funzioni LNC RNA Hotair come un RNA endogene competizione per regolare l'espressione di HER2 con spugnature miR-331-3p nel cancro gastrico

funzioni LNC RNA Hotair come un RNA endogene competizione per regolare l'espressione di HER2 con spugnature miR-331-3p nel carcinoma gastrico
Abstract
sfondo
Accumulando prove indica che la RNA non codificante lungo HOTAIR gioca un ruolo critico nella progressione del cancro e metastasi. Tuttavia, il ruolo biologico generale e significato clinico di HOTAIR nella carcinogenesi gastrica rimane in gran parte sconosciuto.
Metodi
espressione HOTAIR è stata misurata in 78 campioni di tessuto accoppiato cancerose e non tumorali mediante real-time PCR. Gli effetti di HOTAIR sulle cellule di cancro gastrico sono stati studiati da sovraespressione e RNA interferenza approcci in vitro e in vivo. Approfondimenti del meccanismo di RNA endogene competitivi (ceRNAs) sono state acquisite da analisi bioinformatica, saggi di luciferasi e RNA immunoprecipitazione binding protein (RIP). L'interazione positiva HOTAIR /HER2 è stato identificato e verificato da test di immunoistochimica e analisi di correlazione bivariata.
Risultati
HOTAIR upregulation è stata associata con le dimensioni del tumore più grande, avanzato stadio patologico ed estesa la metastasi, e anche correlati con più breve sopravvivenza globale di gastrico i malati di cancro. Inoltre, HOTAIR sovraespressione promosso la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di carcinoma gastrico, mentre deplezione HOTAIR inibito sia l'invasione delle cellule e la vitalità cellulare, e l'arresto della crescita indotto in vitro e in vivo. In particolare, HOTAIR può agire come un Cerna, diventando effettivamente un lavandino per miR-331-3p, modulando in tal modo la derepression di HER2 e imponendo un ulteriore livello di regolazione post-trascrizionale. Infine, la correlazione /HER2 positivo HOTAIR era significativamente associato con cancro gastrico avanzato.
Conclusioni
HOTAIR sovraespressione rappresenta un biomarker di prognosi sfavorevole nel carcinoma gastrico, e può conferire fenotipo maligno a cellule tumorali. La rete regolamentare Cerna coinvolge HOTAIR e l'interazione positiva tra HOTAIR e HER2 può contribuire ad una migliore comprensione della patogenesi gastrica cancro e facilitare lo sviluppo di diagnostica e terapeutica lncRNA-diretto contro questa malattia.
Parole
Competere endogena RNA HER2 HOTAIR gastrico proliferazione del cancro e l'invasione Sfondo
cancro gastrico è la seconda causa di morte per cancro indotto, ed è il tumore maligno gastrointestinale più comune in Asia orientale, Europa orientale, e parte del Centro e Sud America. Nella maggior parte dei pazienti, il cancro gastrico viene diagnosticato in fase avanzata ed è accompagnata da proliferazione maligna, vasta invasione e metastasi linfatica. strategie terapeutiche di successo sono limitate e la mortalità è alta [1, 2]. Lunghe RNA non codificanti (lncRNAs) hanno recentemente maturato una significativa attenzione nel delineare i complessi meccanismi alla base dei processi maligni come la carcinogenesi, metastasi e la resistenza ai farmaci. Pertanto, se vogliamo comprendere appieno carcinogenesi gastrica, dobbiamo considerare questa famiglia di trascrizioni normative che aggiungono un nuovo livello di complessità alla biologia tumorale.
Anche se solo un piccolo numero di lncRNAs funzionali sono stati ben caratterizzato fino ad oggi, hanno hanno dimostrato di regolare l'espressione genica a vari livelli, incluso modifica cromatina, trascrizione e l'elaborazione post-trascrizionale [3, 4]. Recentemente, un nuovo meccanismo di regolazione è stata identificata in cui crosstalk tra lncRNAs e mRNA avviene in competizione per microRNA condivisi elementi di risposta (miRNA). In questo caso, lncRNAs può funzionare come concorrenti RNA endogene (ceRNAs) per spugna miRNA, modulando in tal modo la derepression di obiettivi miRNA e l'imposizione di un ulteriore livello di regolazione post-trascrizionale [5]. In precedenti relazioni, una lncRNA muscolo-specifica, Linc-MD1, è stato segnalato per essere un Cerna che protegge l'RNA MyoD messaggero (mRNA) dal degrado miRNA-mediata [6]. Pluripotenza-associato LNC-RoR può funzionare come un Cerna chiave per collegare la rete di miRNA e fattori di trascrizione di base, ad esempio, Oct4, Sox2, e Nanog, nelle cellule staminali embrionali umane. In particolare, lncRNA HULC è altamente upregulated in cancro del fegato e svolge un ruolo importante nella tumorigenesi [7]. In particolare, HULC può agire come un 'spugna' endogena che down-regola una serie di attività miRNA, tra cui [8] miR-372. Proponiamo quindi che alcuni lncRNAs possono avere anche ruoli di ceRNAs, miRNA collegamento e la rete post-trascrizionale nella patogenesi gastrica.
HOTAIR (Hox trascrizione antisenso intergenic RNA
) è un ~ 2,2-kb RNA non codificante lungo trascritto dal HOXC
locus, che può reprimere la trascrizione in
trans di Hoxd
in fibroblasti prepuzio [9]. Come un nuova molecola nel campo della biologia dei tumori, HOTAIR inizialmente è diventato noto per il suo coinvolgimento nei tumori della mammella primario e delle metastasi del cancro al seno, in cui l'elevazione di HOTAIR promosso invasività e metastasi [10]. Inoltre, l'espressione HOTAIR correla positivamente con i processi maligni e scarso risultato nel cancro del colon-retto, carcinoma epatocellulare, il cancro al pancreas e tumori stromali gastrointestinali [11-14]. Recenti studi hanno riferito che è stato HOTAIR upregulated nel cancro gastrico [15, 16]. Tuttavia, il ruolo biologico generale e il meccanismo molecolare alla base della HOTAIR nella carcinogenesi gastrica rimane in gran parte non definita.
In questo studio, si segnala che HOTAIR upregulation è un cambiamento molecolare caratteristica di cancro gastrico e indagare i ruoli biologici di HOTAIR sui fenotipi di cellule di cancro gastrico in vitro e in vivo. Inoltre, l'analisi rivela che meccanicistica HOTAIR può funzionare come un Cerna per regolare l'espressione del fattore di crescita epiteliale umano del recettore 2 (HER2) attraverso la competizione per miR-331-3p, svolgendo così un ruolo nella patogenesi oncogenico gastrica. Il presente lavoro fornisce la prima evidenza di una correlazione positiva HOTAIR /HER2 ed il crosstalk tra miR-331-3p, HOTAIR e HER2, gettando nuova luce sul trattamento del cancro gastrico.
Risultati
espressione HOTAIR è upregulated in tessuti di cancro gastrico umano
Il livello di espressione HOTAIR è stato determinato in 78 coppie di campioni di cancro gastrico e adiacenti, tessuti normali istologicamente da qRT-PCR, e normalizzati per GAPDH. espressione HOTAIR era significativamente upregulated in tessuti cancerosi (rapporto di 14,35 volte, P <dire; 0,01) rispetto a controparti normali (Figura 1A). L'esame della correlazione tra espressione HOTAIR e caratteristiche cliniche patologiche ha mostrato che HOTAIR upregulation era correlata con dimensione maggiore del tumore, avanzato stadio patologico, metastasi a distanza (Figura 1B e C), metastasi linfonodali e la differenziazione delle cellule tumorali (Tabella 1). Tuttavia, l'espressione HOTAIR non è stata associata con la posizione del tumore o di genere del paziente (Tabella 1). Per quanto riguarda la sopravvivenza globale, i pazienti con elevata espressione HOTAIR avevano una prognosi significativamente peggiore rispetto a quelli con espressione HOTAIR basso (P < 0,001, log-rank test; Figura 1D). Questi risultati implicano che HOTAIR sovraespressione può essere utile per lo sviluppo di nuovi marcatori prognostici o di progressione per il cancro gastrico. Figura 1 espressione HOTAIR relativa nei tessuti di cancro gastrico e il suo significato clinico. (A) L'espressione relativa di HOTAIR nei tessuti di cancro gastrico (n = 78) in confronto con corrispondenti tessuti normali non tumorali (n = 78). espressione HOTAIR è stato esaminato da qRT-PCR e normalizzati per GAPDH espressione. I dati sono stati presentati come fold-cambiamento nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti normali. (B) L'esame della correlazione tra espressione HOTAIR e caratteristiche cliniche patologiche ha mostrato che upregulation HOTAIR correlata con grandi dimensioni del tumore e avanzato stadio patologico. espressione (C) HOTAIR era significativamente più alta nei pazienti con metastasi a distanza che in quelli con metastasi non lontano. curve di sopravvivenza complessiva (D) di Kaplan-Meier in base al livello di espressione HOTAIR. La sopravvivenza complessiva del gruppo ad alto HOTAIR (n = 39: HOTAIR rapporto espressione ≥ rapporto mediana) era significativamente più alta rispetto a quella di Low-HOTAIR gruppo (n = 39; HOTAIR rapporto rapporto espressione ≤ mediana; P < 0,001, log- rank test). * P < 0.05, ** P < 0.01.
Tabella 1 Correlazione dell'espressione di HOTAIR con le caratteristiche clinico-patologiche
caratteristiche clinico-patologiche
n (%)
espressione relativa di
HOTAIRa
P-valoreB
genere
P = 0.62
Maschio
50 (64)
12.21 (0,97-17,53)
femminile
28 (36)
15.01 (7.34 -19,52)
sito del tumore
P = 0,910
distale terzo
18 (23)
9.1 (1,37-14,12)
Medio terzo
20 (26)
7,96 (2,55-9,72)
prossimale dello stomaco
40 (51)
7,76 (1,24-13,58)
Differenziazione
P = 0.045
Poor
56 (72)
15,6 (6,25-20,36)
alta /moderata
22 (28)
8.1 (0,98-11,14)
metastasi linfonodali
P = 0,005
N0
10 (13)
1.14 (0,75-1,42)
N1
11 (14)
3,44 (1,15-4,85)
N2
29 (37)
11.99 (7.15- 14.77)
N3
28 (36)
32.58 (7,34-36,27)
malattia metastatica
P = 0.029
M0
64 (82)
9.35 (2.53 -33,64)
M1
14 fig
28.82 (16,39-39,39)
aMedian di espressione relativa, con 25 ° -75 ° percentile tra parentesi. bP < 0.05 è stato considerato significativo (Mann-Whitney U
test tra i 2 gruppi e prova Kruskall-Wallis per 3 gruppi)
. La manipolazione dei livelli Hotair in cellule di cancro gastrico
Abbiamo poi condotte analisi qRT-PCR per esaminare la livelli di espressione di HOTAIR in varie linee cellulari di cancro, tra cui gastrico, non a piccole cellule del polmone (NSCLC) e le cellule tumorali derivate dal seno. Come mostrato nella Figura 2A, delle quattro linee di cellule di cancro gastrico indagati (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, e AGS), BGC-823 esprimono alti livelli di HOTAIR (3,18 volte) rispetto al normale delle cellule dell'epitelio gastrico line (GES-1). Allo stesso modo, la linea di cellule NSCLC, SPC-A1, ha mostrato un upregulation 3.73 volte del HOTAIR sulla linea normale epiteliali bronchiali umane delle cellule, 16HBE. La linea cellulare di tumore mammario metastatico altamente MDA-MB-231 ha mostrato un upregulation 4,77 volte della HOTAIR rispetto MCF-7 (Figura 2A). I nostri dati suggeriscono che HOTAIR può essere spesso up-regolato in molte cellule tumorali. Figura 2 Il livello di espressione HOTAIR in cellule di cancro gastrico e il suo effetto sulla proliferazione cellulare in vitro. (A) I risultati di qRT-PCR dimostrano Hotair livelli di espressione di linee di cellule di cancro gastrico (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, e AGS) rispetto gastrica linea cellulare dell'epitelio normali (GES-1), linea di cellule NSCLC ( SPC-A1) rispetto al normale bronchiale linea umana cellule epiteliali (16HBE), e della mammella linee cellulari di cancro MDA-MB-231 rispetto a MCF-7. (B) qRT-PCR analisi di HOTAIR livello di espressione in seguito al trattamento BGC-823 cellule con siRNA di targeting cellule SGC-7901 Hotair e il trattamento con pCDNA /HOTAIR vettore. saggio (C) MTT è stata eseguita per determinare la proliferazione di si-HOTAIR transfettate BGC-823 cellule o pCDNA /HOTAIR transfettate cellule SGC-7901. I dati rappresentano la media ± S.D. da tre esperimenti indipendenti. (D) saggio di crescita formante colonia è stata effettuata per determinare la proliferazione di si-HOTAIR transfettate BGC-823 cellule. Le colonie sono state contate e catturato. * P < 0.05 e ** P < 0.01.
Per manipolare i livelli Hotair in cellule di cancro gastrico, un vettore pCDNA /HOTAIR è stato trasfettato in cellule e si-HOTAIR SGC-7901 è stato trasfettato in BGC-823 cellule, rispettivamente. qRT-PCR dei livelli di Hotair è stata effettuata a 48 ore dopo la trasfezione e ha rivelato che l'espressione HOTAIR è stato aumentato 98 volte nelle cellule SGC-7901, rispetto alle cellule di controllo. Tuttavia, in BGC-823 cellule, espressione HOTAIR era effettivamente 75% investito da si-HOTAIR2, il siRNA più efficace successivamente utilizzate nei seguenti esperimenti (Figura 2B).
Effetto di HOTAIR sulla proliferazione cellulare e apoptosi in vitro
il significativo incremento dell'espressione HOTAIR in campioni di cancro gastrico ci ha spinto a esplorare il possibile significato biologico della HOTAIR nella tumorigenesi. saggio MTT ha rivelato che la crescita delle cellule era significativamente ridotto in BGC-823 cellule trasfettate con si-HOTAIR, mentre la proliferazione delle cellule SGC-7901 è stata aumentata nelle cellule /Hotair trasfettate pcDNA rispetto ai rispettivi controlli (Figura 2C). Allo stesso modo, il risultato del test colonia formazione ha rivelato che la sopravvivenza clonogenica era diminuita dopo l'inibizione di HOTAIR nelle cellule BGC-823 (Figura 2D).
Per determinare se l'apoptosi è stato un fattore che contribuisce alla cella inibizione della crescita, abbiamo eseguito la Hoechst colorazione e analisi del flusso-citometria di si-HOTAIR trattati BGC-823 cellule. I dati mostrano che il numero di cellule con nuclei condensati e frammentata indicano la frazione dei primi cellule apoptotiche era significativamente superiore nel si-HOTAIR trattati BGC-823 cellule rispetto alle cellule si-NC-trattati (Figura 3A e B). Inoltre, abbiamo scoperto che l'inibizione di HOTAIR migliorata apoptosi caspasi-3-dipendente, dimostrato da analisi Western Blot della caspasi-3 attivata dopo si-HOTAIR trasfezione (sui file 1: Figura S1). Presi insieme, questi risultati indicano che atterramento di HOTAIR sopprime gastrica proliferazione delle cellule tumorali e induce l'apoptosi in vitro. Figura 3 L'effetto della HOTAIR sul gastrica apoptosi delle cellule tumorali, la migrazione e l'invasione in vitro. BGC-823 cellule sono state trasfettate con si-HOTAIR o si-NC, e le cellule SGC-7901 sono state trasfettate con pCDNA /HOTAIR vettore o controllo vettoriale vuoto. (A) Hoechst saggio colorazione di apoptosi delle cellule; la percentuale di nuclei Hoechst-positivi per campo ottico (almeno 50 campi) è stato determinato. (B) I tassi di apoptosi delle cellule sono state rilevate mediante citometria di flusso. UL, le cellule necrotiche; UR, le cellule apoptotiche terminali; LR, i primi cellule apoptotiche. saggi (C e D) Transwell sono stati eseguiti per studiare i cambiamenti nella migrazione cellulare e l'invasività. * P < 0.05 e ** P < 0.01.
HOTAIR promuove la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico in vitro
cellulare invasione è un aspetto significativo della progressione del cancro che coinvolge la migrazione delle cellule tumorali nei tessuti contigui e la dissoluzione di proteine ​​della matrice extracellulare. Qui abbiamo valutato l'invasione delle cellule tumorali attraverso Transwell saggi. Come mostrato nella Figura 3C, la trasfezione di siRNA HOTAIR ostacolato le capacità migratoria BGC-823 cellule di circa il 66%. Un effetto corrispondente invasività è stata anche osservata in un saggio di invasione parallelo. Al contrario, la trasfezione di cellule SGC-7901 con pCDNA /HOTAIR vettore ha promosso la migrazione cellulare e l'invasività ~ 1,9 volte (Figura 3D). Questi dati indicano che HOTAIR ha proprietà oncogeniche che possono promuovere un fenotipo migratorio e invasivo in cellule di cancro gastrico.
HOTAIR promuove la tumorigenesi delle cellule di cancro gastrico in vivo
di esplorare se il livello di espressione HOTAIR colpisce tumorigenesi, BGC-823 cellule trasdotte con il vettore sh-HOTAIR /pENTR (EV) sono stati utilizzati in un modello di topo xenotrapianto nudo. Fino a 16 giorni dopo knockdown di HOTAIR, c'è stata una diminuzione drastica del volume del tumore e del peso nel gruppo sh-HOTAIR rispetto ai controlli (Figura 4A, B e C). Successivamente, l'analisi immunoistochimica del PCNA marker di proliferazione è stata effettuata nei tessuti tumorali asportati. In confronto con quello in tumori formati da cellule di controllo, tumori sh-HOTAIR-derivati ​​hanno mostrato significativamente ridotto PCNA positività (Figura 4D). Questi risultati suggeriscono che il livello di espressione HOTAIR è significativamente associato con la capacità in vivo proliferazione delle cellule di cancro gastrico. Figura 4 Effetto di HOTAIR knockdown sulla crescita tumorale in vivo. (A) le curve di crescita del tumore sono state misurate dopo l'iniezione di BGC-823 cellule trasfettate con sh-HOTAIR o pENTR vettoriale. volume del tumore è stato calcolato ogni 3 giorni. I dati sono presentati come media ± S.D. (N = 5). (B) il peso del tumore. I valori sono mezzo di peso del tumore ± S.D. (C) qRT-PCR di espressione HOTAIR nei tessuti di tumori asportati. (D) I tumori sviluppati da BGC-823 cellule /sh-Hotair hanno mostrato un più basso livello di proteine ​​PCNA di tumori sviluppati da cellule vettore BGC-823 /pENTR. Tomaia: H & E colorazione; Inferiore: immunocolorazione. * P < 0.05 e ** P < 0.01.
HOTAIR è un bersaglio di miR-331-3P e miR-124
L'analisi bioinformatica delle sequenze di riconoscimento miRNA sulla HOTAIR rivelato la presenza di 11 miRNA tumore soppressiva siti di legame. Il HOTAIR cDNA è stato clonato a valle del gene della luciferasi e denominato RLuc-HOTAIR (Figura 5A), poi transfettate insieme a vari plasmidi miRNA-codifica. RNO-miR-344 ha agito come un controllo negativo. I risultati hanno mostrato che l'attività della luciferasi è stato ridotto del 48% e del 31% rispetto al controllo vettoriale vuoto quando miR-331-3p e miR-124 sono stati espressi, rispettivamente. Questi dati dimostrano che sia miR-331-3p e miR-124 possono direttamente legarsi a HOTAIR attraverso rispettivi siti di riconoscimento miRNA (Figura 5B pannello di sinistra). Figura 5 HOTAIR è un obiettivo di miR-331-3P o miR-124 e miR-bersaglio controlla 331-3p. (A) Le 11 putativi siti di legame miRNA nella sequenza HOTAIR. Il HOTAIR cDNA contenente i siti di riconoscimento miRNA putativi è stato clonato a valle del gene della luciferasi e denominato RLuc-HOTAIR. (B) A sinistra: Il plasmide reporter luciferasi (RLuc-HOTAIR) è stato co-trasfettato in cellule HEK-293 T con le 11 diverse plasmidi miRNA-codifica. A destra: il plasmide reporter luciferasi contenente wild-type o mutante HOTAIR è stato co-trasfettato in cellule HEK-293 T con miR-331-3p in parallelo con un vettore plasmide vuoto. l'attività luciferasi è stata determinata utilizzando il saggio doppio luciferasi e mostrato come l'attività luciferasi relativa normalizzata all'attività renilla. Istogramma indica i valori della luciferasi misurati 48 ore dopo la trasfezione. (C) La 3'-UTR di HER2 è stata fusa alla regione luciferasi di codifica (RLuc-HER2 3'-UTR) e trasfettati in cellule HEK293T con miR-331-3p per confermare HER2 è il bersaglio di miR-331-3p. RLuc-HER2 3'-UTR e costrutti miR-331-3p sono state co-trasfettate in cellule HEK293T con plasmidi che esprimono HOTAIR (pCDNA /HOTAIR) o con un vettore di controllo per verificare l'attività Cerna di HOTAIR. RNO-miRNA-344 è stato utilizzato come controllo negativo. Istogramma indica i valori della luciferasi misurati 48 ore dopo la trasfezione. (D) RIP con il mouse monoclonale anti-Ago2, IgG preimmune o l'ingresso al 10% da BGC estratti 823-cellule. livelli di RNA in immunoprecipitati sono stati determinati da qRT-PCR. Top: livelli di HOTAIR, miRNA331-3P e FOS RNA sono stati presentati come arricchimento volte Ago2 rispetto al immunoprecipitati IgG. In basso: relativi livelli di RNA di U1 snRNA in SNRNP70 rispetto al immunoprecipitati IgG. I numeri sono S.D. media ± (N = 3). (E) Analisi Western Blot dei livelli della proteina HER2 in seguito al trattamento di BGC-823 cellule con SI-HOTAIR o pCDNA /HOTAIR, e le cellule SGC-7901 con pCDNA /HOTAIR. GAPDH è stato utilizzato come controllo. * P < 0.05, ** P < 0,01 e N.S. non significativo.
Qui, abbiamo scelto miR-331-3p come modello miRNA per ulteriori studi. Ad ulteriore conferma che la riduzione dell'attività della luciferasi dal vettore RLuc-HOTAIR-WT era dovuto a dirigere l'interazione tra il miRNA e il suo sito di legame putativo, abbiamo mutato il sito di legame miR-331-3p per mutagenesi sito-specifica, con conseguente RLuc -HOTAIR-Mut. Come previsto, la soppressione dell'attività di luciferasi è stata completamente abolita in questo costrutto mutante rispetto al wild-type vettore (Figura 5B pannello di destra).
HOTAIR e miR-331-3p entrambi si legano con AGO2 in cellule di cancro gastrico
miRNA sono notoriamente presente nel citoplasma in forma di miRNA ribonucleoproteine ​​complessi (miRNPs) che contengono anche Ago2, il componente principale del RNA-induced silencing complex (RISC) [17, 18]. Per verificare se associa hotair con miRNPs, RNA legame immunoprecipitazione di proteine ​​(RIP) esperimenti sono stati condotti su estratti cellulari BGC-823 utilizzando anticorpi contro Ago2. livelli di RNA in immunoprecipitati sono stati determinati da qRT-PCR. HOTAIR era preferenzialmente arricchito (354 volte) in Ago2 contenente miRNPs relativi al controllo di immunoglobuline G (IgG) immunoprecipitati. Analogamente, miRNA-331-3p stato rilevato a livello 840 volte maggiore di quello del controllo anti-IgG. immunoprecipitazione successo di RNA Ago2-associata è stata verificata mediante qRT-PCR, utilizzando primer RIP contro FOS umani inclusi nel kit RIPAb + Ago2 (Figura 5D, pannello superiore). Inoltre, anti-SNRNP70 è stato usato come controllo positivo per la procedura RIP, e U1 snRNA stato anche rilevato un livello 206 volte maggiore di quella di anti-IgG (Figura 5D, pannello inferiore). Così, HOTAIR è presente in Ago2 contenenti miRNPs, probabilmente attraverso l'associazione con miRNA-331-3p, in linea con i nostri saggi di analisi e luciferasi bioinformatici.
HOTAIR controlla il target miR-331-3p, HER2
Tra i tanti obiettivi di miR-331-3p, ci siamo concentrati sulla HER2 dato che codifica per una proteina transmembrana con una funzione rilevante nella carcinogenesi e la resistenza alla terapia a base di trastuzumab [19]. La 3'-UTR di HER2 è stata fusa alla regione luciferasi di codifica (RLuc-HER2 3'-UTR) e trasfettate con plasmidi che codificano miR-331-3p e un vettore plasmide vuoto. RNO-miRNA-344 ha agito come un controllo negativo. Il saggio luciferasi ha dimostrato che miR-331-3p significativamente inibito l'attività della luciferasi (~ inibizione 41%) del RLuc-HER2 3'-UTR giornalista, confermando che HER2 è un bersaglio di miR-331-3p. Il RLuc-HER2 3'-UTR costrutto è stato successivamente transfettate con plasmidi codifica miR-331-3p e HOTAIR (pCDNA /HOTAIR). saggi luciferasi indicato che, in presenza di HOTAIR, RLuc-HER2 3'-UTR repressione è stata ripristinata rispetto al gruppo di controllo (Figura 5C). Questo indica che HOTAIR agisce come un 'spugna' endogena legandosi miR-331-3p, abolendo così l'attività reprimere miRNA indotta sul HER2 3'-UTR.
Inoltre, l'effetto dell'espressione HOTAIR sulla proteina HER2 endogeno combinazione con la modulazione dei livelli di miRNA o lncRNA è stata monitorata dai diversi approcci illustrati nella Figura 5E: (1) sovraespressione miR-331-3p contro HER2 in BGC-823 cellule; (2) HOTAIR atterramento contro HER2 in BGC-823 cellule; (3) sovraespressione HOTAIR per HER2 nelle cellule SGC-7901. Western blot analisi mostrava che l'espressione forzata del miR-331-3p o atterramento di HOTAIR in BGC-823 cellule innescato un significativo effetto di silenziamento sull'espressione della proteina HER2 endogena. Inoltre, l'espressione della proteina HER2 era marcatamente sovraregolati dopo trasfezione con HOTAIR in SGC-7901 cellule, che dimostra un livello relativamente basso di espressione HOTAIR endogeno.
Insieme, questi dati indicano che legandosi miR-331-3p, HOTAIR funge da Cerna per il bersaglio HER2 mRNA, modulando in tal modo la derepression di HER2 e imponendo un ulteriore livello di regolazione post-trascrizionale.
miR-331-3p e miR-124 sopprimere le cellule del cancro gastrico proliferazione
per servire come un lavandino endogena per target miRNA, l'abbondanza di HOTAIR dovrebbe essere paragonabile o superiore miR-331-3p /miR-124. Nel nostro studio, analisi qRT-PCR ha dimostrato che miR-331-3p /miR-124 espressione è stata inversamente correlata con l'espressione HOTAIR in 20 coppie di tumori gastrici avanzati (Figura 6a). Per convalidare se miR-331-3p e miR-124 potrebbero anche inibire la proliferazione delle cellule tumorali gastrica, abbiamo forzato la loro espressione in BGC-823 cellule usando plasmidi miRNA-encoding. I livelli di espressione di miRNA-331-3p e miR-124 trasfettate in BGC-823 cellule sono state significativamente aumentate di 36 volte e 29 volte, rispettivamente, rispetto alle cellule di controllo (figura 6b). saggi Avanti, MTT e colonia-formazione sono state eseguite per determinare la vitalità cellulare. I risultati dei test e di crescita curve MTT hanno rivelato che le cellule trasfettate con miR-331-3p o miR-124 hanno mostrato un significativo ritardo nella crescita se confrontato con le cellule trasfettate con vettore vuoto (Figura 6C). Questi dati indicano che la sovraespressione di miR-331-3p o l'espressione di miR-124 può arrestare la proliferazione delle cellule del cancro gastrico, che è coerente con i risultati di espressione HOTAIR atterramento in BGC-823 cellule. Figura 6 correlazione positiva tra HOTAIR e HER2 espressione e la rilevanza di /miR-124 livelli di espressione di miR-331-3p. (A) analisi di correlazione bivariata del rapporto tra espressione HOTAIR e miR-331-3p, o il livello di miR-124. (B) BGC-823 cellule sono state trasfettate con plasmidi che codificano miR-331-3p o miR-124, e qRT-PCR è stato utilizzato per rilevare i livelli di miRNA rispetto ai controlli (miR-NC). (C) saggio MTT e saggio di crescita delle colonie di formazione sono state eseguite per determinare la proliferazione di miR-331-3p o miR-124 trasfettate BGC-823 cellule. (D) A sinistra: immunocolorazione della proteina HER2 in campioni di tessuto carcinoma gastrico avanzato. Tomaia: immunocolorazione di HER2 è stato negativo nei tessuti di cancro gastrico con l'espressione relativamente basso HOTAIR. Inferiore: immunocolorazione di HER2 è stato positivo nei tessuti di cancro gastrico con l'espressione relativamente alta HOTAIR. A destra: analisi di correlazione bivariata del rapporto tra HOTAIR e HER2 livello di espressione. * P < 0.05, ** P < 0.01.
HER2 è coexpressed con HOTAIR nei tessuti di cancro gastrico
Il tasso di iperespressione di HER2 è stato segnalato per essere 7-34% nel cancro gastrico, ed è stata associata con la malattia più aggressiva e più poveri la sopravvivenza nel carcinoma gastrico [19]. Abbiamo rilevato espressione di HER2 in 50 tessuti avanzati del cancro gastrico (stadio III /IV) selezionati dai precedenti 78 tessuti di cancro gastrico mediante immunoistochimica (IHC) e l'analisi qRT-PCR. I risultati di colorazione IHC hanno mostrato HER2 proteine ​​positività nel 56% dei 50 tessuti di cancro gastrico selezionati. Ottanta-sei per cento di questi campioni positivi HER2 sono stati da stadio avanzato III /IV tumori, e il 71% visualizzata espressione alta HOTAIR (Figura 6D e sui file 2: Tabella S2). analisi di correlazione bivariata ha mostrato che l'espressione di HER2 è risultata significativamente correlata con HOTAIR livello di trascrizione nei tessuti di cancro gastrico rispetto alle controparti normali (Figura 6D). Questi dati indicano che l'espressione di HER2 è correlata positivamente con HOTAIR upregulated in campioni di tessuto di cancro gastrico, suggerendo che la caratterizzazione dell'interazione HER2 /HOTAIR potrebbe essere biologicamente significativo nella tumorigenesi gastrico.
In particolare, a causa di una fase continua III /di prova IV, il tasso iperespressione HER2 rilevata nel presente studio è superiore alla gamma mediana precedentemente riportato. Questo aumento del tasso di HER2 è fortemente legata alla scarsi risultati per i pazienti con carcinoma metastatico e di alta qualità localizzati tumori gastrici, sottolineando così l'importanza di HER2 nello sviluppo del cancro gastrico e metastasi
. Discussione
LncRNAs, che sono più che 200 nucleotidi di lunghezza con una capacità codificante limitata, sono spesso espressi in maniera da malattia, tessuto- o di sviluppo specifici stadi, che indica le funzioni specifiche per lncRNAs in fase di sviluppo e le malattie e stabilisce che tali molecole target terapeutici interessanti [20-22]. Una serie di recenti documenti hanno rivelato che la disregolazione di questi lncRNAs può anche influenzare la regolazione del genoma degli eucarioti e fornire un vantaggio di crescita cellulare, con conseguente crescita del tumore progressiva e incontrollata [23-25]. Pertanto, lncRNAs può fornire un pezzo mancante del altrimenti noto rompicapo rete soppressore del tumore e oncogenici.
In questo studio, abbiamo testato l'espressione di HOTAIR in campioni di carcinoma gastrico ed i loro tessuti non tumorali circostanti. Abbiamo anche individuato la funzione di HOTAIR nelle cellule di carcinoma gastrico mediante l'applicazione di GAIN- e gli approcci di perdita-di-funzione. I risultati hanno dimostrato che HOTAIR era upregulated nei tessuti carcinoma gastrico in confronto con i tessuti normali gastrici adiacenti, e che HOTAIR upregulation correlata con le dimensioni del tumore più grande, avanzato stadio patologico ed estesa metastasi. Inoltre, il tempo di sopravvivenza complessiva dei pazienti con bassi livelli di espressione HotAir era significativamente più lungo di quello dei pazienti con livelli di espressione HOTAIR moderati o forti. Inoltre, HOTAIR sovraespressione promosso la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di carcinoma gastrico, mentre l'esaurimento HOTAIR inibito l'invasione delle cellule e la vitalità delle cellule, e l'arresto della crescita indotto sia in vitro che in vivo. Inoltre, HOTAIR soppressione ha portato alla promozione di apoptosi delle cellule gastriche. Questi risultati suggeriscono che HOTAIR gioca un ruolo diretto nella modulazione di molteplici proprietà oncogeniche e la progressione del cancro gastrico, stimolando nuove direzioni di ricerca e le opzioni terapeutiche considerando HOTAIR come marcatore prognostico romanzo e obiettivo terapeutico nel cancro gastrico.
L'importanza della lncRNAs in malattia umana può essere associato con la loro capacità di influenzare le funzioni cellulari attraverso vari meccanismi. In questo studio, per quanto riguarda il meccanismo di HOTAIR è interessato, vale la pena ricordare che subcellulare analisi localizzazione HOTAIR dall'RNA fluorescence in situ ibridazione saggio dimostra la localizzazione di HOTAIR sia al nucleo e citoplasma [24]. E 'evidente che HOTAIR nucleare può avere come bersaglio Polycomb repressivo complesso 2, alterando H3K27 modelli di metilazione e di espressione genica in tutto il genoma [10, 11]. Un recente lavoro ha registrato una funzione di impalcatura per HOTAIR nel citoplasma come un induttore di proteolisi ubiquitina-mediata [26]. Tuttavia, le proprietà cancerogeni e l'eterogeneità meccanicistica della HOTAIR, ed in particolare quelli della forma citoplasmatica, sono ben lungi dall'essere completamente chiarita.
Ispirato rete regolamentare il 'RNA endogeni competitivi' e prove emergenti che suggerisce che lncRNAs può partecipare a questo circuiti normativo, abbiamo ipotizzato che HOTAIR può anche servire come un Cerna e così abbiamo cercato per potenziali interazioni con miRNA. A sostegno di questo concetto, abbiamo impiegato analisi bioinformatica e saggi di luciferasi per convalidare la capacità di legame diretto degli elementi di risposta miRNA previsti sul full-length HOTAIR trascrizione. (B). GAPDH è stato utilizzato come controllo. * P < 0.05. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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