funciones Lnc ARN de aire caliente como un ARN endógeno en competencia para regular la expresión de HER2 con una esponja miR-331-3p en cancer

gástrica funciones Lnc ARN de aire caliente como un ARN endógeno en competencia para regular la expresión de HER2 con una esponja miR-331-3p en el cáncer gástrico
Resumen
Antecedentes
la acumulación de pruebas indica que la larga no codificante ARN HOTAIR juega un papel crítico en la progresión del cáncer y la metástasis. Sin embargo, sigue siendo en gran parte desconocido el papel biológico en general y la importancia clínica de HOTAIR en la carcinogénesis gástrica.
Métodos
expresión HOTAIR se midió en 78 muestras de tejidos emparejados cancerosos y no cancerosos mediante PCR en tiempo real. Los efectos de HOTAIR en células de cáncer gástrico fueron estudiados por la sobreexpresión y la interferencia de ARN enfoques in vitro e in vivo. Insights del mecanismo de ARN endógenos competitivos (Cerna) se obtuvieron a partir del análisis bioinformático, ensayos de luciferasa y ARN inmunoprecipitación proteína de unión (RIP). Se identificó la interacción positiva HOTAIR /HER2 y verificada mediante un ensayo de inmunohistoquímica y análisis de correlación de dos variables.
Resultados
HOTAIR regulación positiva se asoció con mayor tamaño del tumor, el estadio patológico avanzado y metástasis extensa, y también se correlacionó con la supervivencia general más corta de gástrica pacientes con cáncer. Además, la sobreexpresión HOTAIR promovió la proliferación, migración e invasión de células de carcinoma gástrico, mientras que HOTAIR agotamiento inhibió tanto la invasión de células y la viabilidad celular y la detención del crecimiento inducida in vitro e in vivo. En particular, de aire caliente puede actuar como un Cerna, convirtiéndose prácticamente en un sumidero de miR-331-3p, modulando así la desrepresión de HER2 y la imposición de un nivel adicional de regulación post-transcripcional. Por último, la correlación positiva /HER2 HOTAIR se asoció significativamente con el cáncer gástrico avanzado.
Conclusiones
HOTAIR sobreexpresión representa un biomarcador de mal pronóstico en el cáncer gástrico, y puede conferir fenotipo maligno de las células tumorales. La red de regulación que implica Cerna HOTAIR y la interacción positiva entre HOTAIR y HER2 puede contribuir a una mejor comprensión de la patogénesis del cáncer gástrico y facilitar el desarrollo de diagnósticos y terapéuticas lncRNA-dirige contra esta enfermedad.
Palabras clave
Competir endógeno ARN HER2 HOTAIR gástrico proliferación del cáncer y la invasión de fondo
el cáncer gástrico es la segunda causa principal de muerte inducida por el cáncer, y es la neoplasia gastrointestinal más común en Asia oriental, Europa del Este, y partes de América central y del Sur. En la mayoría de los pacientes, el cáncer gástrico se diagnostica en una etapa avanzada y se acompaña de proliferación maligna, extensa invasión y metástasis linfática. El éxito de las estrategias terapéuticas son limitadas y la mortalidad es alta [1, 2]. Largos ARNs no codificantes (lncRNAs) han ganado recientemente la atención significativa en la delimitación de los complejos mecanismos de los procesos malignos subyacentes, como la carcinogénesis, metástasis y la resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, si queremos entender completamente la carcinogénesis gástrica, debemos tener en cuenta esta familia de reguladores transcripciones que añaden un nuevo nivel de complejidad a la biología del tumor.
Aunque sólo un pequeño número de lncRNAs funcionales han sido bien caracterizado hasta la fecha, se se ha demostrado que regular la expresión génica a varios niveles, incluyendo la modificación de la cromatina, la transcripción y el procesamiento post-transcripcional [3, 4]. Recientemente, un nuevo mecanismo de regulación se ha identificado en la que la interferencia entre lncRNAs y mRNAs se produce al competir por microRNAs compartidos (miRNAs) elementos de respuesta. En este caso, lncRNAs puede funcionar como competidoras ARN endógenos (Cerna) a la esponja de miRNAs, modulando así la desrepresión de los genes miARN objetivos e imponiendo un nivel adicional de regulación post-transcripcional [5]. En informes anteriores, una lncRNA muscular específica, Linc-MD1, se ha informado de que un Cerna que protege el ARN MyoD mensajero (ARNm) de la degradación mediada por miRNA [6]. Pluripotencia asociada a LNC-RoR puede funcionar como un Cerna clave para enlazar la red de miRNAs y factores de transcripción básicos, por ejemplo, Oct4, Sox2, y Nanog, en las células madre embrionarias humanas. Notablemente, lncRNA HULC es altamente regulada positivamente en el cáncer de hígado y juega un papel importante en la tumorigénesis [7]. En particular, HULC puede actuar como una "esponja" endógeno que regula a la baja una serie de actividades miRNAs, incluyendo el miR-372 [8]. Por tanto, proponemos que algunos lncRNAs también pueden tener papeles como Cerna, miRNAs que unen la red y post-transcripcional en la patogénesis gástrico.
HOTAIR (Hox transcripción de ARN antisentido intergénica
) es un largo ARN no codificante ~ 2,2 kb transcrito a partir del Hoxc
locus, que puede reprimir la transcripción en trans
de HOXD
en fibroblastos de prepucio [9]. Como nueva molécula en el campo de la biología del tumor, de aire caliente inicialmente se hizo muy conocido por su participación en los tumores primarios de mama y metástasis de cáncer de mama, en el que la elevación de HOTAIR promovido capacidad de invasión y metástasis [10]. Además, la expresión HOTAIR se correlaciona positivamente con procesos malignos y un peor pronóstico en el cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular, cáncer de páncreas y tumores del estroma gastrointestinal [11-14]. Estudios recientes informaron que HOTAIR se reguló en el cáncer gástrico [15, 16]. Sin embargo, el papel biológico en general y el mecanismo molecular subyacente de HOTAIR en la carcinogénesis gástrica sigue siendo en gran medida sin definir.
En este estudio, mostramos que la regulación positiva HOTAIR es un cambio molecular en el cáncer gástrico característico e investigar las funciones biológicas de HOTAIR en los fenotipos de células de cáncer gástrico in vitro e in vivo. Además, el análisis revela que mecanicista HOTAIR puede funcionar como un cerna para regular la expresión del receptor del factor de crecimiento epitelial humano 2 (HER2) a través de la competencia para miR-331-3p, desempeñando así un papel en la patogénesis oncogénico gástrico. El presente trabajo proporciona la primera evidencia de una correlación positiva HOTAIR /HER2 y la diafonía entre miR-331-3p, de aire caliente y HER2, que arroja nueva luz sobre el tratamiento del cáncer gástrico.
Resultados
expresión está regulada positivamente en HOTAIR tejidos de cáncer gástrico humano comentario El nivel de expresión HOTAIR se determinó en 78 muestras de cáncer gástrico emparejados y tejidos adyacentes, histológicamente normales de QRT-PCR, y se normalizó a GAPDH. expresión HOTAIR se upregulated significativamente en los tejidos cancerosos (media razón de 14,35 veces, P < 0,01) en comparación con sus homólogos normales (Figura 1A). El examen de la correlación entre la expresión HOTAIR y características patológicas clínicas mostró que HOTAIR upregulation se correlacionó con mayor tamaño del tumor, el estadio patológico avanzada, metástasis a distancia (Figura 1B y C), metástasis de ganglios linfáticos y la diferenciación de células tumorales (Tabla 1). Sin embargo, la expresión HOTAIR no se asoció con la posición del tumor o el sexo del paciente (Tabla 1). Con respecto a la supervivencia global, los pacientes con una expresión de alto HOTAIR tenían un pronóstico significativamente peor que aquellos con expresión HOTAIR baja (P < 0,001, prueba de log-rank; Figura 1D). Estos resultados implican que HOTAIR sobreexpresión puede ser útil en el desarrollo de nuevos marcadores de pronóstico o la progresión de cáncer gástrico. Figura 1 HOTAIR expresión relativa en tejidos de cáncer gástrico y su importancia clínica. (A) expresión relativa de HOTAIR en tejidos de cáncer gástrico (n = 78) en comparación con los tejidos normales correspondientes no tumorales (n = 78). HOTAIR expresión fue examinado por QRT-PCR y se normalizó a la expresión de GAPDH. Los datos se presenta como factor de cambio en los tejidos tumorales en relación con los tejidos normales. (B) El examen de la correlación entre la expresión HOTAIR y rasgos patológicos clínicos mostró que la regulación positiva HOTAIR correlacionado con mayor tamaño del tumor y el estadio patológico avanzado. expresión (C) HOTAIR fue significativamente mayor en los pacientes con metástasis a distancia que en aquellos con metástasis no distante. (D) de Kaplan-Meier de supervivencia global de acuerdo con el nivel de expresión HOTAIR. La supervivencia global del grupo de alta HOTAIR (n = 39: Relación de mediana HOTAIR expresión ratio ≥) fue significativamente mayor que el de grupo de bajo HOTAIR (n = 39; HOTAIR relación de relación de expresión ≤ mediana; P < 0,001, log rank test). * P < 0,05, ** P < 0.01.
Tabla 1 Correlación de la expresión de HOTAIR con las características clínico-patológicas
Características clínico
n (%) guía empresas expresión relativa de HOTAIRa
P-valorB
Género
P = 0,62
Hombre
50 (64)
12,21 (0,97-17,53)
Mujer
28 (36)
15.01 (7.34 -19,52)
sitio del tumor
P = 0,910
distal de terceros 18 (23)
9.1 (1,37-14,12)
medio de terceros 20 (26)
7,96 (2,55-9,72)
proximal del estómago
40 (51)
7,76 (1,24-13,58)
Diferenciación
P = 0,045
Pobre
56 (72)
15,6 (6,25-20,36)
alta /moderada
22 (28)
8.1 (0,98-11,14)
metástasis ganglionares
P = 0,005
N0 10
(13)
1,14 (0,75-1,42)
N1 página 11 (14)
3,44 (1,15-4,85)
N2
29 (37)
11.99 (7.15- 14.77)
N3
28 (36)
32.58 (7,34-36,27)
enfermedad metastásica
P = 0,029
M0
64 (82)
9,35 (2,53 -33,64)
M1 página 14 fig
28,82 (16,39-39,39)
aMedian de expresión relativa, con el percentil 25-75º entre paréntesis. BP < 0,05 fue considerado significativo (U de Mann-Whitney
prueba entre 2 grupos y test de Kruskall-Wallis para 3 grupos).
La manipulación de los niveles de aire caliente en células de cáncer gástrico
A continuación realizó QRT-PCR análisis para examinar la niveles de expresión de HOTAIR en varias líneas celulares de cáncer, incluyendo gástrico, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y células de cáncer de mama derivado. Como se muestra en la figura 2A, de las cuatro líneas celulares de cáncer gástrico investigados (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, y AGS), BGC-823 expresaron niveles más altos de HOTAIR (3,18 veces) que la célula epitelial gástrica normal línea (GES-1). Del mismo modo, la línea celular de NSCLC, SPC-A1, mostró una regulación positiva de 3,73 veces mayor de aerostático sobre la línea normal de células epiteliales bronquiales humanas, 16HBE. La línea celular de cáncer de mama altamente metastásico MDA-MB-231 mostró una regulación al alza 4,77 veces de HOTAIR en comparación con las células MCF-7 (Figura 2A). Nuestros datos sugieren que HOTAIR puede ser con frecuencia aumentada en muchas células tumorales. Figura 2 El nivel de expresión HOTAIR en células de cáncer gástrico y su efecto sobre la proliferación celular in vitro. (A) Los resultados de QRT-PCR que demuestran aerostático niveles de expresión de las líneas celulares de cáncer gástrico (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, y AGS) en comparación con la línea celular de epitelio gástrico normales (GES-1), línea de células de NSCLC ( SPC-A1), en comparación con la línea humana normal bronquial de células epiteliales (16HBE), y líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231 en comparación con las células MCF-7. análisis (B) QRT-PCR de células después del tratamiento el nivel de expresión HOTAIR BGC-823 con siRNAs dirigidos a células SGC-7901 de aire caliente y el tratamiento con pCDNA /HOTAIR vectorial. Se llevó a cabo el ensayo (C) MTT para determinar la proliferación de células BGC-823 transfectadas-si-HOTAIR o células transfectadas SGC-7901-HOTAIR pCDNA /. Los datos representan la media ± s.d. de tres experimentos independientes. (D) ensayo de crecimiento formadoras de colonias se realizó para determinar la proliferación de si-HOTAIR células transfectadas BGC-823. Se contaron las colonias y capturados. * P < 0,05 y ** P < 0.01.
A manipular los niveles de aire caliente en células de cáncer gástrico, un vector pCDNA /HOTAIR se transfectó en las células y los si-HOTAIR SGC-7901 se transfectó en células BGC-823, respectivamente. QRT-PCR análisis de los niveles de aire caliente se realizó a 48 h después de la transfección y expresión reveló que HOTAIR se incrementó 98 veces en las células SGC-7901, en comparación con las células de control. Sin embargo, en las células BGC-823, la expresión HOTAIR era efectivamente el 75% derribado por si-HOTAIR2, el siRNA más eficaz utilizado posteriormente en los siguientes experimentos (Figura 2B).
Efecto de HOTAIR sobre la proliferación celular y la apoptosis in vitro
el aumento significativo de la expresión HOTAIR en muestras de cáncer gástrico nos llevó a explorar la posible significación biológica de HOTAIR en la tumorigénesis. MTT ensayo reveló que el crecimiento celular se deteriora de manera significativa en BGC-823 células transfectadas con si-HOTAIR, mientras que la proliferación de células SGC-7901 se incrementó en células /HOTAIR transfectadas pcDNA comparación con los controles respectivos (Figura 2C). Del mismo modo, el resultado de la formación de colonias de ensayo revelaron que la supervivencia clonogénico se redujo después de la inhibición de HOTAIR en las células BGC-823 (Figura 2D).
Para determinar si la apoptosis fue un factor que contribuye a la celda de inhibición del crecimiento, se realizó la tinción Hoechst y El análisis por citometría de flujo de células BGC-823 tratadas-si-HOTAIR. Los datos mostraron que el número de células con núcleos condensados ​​y fragmentados que indican la fracción de células apoptóticas tempranas fue significativamente mayor en-HOTAIR tratados si BGC-823 células en comparación con las células tratadas-si-NC (Figura 3A y B). Además, se encontró que la inhibición de la apoptosis HOTAIR mejorada de la caspasa-3-dependiente, demostrado por análisis de transferencia Western de la caspasa-3 activada después si-HOTAIR transfección (archivo adicional 1: Figura S1). Tomados en conjunto, estos resultados indican que desmontables de HOTAIR suprime la proliferación de células de cáncer gástrico e induce la apoptosis in vitro. Figura 3 El efecto de HOTAIR sobre la apoptosis de células de cáncer gástrico, la migración y la invasión in vitro. células BGC-823 se transfectaron con si-si-HOTAIR o Carolina del Norte, y las células SGC-7901 fueron transfectadas con el vector pCDNA /HOTAIR o control de vector vacío. (A) ensayo de tinción Hoechst de apoptosis de las células; se determinó el porcentaje de núcleos Hoechst-positivas por campo óptico (al menos 50 campos). (B) Las tasas de apoptosis de células se detectaron mediante citometría de flujo. UL, células necróticas; UR, células apoptóticas terminales; LR, los primeros células apoptóticas. se realizaron ensayos (C y D) Transwell para investigar los cambios en la migración celular y la invasión. * P < 0,05 y ** P < 0.01.
HOTAIR promueve la migración y la invasión de células de cáncer gástrico in vitro
Cell invasión es un aspecto importante de la progresión del cáncer que implica la migración de las células tumorales en los tejidos contiguos y la disolución de proteínas de matriz extracelular. Aquí evaluamos la invasión de las células cancerosas a través transwell ensayos. Como se muestra en la Figura 3C, la transfección de ARNsi HOTAIR impedida la capacidad migratoria de células BGC-823 por aproximadamente 66%. Un efecto correspondiente en la invasividad también se observó en un ensayo de invasión paralelo. A la inversa, la transfección de células SGC-7901 con pCDNA /HOTAIR vector promueve la migración celular y la invasión ~ 1,9 veces (Figura 3D). Estos datos indican que HOTAIR tiene propiedades oncogénicas que pueden promover un fenotipo migratorio e invasivo de células de cáncer gástrico.
HOTAIR promueve la tumorigénesis de células de cáncer gástrico in vivo
Para explorar si el nivel de expresión HOTAIR afecta a la tumorigénesis, BGC-823 se utilizaron células transducidas con el vector sh-HOTAIR /pENTR (EV) en un modelo de xenoinjerto en ratones nude. Hasta 16 días después de desmontables de aire caliente, se observó una disminución dramática en el volumen del tumor y el peso en el grupo SH-HOTAIR comparación con los controles (Figura 4A, B y C). A continuación, el análisis de inmunotinción de la PCNA marcador de proliferación se llevó a cabo en los tejidos tumorales resecados. En comparación con el de los tumores formados a partir de las células de control, los tumores derivados de sh-HOTAIR mostraron una reducción significativa PCNA positividad (Figura 4D). Estos resultados sugieren que el nivel de expresión HOTAIR se asocia significativamente con la capacidad de proliferación in vivo de células de cáncer gástrico. Figura 4 Efecto de HOTAIR caída sobre el crecimiento tumoral in vivo. (A) Curvas de crecimiento de los tumores se midieron después de la inyección de BGC-823 células transfectadas con sh-HOTAIR o vector pENTR. El volumen del tumor se calculó cada 3 días. Los datos se presentan como media ± s.d. (N = 5). (B) El peso del tumor. Los valores son medias de peso del tumor ± S. D. (C) Análisis QRT-PCR de la expresión HOTAIR en los tejidos de tumores resecados. (D) Los tumores desarrollados a partir de BGC-823 células /sh-HOTAIR mostraron un menor nivel de proteína PCNA que los tumores desarrollados a partir de células de vectores BGC-823 /pENTR. Alto: H & tinción de E; Inferior: inmunotinción. * P < 0,05 y ** P < 0.01.
HOTAIR es un objetivo de miR-331-3P y miR-124
Bioinformática análisis de secuencias de reconocimiento de miARN en HOTAIR reveló la presencia de 11 miRNAs con el tumor supresor sitios de unión. El cDNA HOTAIR se clonó aguas abajo del gen de luciferasa y nombrado Rluc-HOTAIR (Figura 5A), a continuación, transfectadas junto con diversos plásmidos miARN codificante. RNO-miR-344 actuó como control negativo. Los resultados mostraron que la actividad de la luciferasa se redujo en un 48% y un 31% en comparación con el control del vector vacío cuando miR-331-3p y miR-124 se expresaron, respectivamente. Estos datos demuestran que tanto el miR-331-3p y miR-124 se pueden unir directamente a HOTAIR través de los respectivos sitios de reconocimiento de miARN (Figura 5B izquierda del panel). Figura 5 HOTAIR es un objetivo de miR-331-3P o miR-124 y miR-controla objetivo 331-3p. (A) Los 11 sitios de unión miARN putativo de la secuencia HOTAIR. El cDNA HOTAIR que contiene los sitios de reconocimiento de miRNAs putativo fue clonado aguas abajo del gen de la luciferasa y nombrado Rluc-HOTAIR. (B) A la izquierda: El plásmido indicador de luciferasa (Rluc-HOTAIR) fue co-transfectaron en células HEK-293 T con los diversos plásmidos 11 miARN-codificación. A la derecha: el plásmido informador de luciferasa que contiene de tipo salvaje o mutante HOTAIR se co-transfectaron en células HEK-293 T con el miR-331-3p en paralelo con un vector de plásmido vacío. Se determinó la actividad de luciferasa usando el ensayo de luciferasa dual y muestra como la actividad de luciferasa relativa normalizada a la actividad de Renilla. Histograma indica los valores de luciferasa medida 48 h después de la transfección. (C) El 3'-UTR de HER2 se fusionó a la región codificante de luciferasa (Rluc-HER2 3'-UTR) y se transfectó en células HEK293T con miR-331-3p confirmar HER2 es el objetivo de miR-331-3p. Rluc-HER2 3'-UTR y construcciones de miR-331-3p se co-transfectaron en células HEK293T con plásmidos que expresan HOTAIR (pCDNA /HOTAIR) o con un vector de control para verificar la actividad de cerna HOTAIR. RNO-miARN-344 se usó como un control negativo. Histograma indica los valores de luciferasa medida 48 h después de la transfección. (D) RIP con anticuerpos monoclonales de ratón anti-Ago2, IgG preinmune o entrada de 10% a partir de extractos de BGC-823 células. los niveles de ARN en los inmunoprecipitados se determinaron mediante qRT-PCR. Top: niveles de aire caliente, miRNA331-3P y ARN FOS se presentaron como el enriquecimiento veces en Ago2 en relación con inmunoprecipitados de IgG. Conclusión: los niveles de ARN relativos de U1 snRNA en SNRNP70 en relación con inmunoprecipitados de IgG. Los números son la media ± S. D. (N = 3). (E) Western blot de nivel de la proteína HER2 después del tratamiento de células BGC-823 con si-HOTAIR o pCDNA /aire caliente, y las células SGC-7901 con pCDNA /HOTAIR. GAPDH se utilizó como control. * P < 0,05, ** P < 0,01 y N.S. no es significativo.
En esto, se optó por el miR-331-3p como modelo miARN para estudios posteriores. Para confirmar aún más que la reducción de la actividad de luciferasa a partir del vector Rluc-HOTAIR-WT se debió a la interacción directa entre el miARN y su sitio de unión putativo, mutado el sitio de unión de miR-331-3p por mutagénesis dirigida al sitio, lo que resulta en Rluc -HOTAIR-Mut. Como era de esperar, la supresión de la actividad de la luciferasa fue completamente abolida en esta construcción de mutantes en comparación con el tipo salvaje vector (panel de la derecha Figura 5B).
HOTAIR y miR-331-3p se unen ambos con AGO2 en células de cáncer gástrico son
miRNAs sabe que está presente en el citoplasma en forma de miARN ribonucleoprotein complejos (miRNPs) que también contienen Ago2, el componente de núcleo de la ARN inducida por silenciar complejo (RISC) [17, 18]. Para probar si los asociados de aire caliente con miRNPs, RNA unión inmunoprecipitación de proteínas (RIP) experimentos se realizaron en extractos de células BGC-823 utilizando anticuerpos contra Ago2. los niveles de ARN en los inmunoprecipitados se determinaron mediante qRT-PCR. HOTAIR se enriqueció preferentemente (354 veces) en Ago2 que contienen miRNPs relativas para controlar inmunoprecipitados de inmunoglobulina G (IgG). Del mismo modo, se detectó miRNA-331-3p a un nivel 840 veces mayor que la de control de anti-IgG. inmunoprecipitación con éxito de ARN asociado-Ago2 se verificó mediante QRT-PCR, utilizando cebadores RIP contra FOS humanos incluidos en el kit RIPAb + Ago2 (Figura 5D, panel superior). Por otra parte, anti-SNRNP70 se utilizó como control positivo para el procedimiento de RIP, y U1 snRNA también se detectó en un nivel 206 veces mayor que la de anti-IgG (Figura 5D, panel inferior). Por lo tanto, de aire caliente está presente en miRNPs Ago2 que contienen, probablemente a través de la asociación con los genes miARN-331-3p, consistente con nuestros ensayos y análisis bioinformáticos de luciferasa.
HOTAIR controla el objetivo de miR-331-3p, HER2 Estar entre los muchos objetivos de miR-331-3p, nos concentramos en HER2 ya que codifica una proteína transmembrana con una función relevante en la carcinogénesis y la resistencia a la terapia basada en trastuzumab [19]. El 3'-UTR de HER2 se fusionó a la región codificante de luciferasa (Rluc-HER2 3'-UTR) y se transfectaron con plásmidos que codifican miR-331-3p y un plásmido de vector vacío. RNO-miRNA-344 actuó como control negativo. El ensayo de luciferasa mostró que miR-331-3p inhibió significativamente la actividad de luciferasa (~ 41% de inhibición) de la Rluc-HER2 reportero 3'-UTR, confirmando que HER2 es un objetivo de miR-331-3p. El Rluc HER2-3'-UTR construcción se transfectó posteriormente junto con plásmidos que codifican el miR-331-3p y HOTAIR (pCDNA /HOTAIR). Los ensayos de luciferasa indicaron que, en presencia de aire caliente, Rluc-HER2 3'-UTR represión fue restaurada en comparación con el grupo control (Figura 5C). Esto indica que HOTAIR actúa como una "esponja" endógeno por la unión de miR-331-3p, la supresión de este modo la actividad represora de miARN inducida en el HER2 3'-UTR.
Además, el efecto de la expresión HOTAIR sobre la proteína HER2 endógeno en combinación con la modulación de los niveles de miARN o lncRNA se controló por los diferentes enfoques se muestran en la Figura 5E: (1) la sobreexpresión de miR-331-3p contra HER2 en las células BGC-823; (2) HOTAIR derribo contra HER2 en células BGC-823; (3) la sobreexpresión de HER2 en HOTAIR de células SGC-7901. Western blot mostró que la expresión forzada de miR-331-3p o desmontables de HOTAIR en las células BGC-823 provocó un efecto silenciador significativo en la expresión de proteínas HER2 endógeno. Además, la expresión de proteína HER2 se upregulated notablemente después de la transfección con HOTAIR en células SGC-7901, lo que demuestra un nivel de expresión relativamente bajo HOTAIR endógeno.
Conjunto, estos datos indican que mediante la unión de miR-331-3p, de aire caliente actúa como un cerna para el objetivo HER2 ARNm, modulando así la desrepresión de HER2 y la imposición de un nivel adicional de regulación post-transcripcional.
miR-331-3p y miR-124 suprime la proliferación de células de cáncer gástrico
para servir como un disipador endógena para la meta miRNAs, la abundancia de HOTAIR debe ser comparable o mayor que el miR-331-3p /miR-124. En nuestro estudio, el análisis de QRT-PCR mostró que el miR-331-3p /miR-124 expresión se correlaciona inversamente con la expresión HOTAIR en 20 pares de tipos de cáncer gástrico avanzado (Figura 6A). Para validar si el miR-331-3p y miR-124 también podrían inhibir la proliferación de células de cáncer gástrico, nos obligó a su expresión en células BGC-823 usando plásmidos que codifican los genes miARN. Los niveles de expresión de los genes miARN-331-3p y miR-124 transfectadas en células BGC-823 se incrementaron significativamente en un 36 veces y 29 veces, respectivamente, en comparación con las células control (Figura 6B). se realizaron ensayos A continuación, MTT y de colonias de formación para determinar la viabilidad celular. Los resultados del ensayo de crecimiento y las curvas de MTT revelaron que las células transfectadas con miR-331-3p o miR-124 mostraron retraso en el crecimiento significativo en comparación con las células transfectadas con el vector vacío (Figura 6C). Estos datos indican que la sobreexpresión de miR-331-3p o la expresión de miR-124 se puede detener la proliferación de células de cáncer gástrico, lo que es consistente con los resultados de la expresión HOTAIR caída en células BGC-823. Figura 6 La correlación positiva entre la expresión HOTAIR y HER2 y la relevancia de miR-331-3p /miR-124 niveles de expresión. (A) Análisis de correlación bivariante de la relación entre la expresión de miR-HOTAIR y 331-3p, o el nivel de miR-124. (B) las células BGC-823 fueron transfectadas con plásmidos que codifican el miR-331-3p o miR-124, y QRT-PCR se utilizó para detectar los niveles de miRNA en comparación con los controles (miR-NC). (C) ensayo de MTT y ensayo de crecimiento de formación de colonias se realizaron para determinar la proliferación de miR-331-3p o miR-124 células BGC-823 transfectadas. (D) A la izquierda: la inmunotinción de la proteína HER2 en muestras de tejido de cáncer gástrico avanzado. Parte superior: inmunotinción de HER2 fue negativo en tejidos de cáncer gástrico con la expresión relativamente baja HOTAIR. Inferior: inmunotinción de HER2 fue positiva en los tejidos de cáncer gástrico con la expresión relativamente alta HOTAIR. Derecha: análisis de correlación bivariada de la relación entre el nivel de expresión HOTAIR y HER2. * P < 0,05, ** P < 0.01.
HER2 se coexpresa con HOTAIR en tejidos de cáncer gástrico comentario El índice de sobreexpresión de HER2 se informó a ser 7-34% en el cáncer gástrico, y se asoció con una enfermedad más agresiva y peor supervivencia en el cáncer gástrico [19]. Hemos detectado expresión de HER2 en 50 tejidos avanzados de cáncer gástrico (etapa III /IV) seleccionados de los anteriores 78 tejidos de cáncer gástrico mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC) y el análisis de QRT-PCR. Los resultados de la tinción IHC mostraron HER2 positividad proteína en 56% de los 50 tejidos de cáncer gástrico seleccionados. Ochenta y seis por ciento de estas muestras HER2 positivos eran de estadio avanzado III /IV tumores, y el 71% muestra una expresión de alto HOTAIR (Figura 6D y archivo adicional 2: Tabla S2). análisis de correlación bivariante mostró que la expresión de HER2 se correlacionó significativamente con el nivel de transcripción HOTAIR en tejidos de cáncer gástrico en comparación con sus homólogos normales (Figura 6D). Estos datos indican que la expresión de HER2 se asocia positivamente con HOTAIR upregulated en muestras de tejido de cáncer gástrico, lo que sugiere que la caracterización de la interacción HER2 /HOTAIR podría ser biológicamente significativa en la tumorigénesis gástrico humano.
Cabe destacar que, a causa de una fase continua III /ensayo IV, la tasa de sobreexpresión de HER2 detectado en el presente estudio es mayor que el rango medio se informó anteriormente. Este aumento de la frecuencia de sobreexpresión de HER2 está fuertemente ligada a malos resultados para los pacientes con metástasis y localizado de grado alto cánceres gástricos, poniendo de manifiesto la importancia de HER2 en el desarrollo del cáncer gástrico y metástasis.
Discusión
lncRNAs, que son más de 200 nucleótidos de longitud, con capacidad de codificación de proteína limitada, a menudo se expresan de una manera enfermedades no transmisibles, tejido o grado de desarrollo específicos, indicando las funciones específicas para lncRNAs en el desarrollo y enfermedades y haciendo estas moléculas atractivas dianas terapéuticas [20-22]. Una serie de estudios recientes han revelado que la desregulación de estos lncRNAs también puede afectar a la regulación del genoma eucariota y proporcionar una ventaja de crecimiento celular, resultando en un crecimiento progresivo del tumor y sin control [23-25]. Por lo tanto, lncRNAs puede proporcionar una pieza que falta en el otro modo conocido rompecabezas red de supresión tumoral y oncogénico.
En este estudio, hemos probado la expresión de HOTAIR en muestras de carcinoma gástrico y sus tejidos no tumorales circundantes. También se identificó la función de HOTAIR en células de carcinoma gástrico mediante la aplicación de enfoques ganancia y pérdida de función. Los resultados demostraron que HOTAIR se upregulated en los tejidos de carcinoma gástrico en comparación con los tejidos normales adyacentes gástricos, y que HOTAIR upregulation correlacionado con el tamaño del tumor más grande, el estadio patológico avanzado y metástasis extensa. Por otra parte, el tiempo de supervivencia global de los pacientes con bajos niveles de expresión de aire caliente fue significativamente más larga que la de los pacientes con niveles de expresión HOTAIR moderados o fuertes. Además, la sobreexpresión HOTAIR promovió la proliferación, migración e invasión de células de carcinoma gástrico, mientras que HOTAIR agotamiento inhibió la invasión de células y la viabilidad celular y la detención del crecimiento inducida tanto in vitro como in vivo. Además, la supresión HOTAIR condujo a la promoción de la apoptosis de las células gástricas. Estos hallazgos sugieren que HOTAIR juega un papel directo en la modulación de múltiples propiedades oncogénicas y la progresión del cáncer gástrico, estimulando nuevas direcciones de investigación y las opciones terapéuticas considerando HOTAIR como un nuevo marcador pronóstico y diana terapéutica en el cáncer gástrico. México La importancia de lncRNAs en enfermedad humana puede estar asociada con su capacidad para afectar las funciones celulares a través de diversos mecanismos. En este estudio, en lo que se refiere al mecanismo de aire caliente, vale la pena mencionar que el análisis de la localización subcelular de HOTAIR por RNA de fluorescencia en el ensayo de hibridación in situ demuestra la localización de HOTAIR tanto para el núcleo y el citoplasma [24]. Es evidente que HOTAIR nuclear puede apuntar polycomb represivo complejo 2, la alteración de los patrones de metilación H3K27 y la expresión de genes en todo el genoma [10, 11]. El trabajo reciente informó una función de andamio para HOTAIR en el citoplasma como un inductor de la proteólisis mediada por ubiquitina [26]. Sin embargo, las propiedades oncogénicas y la heterogeneidad mecanicista de aire caliente, y en particular los de la forma citoplasmática, están lejos de ser completamente aclarada.
Inspirado por red de regulación de los ARN endógenos 'competitivos' y la evidencia emergente que sugiere que lncRNAs puede participar en este circuitos de regulación, la hipótesis de que HOTAIR también puede servir como un Cerna y así se realizaron búsquedas de las posibles interacciones con los miRNAs. 0.05. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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