LNC RNA Hotair fungerar som en konkurrerande endogen RNA att reglera HER2 uttryck genom svamp MIR-331-3p i magsäcken cancer

LNC RNA Hotair fungerar som en konkurrerande endogen RNA att reglera HER2 uttryck genom svamp MIR-331-3p i magcancer Bild Sammanfattning
bakgrund
Ackumulerande bevis tyder på att den långa icke-kodande RNA hotair spelar en avgörande roll i cancerutveckling och metastaser. Dock fortfarande den totala biologiska roll och kliniska betydelsen av Hotair i gastrisk karcinogenes i stort sett okänd.
Metoder
Hotair expression mättes i 78 parade cancerous och noncancerous vävnadsprover genom realtids-PCR. Effekterna av Hotair på gastriska cancerceller studerades genom överuttryck och RNA-interferens närmar in vitro och in vivo. Insikter i mekanismen av konkurrenskraftiga endogena RNA (ceRNAs) nåddes från bioinformatisk analys, luciferas analyser och RNA-bindande protein immunfällning (RIP). Den positiva hotair /HER2 interaktion identifierades och kontrolleras av immunhistokemi analys och bivariat korrelationsanalys.
Resultat
Hotair uppreglering associerades med större tumörstorlek, avancerad patologisk scenen och omfattande metastaser, och även korrelerad med kortare total överlevnad av gastric cancerpatienter. Dessutom hotair uttryck främjat spridning, migration och invasion av gastric cancerceller, medan hotair utarmning hämmade både cellinvasion och cellviabilitet, och inducerad tillväxthämning in vitro och in vivo. I synnerhet kan hotair fungera som en Cerna effektivt blir en sänka för MIR-331-3p och därigenom modulera derepression av HER2 och införa en ytterligare nivå av post-transkriptionell reglering. Slutligen, var positiva Hotair /HER2 korrelation signifikant associerade med avancerad magsäckscancer.
Slutsatser
Hotair uttryck representerar en biomarkör för dålig prognos i magcancer, och kan ge maligna fenotypen till tumörceller. Reglerings nätverk Cerna involverar Hotair och positiv samverkan mellan Hotair och HER2 kan bidra till en bättre förståelse av magcancer patogenes och underlätta utvecklingen av lncRNA riktad diagnostik och terapi mot denna sjukdom.
Nyckelord
Konkurrerande endogena RNA HER2 hotair Magcancer spridning och invasion bakgrund
Gastric cancer är den näst vanligaste orsaken till cancer-inducerad död, och är den vanligaste gastrointestinala malignitet i östra Asien, Östeuropa och delar av Central- och Sydamerika. Hos de flesta patienter är magcancer diagnosen i ett framskridet stadium och åtföljs av malign proliferation omfattande invasion och lymfatiska metastasering. Framgångsrika terapeutiska strategier är begränsade och dödligheten är hög [1, 2]. Långa icke-kodande RNA (lncRNAs) har nyligen fått stor uppmärksamhet i avgränsar de komplexa mekanismerna bakom maligna processer såsom cancer, metastaser och läkemedelsresistens. Därför, om vi vill att till fullo förstå gastric cancer, måste vi överväga denna familj av regulatoriska transkript som lägger ett nytt lager av komplexitet till tumörbiologi.
Även om bara ett litet antal av funktionella lncRNAs har väl karakteriserade hittills de har visat att reglera genuttrycket på olika nivåer, inklusive kromatin modifiering, transkription och posttranskriptions behandling [3, 4]. På senare tid har en ny regleringsmekanism identifierats där överhörning mellan lncRNAs och mRNA sker genom att konkurrera om gemensamma mikroRNA (miRNA) svarselement. I detta fall kan lncRNAs fungera som konkurrerande endogena RNA (ceRNAs) att svamp miRNA, och därigenom modulera derepression av miRNA mål och införa en ytterligare nivå av post-transkriptionell reglering [5]. I tidigare rapporter har ett muskelspecifikt lncRNA, Linc-MD1, rapporterats vara en Cerna som skyddar MyoD budbärar-RNA (mRNA) från miRNA-medierad nedbrytning [6]. Pluripotens associerade lna-Rör kan fungera som en viktig cerna att koppla nätverket av miRNA och kärntranskriptionsfaktorer, exempelvis, Oct4, Sox2 och NANOG, i humana embryonala stamceller. Noterbart är lncRNA HULC starkt uppreglerat i levercancer och spelar en viktig roll vid tumorigenes [7]. I synnerhet kan HULC fungera som en endogen "svamp" som nedreglerar en rad miRNA aktiviteter, inklusive miR-372 [8]. Vi föreslår därför att en del lncRNAs också ha roller som ceRNAs, som förbinder miRNAs och post-transkriptionell nätverk i gastric patogenes.
Hotair (Hox avskrift antisense intergeniska RNA
) är en ~ 2,2 kb långa icke-kodande RNA transkriberats från HOXC
locus, som kan undertrycka transkription i träns
av HOXD
i förhudsfibroblaster [9]. Som en ny molekyl inom tumörbiologi, hotair blev först känd för sin medverkan i primärbrösttumörer och bröstcancermetastaser, där höjd av Hotair främjade invasivitet och metastasering [10]. Dessutom hotair uttryck korrelerar positivt med maligna processer och dåligt utfall i kolorektal cancer, levercancer, cancer i bukspottkörteln och gastrointestinala stromacellstumörer [11-14]. Nyligen genomförda studier rapporterade att Hotair var uppreglerat i magcancer [15, 16]. Ändå är i stort sett odefinierade den totala biologiska roll och bakomliggande molekylära mekanismen för Hotair i gastric cancer.
I denna studie rapporterar vi att Hotair uppreglering är en karaktäristisk molekyl förändring i magcancer och undersöka biologiska roller Hotair på fenotyper av gastric cancerceller in vitro och in vivo. Dessutom avslöjar mekanistisk analys att Hotair kan fungera som en cerna att reglera expression av humant epitelialt tillväxtfaktorreceptor 2 (HER2) genom konkurrens för MIR-331-3p, sålunda spela en onkogen roll vid gastrisk patogenes. Detta arbete ger det första beviset för en positiv Hotair /HER2 korrelation och överhörningen mellan MIR-331-3p, hotair och HER2, kasta nytt ljus över den behandling av magsäckscancer.
Resultat
Hotair uttryck uppregleras i humana gastriska cancervävnader
nivå hotair expression bestämdes i 78 parade gastric cancerprov och angränsande, histologiskt normala vävnader genom QRT-PCR, och normaliserades till GAPDH. Varmlufts uttryck signifikant uppregleras i cancervävnader (betyda förhållandet mellan 14,35 gånger, P < 0,01) jämfört med normala motsvarigheter (Figur 1A). Undersökning av sambandet mellan Hotair uttryck och kliniska patologiska drag visade att Hotair uppreglering korrelerade med större tumörstorlek, avancerad patologiskt stadium, fjärrmetastaser (Figur 1B och C), lymfkörtel metastas och tumörcelldifferentiering (tabell 1). Dock hotair uttryck inte förknippas med tumörläge eller patient kön (tabell 1). När det gäller överlevnad, patienter med högt hotair uttryck hade en betydligt sämre prognos än de med låg hotair uttryck (P < 0,001, log-rank test, Figur 1D). Dessa resultat antyder att Hotair överexpression kan vara användbara vid utveckling av nya prognostiska eller progressions markörer för gastrisk cancer. Figur 1 Relativ hotair uttryck i magcancer vävnader och dess kliniska betydelse. (A) Relativ uttryck av Hotair i magcancer vävnader (n = 78) i jämförelse med motsvarande icke-tumör normala vävnader (n = 78). Varmlufts uttryck undersöktes av QRT-PCR och normaliserades till GAPDH uttryck. Data presenterades som utfällbara förändring i tumörvävnad i förhållande till normal vävnad. (B) Undersökning av sambandet mellan Hotair uttryck och kliniska patologiska drag visade att Hotair uppreglering korrelerad med större tumörstorlek och avancerad patologisk stadium. (C) Hotair uttryck var signifikant högre hos patienter med fjärrmetastaser än hos dem med icke-fjärrmetastaser. (D) Kaplan-Meier totala överlevnadskurvor enligt Hotair uttrycksnivån. Den totala överlevnaden av High-Hotair gruppen (n = 39: hotair uttryck förhållande ≥ median förhållande) var betydligt högre än den för låg Hotair gruppen (n = 39, Hotair uttryck förhållande ≤ median förhållande; P < 0,001, log- rank test). * P < 0,05, ** P <
0,01. Tabell 1 Korrelation av uttrycket av Hotair med clinicopathologic funktioner
clinicopathologic funktioner
n (%)
Relativ expression av HOTAIRa
P-värdeB
Kön
P = 0,62
Man
50 (64) Review 12,21 (0,97 till 17,53) Review Kvinna
28 (36) Review 15,01 (7,34 -19,52) Site tumör
P = 0,910
Distal tredje
18 (23) Review 9,1 (1,37-14,12) Review USA tredje
20 (26)
7,96 (2,55-9,72) Review proximal mage
40 (51) Review 7,76 (1,24 till 13,58) Review Differentiation
P = 0,045
Poor
56 (72)
15,6 (6,25-20,36) Review hög /måttlig
22 (28) Review 8,1 (0,98-11,14) Review Körtelcelscancern Metastas
P = 0,005
N0
10 (13) Review 1,14 (0,75-1,42) Review N1
11 (14) Review 3,44 (1,15-4,85) Review N2
29 (37) Review 11,99 (7.15- 14,77) Review N3
28 (36) Review 32,58 (7,34 till 36,27) Review metastaserad sjukdom
P = 0,029
M0
64 (82) Review 9,35 (2,53 -33,64) Review M1
14 fig
28,82 (16,39-39,39) Review aMedian relativ uttryck, med 25-75: e percentilen inom parentes. bP < 0,05 ansågs signifikant (Mann-Whitney U
test mellan 2 grupper och Kruskall-Wallis test för 3 grupper) Manipulering av Hotair nivåer i gastric cancerceller
Vi nästa utförs QRT-PCR-analys för att undersöka.
uttrycksnivåer av hotair i olika cancercellinjer, inklusive gastrisk, icke-småcellig lungcancer (NSCLC) och bröstcancer härledda celler. Såsom visas i fig 2A, av de fyra gastriska cancercellinjer undersöktes (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, och AGS), BGC-823 uttryckte högre nivåer av Hotair (3,18-faldig) än den normala gastriska epitel-cell line (GES-1). På liknande sätt, NSCLC-cellinjen, SPC-A1, visade en 3,73-faldig uppreglering av Hotair över den normala humana bronkial epitelcellinje, 16HBE. Den mycket metastatisk bröstcancercellinje MDA-MB-231 visade en 4,77-faldig uppreglering av Hotair jämfört med MCF-7 (figur 2A). Våra data tyder på att Hotair kan ofta uppregleras i många tumörceller. Figur 2 Nivån på Hotair uttryck i gastric cancerceller och dess effekt på cellförökning in vitro. (A) Resultat från QRT-PCR visar Hotair expressionsnivåer av magcancer cellinjer (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, och AGS) jämfört med normala gastric epitel cellinje (GES-1), NSCLC cellinje ( SPC-A1) jämfört med normal human bronkial epitelcellinje (16HBE) och bröstcancercellinjer MDA-MB-231 jämfört med MCF-7. (B) QRT-PCR-analyser av Hotair uttrycksnivå efter behandling BGC-823 celler med siRNA inriktade Hotair och behandlings SGC-7901 celler med pcDNA /varmlufts vektor. (C) MTT-analys utfördes för att bestämma spridningen av si-Hotair-transfekterade BGC-823-celler eller pCDNA /Hotair-transfekterade SGC-7901-celler. Data representerar medelvärdet ± standardavvikelse från tre oberoende experiment. (D) kolonibildande tillväxtanalys utfördes för att bestämma spridningen av si-Hotair transfekterade BGC-823-celler. Kolonier räknades och fångas. * P < 0,05 och ** P < 0,01.
Att manipulera Hotair nivåer i gastric cancerceller, var en pcDNA /Hotair vektor transfekteras in SGC-7901 celler och si-Hotair transfekterades in BGC-823-celler. QRT-PCR-analys av Hotair nivåer utfördes vid 48 timmar efter transfektion och avslöjade att Hotair uttryck ökades 98-faldigt i SGC-7901 celler, jämfört med kontrollceller. Men i BGC-823 celler, hotair uttryck var effektivt 75% nedslagen av si-HOTAIR2, den mest effektiva siRNA därefter används i följande experiment (figur 2B).
Effekt av Hotair på celltillväxt och apoptos in vitro
den betydande ökningen av hotair uttryck i magcancer prover fick oss att undersöka den möjliga biologiska betydelsen av hotair i tumörbildning. MTT-analysen visade att celltillväxt avsevärt försämras i BGC-823-celler transfekterade med si-hotair, medan spridning av SGC-7901 celler ökades i pcDNA /hotair transfekterade celler jämfört med respektive kontroller (Figur 2C). På liknande sätt visade resultatet av kolonibildningsanalys som klonogen överlevnad minskade efter hämning av Hotair i BGC-823-celler (figur 2D).
Att bestämma huruvida apoptos var en bidragande faktor till celltillväxthämning, utförde vi Hoechst färgning och flödes cytometrisk analys av si-hotair-behandlade BGC-823 celler. Data visade att antalet celler med kondenserad och fragmenterad kärnor som anger andelen av tidiga apoptotiska celler var signifikant högre hos si-Hotair-behandlade BGC-823-celler jämfört med si-NC-behandlade celler (Figur 3A och B). Dessutom fann vi att hämning av Hotair förbättrade kaspas-3-beroende apoptos, framgår av western blot-analys av aktiverad kaspas-3 efter si-Hotair transfektion (Ytterligare fil 1: Figur S1). Sammantaget indikerar dessa resultat att knockdown av Hotair trycker magcancer cellproliferation och inducerar apoptos in vitro. Figur 3 Effekten av Hotair på magcancer cell apoptos, migration och invasion in vitro. BGC-823-celler transfekterades med si-Hotair eller si-NC, och SGC-7901 celler transfekterades med pcDNA /Hotair vektor eller tom vektor kontroll. (A) Hoechst färgning analys av cell apoptos; den procentuella andelen av Hoechst-positiva kärnor per optiskt fält (minst 50 fält) bestämdes. (B) De apoptotiska hastigheter av celler detekterades genom flödescytometri. UL, nekrotiska celler; UR, terminala apoptotiska celler; LR, tidiga apoptotiska celler. (C och D) Transwell-analyser utfördes för att undersöka förändringar i cellmigrering och invasivitet. * P < 0,05 och ** P < 0,01.
Hotair befrämjar migration och invasion av gastriska cancerceller in vitro
Cell invasion är en betydelsefull aspekt av cancer progression som involverar migration av tumörceller i intilliggande vävnader och upplösningen av extracellulära matrisproteiner. Här har vi utvärderade cancercellinvasion genom Transwell analyser. Som visas i figur 3C, transfektion av Hotair siRNA hämmat de vandrande förmåga BGC-823-celler med ca 66%. Motsvarande effekt på invasionsobserverades också i en parallell invasionsanalys. Omvänt, transfektion av SGC-7901 celler med pcDNA /Hotair vektor främjas cellmigration och invasiv ~ 1,9-faldigt (Figur 3D). Dessa data indikerar att Hotair har onkogena egenskaper som kan främja en flyttfågel och invasiv fenotyp i gastric cancerceller.
Hotair främjar tumörbildning av gastric cancerceller in vivo
att undersöka om nivån på Hotair uttryck påverkar tumörbildning, BGC-823 celler transducerade med sh-hotair /pENTR vektor (EV) användes i en nakna möss xenograft-modellen. Upp till 16 dagar efter knockdown av hotair, fanns det en dramatisk minskning i tumörvolym och vikt i sh-hotair gruppen jämfört med kontroller (Figur 4A, B och C). Därefter immunfärgning analys av spridningen markören PCNA utförs i utskurna tumörvävnader. I jämförelse med det i tumörer bildade från kontrollceller, visade sh-Hotair-härledda tumörer minskade signifikant PCNA positivitet (Figur 4D). Dessa resultat tyder på att nivån av Hotair uttryck signifikant associerade med proliferation kapacitet av gastriska cancerceller in vivo. Figur 4 Effekt av Hotair knockdown på tumörtillväxt in vivo. (A) tumörtillväxtkurvor mättes efter injektion av BGC-823-celler transfekterade med sh-Hotair eller pENTR vektor. Tumörvolym beräknades varje 3 dagar. Data presenteras som medelvärde ± s.d. (N = 5). (B) Tumörvikt. Värdena är medelvärden av tumörvikten ± s.d. (C) QRT-PCR-analys av Hotair uttryck i vävnader utskurna tumörer. (D) Tumörer utvecklades från BGC-823 /sh-Hotair celler visade en lägre PCNA protein än tumörer utvecklats från BGC-823 /pENTR vektor celler. Övre: H & E-färgning; Nedre: immunfärgning. * P < 0,05 och ** P < 0,01.
Hotair är ett mål för MIR-331-3P och miR-124
bioinformatik analys av miRNA igenkänningssekvenser på Hotair avslöjade närvaron av 11 tumörundertryckande miRNA bindningsställen. Den Hotair cDNA klonades nedströms om luciferasgenen och benämndes RLuc-Hotair (figur 5A), transfekterades sedan tillsammans med olika miRNA-kodande plasmider. RNO-miR-344 fungerade som en negativ kontroll. Resultaten visade att luciferasaktivitet minskades med 48% och 31% jämfört med den tomma vektorstyrning när MIR-331-3p och MIR-124 uttrycktes, respektive. Dessa data visar att både MIR-331-3p och MIR-124 direkt kan binda till Hotair genom respektive miRNA igenkänningsställen (Figur 5B vänster panel). Figur 5 Hotair är ett mål för MIR-331-3P eller MIR-124 och kontrollerar MIR-331-3p mål. (A) De 11 förmodade miRNA bindningsställen i varmlufts sekvensen. Den Hotair cDNA innehållande de förmodade miRNA igenkänningsställen klonades nedströms om luciferasgenen och benämndes RLuc-hotair. (B) Vänster: Luciferas reporterplasmid (RLuc-Hotair) samtransfekterades in i HEK-293 T-celler med de 11 olika miRNA-kodande plasmider. Höger: luciferas reporter plasmid innehållande vildtyp eller mutant hotair samtransfekterades in i HEK-293 T-celler med MIR-331-3p parallellt med en tom plasmidvektor. Luciferasaktiviteten bestämdes med användning av dubbla luciferasanalysen och visas som den relativa luciferasaktiviteten normaliserad till Renilla-aktivitet. Histogram anger värdena för luciferas mättes 48 timmar efter transfektion. (C) 3'-UTR av HER2 smältes till luciferas-kodande regionen (RLuc-HER2 3'-UTR) och transfekterades i HEK293T celler med MIR-331-3p att bekräfta HER2 är målet för MIR-331-3p. RLuc-HER2 3'-UTR och miR-331-3p konstruktionerna samtransfekteras in HEK293T celler med plasmider som uttrycker Hotair (pCDNA /Hotair) eller med en kontrollvektor för att verifiera Černá aktiviteten av hotair. RNO-miRNA-344 användes som en negativ kontroll. Histogram anger värdena för luciferas mättes 48 timmar efter transfektion. (D) RIP med mus monoklonal anti-Ago2, preimmunt IgG eller 10% input från BGC 823-cellextrakt. RNA-nivåer i immunoprecipitat bestämdes genom QRT-PCR. Överst: nivåer hotair, miRNA331-3P och FOS-RNA presenterades som faldig anrikning i Ago2 förhållande till IgG-immunoprecipitat. Nederst: relativa RNA-nivåer av U1 snRNA i SNRNP70 förhållande till IgG-immunoprecipitat. Siffror är medelvärde ± standardavvikelse (N = 3). (E) Western blot-analys av HER2 proteinnivå efter behandling av BGC-823 celler med si-Hotair eller pCDNA /hotair, och SGC-7901 celler med pcDNA /hotair. GAPDH användes som kontroll. * P < 0,05, ** P < 0,01 och N.S. inte signifikant.
Häri valde vi MIR-331-3p som en modell miRNA för fortsatta studier. För att ytterligare bekräfta att minskningen av luciferasaktivitet från RLuc-Hotair-WT vektor berodde på en direkt interaktion mellan miRNA och dess förmodade bindningsställe, vi muterade Mir-331-3p bindningsstället genom ställesriktad mutagenes, vilket resulterade i RLuc -HOTAIR-Mut. Som väntat, undertryckande av luciferasaktivitet var helt avskaffades i denna mutant konstruktion jämfört med vild-typ-vektorn (figur 5B högra panelen).
Hotair och MIR-331-3p båda binder med AGO2 i gastric cancerceller
miRNA är kända för att vara närvarande i cytoplasman i form av miRNA ribonucleoprotein komplex (miRNPs) som också innehåller Ago2, kärnkomponenten av RNA-induced silencing complex (RISC) [17, 18]. För att testa huruvida Hotair associerar med miRNPs, RNA-bindande proteinet immunfällning (RIP) Experimenten utfördes på cellextrakt BGC-823 med användning av antikroppar mot Ago2. RNA-nivåer i immunoprecipitat bestämdes genom QRT-PCR. Hotair ades preferentiellt berikad (354-faldig) i Ago2-innehållande miRNPs förhållande till kontroll immunoglobulin G (IgG) immunoprecipitat. På liknande sätt var miRNA-331-3p detekterades vid en nivå 840 gånger högre än den för kontroll anti-IgG. Framgångsrik immunutfällning av Ago2-associerade RNA verifierades med QRT-PCR, med hjälp av RIP primers mot mänskliga FOS ingår i RIPAb + Ago2 kit (Figur 5D, övre panelen). Dessutom var anti-SNRNP70 användes som en positiv kontroll för RIP förfarande, och U1 snRNA detekterades också vid en nivå 206 gånger högre än den för anti-IgG (figur 5D, nedre panelen). Sålunda är närvarande i Ago2-innehållande miRNPs hotair, troligtvis genom association med miRNA-331-3p, överensstämmer med våra bioinformatiska analys och luciferasanalyser.
Hotair styr miR-331-3p målet, HER2
Bland de många mål för mIR-331-3p koncentrerade vi oss på HER2 eftersom det kodar för ett transmembranprotein med en relevant funktion i cancer och motstånd mot trastuzumab-baserad behandling [19]. 3'-UTR av HER2 smältes till luciferas-kodande regionen (RLuc-HER2 3'-UTR) och transfekteras med plasmider som kodar MIR-331-3p och en tom plasmidvektor. RNO-miRNA-344 fungerade som en negativ kontroll. Luciferas-test visade att MIR-331-3p signifikant inhiberade luciferasaktivitet (~ 41% inhibition) av RLuc-HER2 3'-UTR reporter, vilket bekräftar att HER2 är ett mål för MIR-331-3p. Den RLuc-HER2 3'-UTR konstruktionen transfekterades därefter tillsammans med plasmider som kodar för MIR-331-3p och Hotair (pcDNA /hotair). Luciferasanalyser indikerade att, i närvaro av hotair, var RLuc-HER2 3'-UTR repression restaurerade jämfört med kontrollgruppen (figur 5C). Detta tyder på att Hotair fungerar som en endogen "svamp" genom att binda MIR-331-3p, alltså avskaffa miRNA-inducerad undertryckande aktivitet på HER2 3'-UTR.
Dessutom effekten av varmlufts uttryck på endogena HER2 protein i kombination med modulering av miRNA eller lncRNA nivåer övervakades av de olika metoder som visas i figur 5E: (1) mIR-331-3p uttryck mot HER2 i BGC-823 celler; (2) Hotair knockdown mot HER2 i BGC-823 celler; (3) Hotair uttryck för HER2 i SGC-7901 celler. Western blot-analys visade att tvångs uttryck av MIR-331-3p eller knockdown av Hotair i BGC-823 celler utlöste en betydande ljuddämpnings effekt på endogena HER2 proteinuttryck. Vidare har HER2-proteinexpression markant uppregleras efter transfektion med Hotair i SGC-7901-celler, vilket visar en relativt låg endogen hotair expressionsnivå.
Tillsammans indikerar dessa data att genom att binda miR-331-3p, agerar hotair som en cerna för mål HER2-mRNA och därigenom modulera derepression av HER2 och införa en ytterligare nivå av post-transkriptionell reglering.
mIR-331-3p och mIR-124 undertrycka gastrisk cancerceller proliferation
att fungera som en endogen sänka för mål miRNA, överflödet av hotair bör vara jämförbar med eller högre än mIR-331-3p /mIR-124. I vår studie visade QRT-PCR-analys att miR-331-3p /miR-124 expression var omvänt korrelerad med Hotair expression i 20 par avancerade gastric cancer (figur 6A). För att validera om MIR-331-3p och MIR-124 kan också hämma magcancer celltillväxt, tvingade vi deras uttryck i BGC-823-celler med hjälp av miRNA-kodande plasmider. Uttrycksnivåer miRNA-331-3p och MIR-124 transfekterade i BGC-823-celler ökade signifikant med 36-faldigt och 29-faldigt, jämfört med kontrollceller (Figur 6B). Nästa, MTT och kolonibildningsanalyser utfördes för att bestämma cellviabilitet. Resultaten av MTT-analysen och tillväxtkurvor visade att celler transfekterade med MIR-331-3p eller miR-124 uppvisade signifikant tillväxthämning jämfört med celler transfekterade med tom vektor (figur 6C). Dessa data tyder på att överuttryck av MIR-331-3p eller MIR-124 uttryck kan gripa magcancer celltillväxt, vilket överensstämmer med resultaten från varmlufts uttryck knockdown i BGC-823 celler. Figur 6 positiv korrelation mellan Hotair och HER2 uttryck och relevans för MIR-331-3p /MIR-124 expressionsnivåer. (A) Bivariate korrelationsanalys av sambandet mellan Hotair uttryck och MIR-331-3p eller MIR-124 nivå. (B) BGC-823-celler transfekterades med plasmider som kodar miR-331-3p eller miR-124, och QRT-PCR användes för att detektera de miRNA nivåerna jämfört med kontroller (MIR-NC). (C) MTT-analys och kolonibildande tillväxtanalys utfördes för att bestämma spridningen av MIR-331-3p eller miR-124 transfekterade BGC-823-celler. (D) Vänster: immunfärgning av HER2-protein i avancerad magsäckscancer vävnadsprover. Övre: immunfärgning av HER2 var negativ i magcancer vävnader med relativt låg hotair uttryck. Nedre: immunfärgning av HER2 var positiv i magcancer vävnader med relativt hög hotair uttryck. Höger: bivariat korrelationsanalys av sambandet mellan Hotair och HER2 expressionsnivå. * P < 0,05, ** P < 0,01.
HER2 samuttrycks med Hotair i magcancer vävnader
HER2 överuttryck hastighet rapporterades vara 7-34% i magcancer, och förknippas med mer aggressiv sjukdom och sämre överlevnad i magcancer [19]. Vi upptäckt uttryck av HER2 i 50 avancerad magsäckscancer vävnader (stadium III /IV) väljs från de tidigare 78 magcancer vävnader genom immunohistokemi (IHC) och QRT-PCR-analys. Resultaten av IHC-färgning visade HER2 protein positivitet i 56% av de utvalda 50 magcancer vävnader. Åttio-sex procent av dessa HER2-positiva prover var från framskridet stadium III /IV tumörer, och 71% visade hög hotair uttryck (Figur 6D och övriga fil 2: Tabell S2). Bivariat korrelationsanalys visade att uttryck av HER2 signifikant korrelerad med varmlufts avskrift nivå i magcancer vävnader jämfört med normala motsvarigheter (figur 6D). Dessa data tyder på att uttrycket av HER2 är förenat med uppreglerad hotair i magcancer vävnadsprover, vilket tyder på att karaktärisering av HER2 /Hotair interaktion kan vara biologiskt signifikant i mänsklig gastric tumörbildning.
Noterbart är, på grund av en pågående fas III /IV rättegång, är HER2 överuttryck hastigheten detekteras i den aktuella studien högre än den tidigare rapporterade median intervall. Denna ökade hastighet av HER2 överuttryck är starkt kopplad till dåliga resultat för patienter med Diskussion
LncRNAs, metastaserad och hög kvalitet lokaliserad gastric cancer, och därmed betonar vikten av HER2 i magcancer utveckling och metastasering.
Som är mer än 200 nukleotider i längd med begränsad proteinkodande förmåga, ofta uttrycks i en sjukdoms, vävnads- eller utvecklingsstadiet specifikt sätt, vilket indikerar specifika funktioner för lncRNAs i utveckling och sjukdomar och göra dessa molekyler attraktiva terapeutiska mål [20-22]. Ett antal nya tidningar har visat att dysreglering av dessa lncRNAs också kan påverka regleringen av den eukaryota genomet och ge en celltillväxtfördel, vilket resulterar i progressiv och okontrollerad tumörtillväxt [23-25]. Därför kan lncRNAs ge en saknad bit av annars välkända onkogena och tumörsuppressorgen nätverk pussel.
I denna studie testade vi uttrycket av Hotair i magcancer prover och deras omgivande icke-tumörvävnad. Vi identifierade också funktionen av Hotair i gastric cancerceller genom att tillämpa GAIN- och förlust av funktions metoder. Resultaten visade att Hotair uppreglerades i gastriska karcinomvävnader i jämförelse med intilliggande normala gastriska vävnader, och att hotair uppreglering korrelerad med större tumörstorlek, avancerad patologiskt stadium och omfattande metastaser. Dessutom den totala överlevnadstiden för patienter med lägre Hotair uttrycksnivåer var signifikant längre än patienter med måttliga eller starka hotair expressionsnivåer. Dessutom hotair uttryck främjat spridning, migration och invasion av gastric cancerceller, medan hotair utarmning hämmade cellinvasion och cellviabilitet, och inducerad tillväxthämning både in vitro och in vivo. Dessutom ledde hotair dämpning för att främja gastric cell apoptos. Dessa fynd tyder på att Hotair spelar en direkt roll i moduleringen av multipla onkogena egenskaper och magcancer progression, stimulera nya forskningsinriktningar och terapeutiska alternativ överväger Hotair som en ny prognostisk markör och terapeutiskt mål i magcancer.
Betydelse lncRNAs i human sjukdom kan vara förenad med deras förmåga att påverka cellulära funktioner genom olika mekanismer. I denna studie, så långt som mekanismen för Hotair är berörda, är det värt att nämna att subcellulär lokalisering analys av Hotair genom RNA fluorescens in situ hybridiseringsanalys demonstrerar lokalisering av Hotair till både kärnan och cytoplasman [24]. Det är uppenbart att kärn hotair kan rikta Polycomb repressiva komplex 2, förändra H3K27 metylering och genuttrycksmönster över genomet [10, 11]. Senaste arbete rapporterade en byggnadsställning funktion för Hotair i cytoplasman som en inducerare av ubiquitinmedierad proteolys [26]. Ändå tumorigena egenskaper och mekanistiska heterogenitet hotair, och i synnerhet de av den cytoplasmatiska formen, är långt ifrån helt klarlagd.
Inspirerad av "konkurrens endogena RNA reglerings nätverk och nya bevis som tyder på att lncRNAs får delta i detta reglerande kretsar, hypotes vi att hotair också kan fungera som en Cerna och så vi sökte efter potentiella interaktioner med miRNA. Till stöd för denna uppfattning, använde vi bioinformatik analys och luciferas analyser för att validera den direkta bindningsförmåga av de förutsagda miRNA svarselement på fullängds hotair transkript. GAPDH användes som kontroll. * P < 0,05. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Livskvalitet, immunmodulering och säkerhet adjuvant mistel behandling av patienter med magsäckscancer - en randomiserad, kontrollerad pilotstudie
• Nedreglering av Thrombospondin2 förutspår dålig prognos hos patienter med magcancer