LNC RNS Hotair funkcionál versengő endogén RNS szabályozni HER2 által sponging miR-331-3p a gyomor cancer

LNC RNS Hotair funkcionál versengő endogén RNS szabályozni HER2 által sponging miR-331-3p gyomorrákban katalógusa Abstract
Háttér katalógusa Egyre több bizonyíték utal, hogy a hosszú, nem kódoló RNS Hotair kritikus szerepet játszik a daganatos progresszió és metasztázis. Azonban a teljes biológiai szerepének és klinikai jelentősége Hotair a gyomor karcinogenezis még jórészt ismeretlen. Katalógusa módszerek
Hotair kifejezés mértük 78 páros rákos és nem rákos szövetmintát real-time PCR. A hatások a Hotair a gyomor rákos sejteket tanulmányoztuk overexpressziója és RNS interferencia megközelítések in vitro és in vivo. Insights mechanizmusának versenyképes endogén RNS (ceRNAs) nyertünk bioinformatikai elemzése, luciferáz vizsgálati eljárás és az RNS-kötő fehérje immunprecipitáció (RIP). A pozitív Hotair /HER2 kölcsönhatást azonosított és igazolt immunhisztokémiai vizsgálattal és kétváltozós korrelációs elemzést. Katalógusa Eredmények katalógusa Hotair upreguláció járt nagyobb a daganat mérete, a fejlett patológiai stádium és kiterjedt metasztázis, továbbá korrelált a rövidebb teljes túlélés a gyomorrák rákos betegeknél. Továbbá Hotair overexpresszió elősegítette a proliferáció, migráció és invázió gyomor karcinóma sejtek, míg Hotair kimerülése gátolta mind sejtek invázióját és a sejtek életképességét, és indukált növekedési gátlás in vitro és in vivo. Különösen Hotair eljárhat Cerna hatékonyan válik mosogató miR-331-3p, ezáltal módosítsák a derepressziójához HER2 voltát, és további szintje poszt-transzkripciós szabályozás. Végül a pozitív Hotair /HER2 korrelációt mutatott szignifikáns összefüggést a fejlett gyomorrák.
Következtetések katalógusa Hotair túltermelése jelent biomarker a rossz prognózis a gyomorrák és ruházhat rosszindulatú fenotípus tumorsejteket. Cserna szabályozási hálózat bevonásával Hotair és pozitív kölcsönhatás Hotair és HER2 hozzájárulhat jobb megértését gyomorrák patogenezise és fejlődésének elősegítése lncRNA irányított diagnosztikai és terápiás e betegség ellen. Katalógusa Kulcsszavak katalógusa Versengő endogén RNS HER2 Hotair gyomorrák proliferáció és invázió Háttér katalógusa gyomorrák a második vezető oka a rák okozta halálozás, valamint a leggyakoribb emésztőrendszeri rosszindulatú Kelet-Ázsiában, Kelet-Európában, és részei Közép-és Dél-Amerikában. A legtöbb betegnél a gyomor rákot diagnosztizáltak előrehaladott állapotban van, és kíséri a malignus proliferáció, kiterjedt invázió és nyirokrendszeri metasztázis. A sikeres terápiás stratégiák korlátozottak, és a mortalitás magas [1, 2]. Hosszú nem-kódoló RNS-ek (lncRNAs) nemrégiben szerzett jelentős figyelmet lehatároló komplex mechanizmusok mögöttes rosszindulatú folyamatok, például a rákkeltő képességet, metasztázis és gyógyszer-rezisztencia. Ezért, ha azt akarjuk, hogy teljes mértékben megértsék a gyomor carcinogenesis, meg kell vizsgálni, így ez a szabályozási átiratát, hogy egy új bonyolítja, hogy a daganat biológiai.
Bár csak egy kis számú funkcionális lncRNAs jól jellemezték a mai napig, akkor kimutatták, hogy szabályozzák a génexpressziót a különböző szinteken, beleértve a kromatin módosítási, transzkripció és poszt-transzkripciós feldolgozás a [3, 4]. Nemrégiben egy új szabályozási mechanizmust azonosítottak, amelyek áthallás lncRNAs és mRNS fordul versengő megosztott mikroRNS (miRNS) válasz elemeket. Ebben az esetben a lncRNAs működhet versengő endogén RNS (ceRNAs) szivaccsal miRNS, ezáltal módosítsák a derepressziójához miRNS célok és impozáns egy további szintet poszt-transzkripciós szabályozás [5]. A korábbi jelentések szerint egy izom specifikus lncRNA Linc-MD1, leírták, hogy egy Cerna amely megvédi MyoD messenger RNS (mRNS) miRNS közvetített lebomlási [6]. Pluripotencia-asszociált LNC-ROR működhet, mint egy kulcsfontosságú Černá összekapcsolni a hálózat a miRNS-ek és az alapvető transzkripciós faktorok, például Oct4, Sox2, és Nanog, a humán embrionális őssejteket. Nevezetesen, lncRNA HULC erősen túlszabályozott májrák és fontos szerepet játszik a tumorigenezisben [7]. Különösen HULC hathatnak endogén "szivacs", amely csökkenti az egy sor miRNS tevékenységek, beleértve a miR-372 [8]. Javasoljuk tehát, hogy néhány lncRNAs is lehet szerepeket ceRNAs összekötő miRNS és a poszt-transzkripciós hálózat gyomor patogenezisében.
Hotair (Hox átirat antiszensz RNS gének közötti katalógusa) egy ~ 2,2 kb hosszúságú nem kódoló RNS átíródott a HOXC
lókusz, amely elnyomják a transzkripciót transz
HOXD
fityma fibroblasztok [9]. Mint új molekula terén daganat biológiai Hotair kezdetben vált ismertté való részvétele miatt primer emlődaganatok és a mellrák áttétek, ahol emelkedés Hotair támogatni invazív és metasztatikus [10]. Továbbá Hotair kifejezés pozitívan korrelál a malignus folyamatok és a gyenge eredmény végbélrák, hepatocelluláris karcinóma, hasnyálmirigy-rák és gasztrointesztinális stroma tumorok [11-14]. Újabb vizsgálatok szerint a Hotair ben fokozódik gyomorrák [15, 16]. Mindazonáltal az átfogó biológiai szerepét és a mögöttes molekuláris mechanizmusa Hotair a gyomor karcinogenezis nagyrészt meghatározatlan.
Ebben a tanulmányban azt jelentette, hogy Hotair upreguláció jellemző molekuláris változás gyomorrák és vizsgálja a biológiai szerepének Hotair a fenotípus gyomorrák-sejtek in vitro és in vivo. Sőt, mechanisztikus elemzés feltárja, hogy Hotair működhet, mint egy Černá, hogy szabályozza a kifejezés az emberi epiteliális növekedési faktor receptor 2 (HER2) keresztül verseny miR-331-3p, így játszik egy onkogén szerepet gyomor patogenezisében. A jelen munka az első bizonyíték arra, hogy pozitív Hotair /HER2 korreláció és közötti áthallás miR-331-3p, Hotair és HER2, új megvilágításba a kezelés a gyomorrák. Katalógusa Eredmények katalógusa Hotair kifejezés felülszabáiyoződik humán gyomorrák szövetek
szintjét Hotair expresszió vizsgálatát a 78 páros gyomorrák minták és a szomszédos, szövettanilag normális szövetek qRT-PCR, és a normalizált GAPDH. Hotair expresszió szignifikánsan emelkedett a rákos szövetekben (átlag aránya 14.35-szeres, a P < 0,01), mint a normál megfelelőik (1a ábra). Vizsgálata közötti összefüggés Hotair expresszió és a klinikai patológiai jellemzői azt mutatták, hogy Hotair upreguláció korrelált nagyobb a daganat mérete, a fejlett patológiai stádium távoli metasztázist (1B és C), nyirokcsomó-metasztázis és tumor sejtek differenciálódása (1. táblázat). Azonban Hotair kifejezés nem állt összefüggésben a tumor helyzetben vagy a beteg neme (1. táblázat). Ami a teljes túlélést, a betegek magas Hotair kifejezés szignifikánsan rosszabb prognózist, mint az alacsony Hotair kifejezés (P < 0,001, log-rank teszt; 1D ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy Hotair túltermelése hasznos lehet a fejlesztés újabb prognosztikai vagy progresszió markerek gyomorrák. 1. ábra Relatív Hotair kifejezés gyomorrákban szövetekben és a klinikai jelentősége. (A) relatív expresszióját Hotair gyomorkarcinómában szövetekben (n = 78) összehasonlítva a megfelelő nem-tumoros normál szövetekben (n = 78). Hotair kifejezés vizsgáltuk qRT-PCR és normalizált GAPDH kifejezést. Az adatokat bemutatott kinyitható változás daganatszöveteken képest normál szövetekben. (B) vizsgálata közötti összefüggés Hotair expresszió és a klinikai patológiai jellemzői azt mutatták, hogy Hotair upreguláció korrelál nagyobb a tumor méretét és a fejlett patológiai stádium. (C) Hotair expressziója szignifikánsan magasabb volt azoknál a betegeknél, akiknél távoli metasztázis, mint azoknál, akik nem-távoli metasztázis. (D) Kaplan-Meier teljes túlélési görbék szerint Hotair expressziós szint. A teljes túlélés a magas Hotair csoport (n = 39: Hotair kifejezés arány ≥ medián arány) szignifikánsan magasabb volt, mint az alacsony Hotair csoport (n = 39; Hotair kifejezés arány ≤ medián aránya; P < 0,001, log rank teszt). * P < 0,05, ** P < 0.01.
1. táblázat korreláció a kifejezés Hotair a klinikopatológiai jellemzők
klinikai és jellemzői Matton n (%) Matton relatív expresszióját HOTAIRa Matton P-VALUE milliárd Matton nemek katalógusa P = 0,62 katalógusa Férfi katalógusa 50 (64) hotelben 12,21 (0,97-17,53) fiatal női katalógusa 28 (36) hotelben 15.01 (7,34 -19,52) hotelben Site tumor katalógusa P = 0,910 katalógusa distalis harmadában katalógusa 18 (23) hotelben 9.1 (1,37-14,12) hotelben Közel harmadik katalógusa 20 (26)
7,96 (2,55-9,72) hotelben proximális gyomor katalógusa 40 (51) hotelben 7,76 (1,24-13,58) hotelben differenciálás katalógusa P = 0,045 katalógusa Gyenge katalógusa 56 (72)
15,6 (6,25-20,36) hotelben Nagy /közepes katalógusa 22 (28) hotelben 8.1 (0,98-11,14) hotelben nyirokcsomómetastasis katalógusa P = 0,005 katalógusa N0 katalógusa 10 (13) hotelben 1,14 (0,75-1,42) hotelben N1 katalógusa 11 (14) hotelben 3,44 (1,15-4,85) hotelben N2 katalógusa 29 (37) hotelben 11,99 (7.15- 14.77) hotelben N3 katalógusa 28 (36) hotelben 32,58 (7,34-36,27) hotelben metasztázis katalógusa P = 0,029 katalógusa M0
64 (82) hotelben 9,35 (2,53 -33,64) hotelben M1 katalógusa 14 ábra
28,82 (16,39-39,39) hotelben aMedian relatív kifejezés, a 25.-75. percentilis zárójelben. bP < 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak (Mann-Whitney U teszt katalógusa között 2 csoport és Kruskall-Wallis teszt 3 csoportban). Katalógusa manipulálása Hotair szintek gyomorrák sejtek katalógusa A következőkben végre qRT-PCR analízis hogy vizsgálja meg a expressziós szintje Hotair különböző rákos sejtvonalak, ideértve a gyomor, a nem-kissejtes tüdőrák (NSCLC) és a mellrák-eredetű sejtek. Amint azt a 2A ábra, a négy gyomorrák sejtvonalakon vizsgáltuk (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, és AGS), BGC-823 expresszált magasabb Hotair (3,18-szeres), mint a normál gyomornyálkahártya sejt vonal (GES-1). Hasonlóképpen, NSCLC-sejtvonal, SPC-A1, mutatott 3,73-szeres túlszabályzását Hotair felett normál humán bronchiális epiteliális sejtvonal, 16HBE. A nagyon metasztázisos emlőrák sejtvonal MDA-MB-231 mutatott 4,77-szeres túlszabályzását Hotair összehasonlítva az MCF-7 (2A ábra). Adataink arra utalnak, hogy Hotair lehet gyakran fokozódik sok tumorsejtekben. 2. ábra A szint Hotair expresszió gyomor rákos sejteket, és annak hatása a sejt-proliferáció in vitro. (A) Eredmények a QRT-PCR bizonyítva Hotair expressziós szintje gyomor rákos sejtvonalat (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, és AGS), mint a normál gyomornyálkahártya sejtvonal (GES-1), az NSCLC-sejtvonal ( SPC-A1), mint a normál humán bronchiális epiteliális sejtvonalat (16HBE), és a mellrák sejtvonalakban az MDA-MB-231 összehasonlítva az MCF-7. (B) qRT-PCR analízise Hotair expressziós szintje a kezelést követő BGC-823 sejtek siRNS célba Hotair és kezelése SGC-7901 sejtek pCDNA /Hotair vektor. (C) Az MTT assay-t végeztünk annak meghatározására, elterjedése Si-Hotair transzfektált BGC-823 sejtek vagy pCDNA /Hotair transzfektált SGC-7901 sejteket. Az adatok középértékek ± S.D. három független kísérlet során. (D) Colony-képző növekedési assay-t, hogy meghatározza a proliferációját Si-Hotair transzfektált BGC-823 sejtekben. Telepeket megszámoltuk és elfogták. * P < 0,05 és ** P < 0.01.
Manipulálni Hotair szint gyomor rákos sejtek, a pCDNA /Hotair vektort transzfektáljuk SGC-7901 sejtek és si-Hotair transzfektáltunk BGC-823 sejtek, ill. QRT-PCR elemzést Hotair szintek végeztük 48 órával a transzfekció és kiderült, hogy Hotair expresszió fokozott 98-szorosára SGC-7901 sejteket, mint a kontroll sejtek. Azonban a BGC-823-sejtek, Hotair expressziója hatékonyan 75% leütött SI-HOTAIR2, a leghatékonyabb siRNS követően felhasználható a következő kísérletekben (2b ábra).
Hatása Hotair sejtproliferációra és az apoptózis in vitro
a jelentős növekedés az Hotair kifejezés gyomorrákban minták arra ösztönzött minket, hogy vizsgálja meg a lehetséges biológiai jelentősége Hotair a tumorok. MTT assay során kiderült, hogy a sejtek növekedését jelentősen károsodott BGC-823 transzfektált sejtek si-Hotair, míg elterjedése SGC-7901 sejtek emelkedett pCDNA /Hotair transzfektált sejtek képest megfelelő kontrollok (2C ábra). Hasonlóképpen, az eredmény a kolónia-képződés vizsgálatban kiderült, hogy a klonogén túlélést követően csökkent gátlásával Hotair a BGC-823 sejteket (2D, ábra).
Annak meghatározásához, hogy az apoptózis is hozzájárult, hogy a sejtnövekedés gátlását, végeztünk Hoechst-festéssel és áramlási citometriás vizsgálata Si-Hotair kezelt BGC-823 sejtekben. Az adatok azt mutatták, hogy a sejtek száma kondenzált és fragmentált atommagok jelezve a frakció korai apoptotikus sejtek szignifikánsan magasabb volt a Si-Hotair kezelt BGC-823 sejtek összehasonlítva Si-NC-kezelt sejtekben (3A és B). Ezen túlmenően azt találtuk, hogy gátolja a Hotair fokozott kaszpáz-3-függő apoptózis, bizonyítja Western blot analízis aktivált kaszpáz-3 után si-Hotair transzfekciós (Plusz fájl 1: ábra S1). Összefoglalva, ezek az eredmények azt jelzik, hogy a kiütése Hotair elnyomja gyomorrák sejt proliferáció és apoptózist indukál in vitro. 3. ábra A hatás Hotair a gyomorrák sejt apoptózis, a migráció és invázió in vitro. BGC-823 sejteket transzfektáltunk Si-Hotair vagy Si-NC, és SGC-7901 sejteket transzfektáltunk a pCDNA /Hotair vektor vagy üres vektorral ellenőrzés. (A) a Hoechst festési esszé apoptózis; a százalékos Hoechst-pozitív sejtmagok per optikai mező (legalább 50 mező) meghatározzuk. (B) Az apoptotikus aránya sejteket mutattunk áramlási citometriával. UL, nekrotikus sejtek; UR, terminál apoptotikus sejtek; LR, korai apoptotikus sejteket. (C és D) Transwell vizsgálatokat végeztünk, hogy vizsgálja változások a sejt migráció és invazivitását. * P < 0,05 és ** P < 0,01.
Hotair elősegíti a migráció és invázió gyomorrák-sejtek in vitro
sejtek invázióját jelentős aspektusa a rák progressziójának, amely magában foglalja a tumorsejtek migrációját egy összefüggő szöveteket és az oldódási extracelluláris mátrix fehérjék. Itt értékeltük a ráksejtek terjedését keresztül transzwell vizsgálatokban. Ábrán látható 3C, a transzfekció Hotair siRNS akadályozta a vándorló képesség BGC-823 sejtek által durván 66%. Hasonló hatása invazivitását is megfigyelhető volt, egy párhuzamos inváziós esszében. Ezzel transzfekcióját SGC-7901 sejtek pCDNA /Hotair vektor mozdítani-migráció és invazív ~ 1,9-szeres (ábra 3D). Ezek az adatok azt jelzik, hogy Hotair onkogén tulajdonságai, amelyek elősegítik a vándorló és az invazív fenotípus gyomor rákos sejtekben.
Hotair elősegíti tumorigenezis gyomorrák-sejtek in vivo
vizsgálni, hogy a szint Hotair kifejezés befolyásolja tumorigenezis, BGC-823 sejtek transzdukált SH-Hotair /pENTR vektor (EV) vontunk be egy csupasz egerekben xenograft modellben. Akár 16 napon belül kiütése Hotair, volt egy drámai csökkenést a tumor térfogat és tömeg az SH-Hotair csoportban a kontrollcsoporthoz viszonyítva (4a ábra A, B és C). Ezután immunfestés elemzése proliferációs marker PCNA végeztünk kimetszett tumoros szövetekben. Ahhoz képest, a tumorokban képződik kontroll sejtekben, SH-Hotair-eredetű tumorok szignifikánsan csökkentette PCNA pozitivitás (ábra 4d). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a szint Hotair expresszió szignifikánsan összefügg az in vivo proliferáció kapacitása gyomorrák sejtek. 4. ábra hatása Hotair knockdown a tumor növekedését in vivo. (A) A tumor növekedési görbék után mértük injekció BGC-823 sejteket transzfektáltunk SH-Hotair vagy pENTR vektor. A tumor térfogatát kiszámítottuk minden 3. napon. Az adatokat átlag ± S.D. (N = 5). (B) A tumor tömegét. Az értékek segítségével a tumor tömege ± S.D. (C) QRT-PCR analízise Hotair expresszió szöveteiben kimetszett tumorok. (D) Daganatok kifejlesztett BGC-823 /sh-Hotair sejtekben mutatott alacsonyabb szintű PCNA fehérje mint tumorok fejlődtek ki BGC-823 /pENTR vektor sejtekbe. Felső: H & E festés; Alsó: immunfestés. * P < 0,05 és ** P < 0.01.
Hotair célpontját miR-331-3P és miR-124 katalógusa Bioinformatikai elemzés miRNS elismerés szekvenciák Hotair jelenlétét mutatta ki a 11 tumor-elnyomó miRNS kötőhelyek. A Hotair cDNS-t klónoztuk downstream a luciferáz gén és a megnevezett RLuc-Hotair (5A ábra), akkor együtt transzfektáltuk különböző miRNS kódoló plazmidok. RNO-miR-344 járt, mint negatív kontrollt. Az eredmények azt mutatták, hogy luciferázaktivitást 48% -kal csökkent, és 31% -kal az üres vektorral ellenőrzésnek miR-331-3p és miR-124 esetében fejezzük ki. Ezek az adatok azt mutatják, hogy mind a miR-331-3p és miR-124 közvetlenül kötődni Hotair keresztül illető miRNS felismerési helyek (5B ábra bal panel). 5. ábra Hotair célpontját miR-331-3P vagy miR-124 és miR-vezérli 331-3p cél. (A) A 11 feltételezett miRNS kötőhelyek Hotair sorrendben. A Hotair tartalmazó cDNS vélt miRNS felismerési helyek klónoztak folyásirányban luciferázgén és elemzi RLuc-Hotair. (B) bal: A luciferáz riporter plazmid (RLuc-Hotair) volt kotranszfektáljuk HEK-293-T-sejtek a 11 különböző miRNS kódoló plazmidok. Jobbra: a luciferáz riporter tartalmazó plazmid vad típusú vagy mutáns Hotair volt ko-transzfektáltuk HEK-293 T-sejtek miR-331-3p párhuzamosan egy üres plazmid vektor. A luciferáz aktivitást meghatározzuk a kettős Luciferase Assay, és kimutatták, például a relatív luciferáz aktivitást normalizált Renilla aktivitás. Hisztogram jelzi, az értékek luciferáz mért 48 órával a transzfekció után. (C) A 3'-UTR HER2 fuzionáltuk a luciferáz kódoló régió (RLuc-HER2 3'-UTR) és transzfektáljuk HEK293T-sejtek miR-331-3p megerősíteni HER2 a cél a miR-331-3p. RLuc-HER2 3'-UTR és miR-331-3p konstrukciókat kotranszfektáljuk HEK293T-sejtek kifejező plazmidok Hotair (pCDNA /Hotair) vagy egy kontroll vektorral, hogy ellenőrizze a Černá aktivitását Hotair. RNO-miRNS-344 használtunk negatív kontrollként. Hisztogram jelzi, az értékek luciferáz mért 48 órával a transzfekció után. (D) a RIP egér monoklonális anti-Ago2, immunizálás előtti IgG vagy 10% bemeneti BGC 823-sejt kivonatok. RNS szintek immunoprecipitátumokban határoztuk meg QRT-PCR. Top: szintek Hotair, miRNA331-3P és FOS RNS bemutatott szeres dúsítást Ago2 képest IgG immunoprecipitátumok. Alsó: relatív RNS szintje U1 snRNS a SNRNP70 képest IgG immunoprecipitátumok. A számok átlag ± S.D. (N = 3). (E) Western-blot analízis a HER2-protein szintjének kezelését követő BGC-823 sejtek Si-Hotair vagy pCDNA /Hotair, és SGC-7901 sejtek pCDNA /Hotair. GAPDH-t használtuk kontrollként. * P < 0,05, ** P < 0,01 és N. S. nem szignifikáns.
leírásban választottuk miR-331-3p modellként miRNS további tanulmányozásra. Annak további igazolására, hogy a luciferáz aktivitásban beállt csökkenés a RLuc-Hotair-WT-vektor volt köszönhető, hogy közvetlen kölcsönhatás között a miRNS és annak feltételezett kötőhely, mi mutált a miR-331-3p kötőhely helyspecifikus mutagenezis, ami RLuc -HOTAIR-Mut. Amint várható volt, elnyomása luciferáz aktivitást teljes mértékben megszüntette ebben mutáns konstrukciót összehasonlítva a vad típusú vektor (5B ábra jobb panel).
Hotair és miR-331-3p egyaránt kötődnek AGO2 a gyomorrák sejtek
miRNS vannak ismert, hogy jelen legyen a citoplazmában formájában miRNS ribonukleoprotein komplexek (miRNPs), amely szintén tartalmaz Ago2, a központi eleme az RNS által indukált silencing komplex (RISC) [17, 18]. Annak tesztelésére, hogy Hotair társítja miRNPs, RNS-kötő fehérje immunprecipitáció (RIP) kísérleteket végeztünk BGC-823 sejtkivonatok elleni antitestek felhasználásával Ago2. RNS szintek immunoprecipitátumokban határoztuk meg QRT-PCR. Hotair volt preferenciálisan dúsított (354-szoros) Ago2-tartalmú miRNPs viszonyított kontroll immunglobulin G (IgG) immunoprecipitátumokban. Hasonlóképpen, miRNS-331-3p detektáltunk olyan szinten 840-szor nagyobb, mint a kontroll anti-IgG-vel. Sikeres immunológiai Ago2 kapcsolatos RNS-t igazolta qRT-PCR segítségével RIP primerek az emberi FOS szerepel a RIPAb + Ago2 kit (5D ábra, felső panel). Ezen túlmenően, az anti-SNRNP70 alkalmaztunk pozitív kontrollként az FI eljárás, és U1 snRNS is kimutatható volt olyan szinten 206-szor nagyobb, mint az anti-IgG-t (5D ábra, alsó panel). Így Hotair van jelen Ago2 tartalmú miRNPs, feltehetőleg társulás miRNS-331-3p, összhangban van a bioinformatikai analízis és luciferáz assay.
Hotair vezérli a miR-331-3p cél, HER2 katalógusa A sok célpontjai miR-331-3p, koncentráltunk HER2 hiszen kódol transzmembrán protein, amely lényeges funkciója a carcinogenezisben és ellenállás trastuzumab-alapú terápia [19]. A 3'-UTR HER2 fuzionáltuk a luciferáz kódoló régió (RLuc-HER2 3'-UTR) és plazmidokkal transzfektált kódoló miR-331-3p és egy üres plazmid vektor. RNO-miRNS-344 járt, mint negatív kontrollt. Luciferázvizsgálatban azt mutatta, hogy a miR-331-3p jelentősen gátolta a luciferázaktivitást (~ 41% -os gátlás) A RLuc-HER2 3'-UTR riporter, megerősítve, hogy a HER2 cél a miR-331-3p. A RLuc-HER2 3'-UTR-konstrukciót ezután együtt transzfektáltuk plazmidok kódoló miR-331-3p és Hotair (pCDNA /Hotair). A luciferáz assay jelezte, hogy a jelenlétében Hotair, RLuc-HER2 3'-UTR elnyomás helyreállították, mint a kontroll csoport (5C). Ez azt jelzi, hogy Hotair viselkedik, mint egy endogén "szivacs" kötődve miR-331-3p, megszüntetve ezáltal a miRNS-indukált represszáló tevékenység a HER2 3'-UTR.
Továbbá a hatása Hotair expresszió endogén HER2 fehérje kombinálva modulációja miRNS vagy lncRNA szinteket követjük nyomon a különböző megközelítések ábrán látható 5E: (1) a miR-331-3p overexpresszió ellen HER2 BGC-823 sejteket; (2) Hotair kiütése ellen HER2 BGC-823 sejteket; (3) Hotair túltermelése a HER2 SGC-7901 sejtek. Western blot analízis azt mutatta, hogy az erőltetett expressziója miR-331-3p vagy kiütése Hotair a BGC-823 sejtekben kiváltott jelentős hangtompító hatása az endogén HER2 fehérje expressziót. Továbbá, a HER2-protein expressziója láthatóan megnövekedett való transzfekció után Hotair az SGC-7901 sejteket, amely bemutatja a viszonylag alacsony endogén Hotair expressziós szintje.
Ezek az adatok azt jelzik, hogy a kötő miR-331-3p, Hotair működik, mint egy CERNA számára a cél a HER2-mRNS, ezáltal módosítsák a derepressziójához HER2 voltát, és további szintje poszt-transzkripciós szabályozás.
miR-331-3p és miR-124 elnyomja gyomorrák sejtek szaporodását katalógusa szolgál endogén mosogató megcélzott miRNS, a bőséges Hotair hasonlónak kell lennie, vagy annál nagyobb miR-331-3p /miR-124. Vizsgálatunkban qRT-PCR analízis azt mutatta, hogy a miR-331-3p /miR-124 expressziója fordítottan arányos Hotair kifejezést 20 pár előrehaladott gyomorrák (6A). Annak megerősítését, hogy a miR-331-3p és miR-124 is gátolja a gyomor rákos sejtek szaporodásának, kényszerítettük a kifejezést BGC-823 sejtekbe miRNS-t kódoló plazmidok. Az expressziós szintek miRNS-331-3p és miR-124 transzfektáljuk BGC-823 sejtek jelentősen növekedtek, 36-szeres és 29-szeres, illetve, míg a kontroll sejtek (6B). Ezután MTT és kolónia-képződés vizsgálatokat végeztünk annak meghatározására, a sejtek életképességét. Az eredmények a MTT assay és a növekedési görbék feltárta, hogy a transzfektált sejtek a miR-331-3p vagy miR-124 szignifikáns növekedés visszamaradása képest transzfektált sejtek üres vektorral (ábra a 6C). Ezek az adatok azt jelzik, hogy overexpressziója miR-331-3p vagy miR-124 expressziós letartóztathatjuk gyomorrák sejtek proliferációját, ami összhangban van az eredmények Hotair expresszió knockdown a BGC-823 sejtekben. 6. ábra Pozitív korrelációt Hotair és HER2 és relevanciáját a miR-331-3p /miR-124 expressziós szintje. (A) A kétváltozós korreláció elemzése közötti kapcsolat Hotair expresszió és miR-331-3p vagy miR-124 szint. (B) BGC-823 sejteket transzfektáltunk plazmidok kódoló miR-331-3p vagy miR-124, és QRT-PCR-t kimutatására használják a miRNS szinteket a kontrollokhoz képest (MIR-NC). (C) MTT assay és telepképző növekedési vizsgálat végeztünk annak meghatározására, elterjedése miR-331-3p vagy miR-124 transzfektált BGC-823 sejtekben. (D) Balra: immunfestésével HER2 fehérje előrehaladott gyomorrákban szövetminta. Felső: immunhisztokémia HER2 negatív volt a gyomorrák szövetekben viszonylag alacsony Hotair kifejezést. Alsó: immunfestésével HER2 pozitív volt a gyomorrák szövetekben viszonylag magas Hotair kifejezést. Jobbra: kétváltozós korreláció elemzése közötti kapcsolat Hotair és HER2 szinten. * P < 0,05, ** P < 0.01.
HER2 koexpresszáljon a Hotair gyomorrákban szövetekben
HER2-expressziót ráta a jelentések szerint 7-34% gyomorrákban, valamint társult agresszív betegség, és rosszabb túlélési gyomorrákban [19]. Azt észleltük, HER2-expressziót, 50 előrehaladott gyomorrák szövetekben (stádium III /IV) közül választott az előző 78 gyomorrák szövetek immunhisztokémiai (IHC) és QRT-PCR elemzést. Az eredmények az IHC festést mutatta, HER2 fehérje pozitivitást 56% a kiválasztott 50 gyomorrák szövetekben. Nyolcvanhatban százaléka ilyen HER2 pozitív minták voltak előrehaladott szakaszában III /IV daganatok, és 71% jelenik magas Hotair kifejezés (6D ábra és további fájl 2. táblázat S2). Kétváltozós korrelációs elemzés azt mutatta, hogy a HER2-expressziót szignifikáns korrelációt Hotair átirat szinten gyomorrákban szövetekben, összehasonlítva a hagyományos társaik (6D ábra). Ezek az adatok azt jelzik, hogy a kifejezés a HER2 pozitív társított serkentett Hotair gyomorkarcinómában szövetminták, ami arra utal, hogy jellemzése a HER2 /Hotair kölcsönhatás lehet biológiailag jelentős humán gyomor tumorigenezis.
Méltó, mert a folyamatos fázis III /IV vizsgálatban a HER2 túlzott expressziója arány kimutathatók a jelen vizsgálatban magasabb, mint a korábban bejelentett medián tartományban. Ez a megnövekedett aránya HER2-expressziót szorosan kapcsolódik a rossz kimenetelt a metasztatikus és kiváló minőségű lokalizált gyomorrák, ezzel kiemelve annak fontosságát, HER2 gyomorrákban fejlesztés, valamint az áttétek. Katalógusa Vita katalógusa LncRNAs, amelyek több mint 200 nukleotid hosszúságú, korlátozott fehérje-kódoló kapacitást, gyakran kifejezve egy betegségtől, szövet- vagy fejlődési stádium-specifikus módon, jelezve specifikus funkciók lncRNAs a fejlődésben és a betegségek, és így ezek a molekulák vonzó terápiás célpontokat [20-22]. Számos újabb tanulmány azt mutatta, hogy ezek zavara lncRNAs is befolyásolhatják a rendelet az eukarióta genom, és a sejtnövekedést előny, ami a progresszív és ellenőrizhetetlen a tumor növekedését [23-25]. Ezért lncRNAs nyújthat egy hiányzó darab az egyébként jól ismert onkogén és a tumorszuppresszor hálózat puzzle.
Ebben a vizsgálatban azt teszteltük expresszióját Hotair a gyomor karcinóma minták és a környező, nem tumoros szövetekben. Azt is azonosított funkciója Hotair a gyomor carcinoma sejtek alkalmazásával gain- és a veszteség-of-function megközelítések. Az eredmények azt mutatják, hogy a Hotair ben fokozódik a gyomor karcinómaszövetek képest szomszédos normál gyomor szövetek, valamint hogy Hotair upreguláció korrelál nagyobb a daganat mérete, a fejlett patológiai stádium és kiterjedt metasztázis. Továbbá, a teljes túlélési idő betegek alacsonyabb Hotair expressziós szintje jelentősen hosszabb volt, mint a betegek közepes vagy erős Hotair expressziós szintet. Továbbá Hotair overexpresszió elősegítette a proliferáció, migráció és invázió gyomor karcinóma sejtek, míg Hotair kimerülése gátolta sejtek invázióját és a sejtek életképességét, és indukált növekedési gátlás in vitro és in vivo. Emellett Hotair elnyomás vezetett előmozdítására gyomor sejt apoptózist. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy Hotair játszik közvetlen szerepet a moduláció több onkogén tulajdonságai, gyomorrák progresszió, serkenti az új kutatási irányok és terápiás lehetőségek figyelembe Hotair mint új prognosztikai és terápiás célpont gyomorrákban.
Fontossága lncRNAs a emberi betegséggel kapcsolatba hozható, hogy képesek hatással sejtfunkciók különböző mechanizmusok révén. Ebben a vizsgálatban, mint amennyire a mechanizmus a Hotair illeti, érdemes megemlíteni, hogy szubcelluláris lokalizációját elemzése Hotair RNS fluoreszcens in situ hibridizációs vizsgálat bizonyítja, a lokalizáció Hotair mind a sejtmagban és a citoplazmában. [24] Nyilvánvaló, hogy a nukleáris Hotair célozhat Polycomb elnyomó komplex 2, megváltoztatva H3K27 metiláció és génexpressziós mintázatok egész genom [10, 11]. Legutóbbi munkája jelentett állvány funkció Hotair citoplazmájában indukálja az ubiquitin-mediálta proteolízis [26]. Mindazonáltal a tumorképző tulajdonságait és mechanisztikus heterogenitása Hotair, és különösen a citoplazmatikus formában, még messze nem teljesen tisztázott.
Ihlette a "kompetitív endogén RNS szabályozási hálózat és a feltörekvő bizonyíték azt sugallja, hogy lncRNAs vehetnek részt ebben a szabályozó áramkört, azt feltételeztük, hogy Hotair is szolgálhat Cerna, így kerestük a lehetséges kölcsönhatások miRNS. * P < 0.05. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• Az életminőség, immunmodulátor és biztonságosságát adjuváns kezelés fagyöngy betegeknél gyomorrák - randomizált, kontrollált kísérleti tanulmány
• Le szabályozása Thrombospondin2 jósolja rossz prognózisú betegeknél gyomorrák