Lnc RNA hetelucht functioneert als een concurrerend endogeen RNA naar HER2 expressie reguleren door sponzen miR-331-3p in de maag cancer

lnc RNA hetelucht functioneert als een concurrerend endogeen RNA naar HER2 expressie reguleren door sponzen miR-331-3p bij maagkanker
Abstract achtergrond
Accumulerende bewijsmateriaal wijst erop dat de lange niet-coderende RNA hetelucht speelt een cruciale rol in de progressie van kanker en metastase. Echter, de totale biologische rol en klinische betekenis van de hetelucht in de maag carcinogenese blijft grotendeels onbekend.
Methods
hetelucht expressie werd gemeten in 78 gepaarde kankercellen en noncancerous weefselmonsters door real-time PCR. De effecten van hetelucht op maagkanker cellen werd bestudeerd door overexpressie en RNA interferentie benaderingen in vitro en in vivo. Inzichten van het mechanisme van competitieve endogene RNA (ceRNAs) werden verkregen uit bioinformatica analyse luciferase assays en immunoprecipitatie RNA bindend eiwit (RIP). De positieve hetelucht /HER2 interactie werd geïdentificeerd en geverifieerd door immunohistochemie test en bivariate correlatie analyse.
Resultaten
hetelucht opregulatie werd geassocieerd met een grotere grootte van de tumor, geavanceerde pathologisch stadium en uitgebreide metastase, en ook gecorreleerd met een kortere totale overleving van maag- kankerpatiënten. Bovendien hetelucht overexpressie bevorderde de proliferatie, migratie en invasie van gastrische carcinoomcellen, maar hetelucht depletie remde zowel invasie en cellevensvatbaarheid en geïnduceerde groeiremming in vitro en in vivo. In het bijzonder kan hetelucht fungeren als een cerna, effectief steeds een gootsteen voor miR-331-3p, waardoor de derepressie van HER2 moduleren en het opleggen van een extra niveau van post-transcriptionele regulatie. Tenslotte werd de positieve hetelucht /HER2 correlatie significant geassocieerd met gevorderde maagkanker.
Conclusies
hetelucht overexpressie biomerker van slechte prognose bij maagkanker voorstelt, en kunnen kwaadaardig fenotype tumorcellen. De cerna regulerende netwerk waarbij hetelucht en de positieve interactie tussen hetelucht en HER2 kunnen bijdragen aan een beter begrip van maagkanker pathogenese en de ontwikkeling van het vergemakkelijken lncRNA gerichte diagnostiek en therapie tegen deze ziekte.
Sleutelwoorden
Concurreren endogene RNA HER2 hetelucht Maagkanker proliferatie en invasie Achtergrond
Maagkanker is de tweede belangrijke oorzaak van kanker-geïnduceerde dood, en is de meest voorkomende gastro-intestinale maligniteit in Oost-Azië, Oost-Europa, en delen van Midden- en Zuid-Amerika. Bij de meeste patiënten is maagkanker gediagnosticeerd in een vergevorderd stadium en wordt begeleid door kwaadaardige proliferatie, uitgebreide invasie en lymfatische metastase. Succesvolle therapeutische strategieën zijn beperkt en het sterftecijfer is hoog [1, 2]. Lang niet-coderende RNA's (lncRNAs) hebben onlangs opgedaan veel aandacht in de afbakening van de complexe mechanismen onderliggende kwaadaardige processen zoals carcinogenese, metastase en resistentie tegen geneesmiddelen. Daarom, als we willen om volledig te begrijpen maag carcinogenese, moeten we deze familie van regulerende transcripten die een nieuwe laag complexiteit toe te voegen aan tumorbiologie overwegen.
Hoewel slechts een klein aantal functionele lncRNAs zijn goed gekarakteriseerd tot op heden, ze aangetoond is dat genexpressie reguleren op verschillende niveaus, waaronder chromatine modificatie, transcriptie en post-transcriptionele verwerking [3, 4]. Onlangs is een nieuw regelgevend mechanisme geïdentificeerd waarin overspraak tussen lncRNAs en mRNA's gebeurt door concurrerende voor medegebruik microRNAs (miRNAs) reactie-elementen. In dit geval kan lncRNAs functioneren als concurrerende endogene RNA (ceRNAs) naar miRNAs spons, waardoor de derepressie van miRNA targets te moduleren en het opleggen van een extra niveau van post-transcriptionele regulatie [5]. In eerdere verslagen, heeft een spier-specifieke lncRNA, linc-MD1, is gemeld dat een cerna dat MyoD messenger RNA beschermt (mRNA) van miRNA-gemedieerde degradatie [6] zijn. -Pluripotentie geassocieerde LNC-ROR kan functioneren als een sleutel CERNA het netwerk van miRNAs en core transcriptiefactoren, bijvoorbeeld verbinden, Oct4, Sox2 en Nanog, in humane embryonale stamcellen. Met name lncRNA HULC sterk opgereguleerd in leverkanker en speelt een belangrijke rol bij het ontstaan ​​van tumoren [7]. In het bijzonder kan HULC fungeren als een endogeen "spons" dat down-reguleert een aantal miRNAs activiteiten, zoals miR-372 [8]. Daarom stellen we voor dat sommige lncRNAs ook rollen als ceRNAs, het koppelen van miRNAs en de post-transcriptie-netwerk in de maag pathogenese kan hebben.
Hetelucht (Hox transcript antisense-RNA intergenisch
) is een ~ 2,2-kb lange niet-coderende RNA getranscribeerd van de HOXC
locus, die de transcriptie kan onderdrukken in trans
van HOXD
in voorhuid fibroblasten [9]. Als een nieuwe molecule op het gebied van de tumor biologie, hetelucht aanvankelijk werd bekend om zijn betrokkenheid bij de primaire borsttumoren en uitzaaiingen van borstkanker, waarbij de hoogte van hetelucht bevorderd invasiviteit en metastase [10]. Bovendien, hetelucht expressie positief correleert met kwaadaardige processen en een slechte uitkomst bij darmkanker, leverkanker, pancreaskanker en gastro-intestinale stromale tumoren [11-14]. Recente studies gemeld dat hetelucht werd opgereguleerd bij maagkanker [15, 16]. Desalniettemin laten de biologische rol en het moleculaire mechanisme van de hetelucht in maagkanker grotendeels ongedefinieerd.
In deze studie rapporteren we hetelucht opregulatie een karakteristieke moleculaire verandering van maagkanker en onderzoek de biologische rol van hetelucht op de fenotypen van maagkanker cellen in vitro en in vivo. Bovendien mechanistische analyse blijkt dat hetelucht kan functioneren als een CERNA de expressie van humane epitheliale groeifactor receptor 2 (HER2) reguleren door competitie voor miR-331-3p, waardoor een oncogeen rol gastrische pathogenese spelen. De huidige werk biedt het eerste bewijs voor een positieve hetelucht /HER2 correlatie en de overspraak tussen miR-331-3p, hetelucht en HER2, het afstoten van een nieuw licht op de behandeling van maagkanker.
Resultaten
hetelucht expressie is opgereguleerd in menselijke maagkanker weefsels
Het niveau van hetelucht-expressie werd bepaald in 78 gepaarde monsters maagkanker en aangrenzende, histologisch normale weefsels door qRT-PCR, en genormaliseerd naar GAPDH. Hetelucht expressie was significant opgereguleerd in kankerachtige weefsels (gemiddelde verhouding van 14,35-voudig, P < 0,01) in vergelijking met de normale tegenhangers (Figuur 1A). Onderzoek van de correlatie tussen hetelucht expressie en klinische pathologische kenmerken toonde dat hetelucht opregulatie was gecorreleerd met grotere tumorgrootte, geavanceerde pathologisch stadium, metastasen (Figuur 1B en C), lymfeknoop metastase en tumor celdifferentiatie (tabel 1). Echter, hetelucht expressie niet geassocieerd met tumor positie of patiënt geslacht (tabel 1). Met betrekking tot de algehele overleving, patiënten met een hoge hetelucht expressie hadden een significant slechtere prognose dan die met een lage hetelucht expressie (P < 0,001, log-rank test; figuur 1D). Deze resultaten impliceren dat hetelucht overexpressie bruikbaar zijn bij de ontwikkeling van nieuwe prognostische markers of progressie van maagkanker kan zijn. Figuur 1 Relatieve hetelucht expressie in maagkanker weefsels en de klinische relevantie. (A) Relatieve expressie van hetelucht bij maagkanker weefsels (n = 78) in vergelijking met overeenkomstige niet-tumor normale weefsels (n = 78). Hetelucht expressie werd onderzocht met qRT-PCR en genormaliseerd op GAPDH expressie. De gegevens werden gepresenteerd als veelvoudverandering in tumorweefsel in verhouding tot normaal weefsel. (B) Onderzoek van de correlatie tussen hetelucht expressie en klinische pathologische kenmerken bleek dat hetelucht opregulatie gecorreleerd met grotere grootte van de tumor en geavanceerde pathologisch stadium. (C) hetelucht expressie was significant hoger bij patiënten met metastasen dan in die met niet-metastasen. (D) Kaplan-Meier overall survival curves volgens hetelucht expressie niveau. De totale overleving van de High-hetelucht-groep (n = 39: hetelucht uitdrukking verhouding ≥ mediaan ratio) was significant hoger dan die van de Low-hetelucht-groep (n = 39; hetelucht uitdrukking verhouding ≤ mediane verhouding; P < 0,001, log rank test). * P < 0,05, ** P < 0.01.
Tabel 1 Correlatie van de expressie van hetelucht met clinicopathologic features
Clinicopathologische features
n (%)
Relatieve expressie van HOTAIRa
P-waarde B
Gender
P = 0,62
Man
50 (64)
12,21 (0,97-17,53)
Vrouw
28 (36)
15,01 (7,34 -19,52)
Site van de tumor
P = 0,910
distale derde
18 (23)
9,1 (1,37-14,12)
Midden derde
20 (26)
7,96 (2,55-9,72)
proximale maag
40 (51)
7,76 (1,24-13,58)
Differentiatie
P = 0,045
Poor
56 (72)
15,6 (6,25-20,36)
hoge /matig
22 (28)
8.1 (0,98-11,14)
lymfekliermetastasen
P = 0,005
N0
10 (13)
1,14 (0,75-1,42)
N1
11 (14)
3,44 (1,15-4,85)
N2
29 (37)
11.99 (7.15- 14.77)
N3
28 (36)
32,58 (7,34-36,27)
metastasen
P = 0,029
M0
64 (82)
9,35 (2,53 -33,64)
M1
14 fig
28,82 (16,39-39,39)
aMedian van relatieve expressie, met een 25e-75e percentiel tussen haakjes. bP < 0,05 werd beschouwd als significant (Mann-Whitney U Electronics Test tussen de 2 groepen en Kruskall-Wallis test voor 3 groepen).
Manipulatie van hetelucht niveaus bij maagkanker cellen
We next uitgevoerd qRT-PCR-analyse van de onderzoeken expressieniveaus van hetelucht in verschillende kankercellijnen, zoals de maag, niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) en borstkanker afgeleide cellen. Zoals getoond in Figuur 2A, de vier maagkanker cellijnen onderzocht (MGC-803, SGC-7901, BGC-823 en AGS), BGC-823 expressie hogere hetelucht (3,18 maal) dan de normale gastrische epitheelcel lijn (GES-1). Ook NSCLC cellijn, SPC-A1, toonden een 3,73-voudige opregulatie van hetelucht over de normale menselijke bronchiale epitheel cellijn, 16HBE. De zeer metastatische borstkanker cellijn MDA-MB-231 vertoonde een 4,77-voudige opregulatie van hetelucht tegen MCF-7 (Figuur 2A). Onze gegevens suggereren dat hetelucht vaak worden opgereguleerd in vele tumorcellen. Figuur 2 Het niveau van expressie in hetelucht maagkanker cellen en het effect op celproliferatie in vitro. (A) Resultaten uit qRT-PCR demonstreren hetelucht expressie van maagkanker cellijnen (MGC-803, SGC-7901, BGC-823 en AGS) in vergelijking met een normale maag epitheel cellijn (GES-1), NSCLC cellijn ( SPC-A1) in vergelijking met een normale humane bronchiale epitheel cellijn (16HBE) en borstkankercellijnen MDA-MB-231 in vergelijking met MCF-7. (B) qRT-PCR analyses van hetelucht expressie na behandeling BGC-823 cellen met siRNA gericht hetelucht en behandeling SGC-7901-cellen met pCDNA /hetelucht vector. (C) MTT-assay werd uitgevoerd om de proliferatie van si-hetelucht-getransfecteerde 823-cellen BGC of pCDNA /hetelucht-getransfecteerde SGC-7901 cellen te bepalen. Gegevens stellen het gemiddelde ± S.D. van drie onafhankelijke experimenten. (D) kolonievormende groei assay werd uitgevoerd om de proliferatie van si-hetelucht bepalen getransfecteerde BGC-823 cellen. Kolonies werden geteld en vastgelegd. * P < 0,05 en ** P < 0,01. Belgique Om hetelucht niveaus bij maagkanker cellen manipuleren, werd een pCDNA /hetelucht vector getransfecteerd in SGC-7901 cellen en si-hetelucht werd getransfecteerd in BGC-823 cellen. qRT-PCR-analyse van hetelucht niveaus werd uitgevoerd bij 48 uur na transfectie en onthulde dat hetelucht expressie was verhoogd 98-voudig SGC-7901-cellen, vergeleken met controlecellen. In BGC-823 cellen, hetelucht expressie was effectief 75% neergeslagen door si-HOTAIR2, de meest effectieve siRNA vervolgens gebruikt in de volgende experimenten (Figuur 2B).
Effect van hetelucht op celproliferatie en apoptose in vitro
de sterke stijging van de hetelucht-expressie in maagkanker monsters voor ons aanleiding om de mogelijke biologische betekenis van de hetelucht in het ontstaan ​​van tumoren te verkennen. MTT-test bleek dat de celgroei was significant verminderd bij BGC-823 cellen die met si-hetelucht, terwijl de proliferatie van SGC-7901 cellen in pCDNA /hetelucht getransfecteerde cellen was toegenomen in vergelijking met de respectievelijke controles (figuur 2C). Ook de resultaten van kolonie-formatie assay bleek dat klonale overleving was verminderd na remming van hetelucht in BGC-823-cellen (Figuur 2D).
Te bepalen of apoptose droeg bij aan groeiremming cel, voerden we Hoechst kleuring en flow cytometrische analyse van si-hetelucht-behandelde BGC-823 cellen. De gegevens toonden dat het aantal cellen met gecondenseerde en gefragmenteerd kernen waarin de fractie van vroege apoptotische cellen significant hoger bij si-hetelucht-behandelde BGC-823-cellen in vergelijking met Si-NC-behandelde cellen (Figuur 3A en B). Bovendien vonden we dat remming van hetelucht verbeterde caspase-3-afhankelijke apoptose, gedemonstreerd door western blot analyse van geactiveerd caspase-3 na transfectie hetelucht-si (aanvullende bestandsinformatie 1: Figuur S1). Samengenomen geven deze resultaten aan dat knockdown van hetelucht onderdrukt maag proliferatie van kankercellen en induceert apoptose in vitro. Figuur 3 Het effect van hetelucht op maagkanker cel apoptose, migratie en invasie in vitro. BGC-823 cellen werden met si-hetelucht of si-NC, en SGC-7901-cellen werden met pCDNA /hetelucht vector of lege vector controle. (A) Hoechst kleuring bepaling van apoptose; het percentage Hoechst-positieve nuclei per optische gebied (tenminste 50 velden) werd bepaald. (B) De tarieven apoptotische cellen werd gedetecteerd door flowcytometrie. UL, necrotische cellen; UR, terminal apoptotische cellen; LR, vroege apoptotische cellen. (C en D) Transwell assays werden uitgevoerd om veranderingen in celmigratie en invasiviteit onderzoeken. * P < 0,05 en ** P < 0,01.
Hetelucht bevordert migratie en invasie van maagkanker cellen in vitro
invasie is een belangrijk aspect van de progressie van kanker die de migratie van tumorcellen in aangrenzende weefsels en de ontbinding van extracellulaire matrixeiwitten omvat. Hier evalueerden we kankercel invasie door middel van Transwell assays. Zoals getoond in figuur 3C, de transfectie van siRNA hetelucht belemmerd het vermogen tot migratie BGC-823-cellen met ongeveer 66%. Een overeenkomstig effect op invasiviteit werd ook waargenomen in een parallelle invasie assay. Omgekeerd transfectie van SGC-7901 cellen met pcDNA /hetelucht vector bevorderen celmigratie en invasiviteit ~ 1,9-voudig (Figuur 3D). Deze gegevens tonen aan dat hetelucht heeft oncogene eigenschappen die een trekkende en invasieve fenotype bij maagkanker cellen kunnen promoten.
Hetelucht bevordert het ontstaan ​​van tumoren van maagkanker cellen in vivo Belgique Om te onderzoeken of het niveau van hetelucht meningsuiting ontstaan ​​van tumoren beïnvloedt, BGC-823 cellen getransduceerd met de SH-hetelucht /pENTR vector (EV) werden in een naakt muis xenograft model. Tot 16 dagen na de knockdown van hetelucht, was er een dramatische afname in tumorvolume en gewicht in de SH-hetelucht groep vergeleken met controles (Figuur 4A, B en C). Vervolgens immunokleuring analyse van de proliferatie merker PCNA werd uitgevoerd in weggesneden tumorweefsels. In vergelijking met die in tumoren gevormd uit controlecellen, vertoonden sh-hetelucht-afgeleide tumors aanzienlijk verminderd PCNA positiviteit (figuur 4D). Deze resultaten suggereren dat het niveau van expressie hetelucht significant geassocieerd is met de in vivo vermeerderingsvermogen van maagkanker cellen. Figuur 4 Effect van hetelucht knockdown op tumorgroei in vivo. (A) De tumorgroei curves werden gemeten na injectie van BGC-823 cellen getransfecteerd met sh-hetelucht of pENTR vector. Het tumorvolume werd elke 3 dagen berekend. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± s.d. (N = 5). (B) Tumor gewicht. Waarden zijn van de tumor gewicht ± s.d. (C) qRT-PCR-analyse van hetelucht expressie in weefsels van tumoren weggesneden. (D) Tumoren ontwikkelden uit BGC-823 /sh-hetelucht cellen vertoonden een lagere PCNA eiwit dan tumoren ontstaan ​​uit BGC-823 /vector pENTR cellen. Boven: H & E kleuring; Onder: immunokleuring. * P < 0,05 en ** P < 0.01.
Hetelucht is een doelwit van miR-331-3P en miR-124
Bioinformatica analyse van miRNA sequenties erkenning hetelucht toonde de aanwezigheid van 11 tumor-onderdrukkende miRNAs bindingsplaatsen. Het hetelucht cDNA stroomafwaarts van het luciferasegen gekloneerd en genoemd RLuc-hetelucht (figuur 5A), daarna samen getransfecteerd met verschillende miRNA-coderende plasmiden. RNO-miR-344 fungeerde als een negatieve controle. De resultaten toonden aan dat luciferase activiteit wanneer respectievelijk miR-331-3p en miR-124 werden tot expressie gebracht, werd verminderd met 48% en 31% ten opzichte van de lege vector controle. Deze gegevens tonen aan dat zowel miR-331-3p en miR-124 direct kan binden aan hetelucht door respectievelijke miRNA herkenningsplaatsen (Figuur 5B linker paneel). Figuur 5 hetelucht is een doelwit van miR-331-3P of miR-124 en regelt miR-331-3p doelwit. (A) De 11 vermoedelijke miRNA bindingsplaatsen in de hetelucht sequentie. De hetelucht cDNA dat de vermeende miRNAs herkenningsplaatsen werd stroomafwaarts van het luciferasegen gekloond en noemde RLuc-hetelucht. (B) Linker: De luciferase reporterplasmide (RLuc-hetelucht) werd samen getransfecteerd in HEK-293 T-cellen met 11 verschillende miRNA-coderende plasmiden. Rechts: het luciferase reporter plasmide dat wild-type of mutant hetelucht werd co-getransfecteerd in HEK-293 T-cellen met miR-331-3p parallel met een lege plasmide vector. Luciferase activiteit werd bepaald met het duale luciferase assay en weergegeven als relatieve luciferase-activiteit genormaliseerd tot Renilla activiteit. Histogram geeft de waarden van luciferase gemeten 48 uur na transfectie. (C) Het 3'-UTR van HER2 werd gefuseerd aan het luciferase coderende gebied (RLuc HER2-3'-UTR) en getransfecteerd in HEK293T-cellen met miR-331-3p bevestigen HER2 is het doelwit van miR-331-3p. RLuc HER2-3'-UTR en miR-331-3p constructen werden tezamen getransfecteerd in HEK293T cellen met plasmiden die hetelucht (pcDNA /hetelucht) of een controlevector de CERNA activiteit van hetelucht controleren. RNO-miRNA-344 werd toegepast als een negatieve controle. Histogram geeft de waarden van luciferase gemeten 48 uur na transfectie. (D) RIP met de muis monoklonale anti-Ago2, pre-immuun IgG of 10% input van BGC 823-cel extracten. RNA niveaus in immunoprecipitaten werden bepaald met qRT-PCR. Top: niveaus van hetelucht, miRNA331-3P en FOS RNA werden gepresenteerd als voudige verrijking in Ago2 ten opzichte van IgG immunoprecipitaten. Bottom: relatieve RNA-spiegels van U1 snRNA in SNRNP70 ten opzichte van IgG immunoprecipitaten. Nummers zijn gemiddelde ± S.D. (N = 3). (E) Western blot analyse van HER2-eiwit niveau na behandeling van BGC-823 cellen met si-hetelucht of pCDNA /hetelucht, en SGC-7901-cellen met pcDNA /hetelucht. GAPDH werd gebruikt als controle. * P < 0,05, ** P < 0,01 en N.S. niet significant.
Hierin kozen we miR-331-3p als model miRNA voor verdere studies. Om verder te bevestigen dat de reductie van luciferaseactiviteit van de RLuc-hetelucht-WT vector was als gevolg van directe interactie tussen het miRNA en zijn vermoedelijke bindingsplaats gemuteerd we de miR-331-3p bindingsplaats door plaatsgerichte mutagenese, waardoor RLuc -HOTAIR-Mut. Zoals verwacht, werd onderdrukking van luciferaseactiviteit volledig afgeschaft in deze mutant construct in vergelijking met wild-type vector (Figuur 5B rechter paneel).
Hetelucht en miR-331-3p beide binden met AGO2 bij maagkanker cellen
miRNAs zijn bekend aanwezig in het cytoplasma in de vorm van miRNA ribonucleoproteïne complexen (miRNPs) zijn die ook Ago2 de kerncomponent bevatten de RNA-geïnduceerd silencing complex (RISC) [17, 18]. Om te testen of hetelucht associeert met miRNPs, RNA-bindende eiwitten immunoprecipitatie (RIP) experimenten werden uitgevoerd op BGC-823 celextracten met behulp van antilichamen tegen Ago2. RNA niveaus in immunoprecipitaten werden bepaald met qRT-PCR. Hetelucht werd voorkeur verrijkt (354-voudig) in Ago2 bevattende miRNPs opzichte van immunoglobuline G (IgG) immunoprecipitaten regelen. Evenzo werd miRNA-331-3p gedetecteerd op een niveau 840-maal groter dan die van de controle anti-IgG. Succesvolle immunoprecipitatie van Ago2-geassocieerde RNA werd geverifieerd door qRT-PCR, met behulp van RIP primers tegen menselijke FOS in de RIPAb + Ago2 kit (figuur 5D, bovenste paneel) inbegrepen. Bovendien werd anti-SNRNP70 toegepast als een positieve controle voor het TNO procedure en U1 snRNA werd ook gedetecteerd op een niveau 206-maal groter dan die van anti-IgG (Figuur 5D, onderste paneel). Dus, hetelucht is aanwezig in Ago2 bevattende miRNPs, waarschijnlijk door middel van associatie met miRNA-331-3p, in overeenstemming met onze bio-informatica-analyse en luciferase assays.
Hetelucht regelt de miR-331-3p doel, HER2
Onder de vele doelstellingen van miR-331-3p concentreerden we ons op HER2 omdat het codeert voor een transmembraaneiwit met relevante functie bij carcinogenese en weerstand tegen trastuzumab-gebaseerde therapie [19]. De 3'-UTR van HER2 werd gefuseerd aan het luciferase coderende gebied (RLuc HER2-3'-UTR) en getransfecteerd met plasmiden die coderen voor miR-331-3p en een lege plasmide vector. RNO-miRNA-344 fungeerde als een negatieve controle. De luciferase test toonde aan dat miR-331-3p significant geremd luciferaseactiviteit (~ 41% remming) van de RLuc-HER2 3'-UTR reporter, bevestigt dat HER2 is een doelwit van miR-331-3p. De RLuc-HER2 3'-UTR construct werd vervolgens samen getransfecteerd met plasmiden die coderen voor miR-331-3p en hetelucht (pCDNA /hetelucht). Luciferase assays aangegeven dat, in aanwezigheid van hetelucht, werd RLuc HER2-3'-UTR onderdrukking hersteld vergelijking met de controlegroep (figuur 5C). Dit geeft aan dat hetelucht fungeert als een endogeen "spons" door binding miR-331-3p, waardoor intrekking van de miRNA-geïnduceerde onderdrukkende activiteit van de HER2 3'-UTR.
Bovendien is het effect van hetelucht expressie op endogene eiwit HER2 combinatie met modulatie van miRNA of lncRNA niveaus werd gevolgd door verschillende benaderingen figuur 5E: (1) miR-331-3p tegen HER2 overexpressie in BGC-823-cellen; (2) hetelucht knock-down tegen HER2 in BGC-823 cellen; (3) hetelucht overexpressie van HER2 in SGC-7901-cellen. Western blot analyse toonde aan dat geforceerde expressie van miR-331-3p of knock-down van de hetelucht in BGC-823 cellen leidde tot een significant silencing effect op de endogene HER2-eiwit expressie. Verder werd HER2 eiwitexpressie sterk opgereguleerd na transfectie met hetelucht in SGC-7901 cellen, die een relatief lage endogene hetelucht expressieniveau aantoont.
Samen geven deze gegevens aan dat door binding miR-331-3p, hetelucht fungeert als CERNA voor het doel HER2 mRNA, waardoor de derepressie van HER2 moduleren en het opleggen van een extra niveau van post-transcriptionele regulatie.
miR-331-3p en miR-124 onderdrukken maagkanker cellen proliferatie Belgique Om als een endogene gootsteen voor doel dienen miRNAs, moet de overvloed van hetelucht vergelijkbaar met of hoger dan de miR-331-3p /miR-124 zijn. In ons onderzoek qRT-PCR analyse toonde aan dat miR-331-3p /miR-124 expressie omgekeerd gecorreleerd met hetelucht expressie in 20 paren gevorderde maagkanker (figuur 6A). Om te valideren of miR-331-3p en miR-124 ook de maag proliferatie kankercel kan remmen, wij genoodzaakt hun expressie in BGC-823 cellen met behulp van miRNA coderende plasmiden. De expressieniveaus van miRNA-331-3p en miR-124 getransfecteerd in BGC-823 cellen significant verhoogd met 36-voudig en 29-voudig, in vergelijking met controlecellen (figuur 6B). Vervolgens MTT en kolonie vorming assays werden uitgevoerd om cellevensvatbaarheid te bepalen. De resultaten van de MTT-bepaling en groeicurves gebleken dat cellen die met miR-331-3p of miR-124 bleek significant groeiretardatie in vergelijking met cellen getransfecteerd met lege vector (Figuur 6C). Deze gegevens geven aan dat overexpressie van miR-331-3p of miR-124 expressie maagkanker celproliferatie, hetgeen consistent is met de resultaten van hetelucht expressie knockdown in BGC-823 cellen kunnen aanhouden. Figuur 6 positieve correlatie tussen hetelucht en HER2 expressie en de relevantie voor miR-331-3p /miR-124 expressie niveaus. (A) Bivariate correlatie analyse van de relatie tussen de hetelucht expressie en miR-331-3p of miR-124-niveau. (B) BGC-823 cellen werden getransfecteerd met plasmiden die coderen voor miR-331-3p of miR-124 en qRT-PCR werd gebruikt om het miRNA niveaus vergeleken met controles (miR-NC) detecteren. (C) MTT assay en kolonievormende groei assay werden uitgevoerd om de proliferatie van miR-331-3p of miR-124 getransfecteerde BGC-823 cellen te bepalen. (D) Links: immunokleuring van HER2-eiwit in gevorderde maagkanker weefselmonsters. Boven: immunokleuring van HER2 was negatief in maagkanker weefsels met een relatief lage hetelucht expressie. Onderste: immunokleuring van HER2 was positief bij maagkanker weefsels met een relatief hoge hetelucht expressie. Rechts: bivariate correlatie analyse van de relatie tussen de hetelucht en HER2 expressie niveau. * P < 0,05, ** P < 0,01.
HER2 co-expressie gebracht met hetelucht bij maagkanker weefsels Ondernemingen De HER2 overexpressie percentage werd gerapporteerd 7-34% in maagkanker, en is geassocieerd met meer agressieve ziekte en slechtere overleving bij maagkanker [19]. Detecteerden we expressie van HER2 in 50 gevorderde maagkanker weefsels (stadium III /IV) gekozen uit de vorige 78 maagkanker weefsels door immunohistochemie (IHC) en qRT-PCR analyse. De resultaten van IHC kleuring toonde HER2 eiwit positiviteit in 56% van de geselecteerde 50 maagkanker weefsels. Zesentachtig procent van deze HER2-positieve monsters waren afkomstig vergevorderd stadium III /IV tumoren, en 71% weergegeven hoog hetelucht expressie (Figuur 6D en bijkomende file 2: Tabel S2). Bivariate correlatie analyse toonde aan dat de expressie van HER2 was significant gecorreleerd met hetelucht transcript niveau bij maagkanker weefsels in vergelijking met een normale tegenhangers (figuur 6D). Deze gegevens geven aan dat de expressie van HER2 positief geassocieerd met opgereguleerd hetelucht bij maagkanker weefselmonsters, wat suggereert dat karakterisering van de HER2 /hetelucht interactie biologisch significant menselijke maag tumorigenese kan zijn.
Name vanwege een lopende fase III /IV proef, de HER2 overexpressie tarief gedetecteerd in de huidige studie is hoger dan de eerder gerapporteerde mediane bereik. Deze verhoogde snelheid van HER2-overexpressie is sterk verbonden met slechte resultaten voor patiënten met uitgezaaide en high-grade gelokaliseerde maagkanker, waardoor het belang van HER2 in de maag de ontwikkeling van kanker en metastase benadrukken.
Discussie
LncRNAs, die meer dan zijn 200 nucleotiden in de lengte met een beperkte-eiwit-coderende capaciteit, worden vaak uitgedrukt in een ziekte-, weefsel- of ontwikkelingsfase-specifieke manier, met vermelding van specifieke functies voor lncRNAs in de ontwikkeling en ziekten en het maken van deze moleculen aantrekkelijke therapeutische doelwitten [20-22]. Een aantal recente publicaties hebben aangetoond dat ontregeling van deze lncRNAs ook de regulering van het eukaryote genoom kunnen beïnvloeden en een celgroei voordeel, resulterend in progressieve en ongecontroleerde tumorgroei [23-25]. Daarom kan lncRNAs een ontbrekend stuk van de anders bekende oncogene en tumor suppressor netwerk puzzel verschaffen.
In dit onderzoek onderzochten we de expressie van hetelucht in maagcarcinoom monsters en de omringende niet-tumor weefsels. Bovendien blijken de functie van hetelucht gastrische carcinoomcellen door toepassing gain en loss-of-function benaderingen. De resultaten toonden aan dat hetelucht werd opgereguleerd in maagcarcinoom weefsels ten opzichte van aangrenzend normaal weefsel maag, en hetelucht opregulatie gecorreleerd met grotere tumorgrootte, geavanceerde pathologische stadium en uitgebreide metastasering. Bovendien is de totale overleving tijd van de patiënten met een lager hetelucht expressie niveaus was significant langer dan die van patiënten met een matige of sterke hetelucht expressie niveaus. Bovendien hetelucht overexpressie bevorderde de proliferatie, migratie en invasie van gastrische carcinoomcellen, maar hetelucht depletie geremd celinvasie en cellevensvatbaarheid en geïnduceerde groeiremming zowel in vitro als in vivo. Bovendien hetelucht onderdrukking leidde tot het bevorderen van maag apoptose. Deze bevindingen suggereren dat hetelucht speelt een directe rol spelen in de modulatie van verschillende oncogene eigenschappen en maagkanker progressie stimuleren nieuwe onderzoeksrichtingen en therapeutische toepassingen overweegt hetelucht als nieuw prognostische merker en therapeutisch doel bij maagkanker.
Het belang van lncRNAs in menselijke ziekte kan worden geassocieerd met hun vermogen om cellulaire functies beïnvloeden door verschillende mechanismen. In deze studie, wat het mechanisme van hetelucht betreft, is het vermeldenswaard dat subcellulaire lokalisatie analyse van hetelucht door RNA fluorescentie in situ hybridisatie assay toont de lokalisatie van hetelucht zowel de kern en het cytoplasma [24]. Het is duidelijk dat de nucleaire hetelucht kunnen richten polycomb repressieve complex 2, wijzigen H3K27 methylatie en genexpressie patronen in het genoom [10, 11]. Recent onderzoek meldde een steiger functie hetelucht in het cytoplasma als een inductor van ubiquitine gemedieerde proteolyse [26]. Toch is de tumorigene eigenschappen en mechanistische heterogeniteit van hetelucht, en met name die van de cytoplasmatische vorm, nog lang niet volledig opgehelderd.
Geïnspireerd door de regelgevende netwerk van de 'concurrerende endogene RNA's' en opkomende bewijs dat suggereert dat lncRNAs kunnen deelnemen aan deze regelgevende circuits, we de hypothese dat hetelucht ook als cerna kan dienen en dus hebben we gezocht naar mogelijke interacties met miRNAs. 0,05. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Kwaliteit van leven, immunomodulatie en de veiligheid van adjuvante maretak behandeling bij patiënten met maagcarcinoom - een gerandomiseerde, gecontroleerde pilot-studie
• Neerwaartse regulatie van Thrombospondin2 voorspelt een slechte prognose bij patiënten met maagkanker