LNC RNA HOTAIR funciona como um RNA endógeno competindo para regular a expressão do HER2 por esponja miR-331-3p em cancer

gástrica funções LNC RNA HOTAIR como um RNA endógeno competindo para regular a expressão do HER2 por esponja miR-331-3p no câncer gástrico da arte abstracta
fundo
Acumulando evidência indica que o tempo não codificante de ARN HOTAIR desempenha um papel fundamental na progressão e metástase do cancro. No entanto, o papel biológico em geral e significado clínico HOTAIR na carcinogênese gástrica permanece em grande parte desconhecido.
Métodos
expressão HOTAIR foi medida em 78 emparelhado amostras de tecidos cancerosos e não cancerosos por PCR em tempo real. Os efeitos de HOTAIR em células gástricas cancerosas foram estudados por sobre-expressão de ARN e interferência abordagens in vitro e in vivo. Insights do mecanismo de RNAs endógenos competitivos (CERNAS) foram obtidas a partir de análise bioinformática, ensaios de luciferase e RNA imunoprecipitação proteína de ligação (RIP). foi identificado e verificadas por ensaio imuno-histoquímica e análise de correlação bivariada a interação HOTAIR /HER2 positivo.
Resultados
HOTAIR regulação positiva foi associada com o tamanho do tumor maior, estágio patológico avançado e extensa metástase, e também se correlacionou com menor sobrevida global de gástrica pacientes com câncer. Além disso, a sobre-expressão HOTAIR promoveu a proliferação, a migração e a invasão de células de carcinoma gástrico, enquanto a depleção HOTAIR inibida tanto a invasão de células e a viabilidade celular, e a paragem do crescimento induzida in vitro e in vivo. Em particular, HOTAIR pode agir como um Cerna, efetivamente tornando-se um dissipador de miR-331-3p, modulando assim a desrepressão de HER2 e impondo um nível adicional de regulação pós-transcricional. Finalmente, o HOTAIR correlação /HER2 positivo foi significativamente associada com câncer gástrico avançado.
Conclusões
HOTAIR superexpressão representa um biomarcador de mau prognóstico no câncer gástrico, podendo conferir fenótipo maligno de células tumorais. A rede de regulação Cerna envolvendo HOTAIR ea interação positiva entre HOTAIR e HER2 pode contribuir para um melhor entendimento da patogênese do câncer gástrico e facilitar o desenvolvimento de diagnóstico e terapêutica lncRNA-dirigido contra esta doença.
Palavras-chave
Competindo endógena RNA HER2 HOTAIR gástrica Proliferação câncer e invasão fundo
o câncer gástrico é a segunda principal causa de morte induzida por câncer, e é o tumor maligno gastrointestinal mais comum no Leste da Ásia, Europa Oriental e partes da América do Sul e Central. Na maioria dos pacientes, o câncer gástrico é diagnosticado em um estágio avançado e é acompanhada de proliferação maligna, extensa invasão e metástase linfática. estratégias terapêuticas bem sucedidas são limitados e a mortalidade é elevada [1, 2]. Longos RNAs não-codificantes (lncRNAs) recentemente ganhou atenção significativa em delinear os mecanismos complexos processos malignos subjacentes tais como carcinogénese, metástase e resistência aos medicamentos. Portanto, se queremos entender completamente carcinogênese gástrica, precisamos considerar esta família de transcrições de regulamentação que adicionam uma nova camada de complexidade para a biologia do tumor.
Embora apenas um pequeno número de lncRNAs funcionais foram bem caracterizados até à data, eles foi demonstrado que regulam a expressão de genes em vários níveis, incluindo a modificação da cromatina, da transcrição e processamento pós-transcrição [3, 4]. Recentemente, um novo mecanismo de regulação tem sido identificada em que crosstalk entre lncRNAs e mRNAs ocorre competindo por microRNAs (miRNAs) compartilhados elementos de resposta. Neste caso, lncRNAs pode funcionar como concorrentes RNAs endógenos (CERNAS) para esponja miRNAs, modulando assim a desrepressão de alvos de miRNA e impondo um nível adicional de regulação pós-transcricional [5]. Em relatórios anteriores, um lncRNA músculo-específica, Linc-MD1, tem sido relatado para ser um cerna que protege MyoD ARN mensageiro (ARNm) a partir de miARN degradação mediada [6]. LNC-RoR pode funcionar como uma chave de cerna para ligar a rede de miARNs e factores de transcrição nucleares, por exemplo, associada à pluripotência, Oct4, Sox2 e Nanog, em células estaminais embrionárias humanas. Notavelmente, lncRNA HULC é altamente regulada positivamente em cancro do fígado e desempenha um papel importante na tumorigênese [7]. Em particular, HULC pode actuar como um "esponja" endógeno que regula negativamente a uma série de actividades miARNs, incluindo a [8] miR-372. Propomos, portanto, que alguns lncRNAs também podem ter papéis como CERNAS, miRNAs que ligam e da rede de pós-transcricional na patogênese gástrico.
HOTAIR (Hox transcrito antisense RNA intergênico
) é um RNA não-codificante longa ~ 2,2 kb transcrito do HOXC
lócus, que pode reprimir a transcrição em
trans de HOXD
em fibroblastos de prepúcio [9]. Como uma nova molécula no campo da biologia do tumor, HOTAIR inicialmente se tornou conhecido por seu envolvimento em tumores de mama primário e as metástases do cancro da mama, em que a elevação de HOTAIR promovido invasão e metástase [10]. Além disso, a expressão HOTAIR correlaciona-se positivamente com os processos malignos e mau prognóstico no câncer colorretal, carcinoma hepatocelular, câncer de pâncreas e tumores estromais gastrointestinais [11-14]. Estudos recentes relataram que HOTAIR foi regulada positivamente em cancro gástrico [15, 16]. No entanto, o papel biológico global e mecanismo molecular subjacente de HOTAIR na carcinogénese gástrica permanece largamente indefinida.
Neste estudo, que relatam que HOTAIR regulação positiva é característica de uma mudança molecular no cancro gástrico e investigar as funções biológicas dos HOTAIR sobre os fenótipos de células de cancro gástrico in vitro e in vivo. Além disso, a análise revela que mecanicista HOTAIR pode funcionar como um cerna para regular a expressão do receptor do factor de crescimento epitelial humano 2 (HER2) através da competição para miR-331-3p, desempenhando assim um papel na patogénese oncogénica gástrico. O presente trabalho fornece a primeira evidência para uma correlação positiva HOTAIR /HER2 ea interferência entre miR-331-3p, HOTAIR e HER2, lançando nova luz sobre o tratamento do câncer gástrico.
Resultados
expressão HOTAIR é regulada em tecidos de cancro gástrico humano
O nível de expressão HOTAIR foi determinado em 78 amostras de cancro gástrico e emparelhados adjacentes, tecidos histologicamente normais por qRT-PCR, e normalizadas para GAPDH. HOTAIR expressão foi significativamente regulada positivamente em tecidos cancerosos (razão de 14,35 vezes, P <significar; 0,01) em comparação com os seus homólogos normais (Figura 1A). O exame da correlação entre a expressão HOTAIR e características patológicas clínicos mostraram que HOTAIR regulação positiva foi correlacionada com maior tamanho do tumor, estágio patológico avançado, metástases à distância (Figura 1B e C), metástases linfonodais e diferenciação de células tumorais (Tabela 1). No entanto, a expressão HOTAIR não foi associada com a posição do tumor ou sexo do paciente (Tabela 1). Com relação à sobrevida global, os pacientes com expressão alta HOTAIR tiveram um prognóstico significativamente pior do que aqueles com baixa expressão HOTAIR (P < 0,001, teste log-rank; Figura 1D). Estes resultados implicam que HOTAIR sobre-expressão pode ser útil no desenvolvimento de novos marcadores de prognóstico ou progressão para o cancro gástrico. Figura 1 expressão HOTAIR Relativa em tecidos com câncer gástrico e seu significado clínico. (A) Expressão relativa de HOTAIR em tecidos de cancro gástrico (n = 78) em comparação com os correspondentes tecidos normais não tumorais (n = 78). HOTAIR expressão foi examinada por qRT-PCR e normalizada para a expressão de GAPDH. Os dados foram apresentados como vezes de alteração em tecidos tumorais em relação a tecidos normais. (B) A análise da correlação entre a expressão HOTAIR e características patológicas clínicos mostraram que a regulação alta HOTAIR correlacionada com o tamanho do tumor maior e estágio patológico avançado. expressão (C) HOTAIR foi significativamente maior em pacientes com metástases à distância do que naqueles com metástases não-distante. (D) de Kaplan-Meier curvas de sobrevida global de acordo com o nível de expressão HOTAIR. A sobrevivência global do grupo de alta HOTAIR (N = 39: proporção média HOTAIR rácio expressão ≥) foi significativamente mais elevada do que a de baixo HOTAIR grupo (n = 39; HOTAIR rácio razão de expressão ≤ mediano; P < 0,001, log- teste de classificação). * P < 0,05, ** P < 0,01.
Tabela 1 Correlação entre a expressão de HOTAIR com características clínico-patológicas
características clínico-patológicas
n (%)
expressão relativa de HOTAIRa
P-valorB
Sexo
P = 0,62
Masculino
50 (64)
12,21 (0,97-17,53)
Feminino
28 (36)
15,01 (7,34 -19,52)
Sítio de tumor
P = 0,910
terço distal
18 (23)
9,1 (1,37-14,12)
Oriente terceira
20 (26)
7,96 (2,55-9,72)
estômago proximal
40 (51)
7,76 (1,24-13,58)
Diferenciação
P = 0,045
Pobre
56 (72)
15,6 (6,25-20,36)
alta /moderada
22 (28)
8,1 (0,98-11,14)
metástases linfonodais
P = 0,005
N0
10 (13)
1,14 (0,75-1,42)
N1
11 (14)
3,44 (1,15-4,85)
N2
29 (37)
11,99 (7.15- 14,77)
N3
28 (36)
32,58 (7,34-36,27)
metastático doença
P = 0,029
M0
64 (82)
9,35 (2,53 -33,64)
M1
14 fig
28,82 (16,39-39,39)
aMedian de expressão relativa, com percentil 25-75th entre parênteses. bP < 0,05 foi considerado significativo (teste de Mann-Whitney U
entre 2 e grupos de teste de Kruskall-Wallis para 3 grupos).
Manipulação dos níveis HOTAIR em células de cancro gástrico
A seguir, realizada uma análise qRT-PCR para analisar o Os níveis de expressão de HOTAIR em várias linhas celulares de cancro, incluindo gástrico, cancro do pulmão de não pequenas (NSCLC) e as células derivadas do cancro da mama. Como mostrado na Figura 2A, uma das quatro linhas celulares de cancro gástrico investigada (MGC-803, a SGC-7901, BGC-823, e AGS), BGC-823 expressa níveis mais elevados de HOTAIR (3,18 vezes) do que a célula do epitélio gástrico normais linha (GES-1). Da mesma forma, linha de células NSCLC, SPC-A1, mostrou uma regulação positiva de 3,73 vezes de HOTAIR sobre a linha humana normal brônquica células epiteliais, 16HBE. A linha celular de cancro da mama altamente metastático MDA-MB-231 mostrou uma regulação positiva 4,77 vezes de HOTAIR em comparação com células MCF-7 (Figura 2A). Os nossos dados sugerem que HOTAIR pode ser frequentemente regulados positivamente em muitas células tumorais. A Figura 2, o nível de expressão HOTAIR em células de cancro gástrico e o seu efeito sobre a proliferação celular in vitro. (A) Os resultados de qRT-PCR demonstrando níveis de expressão HOTAIR de linhas celulares de cancro gástrico (MGC-803, a SGC-7901, BGC-823, e AGS), em comparação com gástrica linha celular de epitélio normal (GES-1), linha de células NSCLC ( SPC-A1), em comparação com a linha epitelial humana normal brônquica célula (16HBE), e linhas celulares de cancro da mama MDA-MB-231, em comparação com células MCF-7. analisa (B) qRT-PCR de seguir tratamento células nível de expressão HOTAIR BGC-823 com siRNAs segmentação células SGC-7901 HOTAIR e tratamento com pCDNA /HOTAIR vetor. ensaio (C) de MTT foi realizado para determinar a proliferação de células BGC-823 SI-HOTAIR-transfectadas ou células SGC-7901 pCDNA /HOTAIR-transfectadas. Os dados representam a média ± S.D. a partir de três experiências independentes. (D) Ensaio de crescimento de formação de colónias foi realizada para determinar a proliferação de Si-HOTAIR células transfectadas BGC-823. As colónias foram contadas e capturado. * P < 0,05 e ** P < 0,01.
Para manipular os níveis HOTAIR em células de cancro gástrico, um vector pCDNA /HOTAIR foi transfectado em células e Si-HOTAIR SGC-7901 foi transfectada em células BGC-823, respectivamente. análise de qRT-PCR de níveis HOTAIR foi realizada às 48 h pós-transfecção e expressão revelaram que HOTAIR foi aumentada 98 vezes em células SGC-7901, em comparação com células de controlo. No entanto, em células BGC-823, a expressão foi eficientemente HOTAIR 75% derrubado por Si-HOTAIR2, o siRNA mais eficaz subsequentemente utilizado nas experiências seguintes (Figura 2B).
Efeito de HOTAIR sobre a proliferação celular e apoptose in vitro
o aumento significativo de expressão HOTAIR em amostras de câncer gástrico nos levou a explorar o possível significado biológico de HOTAIR na tumorigênese. ensaio MTT revelou que o crescimento celular foi diminuída de modo significativo em células BGC-823 transfectadas com Si-HOTAIR, enquanto que a proliferação de células SGC-7901 foi aumentada em células /HOTAIR transfectadas com pcDNA comparação respectivos controlos (Figura 2C). Da mesma forma, o resultado do ensaio de colónias de formação revelaram que a sobrevivência clonogénica foi diminuída com a inibição de HOTAIR em células BGC-823 (Figura 2D).
Para determinar se a apoptose foi um factor que contribui para a inibição do crescimento celular, foi realizada a coloração de Hoechst e A análise de citometria de fluxo de células BGC-823 tratados com Si-HOTAIR. Os dados mostraram que o número de células com núcleos condensados ​​e fragmentados que indicam a fracção de células apoptóticas precoces foi significativamente maior em Si-HOTAIR-tratada BGC-823 células em comparação com as células tratadas com Si-NC (Figura 3A e B). Além disso, verificou-se que a inibição da HOTAIR reforçada apoptose 3-dependente de caspase, demonstrada por análise western blot da caspase-3 ativada após si-HOTAIR transfecção (arquivo adicionais 1: Figura S1). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o knockdown de HOTAIR suprime a proliferação de células de cancro gástrico e induz a apoptose in vitro. Figura 3 O efeito da HOTAIR na apoptose de células de câncer gástrico, migração e invasão in vitro. células BGC-823 foram transfectadas com si-HOTAIR ou si-NC, e as células SGC-7901 foram transfectadas com vector pCDNA /HOTAIR ou controle do vetor vazio. (A) ensaio de coloração Hoechst de apoptose celular; foi determinada a percentagem de núcleos positivos a Hoechst-por campo óptico (pelo menos 50 campos). (B) As taxas de apoptose de células foram detectados por citometria de fluxo. UL, células necróticas; UR, células apoptóticas terminais; LR, células apoptóticas precoces. Os ensaios (C e D) Transwell foram realizados para investigar mudanças na migração celular e invasão. * P < 0,05 e ** P < 0,01.
HOTAIR promove a migração e a invasão de células de cancro gástrico in vitro
invasão celular é um aspecto significativo da progressão do cancro que envolve a migração de células tumorais nos tecidos adjacentes e a dissolução das proteínas da matriz extracelular. Aqui nós avaliamos invasão de células cancerosas através transpo� ensaios. Como mostrado na Figura 3C, a transfecção de HOTAIR siARN impedido a capacidade migratória células BGC-823 em cerca de 66%. Um efeito correspondente na capacidade de invasão também foi observada num ensaio de invasão paralelo. Por outro lado, a transfecção de células SGC-7901 com pCDNA /HOTAIR vector promovido a migração celular e invasão ~ 1,9 vezes (Figura 3D). Estes dados indicam que HOTAIR tem propriedades oncogênicos que podem promover um fenótipo migratória e invasivo em células cancerosas gástricas.
HOTAIR promove tumorigênese de células de câncer gástrico in vivo
Para explorar se o nível de expressão HOTAIR afeta tumorigênese, BGC-823 as células transduzidas com o vector de SH-HOTAIR /pENTR (EV) foram utilizados num modelo de xenoenxerto de murganhos nus. Até 16 dias após o knockdown de HOTAIR, houve uma diminuição drástica do volume do tumor e peso no grupo SH-HOTAIR em comparação com controlos (Figura 4A, B e C). Em seguida, a análise de imunomarcação do PCNA proliferação marcador foi realizada em tecidos de tumores ressecados. Em comparação com isso em tumores formados a partir de células de controlo, os tumores SH-HOTAIR derivados mostraram uma redução significativa positividade PCNA (Figura 4D). Estes resultados sugerem que o nível de expressão HOTAIR está significativamente associado com a capacidade de proliferação in vivo de células de cancro gástrico. Figura 4 Efeito da HOTAIR knockdown no crescimento do tumor in vivo. curvas de crescimento do tumor (A) foram medidos após injecção de células BGC-823 transfectadas com SH-HOTAIR ou pENTR vector. O volume do tumor foi calculado a cada 3 dias. Os dados são apresentados como a média ± S.D. (N = 5). (B) O peso do tumor. Os valores são médias de peso do tumor ± S.D. (C) Análise de qRT-PCR da expressão HOTAIR em tecidos de tumores ressecados. (D) Os tumores desenvolvidos a partir BGC-823 células /SH-HOTAIR mostrou um nível mais baixo de proteína PCNA do que os tumores desenvolvidos a partir de células vector BGC-823 /pENTR. Superior: H & E coloração; Inferior: imunocoloração. * P < 0,05 e ** P < 0,01.
HOTAIR é alvo de miR-124
análise bioinformática de sequências de reconhecimento de miRNA em HOTAIR miR-331-3P e revelou a presença de 11 miRNAs tumor-supressora sítios de ligação. O cDNA foi clonado HOTAIR a jusante do gene da luciferase e chamado RLuc-HOTAIR (Figura 5A), depois transfectados em conjunto com diversos plasmídeos de codificação de miARN. rno-miR-344 agiu como um controlo negativo. Os resultados mostraram que a actividade de luciferase foi reduzida em 48% e 31% em comparação com o controlo de vector vazio quando o miR-331-3p e miR-124 foram expressas, respectivamente. Estes dados demonstram que tanto o miR-331-3p e miR-124 pode ligar-se directamente a HOTAIR através dos respectivos locais de reconhecimento de miARN (Figura 5B painel da esquerda). A Figura 5 é um alvo HOTAIR de miR-331-3P ou miR-124 e miR-alvo controla 331-3p. (A) Os 11 locais putativos de ligação de miARN na sequência HOTAIR. O ADNc HOTAIR contendo os sítios de reconhecimento putativas miARNs foi clonado a jusante do gene da luciferase e chamado RLuc-HOTAIR. (B) À esquerda: O plasmídeo repórter de luciferase (RLuc-HOTAIR) foi co-transfectado em células HEK-293 T, com os 11 vários plasmídeos codificadores de miARN. Direita: o plasmídeo repórter da luciferase contendo o tipo selvagem ou mutante HOTAIR foi co-transfectado em células HEK-293 T com miR-331-3p em paralelo com um vector de plasmídeo vazio. A actividade de luciferase foi determinada utilizando o ensaio de luciferase duplo e mostrado como a actividade de luciferase relativa normalizada para a actividade de Renilla. Histograma indica os valores da lucif erase foi medida 48 h após a transfecção. (C) A 3'UTR do HER2 foi fundido com a região codificante de luciferase (RLuc HER2-3'-UTR) e transfectado em células HEK293T com miR-331-3p para confirmar HER2 é o alvo de miR-331-3p. RLuc HER2-3'-UTR e construções de miR-331-3p foram co-transfectados em células HEK293T com plasmídeos que expressam HOTAIR (pCDNA /HOTAIR) ou com um vector de controlo para verificar a actividade de cerna HOTAIR. RNO-miARN-344 foi utilizado como um controlo negativo. Histograma indica os valores da lucif erase foi medida 48 h após a transfecção. (D) RIP com anticorpo monoclonal de ratinho anti-ago2, IgG pré-imune ou de entrada de 10% a partir de extractos BGC-823 de células. Os níveis de ARN em imunoprecipitados foram determinados por qRT-PCR. Top: níveis de HOTAIR, miRNA331-3P e FOS RNA foram apresentados como enriquecimento vezes na ago2 relação ao imunoprecipitados IgG. Resumindo: os níveis de ARN relativas de snRNA U1 SNRNP70 em relação ao imunoprecipitados IgG. Os números são média DP ± (N = 3). (E) a análise Western blot do nível de proteína HER2 após o tratamento de células BGC-823 com si-HOTAIR ou pCDNA /HOTAIR, e as células SGC-7901 com pCDNA /HOTAIR. GAPDH foi usada como controlo. * P < 0,05, ** P < 0,01 e N.S. não significativo.
Aqui, optamos por miR-331-3p como um modelo miRNA para estudos posteriores. Para confirmar ainda que a redução da actividade de luciferase a partir do vector RLuc-HOTAIR-WT era devido à interacção entre a dirigir miARN e o seu sítio de ligação putativo, que o local de ligação mutado miR-331-3p por mutagénese dirigida ao local, resultando em RLuc -HOTAIR-Mut. Como esperado, a supressão de actividade da luciferase foi completamente abolida nesta construção mutante em comparação com o tipo selvagem do vetor (Figura 5B painel da direita).
HOTAIR e miR-331-3p ambos se ligam com ago2 em células de cancro gástrico são
miARNs conhecido por estar presente no citoplasma sob a forma de complexos de ribonucleoproteína miARN (miRNPs) que também contêm ago2, o componente do núcleo do silenciamento induzido por ARN complexo (RISC) [17, 18]. Para testar se HOTAIR associados com miRNPs, RNA ligação imunoprecipitação de proteínas (RIP) experimentos foram realizados em extratos de células BGC-823 utilizando anticorpos contra ago2. Os níveis de ARN em imunoprecipitados foram determinados por qRT-PCR. HOTAIR foi preferencialmente enriquecida (354 vezes) em ago2 contendo miRNPs em relação ao controlo G (IgG) de imunoglobulina imunoprecipitados. Da mesma forma, miARN-331-3p foi detectada a um nível 840 vezes maior do que a de controlo anti-IgG. imunoprecipitação bem sucedida de ARN ago2-associado foi verificada por meio de qRT-PCR, utilizando iniciadores RIP humanos contra FOS incluídos no kit RIPAb + ago2 (Figura 5D, painel superior). Além disso, anti-SNRNP70 foi usada como um controlo positivo para o procedimento de PIR, e snRNA U1 também foi detectada a um nível 206 vezes maior do que a de anti-IgG (Figura 5D, painel inferior). Assim, HOTAIR está presente em ago2 contendo miRNPs, provavelmente através de associação com miRNA-331-3p, de acordo com os nossos ensaios de análise e luciferase de bioinformática.
HOTAIR controla o alvo miR-331-3p, HER2
Entre os muitos alvos de miR-331-3p, nós nos concentramos em HER2, uma vez que codifica uma proteína transmembranar com uma função relevante na carcinogênese e resistência à terapia baseada em trastuzumab [19]. A 3'UTR do HER2 foi fundido com a região codificante de luciferase (RLuc HER2-3'-UTR) e transfectadas com plasmídeos que codificam o miR-331-3p e um vector de plasmídeo vazio. rno-miRNA-344 agiu como um controlo negativo. O ensaio de luciferase mostrou que o miR-331-3p inibiu significativamente a actividade de luciferase (~ 41% de inibição) da RLuc-HER2 repórter 3'-UTR, confirmando que HER2 é um alvo de miR-331-3p. O RLuc-HER2 construto 3'-UTR foi subsequentemente transfectado juntamente com plasmídeos que codificam o miR-331-3p e HOTAIR (pCDNA /HOTAIR). Os ensaios de luciferase indicaram que, na presença de HOTAIR, RLuc HER2-3'-UTR repressão foi restaurada em comparação com o grupo de controlo (Figura 5C). Isto indica que HOTAIR actua como um "esponja" endógeno pela ligação de miR-331-3p, abolir, assim, a actividade repressora induzida por miARN no HER2 3'-UTR.
Além disso, o efeito da expressão de proteína HER2 HOTAIR endógeno em combinação com a modulação dos níveis de miARN ou lncRNA foi monitorizada pelas diferentes abordagens mostrados na Figura 5E: (1) a sobre-expressão de miR-331-3p contra HER2 em células BGC-823; (2) HOTAIR knockdown contra HER2 em BGC-823 células; (3) superexpressão HOTAIR para HER2 nas células SGC-7901. A análise Western blot mostrou que a expressão forçada de miR-331-3p ou knockdown de HOTAIR em células BGC-823 provocou um efeito de silenciamento significativo sobre a expressão da proteína HER2 endógena. Além disso, a expressão da proteína HER2 foi marcadamente upregulated após transfecção com HOTAIR em células SGC-7901, o que demonstra um nível relativamente baixo de expressão HOTAIR endógeno.
Juntos, estes dados indicam que através da ligação miR-331-3p, HOTAIR atua como um Cerna para o alvo HER2 mRNA, modulando assim a desrepressão de HER2 e impondo um nível adicional de regulação pós-transcricional.
miR-331-3p e miR-124 suprimir a proliferação de células cancerosas gástricas
para servir como um dissipador endógena para o alvo miARNs, a abundância de HOTAIR deve ser comparável ou maior do que o miR-331-3p /miR-124. Em nosso estudo, a análise de qRT-PCR mostraram que miR-331-3p /miR-124 expressão foi inversamente correlacionada com a expressão HOTAIR em 20 pares de cânceres gástrico avançado (Figura 6A). Para validar se o miR-331-3p e miR-124 também poderia inibir a proliferação de células de cancro gástrico, que obrigou a sua expressão em células BGC-823 usando-miARN que codificam plasmídeos. Os níveis de expressão de miARN-331-3p e miR-124 transfectadas em células BGC-823 foram significativamente aumentado 36 vezes e 29 vezes, respectivamente, em comparação com células de controlo (Figura 6B). Os ensaios de seguida, MTT e colónias de formação foram realizados para determinar a viabilidade celular. Os resultados do ensaio de crescimento e curvas de MTT revelou que as células transfectadas com o miR-331-3p ou miR-124 apresentaram retardamento do crescimento significativo, quando comparado com células transfectadas com vector vazio (Figura 6C). Estes dados indicam que a superexpressão de miR-331-3p ou expressão de miR-124 pode prender a proliferação de células de cancro gástrico, o que é consistente com os resultados de expressão em células HOTAIR knockdown BGC-823. Figura 6 correlação positiva entre a expressão HOTAIR e HER2 ea relevância para /miR-124 níveis de expressão de miR-331-3p. (A) análise de correlação bivariada da relação entre a expressão HOTAIR e miR-331-3p, ou nível de miR-124. (B) Células BGC-823 foram transfectadas com plasmídeos que codificam o miR-331-3p ou miR-124, e de qRT-PCR foi utilizado para detectar os níveis de miARN em comparação com controlos (miR-NC). (C) ensaio de MTT e ensaio de crescimento de formação de colónias foram realizados para determinar a proliferação de miR-331-3p ou miR-124 células BGC-823 transfectadas. (D) Esquerda: imunocoloração da proteína HER2 em amostras de tecido câncer gástrico avançado. Superior: imunocoloração de HER2 foi negativo em tecidos de câncer gástrico com relativamente baixa expressão HOTAIR. Inferior: imunocoramento HER2 foi positivo em tecidos de câncer gástrico com a expressão relativamente elevada HOTAIR. Direita: análise de correlação bivariada da relação entre o nível de expressão HOTAIR e HER2. * P < 0,05, ** P < 0,01.
HER2 é co-expressa com HOTAIR em tecidos com câncer gástrico
A taxa de superexpressão de HER2 foi relatado para ser 7-34% no câncer gástrico, e foi associada com doença mais agressiva e pior sobrevida no câncer gástrico [19]. Detectamos expressão de HER2 em 50 tecidos de cancro gástrico avançado (fase III /IV) seleccionados a partir dos 78 tecidos de cancro gástrico anteriores por imuno-histoquimica (IHC) e análise de qRT-PCR. Os resultados da coloração IHC revelou positividade proteína HER2 em 56% dos 50 tecidos de cancro gástrico seleccionadas. Oitenta e seis por cento das amostras positivas HER2 eram de estágio avançado III /IV tumores, e 71% exibido expressão alta HOTAIR (Figura 6D e arquivo adicionais 2: Tabela S2). análise de correlação bivariada mostrou que a expressão de HER2 foi significativamente correlacionada com o nível de transcrição HOTAIR em tecidos com câncer gástrico em comparação com os seus homólogos normal (Figura 6D). Estes dados indicam que a expressão de HER2 está positivamente associado com HOTAIR regulada positivamente em amostras de tecido de cancro gástrico, o que sugere que a caracterização da interacção HER2 /HOTAIR pode ser biologicamente significativa na tumorigénese gástrica humana.
Nomeadamente, por causa de uma fase III em curso /IV ensaio, a taxa de sobre-expressão de HER2 detectada no presente estudo é maior do que o intervalo médio relatado anteriormente. Este aumento da taxa de HER2 sobre-expressão está fortemente ligada a resultados pobres para pacientes com metastático e de alta qualidade localizada cancros gástricos, destacando assim a importância da HER2 no desenvolvimento do câncer gástrico e metástase.
Discussão
lncRNAs, que são mais de 200 nucleótidos de comprimento, com a capacidade de codificação da proteína limitada, são frequentemente expressas de uma forma doença-, tecido- ou de desenvolvimento específico do estágio, indicando as funções específicas para lncRNAs em desenvolvimento e doenças e torna estas moléculas alvos terapêuticos atractivos [20-22]. Uma série de trabalhos recentes revelaram que a desregulação destas lncRNAs podem também afectar a regulação do genoma eucariota e proporcionar uma vantagem de crescimento celular, resultando em crescimento progressivo do tumor e descontrolada [23-25]. Portanto, lncRNAs pode fornecer uma peça que faltava do quebra-cabeça da rede supressor oncogênico e tumor de outra forma bem conhecida.
Neste estudo, foi testada a expressão de HOTAIR em amostras de carcinoma gástrico e seus tecidos circundantes não-tumorais. Identificou-se também a função de HOTAIR em células de carcinoma gástrico, aplicando gain- abordagens e perda de função. Os resultados demonstraram que HOTAIR foi regulado positivamente em tecidos do carcinoma gástrico em comparação com os tecidos normais adjacentes gástrico, e que a regulação positiva HOTAIR correlacionada com o tamanho do tumor maior, estágio avançado da doença e grande metástase. Além disso, o tempo global de sobrevivência de pacientes com baixos níveis de expressão HOTAIR foi significativamente mais longa do que a de pacientes com níveis de expressão HOTAIR moderada ou forte. Além disso, a sobre-expressão HOTAIR promoveu a proliferação, a migração e a invasão de células de carcinoma gástrico, enquanto a depleção HOTAIR inibiu a invasão de células e a viabilidade celular, e a paragem do crescimento induzida tanto in vitro como in vivo. Além disso, a supressão HOTAIR levou à promoção da apoptose das células gástricas. Estes achados sugerem que HOTAIR desempenha um papel direto na modulação de várias propriedades oncogênicas e progressão do cancro gástrico, estimulando novas direções de pesquisa e opções terapêuticas considerando HOTAIR como um novo marcador de prognóstico e alvo terapêutico no cancro gástrico.
A importância de lncRNAs no doença humano pode estar associado com a sua capacidade para influenciar funções celulares através de vários mecanismos. Neste estudo, tanto quanto o mecanismo de HOTAIR diz respeito, vale a pena mencionar que a análise de localização subcelular de HOTAIR ARN por fluorescência no ensaio de hibridação in situ demonstra a localização de HOTAIR a ambos o núcleo e o citoplasma [24]. É evidente que pode ter como alvo nuclear HOTAIR Polycomb repressivo complexo 2, alterando H3K27 metilação e padrões de expressão de genes em todo o genoma [10, 11]. Trabalhos recentes relataram uma função andaime para HOTAIR no citoplasma como um indutor de proteólise mediada por ubiquitina [26]. No entanto, as propriedades tumorigénicas e heterogeneidade mecanicista da HOTAIR, e particularmente aqueles da forma citoplasmática, estão longe de serem completamente elucidados.
Inspirado pela rede de regulação dos RNAs endógenos competitivos 'e evidência emergente que sugere que lncRNAs podem participar nesta circuitos de regulação, a hipótese de que HOTAIR também pode servir como um Cerna e por isso procurou potenciais interacções com miRNAs. 0,05. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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