LNC RNR HOTAIR veikia kaip konkuruojančio endogeninio RNR reguliuoti HER2 raiška sponging MIR-331-3p skrandžio cancer

LNC RNR HOTAIR funkcijų konkuruojančio endogeninio RNR reguliuoti HER2 raiška sponging MIR-331-3p skrandžio vėžio
Anotacija
faktai
Kaupiamosios duomenys rodo, kad ilgai ne kodavimo RNR HOTAIR vaidina svarbų vaidmenį vėžio progresavimo ir metastazių. Tačiau bendras biologinis vaidmuo ir klinikinė reikšmė HOTAIR skrandžio kancerogenezėje lieka iš esmės nežinoma.
Metodai
HOTAIR išraiška buvo matuojamas 78 suporuotas vėžines ir noncancerous audinių mėginius realaus laiko PGR. Iš HOTAIR poveikis skrandžio vėžio ląstelių buvo tiriamas raiškos ir RNR trukdžių metodus in vitro ir in vivo. Įžvalgos konkurencingų endogeninių RNR (ceRNAs) mechanizmas buvo įgyta bioinformatikos analizė, liuciferazės tyrimų ir RNR privalomas baltymų Imunoprecipitacijos (RIP). Teigiamas HOTAIR /HER2 sąveika buvo nustatyti ir patikrinti imunohistocheminiu tyrimu ir bivariate koreliacinė analizė.
Rezultatai
HOTAIR ląstelę buvo susijęs su didesniu naviko dydžio, pažangių patologinės etape ir didelę metastazių, o taip pat koreliuoja su trumpesniu bendro išgyvenamumo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Be to, HOTAIR raiškos skatino dauginimosi, migracijos ir invazija skrandžio karcinoma ląstelių, o HOTAIR išeikvojimas slopino ir ląstelių invaziją ir ląstelių gyvybingumą ir sukėlė augimo sustojimas in vitro ir in vivo. Visų pirma, HOTAIR gali veikti kaip Juodos, efektyviai tampa kriauklė Mir-331-3p, taip moduliuoja HER2 derepression ir nustatant papildomą lygį po transkripcijos reguliavimo. Galiausiai, teigiama HOTAIR /HER2 koreliacija reikšmingai susijęs su išplitusiu skrandžio vėžiu.
Išvadas
HOTAIR raiška sudaro prastos prognozės skrandžio vėžio biologinis, ir gali suteikti piktybinis fenotipo į auglio ląsteles. Cerna reguliavimo tinklas, apimantis HOTAIR ir teigiamą sąveiką tarp HOTAIR ir HER2 gali prisidėti prie geresnio supratimo skrandžio vėžio patogenezės ir palengvinti plėtrą lncRNA nukreiptas diagnostika ir terapija nuo šios ligos.
Raktiniai žodžiai
konkuravimas endogeninė RNR HER2 HOTAIR Skrandžio vėžio išplitimas ir invazija faktai
Skrandžio vėžys yra antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio sukeltas mirties, ir yra labiausiai paplitusi iš virškinimo trakto piktybinių navikų Rytų Azijoje, Rytų Europoje ir dalys Centrinėje ir Pietų Amerikoje. Daugumai pacientų, skrandžio vėžys diagnozuojamas vėlyvos stadijos ir lydi piktybinės platinimu, platus invazija ir limfinės metastazių. Sėkmingi gydymo strategijas, yra riboti ir mirtingumas yra didelis [1, 2]. Ilgi kodavimo RNR (lncRNAs) neseniai įgijo didelį dėmesį apibrėžiant sudėtingus mechanizmus, sukeliančius piktybiniai procesai, tokie kaip Kancerogeninis ir metastazių ir atsparumas vaistams. Taigi, jei norime, kad visiškai suprastų skrandžio Kancerogeninis ir turime apsvarstyti šį reguliavimo nuorašai, kad pridėti naują sluoksnį sudėtingumo naviko biologijos šeimą.
Nors tik nedaugelis funkcinių lncRNAs buvo gerai charakterizuojamas iki šiol, jie buvo įrodyta, kad reguliuoti genų ekspresiją įvairiais lygiais, įskaitant chromatino modifikacijos, transkripcijos ir po transkripcijos perdirbimo [3, 4]. Neseniai naują reguliavimo mechanizmas buvo nustatytas kuriame Šķērsruna tarp lncRNAs ir mRNR atsiranda konkuruojančių dėl bendrų mikro RNR (miRNAs) Reakcijos elementais. Šiuo atveju lncRNAs gali veikti kaip konkuruojantys endogeninių RNR (ceRNAs) kempinė miRNAs, taip moduliuoti Mirna tikslų derepression ir nustatant papildomą lygį po transkripcijos reguliavimo [5]. Ir ankstesnėse ataskaitose, raumenų konkrečių lncRNA, LINC-MD1, buvo pranešta, kad būti Juodos, kuri apsaugo MyoD Messenger RNR (iRNR) nuo Mirna sąlygojamą degradacijos [6]. Pluripotency susijęs LNC-RoR gali veikti kaip pagrindinė ČERNÁ susieti miRNAs ir pagrindinius transkripcijos veiksnių, pavyzdžiui, tinklą, Oct4, Sox2 ir nanog, žmogaus embrionines kamienines ląsteles. Pažymėtina, lncRNA HULC labai aktyvinama kepenų vėžio ir vaidina svarbų vaidmenį Tumorigenesis [7]. Visų pirma, HULC gali veikti kaip endogeninio "kempine", kad žemyn reguliuoja daug miRNAs veiklą serija, įskaitant miR-372 [8]. Todėl mes siūlome, kad kai kurie lncRNAs taip pat gali turėti vaidmenis, kaip ceRNAs susiejimas miRNAs ir po transkripcijos tinklą skrandžio patogenezėje.
HOTAIR (Hox stenograma Priešprasminis intergenic RNR
) yra ~ 2,2 kb ilgio ne kodavimo RNR transkripcija iš HOXC
lokuso, kuris gali nuslopinti rašybą trans
iš HOXD
į apyvarpės fibroblastų [9]. Kaip naują molekulės naviko biologijos srityje, HOTAIR pradžių tapo gerai žinomas dėl savo dalyvavimo pirminis krūties navikų ir metastazių krūties vėžio, kuriame iškilimas HOTAIR skatinamas invazinis ir metastazes [10]. Be to, HOTAIR išraiška teigiamai koreliuoja su piktybinių procesų ir prastos baigtimi storosios žarnos vėžio, kepenų ląstelių karcinoma, Kasos vėžio ir virškinamojo trakto stromos navikų [11-14]. Naujausi tyrimai pranešė, kad HOTAIR buvo aktyvinama skrandžio vėžio [15, 16]. Nepaisant to, bendras biologinis vaidmuo ir pagrindinės molekulinės mechanizmas HOTAIR skrandžio kancerogenezėje esmės išlieka neapibrėžta.
Šiame tyrime mes pranešti, kad HOTAIR ląstelę yra būdingas molekulinės pokytis skrandžio vėžio ir ištirti biologinių vaidmenis HOTAIR apie fenotipų skrandžio vėžio ląstelės in vitro ir in vivo. Be to, mechaninė analizė rodo, kad HOTAIR gali funkcionuoti kaip ČERNÁ reguliuoti žmogaus epitelio augimo faktoriaus receptoriaus 2 (HER2) ekspresija, išraiška per konkurencijos Mir-331-3p, todėl vaidina onkogeninio vaidmenį skrandžio patogenezėje. Šis darbas suteikia pirmą įrodymų teigiamą HOTAIR /HER2 koreliacija ir tarp miR-331-3p, HOTAIR ir HER2 Šķērsruna, barsto naują šviesą skrandžio vėžiui gydyti.
Rezultatai
HOTAIR išraiška yra aktyvinama į žmogaus skrandžio vėžio audiniuose
iš HOTAIR išraiškos lygis buvo nustatytas 78 suporuotų skrandžio vėžio mėginiai ir gretimų, histologiškai normaliomis audiniuose KRL-PGR ir normalizuotas GAPDH. HOTAIR išraiška buvo žymiai aktyvinama visų vėžinių audinių (vidutinis santykis 14.35 kartus, P < 0,01), palyginti su normaliomis kolegomis (1a pav.) Nagrinėjimas tarp HOTAIR saviraiškos ir klinikinių patologinių funkcijų koreliacijos parodė, kad HOTAIR ląstelę koreliavo su didesniu naviko dydžio, pažangių patologinės etape, tolimos metastazės (1B ir C pav), limfmazgių metastazių ir vėžinių ląstelių diferenciacijos (1 lentelė). Tačiau HOTAIR išraiška nebuvo susijęs su naviko būklei ar pacientų lytį (1 lentelė). Kalbant apie bendrą išgyvenamumą, pacientai, sergantys didelio HOTAIR išraiška turėjo žymiai prasčiau prognozę nei tie, su mažu HOTAIR išraiškos (P < 0,001 log-rank testą; 1D pav). Šie rezultatai leidžia manyti, kad HOTAIR raiška gali būti naudinga naujų prognozinių ar progresuoja žymekliai plėtros skrandžio vėžio. 1 pav Santykinis HOTAIR išraišką skrandžio vėžio audiniuose ir jos klinikinės reikšmės. (A) Santykinis išraiška HOTAIR skrandžio vėžio audinių (n = 78), lyginant su atitinkamų ir ne auglio normaliuose audiniuose (n = 78). HOTAIR išraiška išnagrinėjo KRL-PGR ir normalizuotas GAPDH išraiška. Duomenys pateikiami kaip atlenkiamas pokyčių navikų audiniuose, palyginti su sveikų audinių. (B), nagrinėjimas tarp HOTAIR saviraiškos ir klinikinių patologinių funkcijų koreliacijos parodė, kad HOTAIR ląstelę koreliuojantį su didesniu naviko dydžio ir pažangios patologinės etape. (C) HOTAIR išraiška buvo reikšmingai didesnis pacientams, sergantiems toli metastazių nei tie, su ne tolimoje metastazių. (D) Kaplan-Meier bendrasis išgyvenimas kreivės pagal HOTAIR ekspresijos lygį. Bendras išgyvenamumas Aukšto HOTAIR grupėje (n = 39: HOTAIR išraiška rodiklis ≥ mediana santykis) buvo reikšmingai didesnis nei mažai HOTAIR grupėje (n = 39; HOTAIR išraiška santykis ≤ mediana santykis; P <0,001, logoritminis rank testas). * P < 0,05, ** p < 0,01.
1 lentelė Koreliacija iš HOTAIR išraiškos su clinicopathologic funkcijų
Clinicopathologic funkcijų
N (%)
Santykinis išraiška HOTAIRa
P-VALUE mlrd
Lytis
p = 0,62
Vyras
50 (64)
12.21 (0,97-17,53)
Moteris
28 (36)
15.01 (7.34 -19,52) Svetainės naviko
P = 0,910
Distalinė trečioji
18 (23)
9.1 (1,37-14,12)
viduriniame trečdalyje
20 (26)
7,96 (2,55-9,72)
proksimalinės skrandžio
40 (51)
7.76 (1.24-13.58)
diferenciacija pervežimas p = 0,045
Prastas
56 (72)
15,6 (6,25-20,36) Viesbutis High /vidutinio
22 (28)
8,1 (0,98-11,14)
Limfmazgių Metastazė
p = 0,005
N0
10
(13) 1,14 (0.75-1.42)
N1
11 (14)
3,44 (1,15-4,85)
N2
29 (37)
11.99 (7.15- 14.77)
N3
28 (36)
32.58 (7,34-36,27)
metastazavusio
p = 0,029
M0
64 (82)
9.35 (2.53 -33,64)
M1
14 pav
28.82 (16.39-39.39)
aMedian santykinio išraiška, su 25-75 procentilių skliaustuose. BP < 0,05 buvo laikomas reikšmingas (Mann-Whitney U testas
tarp 2 grupių ir Kruskall-Wallis testas 3 grupes) manipuliavimas HOTAIR lygių skrandžio vėžio ląstelių
Mes šalia atliekamų KRL-PGR analizė išnagrinėti.
ekspresijos lygis HOTAIR įvairių vėžio ląstelių linijas, įskaitant skrandžio, nesmulkiųjų ląstelių plaučių vėžio (NSLPV) ir krūties vėžio kilmės ląstelės. Kaip parodyta 2A pav, tiriami keturi skrandžio vėžio ląstelių linijas (MSV-803, SGC-7901, BGC-823, ir "AGS), BGC-823 išreiškė didesnį HOTAIR (3,18 karto) nei įprasta skrandžio epitelio ląstelių linija (GES-1). Panašiai NSLPV ląstelių linija, SPC-A1, parodė 3,73 kartus ląstelę HOTAIR per įprastą žmogaus bronchų epitelio ląstelių linija, 16HBE. Labai metastazavusiu krūties vėžiu ląstelių linija MDA-MB-231 parodė 4,77 kartus ląstelę HOTAIR palyginti su MCF-7 (2a pav.) Mūsų duomenys rodo, kad HOTAIR gali būti dažnai aktyvinama daugelyje vėžinių ląstelių. 2 paveiksle HOTAIR raiškos skrandžio vėžio ląsteles ir jos poveikį ląstelių proliferacijos in vitro lygis. (A), rezultatai KRL-PGR įrodantys HOTAIR raiškos lygius skrandžio vėžio ląstelių linijų (MSV-803, SGC-7901, bgc-823, ir AGS), palyginti su normaliomis skrandžio epitelio ląstelių linija (GES-1), NSLPV ląstelių linijos ( SAK-A1), lyginant su įprasto žmogaus bronchų epitelio ląstelių linijos (16HBE), ir krūties vėžio ląstelių linijų MDA-MB-231, palyginti su MCF-7. (B), KRL-PGR analizė HOTAIR išraiška lygio po gydymo BGC-823 ląstelių su siRNAs skirtomis HOTAIR ir gydymo SGC-7901 ląsteles pcDNR /HOTAIR vektorių. (C) MTT buvo atliekama siekiant nustatyti SI-HOTAIR-transfekuotų BGC-823 ląstelių arba pcDNR /HOTAIR-transfekuotų SGC-7901 ląstelių proliferaciją. Duomenų atstovauti vidurkis ± Š.D. iš trijų nepriklausomų eksperimentų. (D) koloniją sudarantis augimas tyrimas buvo atliktas siekiant nustatyti SI-HOTAIR proliferaciją transfekuota BGC-823 ląstelių. Kolonijos buvo skaičiuojami ir užfiksuoti. * P < 0,05 ir ** P < 0,01.
Manipuliuoti HOTAIR lygių skrandžio vėžio ląsteles, pcDNR /HOTAIR vektorius buvo pernešta į SGC-7901 ląstelių ir SI-HOTAIR buvo pernešta į BGC-823 ląstelių, atitinkamai. KRL-PGR analizė HOTAIR lygiais buvo atlikta 48 h po transfekciją ir parodė, kad HOTAIR išraiška buvo padidintas 98 kartų į SGC-7901 ląstelių, lyginant su kontrolinės ląstelių. Tačiau BGC-823 ląstelių, HOTAIR išraiška efektyviai buvo 75% partrenkė SI-HOTAIR2, efektyviausias siRNA vėliau naudojamas šiuose eksperimentuose (2b pav.)
Poveikis HOTAIR ant ląstelių proliferaciją ir apoptozė in vitro
reikšmingas padidėjimas HOTAIR raiškos skrandžio vėžio mėginių paskatino mus ištirti galimą biologinę reikšmę HOTAIR į Tumorigenesis. MTT atskleidė, kad ląstelių augimas buvo žymiai sutrikęs BGC-823 ląstelių transfektuotose SI-HOTAIR, o masinio SGC-7901 ląstelių buvo padidintas pcDNR /HOTAIR perkeltų ląstelių, lyginant su atitinkamomis kontrolės (2c pav.) Panašiai kolonija formavimosi tyrimo rezultatas rodo, kad clonogenic išgyvenamumas sumažėjo po slopinimu HOTAIR į bgc-823 ląstelių (2d pav.)
Norėdami nustatyti, ar apoptozė buvo veiksnys ląstelių augimo slopinimą, mes atliekame Hoechst dažymo ir srauto citometrijos analizė SI-HOTAIR gydytų BGC-823 ląstelių. Duomenys parodė, kad ląstelių glausta ir fragmentišką branduolių nurodantys anksti apoptozinių ląstelių frakcija skaičius buvo žymiai didesnis SI-HOTAIR gydytų BGC-823 ląstelių, lyginant su SI-NC-paveiktų ląstelių (3a ir B pav.) Be to, mes nustatėme, kad slopinimas HOTAIR sustiprintas kaspaze 3 priklausoma apoptozę, parodė Vakarų dėmė analizė aktyvintos kaspaze 3 po SI-HOTAIR transfekciją (Papildoma failų 1: S1 paveiksle). Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad triuškinantis iš HOTAIR slopina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir indukuoja apoptozę in vitro. 3 paveikslas iš HOTAIR poveikis skrandžio vėžio ląstelių apoptozę, migracijos ir invazijos in vitro. BGC-823 ląstelės buvo pernešta su SI-HOTAIR ar SI-NC, ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelės buvo pernešta su pcDNR /HOTAIR vektoriumi ar tuščią vektoriaus kontrolė. (A), Hoechst dažymo tyrimas ląstelių apoptozės; buvo nustatyta Hoechst-teigiamų branduolių per optinį srityje (ne mažiau kaip 50 laukų) procentas. (B) apoptoziniu normos ląstelių buvo aptikta tėkmės citometrijos metodą. UL nekroziniai ląstelės; UR, terminalų Apoptozinės ląstelės; LR, anksti Apoptozinės ląstelės. (C ir D) Transwell tyrimai buvo atliekami siekiant ištirti pokyčius ląstelių migracijos ir invazijos. * P < 0,05 ir ** P < 0,01.
HOTAIR skatina migraciją ir invazija skrandžio vėžio ląsteles in vitro pervežimas Mobilusis invazijos yra svarbus aspektas, dėl vėžio progresavimą, kuris apima vėžinių ląstelių migraciją į gretimuose audiniuose bei tarpląstelinio matrikso baltymų ištirptų. Čia mes įvertino vėžio ląstelių invaziją per transwell tyrimus. Kaip parodyta Fig.3C, kad HOTAIR siRNA transfekcija trukdoma migruojančioms gebėjimą BGC-823 ląsteles maždaug 66%. Atitinkamą poveikį invazijos taip pat buvo pastebėta, kad lygiagrečiai invazijos tyrimu. Priešingai, transfekavimas SGC-7901 ląstelių su pcDNR /HOTAIR vektoriaus skatinamas ląstelių migraciją ir invaziškumo ~ 1,9 kartus (3D pav.) Šie duomenys rodo, kad HOTAIR turi onkogeninių savybių, kurios gali skatinti migracijos ir invazinę fenotipas skrandžio vėžio ląsteles.
HOTAIR skatina tumorigenezei skrandžio vėžio ląstelėse in vivo
ištirti, ar HOTAIR išraiškos lygis turi įtakos tumorigenezei, BGC-823 ląstelės, transdukuoti SH-HOTAIR /pENTR vektoriaus (EV) buvo naudojamas nuogas pelių svetimo transplantanto modelį. Iki 16 dienų po triuškinantis iš HOTAIR, buvo dramatiška sumažėjimas naviko apimtį ir svorį SH-HOTAIR grupėje, palyginti su kontroline grupe (pav 4A, B ir C). Kitą, imunodažymu analizė proliferacija žymeklio PCNA buvo atliktas rezekcijos navikų audiniuose. Lyginant su kad auglių susidaro iš kontrolinių ląstelių, SH-HOTAIR-gautos navikai parodė žymiai sumažino PCNA pozityvumo (4d pav.) Šie rezultatai rodo, kad HOTAIR raiškos lygis yra reikšmingai susijęs su in vivo proliferacijos talpa skrandžio vėžio ląsteles. 4 pav poveikis HOTAIR triuškinantis naviko augimą in vivo. (A) Naviko augimo kreivės buvo matuojamas po injekcijos BGC-823 ląstelių transfektuotose SH-HOTAIR ar pENTR vektorių. Naviko tūris buvo skaičiuojamas kas 3 dienas. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± Š.D. (N = 5). (B) auglys svoris. Vertybės yra priemonė naviko masė ± Š.D. (C) KRL-PGR analizė HOTAIR išraiškos audiniuose rezekcijos navikų. (D) Navikai sukurtos iš BGC-823 /SH-HOTAIR ląstelių parodė mažesnį PCNA baltymų nei išsivysčiusiose iš BGC-823 /pENTR vektoriaus ląstelių navikų. Viršutinė: H & El dažymo; Žemutinė: imunodažymu. * P < 0,05 ir ** P < 0,01.
HOTAIR yra miR-331-3P ir mir-124
Bioinformatikos analizės Mirna pripažinimo sekas HOTAIR tikslas atskleidė 11 naviko slopinančio miRNAs jungimosi vietų buvimą. HOTAIR kDNR buvo klonuotas pasroviui liuciferazės geno ir pavadino RLuc-HOTAIR (5a pav), tada transfekuotos kartu su įvairiais Mirna kodavimo plazmidės. RNO-Pasaulis-344 veikė kaip neigiamos kontrolės. Rezultatai parodė, kad liuciferazės veikla buvo sumažintas 48% ir 31%, lyginant su tuščiu vektoriaus valdymo, kai miR-331-3p ir miR-124 buvo išreiškiamas atitinkamai. Šie duomenys rodo, kad tiek Pasaulis-331-3p ir Pasaulis-124 gali tiesiogiai jungiasi prie HOTAIR per atitinkamas Mirna pripažinimo vietų (5B pav kairiajame skydelyje). 5 pav HOTAIR yra miR-331-3P ar miR-124 tikslas ir kontroliuoja Pasaulis-331-3p tikslą. (A) 11 spėjamas Mirna įrišimo svetainių HOTAIR seka. HOTAIR kDNR, kuriame yra spėjamas miRNAs pripažinimo svetainių buvo klonuotas pasroviui liuciferazės geno ir pavadino RLuc-HOTAIR. (B) kairėje: liuciferazė reporteris plazmidės (RLuc-HOTAIR) buvo bendrai perkeltų į HEK-293 T ląstelių su 11 įvairių Mirna kodavimo plazmidės. Teisus: liuciferazė reporteris plazmidės sudėtyje yra laukinio tipo arba mutantas HOTAIR buvo bendrai perkeltų į HEK-293 T ląstelių su miR-331-3p lygiagrečiai su tuščiu plazmidžių vektoriaus. Liuciferazė veikla buvo nustatoma naudojant dvigubą liuciferazės testą ir parodė, kaip santykinę liuciferazės veiklos normalizuotas iki renilla veikla. Histograma rodo liuciferazės vertės matuojamas 48 h po transfekciją. (C) 3'-UTR HER2 raišką buvo sulietas su liuciferazės koduojančios regiono (RLuc-HER2 3'-UTR) ir transfekuota į HEK293T ląstelių su miR-331-3p patvirtinti HER2 yra miR-331-3p taikinys. RLuc-HER2 3'-UTR ir Pasaulis-331-3p konstruktai buvo bendrai perkeltų į HEK293T ląstelių su plazmidžių išreiškė HOTAIR (pcDNR /HOTAIR) arba valdymo vektorių, kad patikrintų ČERNÁ aktyvumą HOTAIR. RNO-mirna-344 buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Histograma rodo liuciferazės vertės matuojamas 48 h po transfekciją. (D), RIP su pelių monokloninius kovos su Ago2, preimmune IgG arba 10% indėlio bgc 823-ląstelių ekstraktų. RNR koncentracija immunoprecipitates lėmė KRL-PGR. Top: lygiai HOTAIR, miRNA331-3P ir FOS RNR buvo pateikiami kaip kartų praturtinti Ago2 palyginti su IgG immunoprecipitates. Apačia: santykiniai RNR lygis U1 snRNA į SNRNP70 palyginti su IgG immunoprecipitates. Skaičiai vidurkis ± Šis miglotas terminas (N = 3). (R) Vakarų dėmė analizė HER2 baltymo lygį po gydymo BGC-823 ląstelių su SI-HOTAIR ar pcDNR /HOTAIR ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių su pcDNR /HOTAIR. GAPDH buvo naudojamas kaip kontrolės. * P < 0,05, ** p < 0,01 ir Nauja serija nėra reikšminga.
čia, mes pasirinkome MIR-331-3p kaip modelis Mirna tolesnėms studijoms. Siekiant dar labiau patvirtina, kad liuciferazės veiklos iš RLuc-HOTAIR-WT vektoriaus sumažėjo dėl tiesioginės sąveikos tarp Mirna ir jo spėjamą privalomą svetainėje, mes mutavo Mir-331-3p privalomąją svetainėje sait-mutagenezes, todėl RLuc -HOTAIR-Mut. Kaip ir tikėtasi, slopinimas liuciferazės veiklos buvo visiškai panaikinta šio mutanto konstruktą, lyginant su laukinio tipo vektoriaus (5b pav dešinę skydelyje).
HOTAIR ir mir-331-3p BIND su AGO2 skrandžio vėžio ląstelių
miRNAs yra žinoma, esančių atsižvelgiant į Mirna ribonucleoprotein infrastruktūromis (miRNPs) forma citoplazmoje, kad taip pat yra Ago2, pagrindinė sudedamoji dalis RNR sukeltas slopinimo kompleksas (RISC) [17, 18]. Norėdami patikrinti, ar HOTAIR asocijuojasi su miRNPs, RNR surišančio baltymo imunoprecipitacijos (RIP) eksperimentai buvo atliekami BGC-823 ląstelių ekstraktų, naudojant antikūnus prieš Ago2. RNR koncentracija immunoprecipitates lėmė KRL-PGR. HOTAIR buvo pirmenybė praturtino (354 kartų) į Ago2 turinčių miRNPs santykinius kontroliuoti imunoglobulino G (IgG) immunoprecipitates. Panašiai Mirna-331-3p buvo aptikta tokiame lygyje 840 kartų didesnė nei kontrolė Anti-IgG. Sėkmingas imunoprecipitacijos iš Ago2 sukelto RNR buvo patikrintas KRL-PGR, naudojant RIP pradmenis prieš žmogaus FOS įtraukti į RIPAb + Ago2 komplektas (pav 5D, viršutiniame tinklinio audeklo gabale). Be to, anti-SNRNP70 buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė RIP procedūrą, ir U1 snRNA taip pat buvo aptikta iki tokio lygio, 206 kartų didesnė negu kad anti-IgG (5D pav, karteczka). Taigi, HOTAIR būna Ago2 turinčiais miRNPs, tikėtina, per kartu su Mirna-331-3p, nuosekliai su mūsų bioinformatikos analizės ir liuciferazės tyrimus.
HOTAIR kontroliuoja Mir-331-3p tikslą, HER2
Tarp daugelio tikslai PPN-331-3p, mes sutelktas į HER2 nes koduoja transmembraninę baltymų su atitinkama funkcija kancerogenezėje ir atsparumą trastuzumabo pagrindu terapija [19]. 3'-UTR HER2 raišką buvo sulietas su liuciferazės koduojančios regiono (RLuc-HER2 3'-UTR) ir transfekuota su plazmidžių, koduojančių miR-331-3p ir tuščią plazmidės vektorių. RNO-Mirna-344 veikė kaip neigiamos kontrolės. Liuciferazės tyrimas parodė, kad Pasaulis-331-3p smarkiai slopino liuciferazės veikla (~ 41% slopinimas), kad RLuc-HER2 3'-UTR reporteris, patvirtinantis, kad HER2 yra miR-331-3p taikiniu. RLuc-HER2 3'-UTR konstruktas vėliau buvo pernešta kartu su plazmidės kodavimo Pasaulis-331-3p ir HOTAIR (pcDNR /HOTAIR). Liuciferazės tyrimai parodė, kad, atsižvelgiant į HOTAIR akivaizdoje, RLuc-HER2 3'-UTR represijos buvo atkurta palyginti su kontroline grupe (5c pav.) Tai rodo, kad HOTAIR veikia kaip endogeninis "kempine", prisijungdamas MIR-331-3p, taip panaikindamos Mirna sukeltos represuoti veiklą HER2 3'-UTR.
Be to, HOTAIR raiškos poveikį endogeninio HER2 baltymo kartu su moduliavimo Mirna arba lncRNA lygiais buvo stebimas skirtingų požiūrių rodomų 5E pav: (1) Pasaulis-331-3p raiška prieš HER2 į bgc-823 ląstelių; (2) HOTAIR nokdaunas prieš HER2 į bgc-823 ląstelių; (3) HOTAIR raiška už HER2 į SGC-7901 ląstelių. Vakarų dėmė analizė parodė, kad priverstinio išraiška miR-331-3p ar triuškinantis iš HOTAIR į BGC-823 ląstelių sukėlė didelį triukšmo slopinimo poveikį endogeninio HER2 baltymo ekspresiją. Be to, HER2 baltymo ekspresija buvo ženkliai aktyvinama po transfekciją su HOTAIR į SGC-7901 ląstelių, o tai rodo santykinai mažą endogeninio HOTAIR išraiška lygį.
Kartu šie duomenys rodo, kad privalomas MIR-331-3p, HOTAIR veikia kaip ČERNÁ už tikslinė HER2 iRNR, taip moduliuoja HER2 derepression ir nustatant papildomą lygį po transkripcijos reguliavimo.
MIR-331-3p ir Pasaulis-124 slopinti skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją
tarnauti kaip endogeninio kriaukle tikslinių miRNAs, kad HOTAIR gausa turėtų būti panašus arba didesnis nei miR-331-3p /miR-124. Mūsų tyrimo duomenimis, KRL-PGR analizė parodė, kad Pasaulis-331-3p /Pasaulis-124 išraiška buvo atvirkščiai koreliuoja su HOTAIR raiškos 20 porų išplitusiu skrandžio vėžiu (6a pav.) Norėdami patvirtinti, ar Pasaulis-331-3p ir Pasaulis-124 taip pat gali slopinti skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, mes priversti savo išraišką BGC-823 ląstelių naudojant Mirna kodavimas plazmidžių. Sąvoka lygiai Mirna-331-3p ir miR-124 Transfekuoti į bgc-823 ląstelių buvo žymiai padidėjo 36 kartų ir 29 kartų, atitinkamai, lyginant su kontrolinės ląstelių (6b pav.) buvo atlikta to, MTT ir kolonijų formavimosi tyrimai, siekiant nustatyti ląstelių gyvybingumą. Iš MTT ir augimo kreivių rezultatai atskleidė, kad ląstelės transfektuotose miR-331-3p ar miR-124 parodė didelį augimo atsilikimas, palyginti su ląstelėmis perkeltų su tuščiu vektoriaus (6c pav.) Šie duomenys rodo, kad padidėjusi miR-331-3p arba Pasaulis-124 išraiškos gali suimti skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, kuris yra suderinamas su HOTAIR išraiškos triuškinantis į BGC-823 ląstelių rezultatus. 6 pav teigiama koreliacija tarp HOTAIR ir HER2 raiška ir EEE PPN-331-3p /Pasaulis-124 raiškos lygį. (A), bivariate koreliacinė analizė tarp HOTAIR saviraiškos ir miR-331-3p, arba Pasaulis-124 lygio santykius. (B) BGC-823 ląstelės buvo pernešta su plazmidžių, koduojančių Pasaulis-331-3p arba MIR-124, ir KRL-PGR buvo naudojamas aptikti Mirna lygį, palyginti su kontroline grupe (MIR-NC). (C) MTT ir kolonijas sudarančių augimas tyrimas buvo atliktas siekiant nustatyti miR-331-3p arba miR-124 transfekuotų BGC-823 ląstelių proliferaciją. (D), Kairėje: imunodažymu HER2 baltymo išplitusiu skrandžio vėžiu audinių pavyzdžius. Viršutinė: imunodažymu apie HER2 buvo neigiamas skrandžio vėžio audiniuose su santykinai žemos HOTAIR išraiška. Žemutinė: imunodažymu apie HER2 buvo teigiamas skrandžio vėžio audiniuose su santykinai dideliu HOTAIR išraiška. Teisė: bivariate koreliacinė analizė tarp HOTAIR ir HER2 raiškos lygio santykius. * P < 0,05, ** p < 0,01.
HER2 yra persipynusių su HOTAIR skrandžio vėžio audiniuose
HER2 raiškos lygis buvo pranešta, kad 7-34% skrandžio vėžio, ir buvo susijęs su agresyvesniu ligos ir prastesne išlikimo skrandžio vėžio [19]. Mes nustatėme, išraiška HER2 50 išplitusiu skrandžio vėžiu, audinius (III etapas /IV), parinktų iš ankstesnių 78 skrandžio vėžiu audinių imunohistocheminiu (IHC) ir KRL-PGR analizei. Į IHC dažymo rezultatai parodė, HER2 baltymo teigiamas, 56% pasirinktų 50 skrandžio vėžiu audiniuose. Aštuoniasdešimt šeši procentai šių HER2 teigiami mėginiai buvo iš pažengęs III /IV navikai, ir 71% rodomas aukštą HOTAIR išraišką (6d paveiksle ir papildomų failų 2: Lentelė s2). Bivariate koreliacinė analizė parodė, kad išraiška HER2 reikšmingai koreliavo su HOTAIR stenograma lygio skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su normaliomis kolegomis (6d pav). Šie duomenys rodo, kad HER2 ekspresija yra teigiamai susijęs su aktyvinama HOTAIR skrandžio vėžio audinių pavyzdžių, tai rodo, kad HER2 /HOTAIR sąveikos apibūdinimas gali būti biologiškai reikšmingas žmogaus skrandžio Tumorigenesis.
Pažymėtina, nes nuolat III fazės /IV bandymus, HER2 raiškos lygis aptikta šiame tyrime yra didesnis nei anksčiau pranešė vidurinės diapazone. Tai padidino norma HER2 raiškos yra glaudžiai susijęs su prastos rezultatus pacientams, sergantiems metastazavusiu ir aukštos kokybės lokalizuota skrandžio vėžio, taip pabrėžiant HER2 svarbą skrandžio vėžio vystymosi ir metastazių.
Diskusija pervežimas LncRNAs, kurie yra daugiau nei 200 nukleotidų ilgio riboto baltymų kodavimo pajėgumu, dažnai išreiškiamas disease-, audinių ar raidos etape konkrečiai būdu, nurodant konkrečias funkcijas lncRNAs kuriant ir ligų, ir todėl šių molekulių patrauklias terapinių tikslų [20-22]. A pastaraisiais kortelių skaičius parodė, kad disreguliacija iš šių lncRNAs taip pat gali turėti įtakos eukariotinio genomo reguliavimą ir pateikti ląstelių augimą pranašumą, todėl laipsniškai ir nekontroliuojamo naviko augimui [23-25]. Todėl lncRNAs gali pateikti trūkstamą gabalas kitaip žinomo onkogeninių ir naviko slopintuvas tinklo galvosūkį.
Šiame tyrime mes išbandė HOTAIR išraišką skrandžio karcinoma pavyzdžių ir juos supančiais ne tumoro audiniuose. Mes taip pat nustatė, kad HOTAIR funkciją skrandžio karcinoma ląstelių taikant gain- ir netekus funkcijos metodai. Rezultatai parodė, kad HOTAIR buvo aktyvinama skrandžio karcinoma audinių, palyginti su gretimų normaliomis skrandžio audinių, o HOTAIR ląstelę koreliuoja su didesniu naviko dydžio, pažangių patologinės etape ir didelę metastazių. Be to, bendro išgyvenamumo laikas pacientams, sergantiems apatinių HOTAIR ekspresijos lygį buvo reikšmingai ilgesnis negu pacientams, sergantiems vidutinio sunkumo arba stiprių HOTAIR ekspresijos lygį. Be to, HOTAIR raiškos skatino dauginimosi, migracijos ir invazija skrandžio karcinoma ląstelių, o HOTAIR išeikvojimas slopino ląstelių invaziją ir ląstelių gyvybingumą ir sukėlė augimo sustojimas tiek in vitro ir in vivo. Be to, HOTAIR slopinimas sukėlė skrandžio ląstelių apoptozės skatinimo. Šie rezultatai rodo, kad HOTAIR vaidina tiesioginį vaidmenį keliais onkogeniniam savybių ir skrandžio vėžio progresavimo moduliavimo, skatinti naujų mokslinių tyrimų kryptis ir gydymo galimybes svarsto HOTAIR kaip naują prognostinį persekiotoją ir terapinio tikslo skrandžio vėžio.
Į lncRNAs svarbą žmogaus liga gali būti susijęs su jų gebėjimą daryti poveikį korinio ryšio funkcijas taikant įvairius mechanizmus. Šiame tyrime, kiek tai susiję su HOTAIR mechanizmas, verta paminėti, kad pavienių ląstelių tyri- mas lokalizacijos analizė HOTAIR pagal RNR chromosomų dažymas tyrimu įrodo, kad HOTAIR lokalizacija tiek branduolio ir citoplazmos [24]. Akivaizdu, kad branduolinė HOTAIR gali nukreipti polycomb represinį kompleksas 2, keičiant H3K27 metilinimas ir genų ekspresijos modelius visoje genomo [10, 11]. Naujausi darbai pranešė pastolių funkciją HOTAIR citoplazmoje kaip iš ubikvitino tarpininkaujant proteolizė [26] induktorių. Nepaisant to, tumorogeniškas savybės ir mechaninė heterogeniškumas HOTAIR, o ypač tos, kurios citoplazmos forma, yra toli gražu visiškai išaiškinta.
Įkvėptas konkurencinio endogeninio RNR "reguliavimo tinklą ir naujus įrodymus, kuriais teigiama, kad lncRNAs gali dalyvauti šioje reguliavimo schema, mes iškėlė hipotezę, kad HOTAIR taip pat gali tarnauti kaip Juodos ir todėl mes ieškoma galimą sąveiką su miRNAs. GAPDH buvo naudojamas kaip kontrolės. 0,05. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Gyvenimo kokybę, imunomoduliacijai ir saugos pagalbinį amalas pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu - atsitiktinių imčių, kontroliuojamų bandomasis tyrimas
• Žemyn reguliavimas Thrombospondin2 prognozuoja prastą prognozę pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu