinien ilmentymisen suhteen, että GAPDH on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. Merkittävin vähennys on esitetty tason FOV kaikissa tapauksissa. Aste vähenemisen GST-proteiinin ilmentyminen oli lähes sama kuin vuonna FOV (asiat B, D ja E), vaikka yksi ei havaittu kahdessa muussa. Toisaalta, kasvu HMG-1 on merkitty kolmessa tapauksessa (A, C, ja D), vaikka tällainen ero ilmentymistä ei havaittu muissa kahdessa tapauksessa. MnSOD ilmeni taipumusta kasvaa tuumorikudoksissa kolme potilasta (asiat A, C, ja D), mutta suhteellinen lasku havaittiin myös asiassa B. Kuten PGK-1, merkittävä suhde kertaiseksi muutoksia proteiiniekspressiossa ja patologinen luokittelu kasvaimia tuskin havaittiin. Kuva 2 Yksityiskohtainen muuttamista kuvioita proteiineja. (A) Nontumor ja (B) kasvaimen proteiineja, mukaan lukien CAI (No. 58), CAII (No.59), MnSOD (No.61), FOV (No.63), HMG-1 (No.64), ja GST (No.65). (C) Nontumor ja (D) kasvainproteiinien, mukaan lukien PGK-1 (No.46), AST (No.47), ja GST (No.69). GAPDH, kiersi, käytettiin referenssinä proteiinia.
Taulukko 2 taitto muutoksia proteiinin ilmentymisen välillä nontumor ja tuumorikudokset peräisin viidestä potilailla, joilla on mahalaukun adenokarsinoomia.
Protein
Tapaus A
Tapaus B
asiassa
asiassa D
asia E

CA I
-6,5
-1,6
-3,3
-4,3
-2,6
CA II
-2.6
-1.3
-26
-4.3
-13
FOV
-13
-13
-26
*
-26
MnSOD
+1.7
-2.6
+6.5
+1.4
+1.1
HMG-1
+13
*
+3.7
+13
*
PGK1
+1.6
+1.1
-1.2
+2.6
-1.4
AST
-13
-1.6
-6.5
-3.7
-2.6
GST
*
-26
*
-13
-13
CA I hiilihappoanhydraasilla I.
CA II, hiilihappoanhydraasi II.
FOV, foveolin esiaste.
MnSOD, mangaani superoksididismutaasi.
HMG-1, nonhistone kromosomi proteiinia.
PGK1-, fosfoglyseraattikinaasin 1.
AST, aspartaattiaminotransferaasi 2 prekursori.
GST, glutationi-S-transferaasi.
*, ei ole määritelty.
RT-PCR-analyysi
RT-PCR: llä, muutokset mRNA ilmentymistä kasvain- ja ei-kudoksissa, jotka ovat peräisin mahasyöpäpotilaista analysoitiin proteiineja, jotka osoittivat muutokset proteiinin ilmentyminen, mukaan lukien FOV, MnSOD ja HMG-1. Kuten kuviossa 3 on esitetty, FOV mRNA oli merkittävästi vähentynyt kasvainkudoksissa neljässä kaikilla potilailla (asiat A, B, C, ja E), kun taas sitä ei havaita joko nontumor tai kasvainkudoksissa muista potilaan (Case D) . Toisaalta, MnSOD mRNA oli merkittävästi lisääntynyt neljällä potilaalla (asiat B, C, D, ja E), vaikka vähän eroa mRNA-tasolla välillä nontumor ja kasvaimen kudosten Tapaus A havaittiin. Kuitenkin suhde HMG-1-mRNA: n ekspression ja patologisten fenotyypit kasvainten tuskin havaittiin. Kuvio 3 vertailu mRNA: n ilmentymisen proteiinien mahdollisesti liittyvät karsinogeneesiin välillä nontumor ja tuumorikudokset peräisin viidestä potilailla, joilla on mahalaukun adenokarsinoomat (tapaukset A-E) RT-PCR: llä. N ja T ilmaisevat nontumor ja tuumorikudoksissa, vastaavasti.
Keskustelu
Tässä tutkimuksessa suoritettiin proteomiikka-analyysi kasvain- ja ei-kudoksissa, jotka ovat peräisin Japanin mahalaukun adenokarsinooman potilailla. Kuusikymmentä-yhdeksän eri proteiineja kasvaimen kudosta mahasyöpä tapaus tunnistettiin 2D-EP ja LC-ESI-MS /MS, joka sisälsi stressi proteiinit, Hsp70, Hsp90 ja chaperonine sisältäviä TCP1 (CCT), itsesuojelu; glykolyyttiset entsyymit, trioosifosfaatti-isomeraasin 1, α-enolaasin ja PGK-1, kasvaville energiantarvetta; cytoskeletal proteiineja, esriinin, gelsoliini isoformi b ja vimentiinista; proteiinit osallistuvat solujen erilaistumiseen ja proliferaatioon, galektiini-3 ja transferriini; ja proteiinit, joilla otaksuttu kasvaimia estävä aktiivisuus, FOV. Monet näistä proteiineista on raportoitu liittyvän kasvaimen kehittymisen mahalaukun adenokarsinoomien johon sisältyy useita vaiheita ja tekijöitä [18, 19].
Myös osoitettu, että ekspressiotasot useiden proteiinien kasvainkudoksissa olivat yleisesti muutettu viisi japanilaisten potilaiden mahalaukun adenokarsinoomat, verrattuna vuonna nontumor kudoksissa. Yleinen kasvu proteiiniekspressiossa kasvainkudoksissa tapahtunut MnSOD, HMG-1 ja PGK-1, kun taas yleinen lasku tuumorikudoksissa tapahtunut FOV, GST ja AST.
Superoksidi (O 2 - ), vapaa radikaali, on tärkeää, että anti-mikrobien toimintaa granulosyyttien ja monosyyttien. (SOD) nopeasti poistaa ylimäärä superoksidi tuotettu stressi ja biologisia reaktioita in vivo
kautta katalyysi muuntamisen superoksidi H + H 2O 2 ja O 2. MnSOD yksi SOD, sijaitsee mitokondrioissa ja edistää suojelua mitokondriaalisen DNA vaurioita. On raportoitu, että tehostettu ilmentyminen MnSOD progressiivisessa mahasyövässä tulisi liittyä 5 vuoden pysyvyys ajan leikkauksen jälkeen [20] ja herkkyys kemoterapia [21]. Tässä tutkimuksessa, proteiinin ekspressio MnSOD oli säädelty vahvistavasti 4 5 mahasyöpäpotilaista, viittaa itse suojaavan vasteen. Toisaalta, ylös-säätely MnSOD kasvainkudoksissa on pidetty häiritsevän tehokkaasti kemoterapian perustuu radikaalien tuotantoa, mikä voi aiheuttaa vähenemistä herkkyys syöpälääkkeiden ja määrittää vakavuus syöpä.
HMG-1 säätelee transkription eri geenien ja rakenteellinen vakauttaminen kromosomeja kuin DNA-sitovan proteiinin. HMG-1: n on raportoitu liittyvän syövän synnyn ja etäpesäkkeiden peräsuolen ja rintasyövän [22].
Transkriptionaalinen lisäävä säätely HMG-1 mahasyövän on myös osoitettu [23]. Expression of HMG-1 kasvainkudoksissa ehdotettiin liittyvän vastustuskyvyn Sisplatiinin [24]. Osoitimme täällä kasvu tätä proteiinia kolmessa tapauksessa.
GST on huume-metaboloivien entsyymi, joka katalysoi konjugaatio pelkistetyn glutationin huumeiden ja aineenvaihduntatuotteiden, ja alentaa lisäksi vieroitus karsinogeenejä. Siksi lasku toiminta voi olla riskitekijä syövän synnyn. Infektion Helicobacter pylori on raportoitu alentavan GST ilmaisun [25], mikä viittaa siihen, että väheneminen GST toimintaa voisi olla syynä mahasyövän. Tässä tutkimuksessa lasku GST-proteiinin ekspressio havaittiin kolmessa tapauksessa. Väheneminen GST-proteiinin ilmentymisen, voidaan käyttää biomarkkerina diagnosointiin mahalaukun kasvaimet.
AST on transferaasi, joka toimii aminohappoja ja α-keto happoa, joka on jakautunut laajasti ihmisen elinten. AST vapautuu verenkiertoon johtuu tehostetun läpäisevyyttä ja tuhoaminen kudoksiin. Kohonnut pitoisuus AST-proteiinin on raportoitu veren Hepatiittipotilailla pahanlaatuisia kasvaimia kuten hepatoomaa, ja leuchemia. Geenien ilmentyminen GST on myös osoitettu olevan säädelty peräsuolen kasvain kudoksissa [26]. Kuitenkin lasku AST -proteiiniekspressio yleisesti havaittu kaikissa tuumorikudoksissa johdettu esillä viisi potilasta mahalaukun adenokarsinooman. Lisätutkimuksia pitäisi suorittaa selvittämään, onko lasku AST-proteiinin on erityisesti havaittu mahakasvaimen kudosten tai ei.
Elevated ilmentymistä PGK-1, joka on yksi entsyymien glykolyyttisen reitin ja joka katalysoi defosforyloitumista 1,3-bisphosphoglycerate tuottaa ATP, on havaittu monissa pahanlaatuinen kasvain kudoksissa, jotka ovat riippuvaisia ​​ATP merkittävänä energianlähteenä. Kiinteät kasvaimet arvellaan tarvitsevan ylituotanto ATP ylläpitämiseksi tehostetun leviämisen. Ylös-säätely glykolyyttisten entsyymien, mukaan lukien PGK-1 in keuhkosyövän [27] ja M2-tyypin pyruvaattikinaasia kolorektaalisyövässä [28], on raportoitu ja ehdotettu olevan käyttökelpoisia syövän seulontaa. Kuitenkin, esillä olevassa tutkimuksessa, on merkittävä suhde PGK-1-proteiinin ilmentymisen ja fenotyyppien mahalaukun adenokarsinoomien tuskin havaitaan. Näin ollen, PGK-1 pidettiin ei sovellu diagnoosia mahasyövässä.
Karbonianhydraasit (CA) ovat sinkkiä sisältäviä entsyymejä, jotka jaetaan laajasti eri elimissä, ja jotka käsittävät suuren perheen, mukaan lukien CA-I CA -Ix. Ne katalysoivat nesteytystä CO 2 välituotteiden aineenvaihduntaa ja ylläpitää pH ja ioni tasapaino kehossa. Toistaiseksi suora suhde välillä on osoitettu pahanlaatuisiksi ja proteiinin ilmaisun CA I-VII [29]. Kahden aikaisemman tutkimukset osoittivat, että ilmentyminen sekä CA-I: n ja CA-II väheni merkittävästi Kolorektaalituumorien verrattuna normaaliin peräsuolen epiteeli tai limakalvojen [30]. Toinen raportti esitetään tulokset osoittavat, että alennettu ilmentyminen CA-I ja CA-II korreloi biologisen aggressiivisuus paksusuolisyövän ja synkronisen etäpesäkkeiden [31]. Kuten ehdotti aiemmin [32], maha- ja peräsuolen karsinoomat voi jakaa samaa mekanismia solujen lisääntymisen ja limakalvojen maligniteetin, ja se voi tulla biomarkkereiden näille karsinoomien, koska yhteinen alenemista proteiinin ilmentymistä CA-I ja CA-II havaittiin myös tässä tutkimuksessa.
FOV, joka on samanlainen kuin vatsa-erityinen 18-kDa antrumlimakalvolla proteiinia! (AMP-18) [33, 34], GKN1 [35], ja apilatekijän vuorovaikutukset (z) (TFIZ) [36], osoitettiin olevan merkittävästi alassäädetty tai poissa mahalaukun adenokarsinoomaa tutkimuspotilaat. Ihmisen AMP-18 ja ihmisen carcinoantigenic CA11-geenin tuote, joka koodaa aminohapposekvenssiä, joka eroaa AMP-18 on vain yksi tähde [37, 38], toimivat erittyy kasvutekijöitä osittain vastuussa säilyttää normaali toiminnallinen mahalaukun epiteelin [33]. Sekä AMP-18 ja CA11 geenituotteen on raportoitu intensiivisesti ilmentyy normaaleissa mahan kudoksessa, mutta eivät useimmissa syöpien [33, 37, 38]. Immunohistokemialliset tutkimukset osoittivat, että AMP-18 näyttää olevan läsnä limakalvon epiteelisolujen normaalin ihmisen mahan antrum ja pohjukaissuoli [33]. Äskettäin TFIZ osoitettiin toimimaan kasvun säätelijänä mahalaukun epiteelisolujen muodostamalla heterodimeerin kanssa apilatekijän 1 (TFF1) [36]. Nykyinen tieto vahvistettiin lisäksi korkean ilmentymisen FOV on nontumor mahan kudoksissa ja merkittävä suppressio proteiinin mahalaukun adnocarcinomas, mikä osoittaa, että FOV rooleja normaaleista erilaistumisen epiteelisolujen ja kasvaimen suppression, mutta ei kasvainkudoksissa. Lisäksi osoitimme, että transkriptio FOV mRNA oli myös yleisesti alassäädetty mahalaukun syöpäpotilailla, mikä osoittaa, että vähentyneen merkittävästi FOV proteiini aiheutti suppressio FOV geeniekspression. Lisäksi yksi potilas proteiinia ei havaittu nontumor kudoksissa, mikä viittaa siihen, että ekspression taso FOV proteiinin henkilöt voivat määrittää mahalaukun adenokarsinooman fenotyyppi. Näin ollen ilmentymistaso FOV biomarkkerina voi olla informatiivinen arvioinnissa mahasyövässä.
Päätelmä
Protein profiloinnin kasvain- ja ei-kudoksissa, jotka ovat peräisin Japanin potilailla, joilla on mahalaukun adenokarsinoomien suoritettiin käyttäen 2D-EP ja LC ESI-MS /MS. Tunnistetut proteiinit mukana molekyyli- saattajia, energiaa tuottavat entsyymejä, solun tukirangan proteiineja, ja niin edelleen. Yhteinen proteiini muutoksia havaittiin mahalaukun syöpäpotilailla. Proteiinin ilmentyminen MnSOD ja HMG-1 sääteli kun taas GST, ASAT ja FOV oli säädellä vähentävästi mahakasvaimen kudoksissa. Korrelaatio muutos näiden proteiinien ja niiden transkription ilmaisun mahasyövässä tuskin havaittiin tässä tutkimuksessa, paitsi jos kyseessä on FOV. Sekä proteiini ja geenin ilmentymisen FOV, vatsa-eritystekijän kasvutekijä normaali mahan epiteelisolujen, oli huomattavasti alassäädetty kasvainkudoksissa peräisin Japanin potilailla, joilla on mahalaukun adenokarsinoomat. Seuranta ekspressiotasoja tämän mahan-spesifistä proteiinia kliinisissä näytteissä voivat antaa hyödyllistä tietoa diagnosointiin mahasyövän erityisenä biomarkkerina ja parempaa ymmärtämistä mahasyövän. Tool Menetelmät
Materiaalit
DNaasi I, RNaasi A, 2-merkaptoetanolia (2-ME), lasihelmiä (212-300 um), Nonidet P-40, akryyliamidi, N, N, N ', N'
-tetramethylenediamine (TEMED), natriumdodekyylisulfaatti (SDS ), jodiasetamidia ja ditiotreitolia (DTT) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). Agaroosia isoelectronic fokusointi (IEF), ja Pharmalyte pl 3-10, 4-6,5 ja 8-10,5 olivat Amersham Bioscience (Piscataway, NJ). Trypsiini (sekvenssointilaatua) oli Roche (Manheim, Saksa). Fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), tiourea, sorbitoli, natrium- pyrofosfaatti, ammoniumpersulfaatti, D, L-asparagiinihappo, trikloorietikkahappo, sulfosalisyylihappo dihydraatti, etikkahappo, asetonitriili, muurahaishappo ja trifluorietikkahappoa (TFA) olivat Wako Pure Chemicals (Osaka , Japani). Urea oli peräisin Katayama Chemicals (Osaka, Japani). Pepstatiini A ja leupeptiiniä olivat peräisin Peptide Institute (Osaka, Japani). NH 4HCO 3 ja N, N'-mety- olivat Nacalai Tesque (Kioto, Japani). CBB R-250 oli peräisin ICN Biomedicalsin Inc. (Aurora, OH). Moolimassastandardit olivat APRO Science, Inc. (Tokushima, Japani). TRIZOL reagenssi oli Life Technologies (Frederick, MD). Oligo (dT) 12-18-aluketta, deoksinukleotidejä (dNTP: t), ja RNaseOUT oli Invitrogen (Carlsbad, CA). M-MLV käänteistranskriptaasia ja Taq DNA -polymeraasia olivat Promega (Madison, WI).
Kudokset ja näytteenvalmistus
Ensisijainen mahalaukun adenokarsinooman ja viereisen nontumor limakalvojen kerättiin gastrectomy ja tarjoamia Dept. of Surgery, Graduate School lääketieteen, The University of Tokushima, Tokushima, Japani. Tutkimus toteutettiin mukaisesti Helsingin julistuksen World Medical Association, ja hyväksyi eettinen komitea yliopiston Tokushima. Tietoon perustuva suostumus annettiin myös kaikki potilaat, jotka toimitti kliinisistä näytteistä. Kudokset jäädytettiin kuivajää-metanolihauteessa niin pian kuin mahdollista sen jälkeen, kun leikkely ja varastoidaan pakastimeen (-80 ° C) ennen käyttöä. MRNA-analyysi, kudokset upotettiin ensin RNAlater (Takara, Tokio, Japani) ennen pakastusta. Yksityiskohtaiset kliinis tiedot mukaan lukien kasvain vaiheessa (mukaan AJCC järjestelmä), päällä ja erilaistumista ja histologiset tiedot kudosnäytteitä on lueteltu taulukossa 3. Mikään näistä tapauksista oli luokiteltu scirrhous tyyppi luokka, ja kasvain kudos selvästi distinguishted ei-kasvain yksi kussakin tapauksessa. Kaksiulotteisen geelielektroforeesin (2D-EP), proteiini uuttamalla kudoksista suoritettiin seuraavalla menettelyllä. Jäädytettyjen levyjen (20-30 mg märkäpainoa) homogenisoitiin muovinen survin (Toyobo, Tokio, Japani), kun läsnä on lasihelmiä 10 vol /märkäpaino dialyysipuskurista sisältää 5 M ureaa, 1 M tioureaa, 10 mM Nappi , 1,67 ul /ml 2-ME, 0,005% DNaasi I, 0,05 mg /ml RNaasi A, 20 uM leupeptiiniä, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF ja 20 uM pepstatinA, ja sitten sentrifugoitiin 50000 rpm 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa (Beckman -Coulter, Fullerton, CA). Saatua supernatanttia käytettiin kudoksen uute. Proteiinikonsentraatiot määritettiin Bradford-proteiinin määrityksen kit (Bio-Rad, Hercules, CA) käyttäen naudan gammaglobuliinia kuin standard.Table 3 Kliiniset piirteet ja potilailla, joilla on mahalaukun adenokarsinoomat.
Case

Age

Sex

Locationa

Gradeb

Stage


A
63
Male
UM
G3
IIIA
T2N2M0H0
B
68
Female
L
G2
II
T2N2M0
C
76
Male
ML
G2
IV
T4N3M0
D
78
Female
L
G2
III
T2N0M0H0
E
77
Male
ML
G2
II
T2N1M0
aU: ylempi, M: keskimmäinen, L: alempi
BG2: kohtalaisen eriytetty, G3: huonosti eriytetty.
Kahden dimesional geelielektroforeesilla
2D-EP suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [39]. Ensimmäisen ulottuvuuden isoelektrinen fokusointi suoritetaan sopivasti 1% (paino /tilavuus) agaroosigeelillä (φ 2,6 x 180 mm), jonka pH 3-10 gradientin 700 V: ssa 18 tunnin ajan 4 ° C: ssa, ja toisen ulottuvuuden SDS geelielektroforeesi suoritettiin 5-15% (w /v) akryyliamidia gradientin (M
r välillä, 6-200 kDa) on vakio geelilevyyn (20 x 13 cm), 15 mA: ssa 3 tuntia, ja sitten 70 mA 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Geelit värjättiin CBB R-250.
Proteiininäytteet (500 ug) uutettiin kasvaimen keskustasta ja ympäröivän histologisesti normaalin limakalvon tehtiin 2D-EP ja suorittaa pareittain vierekkäin.
Jotkut värjätään paikkoja leikattiin 2D-geeli, geelissä pilkottiin trypsiinillä ja sitten altistettiin LC-ESI-MS /MS-analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [40]. Peptidi seos erotettiin käänteisfaasi nanoLC järjestelmän (Tunnetut, Swichos II, Ultimate, LC Packings, Sunnyvale, CA). Eluoitu peptidit suihkutetaan suoraan ESI massaspektrometriin (Esquire3000 Plus, Bruker-Daltonics, Fremont, CA).
Suuri tilavuus MS /MS-tiedot hankittiin kanssa DataAnalysis 3.1 ohjelmisto (Bruker-Daltonics), muunnetaan tekstiksi tiedostoja listaus massa arvot emoionien, ja intensiivisyys ja massat fragmentti-ionit, ja käsiteltiin sitten MASCOT-algoritmia (Matrix Science Ltd, Lontoo, Iso-Britannia) määrittää peptidejä NCBI ei-tarpeeton sekvenssin tietokannassa taxonomic rajoitus, 'ihmisen'. Tietokanta Haku suoritettiin kanssa parametrien kuvanneet Yoshimura et al. [40].
Kuva-analyysi ja MS peptidisekvensoinnilla
Image hankintaa ja analyysiä suoritettiin Molecular Imager FXProPlus (Bio-Rad) ja ImageMaster ohjelmistot (Bio-Rad). Tehtiin vertailuja geeli kuvien kasvaimen ja Hyväksytty nontumor näytteiden paria pareittain. Normalisoitu tilavuus erot tilastollisesti laskettiin kaikissa viidessä tapauksessa. Sisällön glyseraldehydi 3-fosfodehydrogenaasigeenin (GAPDH) proteiinia käytettiin referenssinä arvioida kertaiseksi muuttamalla proteiinin ilmentymisen välillä kasvain ja täsmäsi nontumor kudokset tasot GAPDH-mRNA: n ja proteiinin eivät muuttuneet kudosten välillä, jotka ovat peräisin potilaista. Johdonmukaisesti ja merkittävästi eri paikoista valittiin analyysiin LC-ESI-MS /MS: llä. Proteiinitäplät! Leikattiin geeleistä pieninä paloina, ja altistettiin in-geeli tryptinen ruoansulatus yössä [40]. Peptidi-massaspektrit rekisteröitiin, ja parametrit spektrien hankkimista käytettiin kuten aiemmin [40]. Tarkkuus tietokannassa proteiinin matching käyttäen Mascot Haku [41] arvosteltiin pisteet yli 37, joka saatiin useimmissa analyyseissä.
RNA: n eristys ja RT-PCR-analyysi
Kasvain ja sovitettu nontumor näytteitä (n. 50 mg märkäpaino) jauhettiin, ja sitten homogenisoitiin käsin 1 ml TRIZOL reagenssia (Invitrogen) jäällä. RNA eristettiin ilman DNaasi I mukaisen käsittelyn valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 0,2 ml: aan CHCl 3 lisättiin homogenaattiin, mitä seurasi sentrifugointi 20600 x g 15 minuuttia. Yhtä suuri tilavuus 2-propanolia lisättiin tuloksena supernatantti RNA: n saostamiseksi. Sentrifugoinnin jälkeen pelletti huuhdeltiin 75% etanolilla /diethylpyridylchloride (DEPC) käsitellyssä vedessä, mitä seuraa kuivaus. Pelletti liuotettiin sopivaan tilavuuteen DEPC-käsiteltyä vettä kokonais-RNA osa. Käänteistranskriptioon (RT), 2 ug RNA: ta kustakin näytteestä transkriboitiin 37 ° C: ssa 1 h, kun läsnä oli 200 U on Molony leukemiaviruksen käänteistranskriptaasia (Promega), oligo (dT) 12-18-aluketta, 0,5 mM dNTP ja 50U of RNaseOUT. PCR: t for hiilihappoanhydraasin-I ja II, glutationi-S-transferaasi, FOV, ja GAPDH tehtiin sisällä lineaarisen alueen vahvistus käyttämällä valittua alukesarjaa ja olosuhteet, ja odotettu koko tuotteiden, jotka esitetään taulukossa 4. PCR

• Down sääntely Thrombospondin2 ennustaa huonon ennusteen potilailla mahalaukun cancer
• Katekolamiini up-regulation MMP-7 ilmentymistä aktivoimalla AP-1 ja STAT3 mahalaukun cancer