Функции ЛНК РНК HOTAIR как конкурирующего эндогенной РНК, чтобы регулировать экспрессию HER2 на обтирание MIR-331-3p в желудочном cancer

функций ЛНК РНК HOTAIR как конкурирующего эндогенной РНК, чтобы регулировать экспрессию HER2 путем обтирания MIR-331-3p при раке желудка
Аннотация
Справочная информация
Накопленные данные показывают, что длинные некодирующие РНК HOTAIR играет критическую роль в прогрессии рака и метастазов. Тем не менее, общая биологическая роль и клиническое значение HOTAIR в желудочном канцерогенезе остается в значительной степени неизвестны.
Методы
выражение HOTAIR измеряли в 78 парных и раковыми доброкачественное образцы ткани с помощью ПЦР в реальном времени. Были изучены эффекты HOTAIR на желудочную раковых клеток с помощью избыточной экспрессии и РНК-интерференции подходов в пробирке и в естественных условиях. Способность проникновения в суть механизма конкурентных эндогенных РНК (ceRNAs) были получены из анализа биоинформатики, люциферазы анализов и РНК связывающий белок иммунопреципитации (RIP). Положительное взаимодействие HOTAIR /HER2 был идентифицирован и проверены с помощью анализа иммуногистохимии и двухмерного корреляционного анализа.
Результаты
HOTAIR повышающую регуляцию было связано с большим размером опухоли, продвинутой стадии патологического и обширного метастазирования, а также коррелирует с более короткой общей выживаемости желудка больных раком. Кроме того, избыточная экспрессия HOTAIR способствовала пролиферации, миграции и инвазии клеток рака желудка, в то время как истощение HOTAIR ингибирует как вторжение клеток и жизнеспособность клеток и индуцированный остановку роста в пробирке и в естественных условиях. В частности, HOTAIR может выступать в качестве Черна, эффективно становясь стоком для MIR-331-3p, тем самым модулируя дерепрессию HER2 и введение дополнительного уровня пост-транскрипционной регуляции. Наконец, положительная HOTAIR /HER2 корреляция была в значительной степени связано с поздних стадий рака желудка.
Выводы
HOTAIR избыточная экспрессия представляет собой биомаркера плохим прогнозом при раке желудка, а также может придавать опухолевого фенотипа отношению к опухолевым клеткам. Регулирующая сеть Черна с участием HOTAIR и позитивного взаимодействия между HOTAIR и HER2 может способствовать лучшему пониманию патогенеза рака желудка и способствовать развитию lncRNA направленной диагностики и терапии против этого заболевания.
Ключевые слова
Конкурирующие эндогенная РНК HER2 HOTAIR Желудочный пролиферации рака и вторжение фон
рака желудка является второй ведущей причиной рака-индуцированной гибели, и является наиболее распространенным желудочно-злокачественности в Восточной Азии, Восточной Европе и в некоторых частях Центральной и Южной Америки. У большинства пациентов, рак желудка диагностируется на продвинутой стадии и сопровождается злокачественной пролиферации, обширные инвазии и лимфатического метастазирования. Успешные стратегии лечения ограничены, а смертность высока [1, 2]. Длинные некодирующие РНК (lncRNAs) недавно получила значительное внимание в разграничении сложные механизмы, лежащие в основе злокачественные процессы, такие как канцерогенеза, метастазирования и лекарственной устойчивости. Поэтому, если мы хотим, чтобы полностью понять желудка канцерогенеза, мы должны рассмотреть это семейство регуляторных транскриптов, которые добавляют новый уровень сложности биологии опухоли.
Хотя только небольшое количество функциональных lncRNAs хорошо изучены на сегодняшний день, они было показано, что регулируют экспрессию генов на различных уровнях, в том числе модификации хроматина, транскрипции и пост-транскрипционной обработки [3, 4]. В последнее время новый регулирующий механизм был определен, в котором перекрестные помехи между lncRNAs и происходит путем мРНК, конкурирующих за общие микроРНК элементами ответа (микроРНК). В этом случае lncRNAs может функционировать как конкурирующие эндогенные РНК (ceRNAs) в губчатое микроРНК, тем самым модулируя дерепрессию мишеней микроРНК и навязывания дополнительный уровень пост-транскрипционной регуляции [5]. В предыдущих докладах, мышцы конкретных lncRNA, ЛИНК-МД1, как сообщается, будет Черна, который защищает MyoD матричную РНК (мРНК) из микроРНК-опосредованной деградации [6]. Плюрипотентность-ассоциированный ЛНК-RoR может функционировать в качестве ключа Черна связать сеть микроРНК и основных факторов транскрипции, например, Oct4, Sox2 и Nanog в эмбриональных стволовых клеток человека. Следует отметить, что lncRNA HULC сильно активируемых при раке печени и играет важную роль в онкогенеза [7]. В частности, HULC может выступать в качестве эндогенного "губка", что вниз регулирует целый ряд мероприятий, в том числе микроРНК микроРНК-372 [8]. Поэтому мы полагаем, что некоторые lncRNAs могут также иметь роль в качестве ceRNAs, связывая микроРНК и пост-транскрипционный сеть в желудочном патогенеза.
HOTAIR (Hox транскрипт РНК антисмысловой межгенная
) является ~ 2,2 т.п.н. долго некодирующих РНК переписана из HOXC
локуса, который может подавлять транскрипцию в транс Каталог HOXD
в фибробласты крайней плоти [9]. В качестве новой молекулы в области биологии опухолей, HOTAIR первоначально стал хорошо известен за участие в первичных опухолей молочной железы и метастазов рака молочной железы, в котором повышение HOTAIR способствовало инвазивность и метастазирование [10]. Более того, экспрессия HOTAIR положительно коррелирует со злокачественными процессами и неблагоприятным исходом при колоректальном раке, гепатоцеллюлярной карциномы, рака поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта стромальных опухолей [11-14]. Недавние исследования сообщили, что HOTAIR был усиливается в раке желудка [15, 16]. Тем не менее, общая биологическая роль и основной молекулярный механизм HOTAIR в желудочном канцерогенезе остается в значительной степени неопределенным.
В этом исследовании мы сообщаем, что HOTAIR повышающая регуляция является характерным молекулярно изменение рака желудка и исследовать биологические роли HOTAIR на фенотип клетки рака желудка в пробирке и в естественных условиях. Кроме того, механистической анализ показывает, что HOTAIR может функционировать как Серна, чтобы регулировать экспрессию эпителиального фактора роста человеческого рецептора 2 (HER2) конкуренция за MIR-331-3p, таким образом, играет онкогенного роль в патогенезе желудка. Настоящая работа предоставляет первое доказательство для положительного HOTAIR /HER2 корреляции и перекрестных помех между MIR-331-3p, HOTAIR и HER2, проливают новый свет на лечение рака желудка.
Результаты
выражение HOTAIR активируется в желудочные раковые ткани человека
уровень экспрессии HOTAIR определяли в 78 парных образцах рака желудка и прилегающих к ним, гистологически нормальных тканей с помощью QRT-PCR, и нормированы на GAPDH. Выражение HOTAIR значительно усиливается в раковых тканях (среднее соотношение 14,35 раза, P < 0,01) по сравнению с нормальными аналогами (Рис. 1А) Исследование корреляции между экспрессией HOTAIR и клинических патологических признаков показал, что HOTAIR повышающей регуляцией коррелировало с большим размером опухоли, продвинутой стадии патологического, отдаленными метастазами (Фиг.1В и C), узел метастаза лимфатический и дифференцировки опухолевых клеток (таблица 1). Однако экспрессия HOTAIR не было связано с положением опухоли или пола пациента (таблица 1). Что касается общей выживаемости у пациентов с высокой экспрессии HOTAIR имели значительно худший прогноз, чем те, с низким уровнем экспрессии HOTAIR (P < 0,001, лог-ранговый тест; Рисунок 1D). Эти результаты означают, что HOTAIR избыточная экспрессия может быть полезным при разработке новых прогностическими или прогрессированием маркеров для рака желудка. Рисунок 1 Относительное выражение HOTAIR в желудочных тканях рака и его клиническое значение. (A) Относительное выражение HOTAIR в желудочном раковых тканей (п = 78) по сравнению с соответствующими неопухолевыми нормальных тканей (п = 78). Выражение HOTAIR было рассмотрено QRT-PCR и нормализовали к экспрессии GAPDH. Данные были представлены в виде складчатой-изменения в опухолевых тканях по сравнению с нормальными тканями. (B) Исследование корреляции между выражением HOTAIR и клинических патологических признаков показал, что HOTAIR повышающую регуляцию коррелирует с большим размером опухоли и продвинутой стадии патологического. Выражение (С) HOTAIR была значительно выше у больных с отдаленными метастазами, чем у больных без отдаленных метастазов. Кривые общей выживаемости (D) Kaplan-Meier в соответствии с уровнем экспрессии HOTAIR. Общая выживаемость в группе высокого HOTAIR (п = 39: HOTAIR отношение выражение ≥ средний коэффициент) был значительно выше, чем у Low-HOTAIR группы (п = 39; HOTAIR отношение отношение выражение ≤ медиана; P &л; 0,001, логарифмическая ранговый тест). * P &л; 0,05, ** Р &л; 0.01.
Таблица 1 Соотношение экспрессии HOTAIR с клиникопатологическими функциями
клиникопатологическими функции

п (%)

Относительное выражение HOTAIRa

P-VALUE млрд

Пол
P = 0,62
Мужчина
50 (64)
12.21 (0.97-17.53)
Женский
28 (36)
15,01 (+7,34 -19,52)
сайт опухоли
P = 0,910
дистальной трети
18 (23)
9.1 (1.37-14.12)
Средняя треть
20 (26) <бр> 7.96 (2.55-9.72)
проксимального отдела желудка
40 (51)
7,76 (1.24-13.58)
Дифференциация
P = 0,045
Бедная
56 (72)
15.6 (6.25-20.36)
высокий /умеренный
22 (28)
8.1 (0.98-11.14)
лимфоузлов метастазы
P = 0,005
N0
10 (13)
1.14 (0.75-1.42)
N1
11 (14)
3.44 (1.15-4.85)
N2
29 (37)
11.99 (7.15- 14,77)
N3
28 (36)
32.58 (7.34-36.27)
метастатического заболевания
P = 0,029
M0
64 (82)
9,35 (2,53 -33,64)
M1
14 рис
28.82 (16.39-39.39)
aMedian относительного выражения, с 25-м 75-го процентиля в скобках. ЬР &л; 0,05 считался значимым (Mann-Whitney U
тест между 2 группами и тест Крускала-Уоллиса для 3 группы).
Манипуляция уровней HOTAIR в клетках рака желудка
Затем мы провели анализ QRT-PCR для изучения уровни экспрессии HOTAIR в различных клеточных линиях рака желудка, в том числе, немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) и рак молочной железы, полученных клеток. Как показано на фигуре 2А, ​​из четырех клеток желудка линии исследовали (МГЦ-803, СГК-7901, КУП-823, и АГС), КУП-+823 выразили более высокие уровни HOTAIR (3,18 раза), чем нормальный желудочный эпителий клетки линия (ГЭС-1). Аналогичным образом, клеточная линия НМРЛ, SPC-A1, показал 3,73 раза повышающую регуляцию HOTAIR над нормальной человеческой бронхиальной эпителиальной клеточной линии, 16HBE. Высокой метастатической активностью клеток рака молочной железы линии MDA-MB-231 показал 4,77 раза повышающую регуляцию HOTAIR по сравнению с линии MCF-7 (Рисунок 2А). Наши данные свидетельствуют о том, что HOTAIR могут часто повышающей регуляции во многих опухолевых клетках. Рисунок 2 Уровень экспрессии HOTAIR в клетках рака желудка и его влияние на пролиферацию клеток в пробирке. (А) Результаты QRT-PCR, демонстрирующих уровни экспрессии HOTAIR желудочного линий раковых клеток (MGC-803, СГК-7901, BGC-823, и AGS) по сравнению с нормальными желудочный эпителий линии клеток (GES-1), линии клеток NSCLC ( SPC-A1), по сравнению с нормальной человеческой бронхиальной эпителиальной клеточной линии (16HBE) и клеточные линии рака молочной железы MDA-MB-231 по сравнению с MCF-7. (B) QRT-PCR анализа после окончания лечения клеток уровень экспрессии HOTAIR BGC-823 с миРНК, направленных HOTAIR и лечения SGC-7901 клетки с pCDNA /HOTAIR вектором. Анализ (C) МТТ проводили для определения распространения си-HOTAIR-трансфецированных клеток BGC-823 или pCDNA /HOTAIR-трансфицированных SGC-7901 клеток. Данные представляют собой среднее ± S.D. из трех независимых экспериментов. (D) Анализ колониеобразующих роста проводили для определения распространения си-HOTAIR трансфецированных клеток BGC-823. Колонии подсчитывали и захвачен в плен. * P &л; 0,05 и ** P &л; 0.01.
Чтобы управлять уровнями HOTAIR в желудочном раковых клеток, вектор pCDNA /HOTAIR трансфицировали в SGC-7901-клетки и си-HOTAIR трансфицировали в клетки BGC-823, соответственно. QRT-PCR-анализ уровней HOTAIR проводили при 48 ч после трансфекции и показали, что экспрессия HOTAIR повышали 98 раз в СГК-7901 клеток, по сравнению с контрольными клетками. Тем не менее, в клетках BGC-823, экспрессия HOTAIR была фактически 75% сбиты си-HOTAIR2, наиболее эффективным миРНК впоследствии используется в следующих экспериментах (рис 2В).
Влияние HOTAIR на пролиферацию клеток и апоптоз в пробирке <бр> значительное увеличение экспрессии HOTAIR в образцах рака желудка побудило нас исследовать возможное биологическое значение HOTAIR в онкогенеза. МТТ показали, что рост клеток значительно ухудшается в клетках BGC-823, трансфицированных си-HOTAIR, в то время как увеличение числа SGC-7901 клеток была увеличена в pCDNA /HOTAIR трансфицированных клеток по сравнению с соответствующим контролем (рис 2С). Аналогичным образом, в результате анализа колонии-образования показало, что клоногенному выживаемость была снижена следующая ингибирование HOTAIR в BGC-823 клеток (рис 2D).
Чтобы определить, был ли апоптоз фактором, способствующим клеток ингибирования роста, мы провели Hoechst окрашивания и флоу-цитометрии анализ си-HOTAIR-обработанных клеток BGC-823. Данные показали, что число клеток с конденсацией и фрагментированных ядер, указывающие на долю ранних апоптотических клеток была значительно выше в си-HOTAIR обработанных КУП-823 клеток, по сравнению с Si-НК-клеток, обработанных (фиг.3А и В). Кроме того, мы обнаружили, что ингибирование HOTAIR усиливается активность каспазы-3-зависимом апоптозе, продемонстрированный вестерн-блот анализ активированного каспазы-3 после си-HOTAIR трансфекцией (Дополнительный файл 1: Рисунок S1). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что нокдаун HOTAIR подавляет пролиферацию раковых клеток желудка и индуцирует апоптоз в лабораторных условиях. Рисунок 3 Влияние HOTAIR на желудочную апоптоза раковых клеток, миграции и вторжения в пробирке. Клетки КУП-823 трансфицировали си-HOTAIR или си-NC, и СГК-7901 клетки были трансфицированы pCDNA /HOTAIR вектором или пустого векторного управления. (A) Hoechst окрашивания анализ клеточного апоптоза; процент Hoechst-положительных ядер в оптическом поле (по крайней мере, 50 полей) была определена. (В) Апоптические показатели клеток были обнаружены с помощью проточной цитометрии. UL, отмершие клетки; UR, терминал апоптотических клеток; LR, ранние апоптотических клеток. Анализы (C и D) Transwell были выполнены, чтобы исследовать изменения в клеточной миграции и инвазии. * P &л; 0,05 и ** P &л; 0.01.
HOTAIR способствует миграции и инвазии клеток рака желудка в пробирке
инвазии клеток является важным аспектом прогрессии рака, который включает миграцию опухолевых клеток в смежные ткани и растворение белков внеклеточного матрикса. Здесь мы оценивали вторжение раковых клеток с помощью Transwell анализов. Как показано на фиг.3С, трансфекция HOTAIR миРНК препятствует мигрирующий способность клеток КУП-823 примерно на 66%. Соответствующее влияние на инвазивность также наблюдалось в параллельном анализе вторжения. И наоборот, трансфекция SGC-7901 клеток с pCDNA /HOTAIR вектором способствует миграции клеток и инвазивности ~ 1,9 раза (рис 3D). Эти данные указывают на то, что HOTAIR обладает онкогенными свойствами, которые могут способствовать миграционную и инвазивный фенотип клеток рака желудка.
HOTAIR способствует туморогенез желудочного раковых клеток в естественных условиях
Изучить, влияет ли уровень экспрессии HOTAIR туморогенез, КУП-823 клетки трансдуцированных с вектором ш-HOTAIR /pENTR (EV) были использованы в обнаженной модели мышей ксенотрансплантата. До 16 дней после нокдауна HOTAIR, произошло резкое уменьшение объема опухоли и веса в ш-HOTAIR группе по сравнению с контрольной группой (рис 4А, В и С). Затем иммунным окрашиванием анализ маркера пролиферации PCNA проводили в резецированных опухолевых тканях. По сравнению с тем, что в опухолях, полученных из контрольных клеток, SH-HOTAIR полученные из опухолей, показал значительно снижается PCNA позитивности (рис 4D). Эти результаты свидетельствуют о том, что уровень экспрессии HOTAIR значительно связан со способностью пролиферации в естественных условиях желудка раковых клеток. Рисунок 4. Влияние HOTAIR нокдаун на рост опухоли в естественных условиях. (А) кривые роста опухоли измеряли после инъекции клеток КУП-823, трансфицированных ш-HOTAIR или pENTR вектора. Объем опухоли вычисляли через каждые 3 дня. Данные представлены в виде среднего значения ± S.D. (П = 5). (Б) Опухоль вес. Значения являются средством веса опухоли ± S.D. (C) QRT-PCR анализ экспрессии HOTAIR в тканях резекции опухоли. (D) Опухоли развились из BGC-823 /ш-HOTAIR клетки показали более низкий уровень белка PCNA, чем опухоли развитых из векторных клеток BGC-823 /pENTR. Верх: H & E окрашивание; Нижняя: иммунное. * P &л; 0,05 и ** P &л; 0.01.
HOTAIR является мишенью MIR-331-3P и MIR-124
анализа биоинформатики последовательностей распознавания микроРНК на HOTAIR показал наличие 11-опухолевыми подавляющих микроРНК сайты связывания. HOTAIR кДНК клонировали ниже гена люциферазы и названный RLuc-HOTAIR (рис 5А), затем трансфи- вместе с различными микроРНК-кодирующих плазмид. РНО-микроРНК-344 действовал в качестве отрицательного контроля. Результаты показали, что активность люциферазы была снижена на 48% и на 31% по сравнению с пустым вектором управления, когда микроРНК-331-3p и микроРНК-124 были выражены соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что как микроРНК-331-3p и микроРНК-124 может напрямую связываться с HOTAIR через соответствующие сайты распознавания микроРНК (Рисунок 5B левая панель). Рисунок 5 HOTAIR является мишенью MIR-331-3P или MIR-124 и управляет микроРНК-331-3p цели. (A) 11 предположительные сайты связывания микроРНК в последовательности HOTAIR. HOTAIR кДНК содержащие мнимые микроРНК сайты распознавания клонировали ниже гена люциферазы и назван RLuc-HOTAIR. (Б) Слева: люциферазы плазмида (RLuc-HOTAIR) котрансфицировали в НЕК-293 Т-клеток с 11 различными микроРНК-кодирующих плазмид. Справа: люциферазы плазмиду, содержащую дикого типа или мутантный HOTAIR котрансфицировали в НЕК-293 Т-клеток с микроРНК-331-3p параллельно с пустым вектором плазмиды. Активность люциферазы определяли с помощью двойного анализа люциферазы и показано в виде относительной активности люциферазы нормированной к рениллы активности. Гистограмма показывает значения люциферазы измеряли через 48 ч после трансфекции. (C) 3'-UTR HER2, был слит в область люциферазы кодирования (RLuc-HER2 3'-UTR) и трансфицировали в клетках HEK293T с MIR-331-3p для подтверждения HER2 является объектом MIR-331-3p. RLuc-HER2, 3'-UTR и микроРНК-331-3p конструкции были совместно трансфицированы в клетках HEK293T плазмидами, экспрессирующими HOTAIR (pCDNA /HOTAIR) или с контрольным вектором для проверки активности Серна из HOTAIR. РНО-микроРНК-344 был использован в качестве отрицательного контроля. Гистограмма показывает значения люциферазы измеряли через 48 ч после трансфекции. (D) RIP с мышиными моноклональными анти-AGO2, преиммунной IgG или 10% вклада экстрактов +823-клеток BGC. уровни РНК в иммуноосажденными определяли с помощью QRT-PCR. были представлены уровни HOTAIR, miRNA331-3P и FOS РНК, как кратное обогащение в AGO2 по отношению к IgG иммуноосажденными: Top. Внизу: относительные уровни РНК U1 мяРНК в SNRNP70 по отношению к IgG иммуноосажденными. Числа представляют собой среднее ± S.D. (П = 3). (Е) Вестерн-блот-анализ уровня белка HER2 после обработки клеток КУП-823 с си-HOTAIR или pCDNA /HOTAIR и СГК-7901 клеток с pCDNA /HOTAIR. GAPDH, использовали в качестве контроля. * P &л; 0,05, ** Р &л; 0,01 и N.S. не имеет существенного значения.
в данном описании, мы выбрали MIR-331-3p в качестве модели микроРНК для дальнейших исследований. Для дальнейшего подтверждения, что снижение активности люциферазы из вектора RLuc-HOTAIR-WT было обусловлено прямым взаимодействием между микроРНК и его предполагаемого сайта связывания, мы мутировали в микроРНК-331-3p сайт связывания сайт-направленного мутагенеза, в результате чего RLuc -HOTAIR-Мут. Как и ожидалось, подавление активности люциферазы полностью отменена в этой мутантной конструкции по сравнению с диким типом вектора (рис 5B правая панель).
HOTAIR и MIR-331-3p оба связываются с AGO2 в клеток рака желудка
микроРНК как известно, присутствует в цитоплазме в виде микроРНК рибонуклеопротеидных комплексов (miRNPs), которые также содержат AGO2, это основной компонент РНК-индуцированного глушителей комплекса (RISC) [17, 18]. Для того, чтобы проверить, является ли РНК-связывающий белок иммунопреципитации (RIP) были проведены эксперименты HOTAIR ассоциирует с miRNPs на экстрактах BGC-823 клеток с использованием антител против Ago2. уровни РНК в иммуноосажденными определяли с помощью QRT-PCR. HOTAIR был преимущественно обогащен (354-кратный) в AGO2 содержащих miRNPs по сравнению с контрольными иммуноглобулина G (IgG) иммуноосажденными. Точно так же, микроРНК-331-3p был обнаружен на уровне 840 раз выше, чем у контрольной группы анти-IgG. Успешное иммунопреципитация AGO2-ассоциированной РНК была проверена QRT-ПЦР с использованием праймеров RIP против человека ФОС включены в RIPAb + AGO2 комплект (рис 5D, верхняя панель). Кроме того, анти-SNRNP70 использовался в качестве положительного контроля для процедуры RIP, и U1 мяРНК был также обнаружен на уровне 206 раз больше, чем у анти-IgG (рис 5D, нижняя панель). Таким образом, HOTAIR присутствует в AGO2-содержащих miRNPs, вероятно, через ассоциацию с микроРНК-331-3p, в соответствии с нашими биоинформатики анализа и люциферазы анализов.
HOTAIR контролирует цель микроРНК-331-3p, HER2
Среди многих мишенями микроРНК-331-3p, мы сосредоточили на HER2, поскольку он кодирует трансмембранный белок с соответствующей функцией в канцерогенезе и устойчивости к трастузумаб терапии, основанной на [19]. 3'-UTR HER2, был слит в область люциферазы кодирования (RLuc-HER2, 3'-UTR) и трансфицировали плазмидами, кодирующими микроРНК-331-3p и пустой плазмидный вектор. РНО-микроРНК-344 действовал в качестве отрицательного контроля. Анализ люциферазы показали, что микроРНК-331-3p значительно ингибирует активность люциферазы (~ 41% ингибирование) 3'-UTR репортер RLuc-HER2, подтверждая, что HER2 является мишенью MIR-331-3p. RLuc-HER2 3'-UTR конструкция была впоследствии трансфицировали вместе с плазмидами, кодирующими микроРНК-331-3p и HOTAIR (pCDNA /HOTAIR). Люциферазы анализы показали, что в присутствии HOTAIR, RLuc-HER2, 3'-UTR репрессии была восстановлена ​​по сравнению с контрольной группой (рис 5в). Это указывает на то, что HOTAIR действует как эндогенный "губку" путем связывания микроРНК-331-3p, тем самым отменяя микроРНК индуцированных подавляя активность на HER2 3'-UTR.
Кроме того, эффект экспрессии HOTAIR на эндогенного белка HER2 в сочетание с модуляцией уровней микроРНК или lncRNA контролировали с помощью различных подходов, показанных на рисунке 5E: (1) микроРНК-331-3p суперэкспрессия против HER2 в BGC-823 клеток; (2) HOTAIR нокдаун против HER2 в BGC-823 клеток; (3) HOTAIR суперэкспрессия для HER2 в SGC-7901 клеток. Вестерн-блот-анализ показал, что принудительная экспрессия микроРНК-331-3p или нокдауна HOTAIR в клетках BGC-823 вызвало значительное влияние на заглушающие эндогенной экспрессии HER2 белка. Кроме того, экспрессия белка HER2 заметно усиливает свою активность после трансфекции HOTAIR в SGC-7901 клеток, что свидетельствует относительно низкий эндогенный уровень экспрессии HOTAIR.
В совокупности эти данные указывают на то, что путем связывания MIR-331-3p, HOTAIR действует как Черна для мишень HER2 мРНК, тем самым модулируя дерепрессию HER2 и введение дополнительного уровня пост-транскрипционной регуляции.
MIR-331-3p и микроРНК-124 подавляет желудочную пролиферацию раковых клеток
Чтобы служить в качестве эндогенного раковине для мишени микроРНК, обилие HOTAIR должна быть сопоставима или выше, чем MIR-331-3p /MIR-124. В нашем исследовании анализ QRT-PCR показали, что микроРНК-331-3p /микроРНК-124 экспрессия обратно коррелирует с экспрессией HOTAIR в 20 пар передовых рака желудка (рис 6А). Для того, чтобы проверить ли микроРНК-331-3p и микроРНК-124 также может ингибировать пролиферацию раковых клеток желудка, мы вынуждены их экспрессию в клетках BGC-823 с использованием микроРНК-кодирующих плазмид. Уровни экспрессии микроРНК-331-3p и микроРНК-124, трансфецированные в BGC-823 клеток были значительно увеличены на 36 раз и 29 раз, соответственно, по сравнению с контрольными клетками (рис 6б). Далее, MTT и колониестимулирующий образование анализы проводили для определения жизнеспособности клеток. Результаты данного анализа и роста кривых МТТ показали, что клетки, трансфицированные MIR-331-3p или MIR-124, показали значительную задержку роста, по сравнению с клетками, трансфицированных пустым вектором (фиг.6С). Эти данные свидетельствуют о том, что избыточная экспрессия микроРНК-331-3p или экспрессии микроРНК-124 может задержать желудочную пролиферацию раковых клеток, что согласуется с результатами экспрессии HOTAIR нокдаун в клетках BGC-823. Рисунок 6 Положительная корреляция между экспрессией HOTAIR и HER2 и отношение к микроРНК-331-3p /уровни экспрессии микроРНК-124. (A) Двумерный корреляционный анализ взаимосвязи между выражением HOTAIR и MIR-331-3p или микроРНК-124 уровня. (В) Клетки КУП-823 трансфицировали плазмидами, кодирующими микроРНК-331-3p или MIR-124, и QRT-ПЦР использовали для выявления уровней микроРНК сравнению с контрольной группой (MIR-NC). (С) МТТ и анализа роста колониеобразующих были выполнены, чтобы определить пролиферацию микроРНК-331-3p или микроРНК-124, трансфецированных клеток КУП-823. (D) Слева: иммунное белка HER2 в передовых образцах ткани рака желудка. Верх: иммунное HER2 был отрицательным в желудочном раковых тканей с относительно низким уровнем экспрессии HOTAIR. Нижняя: иммунное HER2 был положительным в желудочном раковых тканей с относительно высоким уровнем экспрессии HOTAIR. Справа: Двумерный корреляционный анализ взаимосвязи между уровнем экспрессии HOTAIR и HER2. * P &л; 0,05, ** Р &л; 0.01.
HER2 является коэкспрессируются с HOTAIR в желудочном раковых тканей
Скорость сверхэкспрессия HER2, как сообщалось, 7-34% при раке желудка, и было связано с более агрессивным заболеванием и ухудшению выживаемости при раке желудка [19]. Мы обнаружили экспрессию HER2 в 50 передовых желудочных раковых тканей (стадия III /IV), выбранных из предыдущих 78 желудочных раковых тканей с помощью иммуногистохимии (IHC) и анализа QRT-PCR. Результаты IHC окрашивания показали HER2 белка позитивности в 56% отобранных 50 раковых тканей желудка. Восемьдесят шесть процентов этих HER2 положительных образцов были от продвинутой стадии III /IV опухоли, а 71% проявили высокую экспрессию HOTAIR (рисунок 6D и дополнительный файл 2: Таблица S2). Двумерный корреляционный анализ показал, что экспрессия HER2 достоверно коррелировал с уровнем транскрипта HOTAIR в желудочном раковых тканях по сравнению с нормальными аналогами (рис 6D). Эти данные указывают на то, что экспрессия HER2 положительно связана с повышающей регуляции HOTAIR в желудочном образцах ткани рака, предполагая, что характеристика взаимодействия HER2 /HOTAIR может быть биологически значимым в онкогенеза желудка человека.
Следует отметить, что из-за постоянной фазы III /IV испытание, скорость избыточная экспрессия HER2 обнаруживается в настоящем исследовании выше, чем сообщалось ранее срединного диапазона. Это увеличило скорость гиперэкспрессией HER2 тесно связана с плохим исходом у пациентов с метастатическим
и высокосортной локализуется рак желудка, тем самым подчеркивая важность HER2 в развитии рака желудка и метастазирования. Обсуждение
LncRNAs, которые более 200 нуклеотидов в длину с ограниченной способностью кодирующей белок, часто выражаются в болезням, ткане или стадии развития-специфическим образом, с указанием конкретных функций для lncRNAs в развитии и болезней и делает эти молекулы привлекательными терапевтических мишеней [20-22]. Ряд недавних работ показали, что нарушение регуляции этих lncRNAs может также повлиять на регулирование генома эукариот и обеспечивают клеточный преимущество в росте, что приводит к постепенной и неконтролируемого роста опухоли [23-25]. Поэтому lncRNAs может обеспечить недостающий кусок в противном случае хорошо известного онкогенного и опухолевый супрессор сети головоломки.
В этом исследовании мы проверили экспрессию HOTAIR в образцах карциномы желудка и их окружающих неопухолевых тканей. Мы также определили функцию HOTAIR в желудочных клетках карциномы путем применения амплитудно и с потерей функции подходов. Результаты показали, что HOTAIR был повышающей регуляции в желудочных тканях карциномы по сравнению с соседними нормальными тканями желудка, и что HOTAIR повышающей регуляции коррелируют с большим размером опухоли, продвинутой стадии патологического и обширным метастазированием. Кроме того, общая продолжительность жизни пациентов с более низкими уровнями экспрессии HOTAIR было значительно больше, чем у пациентов с умеренными или сильными уровнями экспрессии HOTAIR. Кроме того, избыточная экспрессия HOTAIR способствовала пролиферации, миграции и инвазии клеток рака желудка, в то время как истощение HOTAIR препятствует проникновению клеток и их жизнеспособность клеток и индуцированный остановку роста как в пробирке и в естественных условиях. Кроме того, подавление HOTAIR привело к продвижению желудочного клеточного апоптоза. Эти данные позволяют предположить, что HOTAIR играет непосредственную роль в модуляции нескольких онкогенных свойств и прогрессии рака желудка, стимулируя новые направления исследований и терапевтические возможности с учетом HOTAIR в качестве нового прогностического маркера и терапевтической мишени при раке желудка.
Важность lncRNAs в заболевание человека, может быть связано с их способностью воздействовать на клеточные функции, с помощью различных механизмов. В этом исследовании, насколько механизм HOTAIR обеспокоен тем, стоит отметить, что анализ внутриклеточной локализации HOTAIR РНК флуоресценции гибридизация пробирного демонстрирует локализацию HOTAIR как для ядра и цитоплазмы [24]. Очевидно, что ядерная HOTAIR может предназначаться Поликомб репрессивный комплекс 2, изменяя H3K27 метилирования и экспрессии генов закономерности в геноме [10, 11]. Недавние работы сообщили функцию каркаса для HOTAIR в цитоплазме в качестве индуктора убиквитин-опосредованный протеолиз [26]. Тем не менее, онкогенные свойства и механистической гетерогенность HOTAIR, и особенно те из цитоплазматической формы, далеко не полностью выяснены.
Вдохновленный регуляторной сети "конкурентоспособных эндогенных РНК» и появлением новых фактических данных, что наводит на мысль, что lncRNAs могут участвовать в этом регуляторная схема, мы предположили, что HOTAIR может также служить в качестве Черна, и поэтому мы искали потенциальных взаимодействий с микроРНК. (В). GAPDH, использовали в качестве контроля. * P &л; Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Качество жизни, иммуномодуляции и безопасность адъювантной терапии омелы у больных раком желудка - рандомизи…
• Вниз регулирование Thrombospondin2 предсказывает плохой прогноз у больных раком желудка