LNC RNA HOTAIR Funktionen als konkurrierenden endogenen RNA HER2-Expression durch Abtupfen miR-331-3p im Magen-cancer

Lnc RNA HOTAIR Funktionen als konkurrierenden endogenen RNA zu regulieren, um HER2-Expression regulieren durch Abtupfen miR-331-3p bei Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
mehr deutet darauf hinweisen, dass die lange nicht-kodierenden RNA HOTAIR eine entscheidende Rolle bei der Tumorprogression und Metastasierung spielt. Allerdings bleibt die Gesamt biologische Rolle und klinische Bedeutung von HOTAIR in Magen-Krebsentstehung weitgehend unbekannt.
Methoden
HOTAIR Expression gemessen wurde in 78 Krebs- und noncancerous Gewebeproben durch real-time PCR gepaart. Die Wirkungen von HOTAIR auf Magenkrebszellen wurden durch Überexpression untersucht und RNA-Interferenz nähert sich in vitro und in vivo. Insights des Mechanismus der Wettbewerbs endogene RNAs (ceRNAs) wurden von bioinformatischen Analyse gewonnen, Luciferase-Assays und RNA-Bindungsprotein Immunpräzipitation (RIP). Die positive HOTAIR /HER2-Wechselwirkung wurde durch Immunhistochemie Assay und bivariate Korrelationsanalyse identifiziert und verifiziert.
Ergebnisse | HOTAIR upregulation wurde mit einer größeren Größe des Tumors, fortgeschrittenen Krankheitsstadium und umfangreiche Metastasierung assoziiert und auch mit kürzeren Gesamtüberlebenszeit von Magen korreliert Krebspatienten. Darüber hinaus gefördert HOTAIR Überexpression, die Proliferation, Migration und Invasion von Magenkarzinomzellen, während HOTAIR Verarmungs beide Zellinvasion und die Lebensfähigkeit der Zellen inhibiert, und induzierte Wachstumshemmung in vitro und in vivo. Insbesondere HOTAIR kann als Cerna handeln, effektiv eine Senke für miR-331-3p werden, wodurch die Derepression von HER2 Modulation und eine zusätzliche Ebene der posttranskriptionales Verordnung zur Einführung. Schließlich wurde die positive HOTAIR /HER2 Korrelation signifikant mit fortgeschrittenem Magenkrebs in Verbindung gebracht.
Schlussfolgerungen
HOTAIR Überexpression eines Biomarkers von einer schlechten Prognose bei Magenkrebs darstellt und kann malignen Phänotyp, um Tumorzellen verleihen. Das Cerna regulatorisches Netzwerk HOTAIR und die positive Interaktion zwischen HOTAIR und HER2 beteiligt sind, können zu einem besseren Verständnis von Magenkrebs Pathogenese beitragen und die Entwicklung erleichtern lncRNA gerichtete Diagnostik und Therapie gegen diese Krankheit.
Schlüsselwörter Konkurrierende endogenen RNA HER2 HOTAIR Magenkrebs Proliferation und Invasion hintergrund und Magenkrebs ist die zweithäufigste Ursache von Krebs-induzierten Tod, und ist die häufigste Magen-Darm-Malignität in Ostasien, Osteuropa und Teilen Mittel- und Südamerika. Bei den meisten Patienten ist Magenkrebs in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert und wird durch maligne Proliferation, umfangreiche Invasion und lymphatischen Metastasierung begleitet. Erfolgreiche therapeutische Strategien sind begrenzt, und die Sterblichkeit ist hoch [1, 2]. Lange nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) wurden kürzlich große Aufmerksamkeit gewonnen, die komplexen Mechanismen der malignen Prozesse wie Karzinogenese, Metastasierung und Medikamentenresistenz in Abgrenzen. Wenn wir also Magen Karzinogenese vollständig zu verstehen wollen, müssen wir diese Familie von regulatorischen Transkripte zu berücksichtigen, die eine neue Ebene der Komplexität der Tumorbiologie hinzufügen.
Obwohl nur eine kleine Anzahl von funktionellen lncRNAs haben bisher gut charakterisiert worden ist, sie gezeigt, um die Genexpression auf verschiedenen Ebenen, einschließlich Chromatin Modifikation, Transkription und post-Transkriptions-Verarbeitung [3, 4] regeln wurden. Vor kurzem wurde ein neuer Regulationsmechanismus ermittelt, in denen Übersprechens zwischen lncRNAs und mRNAs von konkurrierenden für den gemeinsamen microRNAs (miRNAs) Response-Elemente auftritt. In diesem Fall funktionieren lncRNAs als konkurrierende endogene RNAs (ceRNAs) miRNAs Schwamm, wodurch die Derepression von miRNA Ziele zu modulieren und eine zusätzliche Ebene der posttranskriptionales Verordnung zur Einführung [5]. In früheren Berichten, eine muskelspezifische lncRNA, LINC-MD1, wurde berichtet, ein Cerna zu sein, die MyoD Boten-RNA (mRNA) von miRNA-vermittelten Abbau [6] schützt. Pluripotenz-assoziierten LNC-RoR als Schlüssel Cerna fungieren kann das Netzwerk von miRNAs und Kerntranskriptionsfaktoren zu verbinden, zum Beispiel Oct4, Sox2 und Nanog, in humanen embryonalen Stammzellen. Bemerkenswerterweise lncRNA HULC ist stark hochreguliert in Leberkrebs und spielt eine wichtige Rolle in der Tumorgenese [7]. Insbesondere wirken kann HULC als endogene "Schwamm", die eine Reihe von miRNAs Aktivitäten herunterreguliert, einschließlich miR-372 [8]. Wir schlagen daher vor, dass einige lncRNAs auch Rollen als ceRNAs, die Verknüpfung miRNAs und die post-Transkriptions-Netzwerk in Magen Pathogenese haben.
HOTAIR (Hox-Transkript Antisense-RNA intergene
) ist ein ~ 2,2 kb langen nicht-kodierenden RNA aus dem Locus
Hoxc transkribiert, die die Transkription in trans
von HOXD
in Vorhautfibroblasten [9] unterdrücken kann. Als ein neues Molekül auf dem Gebiet der Tumorbiologie, wurde HOTAIR zunächst bekannt für seine Beteiligung an der primären Brusttumoren und Brustkrebs Metastasen, bei Erhöhung der HOTAIR Invasivität und Metastasierung gefördert [10]. Darüber hinaus korreliert HOTAIR Ausdruck positiv mit malignen Prozessen und einer schlechten Prognose bei Darmkrebs, Leberzellkarzinom, Pankreaskarzinom und gastrointestinalen Stromatumoren [11-14]. Jüngste Studien berichtet, dass HOTAIR wurde bei Magenkrebs nach oben reguliert [15, 16]. Dennoch bleibt die gesamte biologische Rolle und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismus der HOTAIR in Magen-Krebsentstehung weitgehend undefiniert. In dieser Studie
berichten wir, dass HOTAIR upregulation eine charakteristische molekulare Veränderung in Magenkrebs ist und untersuchen die biologischen Rollen von HOTAIR auf den Phänotypen Magenkrebszellen in vitro und in vivo. Darüber hinaus zeigt mechanistischen Analyse, dass HOTAIR als Cerna fungieren kann die Expression von humanen epithelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) durch den Wettbewerb für miR-331-3p zu regulieren, so dass eine onkogene Rolle bei Magen-Pathogenese spielen. Die vorliegende Arbeit stellt den ersten Beweis für eine positive HOTAIR /HER2-Korrelation und des Übersprechens zwischen miR-331-3p, HOTAIR und HER2, über die Behandlung von Magenkrebs ein neues Licht zu vergießen.
Ergebnisse | HOTAIR Expression hochreguliert in menschlichen Magenkrebsgewebe
Die Höhe der HOTAIR Expression wurde in 78 gepaart Magenkrebs Proben und den angrenzenden, histologisch normalen Gewebe durch qRT-PCR, und normiert auf GAPDH bestimmt. HOTAIR Expression signifikant in Krebsgewebe upregulated (mittleres Verhältnis von 14,35-fach, P < 0,01) im Vergleich zu normalen Pendants (Abbildung 1A). Die Untersuchung der Korrelation zwischen HOTAIR Expression und klinischen pathologischen Merkmale zeigten, dass HOTAIR upregulation mit größeren Tumorgröße, fortgeschrittenen Krankheitsstadium, korreliert Fernmetastasen (1B und C), Lymphknotenmetastasen und Tumorzelldifferenzierung (Tabelle 1). Jedoch wurde HOTAIR Expression nicht mit der Tumorposition oder Patienten Geschlecht (Tabelle 1) zugeordnet ist. Im Hinblick auf das Gesamtüberleben bei Patienten mit hohem HOTAIR Ausdruck hatten eine signifikant schlechtere Prognose als solche mit niedrigem HOTAIR Ausdruck (P < 0,001, Log-Rank-Test; 1D). Diese Ergebnisse implizieren, dass HOTAIR Überexpression in der Entwicklung neuartiger prognostischen oder Progressionsmarker für Magenkrebs nützlich sein können. Abbildung 1 Relative HOTAIR Expression in Magenkrebsgewebe und ihre klinische Bedeutung. (A) Relative Expression von HOTAIR in Magenkrebsgewebe (n = 78) im Vergleich zu entsprechenden nicht-Tumor normalen Geweben (n = 78). HOTAIR Expression wurde durch qRT-PCR und normiert auf GAPDH-Expression untersucht. Die Daten wurden als fold change in Tumorgewebe im Vergleich zu normalen Geweben präsentiert. (B) Untersuchung der Korrelation zwischen HOTAIR Expression und klinischen pathologischen Merkmale zeigten, dass HOTAIR upregulation mit größeren Tumorgröße korreliert und fortgeschrittenen Krankheitsstadium. (C) HOTAIR Expression war signifikant höher bei Patienten mit Fernmetastasen als in denen mit nicht-Fernmetastasen. (D) Kaplan-Meier-Gesamtüberlebenskurven nach HOTAIR Expressionsniveau. Das Gesamtüberleben der Hoch HOTAIR Gruppe (n = 39: HOTAIR Expressionsverhältnis ≥ Median-Verhältnis) war signifikant höher als die von Low-HOTAIR Gruppe (n = 39; HOTAIR Expressionsverhältnis ≤ mittlere Verhältnis; P < 0,001, Log- Rank-Test). * P < 0,05, ** P < 0,01.
Tabelle 1 Korrelation der Expression von HOTAIR mit klinisch-pathologische Merkmale
klinisch-pathologische Merkmale

n (%)
Relative Expression von HOTAIRa
P-WertB
Geschlecht
P = 0,62
männlich
50 (64)
12.21 (0,97-17,53)
Weiblich
28 (36)
15,01 (7,34 -19,52)
Site des Tumors
P = 0,910
Distal dritte
18 (23)
9.1 (1,37-14,12)
Mitte Drittel
20 (26)
7,96 (2,55-9,72)
40
proximale Magen (51)
7,76 (1,24-13,58)
Differenzierung
P = 0,045
Schlechte
56 (72)
15,6 (6,25-20,36)
hoch /mittel
22 (28)
8.1 (0,98-11,14)
Lymphknotenmetastase
P = 0,005
N0
10 (13)
1,14 (0,75-1,42)
N1
11 (14)
3,44 (1,15-4,85)
N2
29 (37)
11.99 (7.15- 14.77)
N3
28 (36)
32.58 (7,34-36,27)
Metastasierung
P = 0,029
M0
64 (82)
9,35 (2,53 -33,64)
M1
14 Abb
28,82 (16,39-39,39)
aMedian der relativen Expression, mit 25.-75 Perzentil in Klammern. bP < 0,05 wurde als signifikant angesehen (Mann-Whitney-U-Test
zwischen zwei Gruppen und Kruskall-Wallis-Test für drei Gruppen).
Manipulation von HOTAIR Ebenen in Magenkrebszellen kaufen Wir die nächste qRT-PCR-Analyse durchgeführt, um zu untersuchen Expressionsniveaus von HOTAIR in Linien verschiedene Krebszelle, einschließlich des Magens, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und Brustkrebs abgeleiteten Zellen. Wie in 2A gezeigt, der vier Magenkrebszelle Linien untersucht (MGC-803, SGC-7901, BGC-823 und AGS), ausgedrückt BGC-823 höhere HOTAIR (3,18-fach) als die normalen Zell Magenepithel Linie (GES-1). In ähnlicher Weise NSCLC-Zelllinie, SPC-A1, zeigten eine 3,73-fache Hochregulation von HOTAIR über die normalen menschlichen bronchialen Epithelzellen Zelllinie, 16HBE. Die hoch metastasierendem Brustkrebs-Zelllinie MDA-MB-231 zeigte eine 4,77-fache Hochregulation von HOTAIR verglichen mit MCF-7 (2A). Unsere Daten deuten darauf hin, dass HOTAIR kann häufig in vielen Tumorzellen hochreguliert werden. Figur 2 Die Höhe der HOTAIR Expression in Magenkrebszellen und ihrer Wirkung auf die Zellproliferation in vitro. (A) Die Ergebnisse der qRT-PCR demonstriert HOTAIR Expressionsniveaus von Magenkrebs-Zelllinien (MGC-803, SGC-7901, BGC-823 und AGS), verglichen mit normalen Magenepithel Zelllinie (GES-1), NSCLC-Zelllinie ( SPC-A1) im Vergleich zu normalen humanen Bronchialepithelzellen Zelllinie (16HBE) und Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 im Vergleich zu MCF-7. (B) qRT-PCR-Analysen von HOTAIR Expressionsniveau nach der Behandlung BGC-823 Zellen mit siRNAs Targeting HOTAIR und Behandlung SGC-7901-Zellen mit pCDNA /HOTAIR Vektor. (C) MTT-Test wurde durchgeführt, die Proliferation von si-HOTAIR-transfizierten BGC-823-Zellen oder pCDNA /HOTAIR-transfizierten SGC-7901-Zellen zu bestimmen. Die Daten stellen den Mittelwert ± S. D. aus drei unabhängigen Experimenten. (D) Koloniebildende Wachstumstest wurde durchgeführt, die Proliferation von si-HOTAIR transfizierten BGC-823-Zellen zu bestimmen. Die Kolonien wurden gezählt und erfasst. * P < 0,05 und ** P < 0,01.
Um HOTAIR Ebenen bei Magenkrebs-Zellen, eine pCDNA /HOTAIR Vektor wurde Transfektion in SGC-7901-Zellen und si-HOTAIR wurde Transfektion in BGC-823-Zellen, die jeweils zu manipulieren. qRT-PCR-Analyse von HOTAIR Ebenen wurde bei 48 h nach der Transfektion durchgeführt und ergab, dass HOTAIR Ausdruck 98-fach in SGC-7901-Zellen erhöht wurde, im Vergleich zu Kontrollzellen. Jedoch in BGC-823-Zellen war HOTAIR Ausdruck effektiv 75% umgeworfen von si-HOTAIR2, der wirksamsten siRNA anschließend in den folgenden Experimenten verwendet wird (2B).
Wirkung von HOTAIR auf die Zellproliferation und Apoptose in vitro
der deutliche Anstieg der HOTAIR Expression in Magenkrebs Proben veranlasste uns, die mögliche biologische Bedeutung von HOTAIR in tumorigenesis zu erkunden. MTT-Assay ergab, dass das Zellwachstum wurde in BGC-823 Zellen mit si-HOTAIR transfiziert signifikant beeinträchtigt, während die Proliferation von SGC-7901-Zellen in pCDNA /HOTAIR transfizierten Zellen im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen (2C) erhöht wurde. In ähnlicher Weise offenbart das Ergebnis der Kolonie-Bildungstest, dass klonogenen Überleben nach Hemmung der HOTAIR in BGC-823-Zellen (2D) verringert wurde.
Um zu bestimmen, ob die Apoptose ein entscheidender Faktor war die Wachstumshemmung der Zelle, führten wir Hoechst-Färbung und durchflusszytometrische Analyse von si-HOTAIR behandelten BGC-823-Zellen. Die Daten zeigten, dass die Anzahl der Zellen mit kondensierten und fragmentierte Kerne der Anteil der frühen apoptotischen Zellen anzeigt, war signifikant höher in si-HOTAIR behandelten BGC-823-Zellen im Vergleich mit Si-NC-behandelten Zellen (Figur 3A und B). Darüber hinaus fanden wir, dass die Hemmung der HOTAIR Caspase-3-abhängige Apoptose verstärkt, durch Western-Blot-Analyse der aktivierten Caspase-3 zeigte nach si-HOTAIR Transfektion (Weitere Datei 1: Abbildung S1). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass der Zuschlags HOTAIR Proliferation Magenkrebszellen unterdrückt und induziert Apoptose in vitro. Abbildung 3 Die Wirkung von HOTAIR auf Magenkrebs Zell-Apoptose, Migration und Invasion in vitro. BGC-823-Zellen wurden mit si-HOTAIR oder si-NC transfiziert und SGC-7901-Zellen wurden mit pCDNA /HOTAIR Vektor oder leeren Vektorkontrolle transfiziert. (A) Hoechst-Färbung Assay von Zellapoptose; der Prozentsatz der Hoechst-positive Keime pro optisches Feld (mindestens 50 Felder) bestimmt. (B) Die apoptotischen Raten von Zellen durch Durchflußzytometrie nachgewiesen. UL, nekrotische Zellen; UR, Terminal apoptotischen Zellen; LR, früh apoptotischen Zellen. (C und D) Transwell-Assays wurden durchgeführt, Änderungen in der Zellmigration und Invasivität zu untersuchen. * P < 0,05 und ** P < 0,01.
HOTAIR fördert Migration und Invasion von Magenkrebszellen in vitro
Zellinvasion ist ein wichtiger Aspekt der Tumorprogression, die die Wanderung von Tumorzellen in benachbarte Gewebe und die Auflösung von extrazellulären Matrixproteinen beinhaltet. Hier werteten wir Invasion von Krebszellen durch Transwell-Assays. Wie in 3C gezeigt ist, behindert die Transfektion von siRNA HOTAIR die Migrationsfähigkeit BGC-823-Zellen um etwa 66%. Eine entsprechende Wirkung auf Invasivität wurde auch in einer parallel Invasionstest beobachtet. Im Gegensatz dazu, die Transfektion von SGC-7901-Zellen mit pCDNA /HOTAIR Vektor gefördert Zellmigration und Invasivität ~ 1,9-fach (3D). Diese Daten zeigen, dass HOTAIR onkogenen Eigenschaften hat, die einen Migrations und invasiven Phänotyp bei Magenkrebszellen fördern können.
HOTAIR tumorigenesis von Magenkrebszellen in vivo
fördert Um zu untersuchen, ob die Höhe der HOTAIR Ausdruck tumorigenesis betrifft, BGC-823 transduzierten Zellen mit dem sh-HOTAIR /pENTR Vektor (EV) wurden in einem Nacktmäuse Xenograftmodell verwendet. Bis zu 16 Tage nach der Zuschlags HOTAIR gab es eine dramatische Abnahme des Tumorvolumens und das Gewicht in der SH-Gruppe HOTAIR verglichen mit den Kontrollen (4A, B und C). Als nächstes wurde eine Immunfärbung Analyse der Proliferationsmarker PCNA in reseziert Tumorgewebe durchgeführt. Im Vergleich mit der in Tumoren, die aus Kontrollzellen gebildet werden, zeigten sh-HOTAIR abgeleiteten Tumoren signifikant PCNA Positivität (4D) reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Niveau der Expression HOTAIR signifikant mit der in vivo-Proliferation Kapazität von Magenkrebszellen assoziiert ist. Abbildung 4: Wirkung der HOTAIR Knockdown auf das Tumorwachstum in vivo. (A) Tumorwachstumskurven wurden nach der Injektion von BGC-823 Zellen mit sh-HOTAIR oder pENTR Vektor transfiziert gemessen. Das Tumorvolumen wurde alle 3 Tage berechnet. Die Daten sind als Mittelwert ± s.d. (N = 5). (B) Tumorgewicht. Werte sind Mittelwerte von Tumorgewicht ± S. D. (C) qRT-PCR-Analyse von HOTAIR Expression in Geweben von reseziert Tumoren. (D) Tumoren entwickelt von BGC-823 /sh-HOTAIR Zellen zeigten eine geringere Menge an PCNA Protein als von BGC-823 /pENTR Vektor Zellen Tumoren entwickelt. Obermaterial: H & E-Färbung; Unten: Immunfärbung. * P < 0,05 und ** P < 0,01.
HOTAIR ein Ziel von miR-331-3P und miR-124
Bioinformatik Analyse von miRNA-Erkennungssequenzen auf HOTAIR ist zeigte die Anwesenheit von 11 tumorunterdrückende miRNAs Bindungsstellen. Die HOTAIR cDNA wurde stromabwärts des Luciferase-Gens kloniert und RLuc-HOTAIR (5A), dann transfiziert zusammen mit verschiedenen miRNA-kodierenden Plasmide genannt. RNO-miR-344 diente als negative Kontrolle. Die Ergebnisse zeigten, dass die Luciferase-Aktivität um 48% bzw. 31% reduziert im Vergleich mit dem leeren Vektor-Kontrolle, wenn miR-331-3p und miR-124 wurden ausgedrückt. Diese Daten zeigen, dass sowohl miR-331-3p und miR-124 direkt an HOTAIR durch entsprechende miRNA-Erkennungsstellen (5B links) binden können. Abbildung 5 HOTAIR ist ein Ziel von miR-331-3P oder miR-124 und miR-steuert 331-3p Ziel. (A) Die 11 mutmaßliche miRNA-Bindungsstellen in der HOTAIR Sequenz. Die HOTAIR cDNA die putative miRNAs Erkennungsstellen enthält, wurde stromabwärts des Luciferase-Gens kloniert und RLuc-HOTAIR genannt. (B) Links: Die Luciferasereporterplasmid (RLuc-HOTAIR) war Co-Transfektion in HEK-293-T-Zellen mit den 11 verschiedenen miRNA-kodierenden Plasmide. Rechts: die Luciferasereporterplasmid Wildtyp oder mutierten HOTAIR enthielt, wurde Co-Transfektion in HEK-293-T-Zellen mit miR-331-3p parallel mit einem leeren Plasmidvektor. Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung des Dual-Luciferase-Assay bestimmt und als relative Luciferaseaktivität normalisiert auf Renilla-Aktivität gezeigt. Histogramm zeigt die Werte der Luciferase 48 h nach der Transfektion gemessen. (C) Das 3'-UTR von HER2 wurde mit dem Luciferase-kodierende Region fusioniert (RLuc-HER2-3'-UTR) und transfiziert in HEK293T-Zellen mit miR-331-3p bestätigen HER2 das Ziel von miR-331-3p ist. RLuc-HER2-3'-UTR und miR-331-3p Konstrukte wurden co-transfiziert in HEK293T-Zellen mit Plasmiden exprimieren HOTAIR (pCDNA /HOTAIR) oder mit einem Kontrollvektor die CERNA Aktivität von HOTAIR zu verifizieren. RNO-miRNA-344 wurde als negative Kontrolle verwendet. Histogramm zeigt die Werte der Luciferase 48 h nach der Transfektion gemessen. (D) RIP mit monoklonalen Maus-anti-Ago2, Preimmun IgG oder 10% Eingang von BGC 823-Zellextrakten. RNA-Spiegel in Immunpräzipitate wurden durch qRT-PCR bestimmt. Top: Ebenen HOTAIR, miRNA331-3P und FOS-RNA wurden als fache Anreicherung in Ago2 in Bezug auf IgG Immunpräzipitate dargestellt. Unten: relative RNA-Werte von U1 snRNA in SNRNP70 in Bezug auf IgG-Immunfällungen. Die Zahlen sind Mittelwert ± Standardabweichung (N = 3). (E) Western-Blot-Analyse von HER2-Protein-Ebene nach der Behandlung von BGC-823 Zellen mit si-HOTAIR oder pCDNA /HOTAIR und SGC-7901-Zellen mit pCDNA /HOTAIR. GAPDH wurde als Kontrolle verwendet. * P < 0,05, ** P < 0,01 und N.S. nicht signifikant.
Hierbei haben wir uns für miR-331-3p als Modell miRNA für weitere Studien. Um weiter zu bestätigen, dass die Reduktion der Luciferase-Aktivität aus dem RLuc-HOTAIR-WT Vektor zurückzuführen Wechselwirkung zwischen der miRNA und seine mutmaßliche Bindungsstelle zu richten, wir mutierte die miR-331-3p Bindungsstelle durch ortsgerichtete Mutagenese, was zu RLuc -HOTAIR-Mut. Wie erwartet, wurde die Unterdrückung der Luciferase-Aktivität vollständig in diesem mutierten Konstrukt im Vergleich zu Wildtyp-Vektor (5B rechts) abgeschafft.
HOTAIR und miR-331-3p binden beide mit AGO2 in Zellen Magenkrebs
miRNAs sind in Form von miRNA Ribonukleoproteinkomplexe (miRNPs), die auch Ago2, die Kernkomponente der RNA-induced silencing complex (RISC) [17, 18] bekannt im Zytoplasma enthalten sein. Um zu testen, ob HOTAIR Mitarbeiter mit miRNPs wurden RNA-bindendes Protein Immunpräzipitation (RIP) durchgeführten Experimente auf BGC-823-Zellextrakten Antikörper gegen Ago2 verwenden. RNA-Spiegel in Immunpräzipitate wurden durch qRT-PCR bestimmt. HOTAIR wurde bevorzugt angereichert (354-fach) in Ago2 haltigen miRNPs relativen Immunglobulin G (IgG) Immunpräzipitaten zu steuern. In ähnlicher Weise wurde auf einem Niveau festgestellt miRNA-331-3p 840-fach größer als die der Kontroll anti-IgG. Erfolgreiche Immunpräzipitation von Ago2-assoziierten RNA wurde durch qRT-PCR verifiziert, RIP-Primer gegen menschliche FOS im RIPAb + Ago2 Kit (Abbildung 5D, oberes Feld) enthalten. Außerdem wurde anti-SNRNP70 als positive Kontrolle für den RIP Verfahren verwendet und U1 snRNA auch auf einem Niveau 206-fach größer als die von anti-IgG (5D, unteres Feld) nachgewiesen wurde. Somit ist HOTAIR in Ago2 haltigen miRNPs, wahrscheinlich durch die Verbindung mit miRNA-331-3p, im Einklang mit unserer bioinformatischen Analyse und Luciferase-Assays.
HOTAIR steuert die miR-331-3p Ziel, HER2
Unter den vielen Ziele von miR-331-3p wir auf HER2 konzentriert, da es ein Transmembranprotein mit einer entsprechenden Funktion in der Karzinogenese und der Resistenz gegen Trastuzumab-Therapie [19] kodiert. Die 3'-UTR von HER2 wurde mit dem Luciferase-kodierende Region fusioniert (RLuc-HER2-3'-UTR) und transfiziert mit Plasmiden, miR-331-3p und einen leeren Plasmidvektor. RNO-miRNA-344 diente als negative Kontrolle. Die Luciferase-Test zeigte, dass miR-331-3p signifikant Luciferase-Aktivität gehemmt (~ 41% ige Hemmung) des RLuc-HER2-3'-UTR-Reporter, die bestätigt, dass HER2 ein Ziel von miR-331-3p ist. Die RLuc-HER2-3'-UTR-Konstrukt wurde anschließend transfiziert zusammen mit Plasmiden, miR-331-3p und HOTAIR (pCDNA /HOTAIR). Luciferase-Assays zeigten, dass in Gegenwart von HOTAIR, RLuc-HER2-3'-UTR Repression wiederhergestellt wurde, verglichen mit der Kontrollgruppe (5C). Dies zeigt, dass HOTAIR wirkt als endogene "Schwamm" durch miR-331-3p Bindung, wodurch die miRNA-induzierte Nachpressen Aktivität auf der HER2 3'-UTR abzuschaffen.
Weiteren die Wirkung der HOTAIR Expression auf endogene Protein in HER2 Kombination mit Modulation der miRNA oder lncRNA Ebenen durch die verschiedenen Ansätze gezeigt in 5E überwacht wurde: (1) miR-331-3p Überexpression gegen HER2 in BGC-823-Zellen; (2) HOTAIR Knockdown gegen HER2 in BGC-823-Zellen; (3) HOTAIR Überexpression für HER2 in SGC-7901-Zellen. Western-Blot-Analyse zeigte, dass erzwungene Expression von miR-331-3p oder Zuschlags von HOTAIR in BGC-823-Zellen eine signifikante Dämpfungswirkung auf die endogene HER2-Protein-Expression ausgelöst. Weiterhin wurde HER2-Protein-Expression nach der Transfektion mit deutlich HOTAIR in SGC-7901-Zellen nach oben reguliert, die eine relativ niedrige endogene HOTAIR Expressionsniveau zeigt.
Zusammen zeigen diese Daten, dass miR-331-3p durch Binden, HOTAIR wirkt als CERNA für das Ziel HER2 mRNA, wodurch die Derepression von HER2 Modulation und eine zusätzliche Ebene der posttranskriptionales Verordnung zur Einführung.
miR-331-3p und miR-124 Magenkrebs-Zellen-Proliferation unterdrücken
als endogene Senke für Ziel zu dienen miRNAs sollte die Fülle von HOTAIR vergleichbar oder höher als miR-331-3p /miR-124. In unserer Studie zeigte qRT-PCR-Analyse, dass miR-331-3p /miR-124 Expression invers mit HOTAIR Ausdruck in 20 Paaren von fortgeschrittenem Magenkrebs (6A) korreliert. Um zu überprüfen, ob miR-331-3p und miR-124 auch Magenkrebs-Zellproliferation hemmen könnten, wir gezwungen, ihren Ausdruck in BGC-823 Zellen miRNA-kodierenden Plasmide verwenden. Die Expression von miRNA-331-3p und miR-124 Transfektion in BGC-823-Zellen wurden signifikant um 36-fach erhöht und 29-fache, verglichen mit Kontrollzellen (6B). Als nächstes MTT und Koloniebildungstests wurden durchgeführt, die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse der MTT-Assay und Wachstumskurven zeigten, dass mit miR-331-3p transfizierten Zellen oder miR-124 signifikante Wachstumshemmung zeigte, wenn es mit Zellen, transfiziert mit leerem Vektor (6C) verglichen. Diese Daten zeigen, dass die Überexpression von miR-331-3p oder miR-124 Expression Magenkrebs-Zellproliferation festnehmen können, die mit den Ergebnissen der HOTAIR Ausdruck Zuschlag in BGC-823 Zellen konsistent ist. 6 Positive Korrelation zwischen HOTAIR und HER2-Expression und die Relevanz für die miR-331-3p /miR-124-Expressionsniveaus. (A) Bivariate Korrelation Analyse der Beziehung zwischen HOTAIR Ausdruck und miR-331-3p oder miR-124-Ebene. (B) BGC-823-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert kodieren miR-331-3p oder miR-124 und qRT-PCR wurde verwendet, um die miRNA Ebenen mit Kontrollen (miR-NC) im Vergleich zu detektieren. (C) MTT-Test und koloniebildenden Wachstumstest wurden durchgeführt, die Proliferation von miR-331-3p oder miR-124 transfiziert BGC-823-Zellen zu bestimmen. (D) Links: Immunfärbung von HER2-Protein in fortgeschrittenem Magenkrebs Gewebeproben. Obermaterial: immunostaining von HER2 negativ war im Magenkrebsgewebe mit relativ niedrigen HOTAIR Ausdruck. Unten: Immunfärbung von HER2 war positiv bei Magenkrebs Gewebe mit relativ hohen HOTAIR Ausdruck. Rechts: bivariate Korrelationsanalyse der Beziehung zwischen HOTAIR und HER2 Expressionsniveau. * P < 0,05, ** P < HER2 0,01.
Ist koexprimiert mit HOTAIR bei Magenkrebs Gewebe
Der HER2-Überexpression Rate berichtet wurde 7-34% bei Magenkrebs zu sein, und wurde mit mehr aggressive Krankheit und schlechteren Überleben bei Magenkrebs assoziiert [19]. Wir haben festgestellt Expression von HER2 in 50 fortgeschrittenem Magenkrebs Gewebe (Stadium III /IV) von den bisherigen 78 Magenkrebsgewebe durch Immunhistochemie ausgewählt (IHC) und qRT-PCR-Analyse. Die Ergebnisse der IHC-Färbung zeigte Protein HER2-Positivität in 56% der ausgewählten 50 Magenkrebsgewebe. Sechsundachtzig Prozent dieser HER2-positiven Proben wurden von fortgeschrittenen Stadium III /IV-Tumoren und 71% zeigten eine hohe HOTAIR Ausdruck (6D und Zusatzdatei 2: Tabelle S2). Bivariate Korrelationsanalyse zeigte, dass die Expression von HER2 signifikant mit HOTAIR Transkriptebene im Magenkrebsgewebe im Vergleich zu normalen Pendants (6D) korreliert. Diese Daten zeigen, dass die Expression von HER2 positiv im Zusammenhang mit hochregulierten HOTAIR bei Magenkrebs Gewebeproben, was darauf hindeutet, dass die Charakterisierung des HER2 /HOTAIR Wechselwirkung könnte biologisch bedeutsam sein in menschlichen Magen tumorigenesis.
Bemerkenswert ist, wegen einer laufenden Phase III /IV-Studie, die HER2-Überexpression Rate in der vorliegenden Studie nachgewiesen ist höher als die zuvor berichteten medianen Bereich. Diese erhöhte Rate von HER2-Überexpression ist Magenkrebs zu schlechte Ergebnisse für Patienten mit metastasiertem und hochwertigen lokalisiert, wodurch die Betonung der Bedeutung von HER2 bei Magenkrebs Entwicklung und Metastasierung.
Diskussion
LncRNAs, die eng miteinander verknüpft sind mehr als 200 Nukleotiden Länge mit begrenzter Protein-Kodierungskapazität, werden oft in einem krankheits-, gewebe- oder entwicklungsstadiumspezifischen Weise exprimiert, spezifische Funktionen für lncRNAs in Entwicklung und Erkrankungen anzeigt und diese Moleküle attraktive therapeutische Ziele machen [20-22]. Eine Reihe von neueren Arbeiten haben gezeigt, dass eine Fehlregulation dieser lncRNAs auch die Regulation der eukaryotischen Genom beeinflussen können und eine zelluläre Wachstumsvorteil bieten, was zu einer progressiven und unkontrollierte Tumorwachstum [23-25]. Daher kann lncRNAs eine fehlende Stück der sonst bekannten onkogenen und Tumor-Suppressor-Netzwerk Puzzle bieten.
In dieser Studie untersuchten wir die Expression von HOTAIR in Magenkarzinomproben und ihre Umgebung nicht tumoröse Gewebe. Wir haben auch die Funktion der HOTAIR in Magenkarzinomzellen identifiziert durch Anwendung Verstärkungs- und loss-of-function Ansätze. Die Ergebnisse zeigten, dass HOTAIR in Magenkarzinom Gewebe im Vergleich zu angrenzenden normalen Magengewebe hochreguliert wurde, und dass HOTAIR upregulation mit größeren Tumorgröße, fortgeschrittenen Krankheitsstadium und umfangreiche Metastasierung korreliert. Darüber hinaus war die Gesamtüberlebenszeit von Patienten mit niedriger HOTAIR Expressionsniveaus signifikant länger als bei Patienten mit mäßiger oder starker HOTAIR Expressionsniveaus. Darüber hinaus gefördert HOTAIR Überexpression, die Proliferation, Migration und Invasion von Magenkarzinomzellen, während HOTAIR Depletion Zellinvasion und die Lebensfähigkeit der Zellen inhibiert, und induzierte Wachstumshemmung in vitro und in vivo. Darüber hinaus führte HOTAIR Unterdrückung zur Förderung der Magen-Zell-Apoptose. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HOTAIR eine direkte Rolle bei der Modulation von mehreren onkogenen Eigenschaften spielt und Magenkrebs Progression, neue Forschungsrichtungen stimulieren und therapeutischen Möglichkeiten HOTAIR als neuartige prognostischer Marker und therapeutisches Ziel bei Magenkrebs unter Berücksichtigung.
Die Bedeutung von lncRNAs in menschliche Krankheit kann mit ihrer Fähigkeit zu beeinflussen zelluläre Funktionen durch verschiedene Mechanismen verbunden sein. In dieser Studie wird so weit wie der Mechanismus der HOTAIR betrifft, ist es erwähnenswert, dass die subzelluläre Lokalisierung Analyse HOTAIR von RNA in situ-Fluoreszenz-Hybridisierungsassay die Lokalisierung von HOTAIR sowohl den Zellkern zeigt und Zytoplasma [24]. Es ist offensichtlich, dass die Kern HOTAIR polycomb repressive Komplex 2 zielen kann, zu verändern H3K27 Methylierung und Gen-Expressionsmuster über das Genom [10, 11]. Neuere Arbeiten berichteten über eine Gerüstfunktion für HOTAIR im Zytoplasma als Induktor von Ubiquitin-vermittelten Proteolyse [26]. Dennoch sind die tumorigenen Eigenschaften und mechanistische Heterogenität der HOTAIR, und insbesondere jene von der Zytoplasma-Form, sind bei weitem nicht vollständig aufgeklärt werden. Durch die Wettbewerbs endogenen RNAs 'regulatorische Netzwerk und neue Erkenntnisse inspiriert
das legt nahe, dass lncRNAs in dieser teilnehmen Regulierungsschaltung, die Hypothese aufgestellt, dass HOTAIR auch als Cerna dienen können und so suchten wir nach möglichen Wechselwirkungen mit den miRNAs. * P < 0,05. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

• Lebensqualität, Immunmodulation und die Sicherheit der adjuvanten Misteltherapie bei Patienten mit Magenkarzinom - eine randomisierte, kontrollierte Pilotstudie
• Down-Regulation der Thrombospondin2 prognostiziert schlechten Prognose bei Patienten mit Magenkrebs