Pvm RNA hotair toimii kilpailevan endogeeninen RNA säätelemään HER2 ilmentymistä pyyhkimällä miR-331-3p mahasyövän

Pvm RNA hotair toimii kilpailevan endogeeninen RNA säätelemään HER2 ilmentymistä pyyhkimällä miR-331-3p mahasyövän
tiivistelmä
tausta
Kertyvät näyttö osoittaa, että pitkän ei-koodaavat RNA hotair on keskeisessä asemassa syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Kuitenkin yleinen biologinen rooli ja kliinistä merkitystä hotair vuonna mahasyövän edelleen suurelta osin tuntemattomia. Tool Menetelmät
hotair ilmentyminen mitattiin 78 pariksi syöpä- ja noncancerous kudosnäytteiden reaaliaikaisella PCR: llä. Vaikutukset hotair mahalaukun syövän solut tutkittiin yli-ilmentymisen ja RNA-interferenssi lähestymistapoja in vitro ja in vivo. Insights mekanismin kilpailukykyinen endogeenisen RNA: iden (ceRNAs) saavutettuja bioinformatiikka analyysin Lusiferaasimäärityksiä ja RNA sitovan proteiinin immunosaostus (RIP). Positiivinen hotair /HER2 vuorovaikutus identifioitiin ja varmistettiin immunohistokemiallisesti määrityksen ja kahden muuttujan korrelaatio analyysi.
Tulokset
hotair säätelyä liittyi suurempi kasvaimen kokoa, kehittyneet patologinen vaiheessa ja laaja etäpesäke, ja myös korreloi lyhyempiä eloonjäämisaste mahalaukun syöpäpotilailla. Lisäksi hotair yli-ilmentyminen edisti proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota mahalaukun syöpä solujen, kun taas hotair ehtyminen estämällä sekä soluinvaasiota ja solujen elinkelpoisuuden, ja indusoi kasvun pysähtymisen in vitro ja in vivo. Erityisesti hotair voi toimia Cerna tehokkaasti tulossa sink Mir-331-3p siten moduloimalla derepressiota HER2 ja asetetaan ylimääräinen taso transkription jälkeisen sääntelyn. Lopuksi positiivinen hotair /HER2 korrelaatio merkitsevästi yhteydessä kehittynyt mahasyövistä.
Johtopäätökset
hotair yliekspressio edustaa biomarkkereiden huonon ennusteen mahasyövässä ja voi antaa pahanlaatuinen fenotyyppi kasvainsoluihin. Cerna sääntely verkko, johon hotair ja myönteistä vuorovaikutusta hotair ja HER2 saattaa osaltaan ymmärtämään paremmin mahasyövän synnyssä ja kehittämisen helpottamiseksi lncRNA ohjaama diagnostiikka ja terapeuttisia tätä tautia vastaan.
Avainsanat
Kilpailevat endogeeninen RNA HER2 hotair Mahasyöpää leviämisen ja invaasion Background
Mahalaukun syöpä on toiseksi suurin syy syövän aiheuttama kuolema, ja on yleisin ruoansulatuskanavan maligniteetti Itä-Aasiassa, Itä-Euroopassa, ja osaa Keski- ja Etelä-Amerikassa. Useimmilla potilailla mahalaukun syöpä diagnosoidaan edennyt pitkälle, ja siihen liittyy pahanlaatuinen leviämisen, laaja invaasio ja imusuonten etäpesäke. Onnistuneet terapeuttiset strategiat ovat rajalliset ja kuolleisuus on korkea [1, 2]. Pitkien ei-koodaavat RNA: t (lncRNAs) ovat viime aikoina saavuttaneet merkittävän huomiota rajata monimutkaisten mekanismien pahanlaatuinen prosesseja, kuten syövän synnyn, etäpesäkkeitä ja lääkeresistenssin. Siksi, jos haluamme ymmärtää täysin mahasyövän, meidän on harkittava tätä perhettä sääntelyn transkriptien, jotka lisäävät uuden kerroksen monimutkaisuutta tuumoribiologiassa.
Vaikka vain pieni joukko toiminnallisia lncRNAs on hyvin tunnettu tasalla, ne on osoitettu säädellä geeniekspressiota eri tasoilla, kuten kromatiinin muutos, transkriptio ja transkription jälkeisiin käsittely [3, 4]. Äskettäin uusi sääntelymekanismi on tunnistettu, jossa ylikuulumisen lncRNAs ja mRNA: iden tapahtuu kilpailemalla jaettua MikroRNA (miRNA) vaste elementtejä. Tällöin lncRNAs voi toimia kilpailevia endogeeninen RNA: t (ceRNAs) sieneen miRNA näin moduloimalla derepressiota miRNA tavoitteiden ja asetetaan ylimääräinen taso jälkeisen kopioinnin säätely [5]. Aiemmissa raporteissa lihas-specific lncRNA, linc-MD1, on raportoitu olevan cerna joka suojaa MyoD lähetti-RNA (mRNA) peräisin miRNA-välitteinen hajoaminen [6]. Pluripotenttisuus liittyvä pvm-RoR voi toimia keskeisenä cerna yhdistää verkkoon miRNA ja ytimen transkriptiotekijöitä, esim Oct4, Sox2, ja Nanog, ihmisen alkion kantasoluja. Erityisesti, lncRNA HULC on erittäin ylössäädelty maksasyövän ja sillä on tärkeä rooli tuumorigeneesissä [7]. Erityisesti HULC voi toimia sisäsyntyinen "sieni", joka säätää alas joukko miRNA aktiviteetteja, kuten miR-372 [8]. Siksi ehdotamme, että jotkut lncRNAs voi olla myös rooleja ceRNAs, joka yhdistää miRNA ja transkription jälkeisen verkon mahalaukun synnyssä.
Hotair (Hox transkripti antisense-geenien välinen RNA
) on ~ 2,2 kb pitkä ei-koodaava RNA transkriboidaan HOXC
lokuksen, joka voidaan torjua transkription trans
on HOXD
on esinahan fibroblasteissa [9]. Uutena molekyyli alalla tuumoribiologiassa, hotair aluksi tuli tunnetuksi sen osallistumisesta ensisijainen rintojen kasvaimia ja rintasyöpä etäpesäkkeitä, jossa korkeus hotair edistetään invasiivisuus ja etäpesäkkeiden [10]. Lisäksi hotair ilmaisu positiivisesti korreloi pahanlaatuinen prosesseja ja huono tulos kolorektaalisyövässä, maksasyövän, haimasyövän ja ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet [11-14]. Viimeaikaiset tutkimukset raportoitu että hotair oli yläreguloituja mahasyövässä [15, 16]. Kuitenkin yleinen biologinen rooli ja taustalla molekyylitason mekanismi hotair vuonna mahasyövän edelleen suurelta osin määrittelemätön.
Tässä tutkimuksessa me raportoimme että hotair säätelyä on ominaista molekyylimuutos mahasyövän ja tutkia biologisia rooleja hotair on fenotyypit mahasyöpä solujen kasvua in vitro ja in vivo. Lisäksi mekanistinen analyysi paljastaa, että hotair voi toimia cerna säätelemään ihmisen epiteelisolujen kasvutekijän reseptori 2 (HER2) kautta kilpailun miR-331-3p, ovat siten onkogeenisen rooli mahan synnyssä. Tässä työssä tarjoaa ensimmäisen todiste myönteistä hotair /HER2 korrelaatio ja ylikuulumisen välillä miR-331-3p, hotair ja HER2, irtoaminen uutta valoa hoitoon mahasyövän.
Tulokset
hotair ilmentyminen on yliaktiivista ihmisen mahasyöpä kudosten
taso hotair ilmaisun määritettiin 78 pariksi mahasyövässä näytteitä ja viereisen, histologisesti normaaleissa kudoksissa by qRT-PCR, ja normalisoitiin GAPDH. Hotair ilmentyminen merkitsevästi yläreguloituja syöpäkudokset (keskimääräinen suhde 14,35-kertainen, P < 0,01) verrattuna normaaliin kollegansa (kuvio 1A). Tutkiminen korrelaatio hotair ilmaisun ja kliinisiä patologisia ominaisuuksia, osoitti, että hotair säätelyä korreloi suuremman kasvaimen kokoa, pitkälle patologinen vaiheessa, etäpesäkkeiden (kuvio 1 B ja C), imusolmuke etäpesäke ja kasvaimen solujen erilaistumiseen (taulukko 1). Kuitenkin hotair ilmentyminen ei liittynyt kasvain asennossa tai potilaan sukupuoli (taulukko 1). Mitä tulee yleiseen eloonjäämiseen, potilailla, joilla on korkea hotair ilme oli huomattavasti huonompi ennuste kuin ne, joilla on alhainen hotair ilme (P < 0,001, log-rank-testi, kuvio 1 D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että hotair yliekspressio voivat olla käyttökelpoisia kehitettäessä uusia prognostisia tai etenemisen markkereita mahasyövän. Kuva 1 Suhteellinen hotair ilmentymisen mahasyövässä kudoksissa ja sen kliinistä merkitystä. (A) Suhteellinen ilmentyminen hotair mahasyövän kudoksissa (n = 78) verrattuna vastaavan ei-kasvain normaalien kudosten (n = 78). Hotair ilmentyminen tutkittiin qRT-PCR ja normalisoitiin GAPDH ilme. Tiedot esitettiin kertamuutosta kasvainkudoksissa suhteessa normaaleissa kudoksissa. (B) tutkiminen korrelaatio hotair ilmaisun ja kliinisiä patologisia piirteitä osoitti, että hotair säätelyä korreloivat suurempi kasvaimen koon ja kehittyneet patologinen vaiheessa. (C) hotair ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi potilailla, joilla etäpesäkkeiden kuin niillä, joilla ei ole kaukainen etäpesäke. (D) Kaplan-Meier eloonjäämiseen käyrät mukaan hotair ekspressiotason. Yleinen eloonjääminen korkean hotair ryhmä (n = 39: hotair ilmaus suhde ≥ mediaani ratio) oli huomattavasti korkeampi kuin Low-hotair ryhmä (n = 39; hotair ilmaus suhde ≤ mediaani ratio; P < 0,001, log rank-testi). * P < 0,05, ** P < 0,01.
Taulukko 1 korrelaatio ilmentymisen hotair kanssa viittaavia tekijöitä
viittaavia tekijöitä
n (%)
Suhteellinen ilmentyminen HOTAIRa
P-arvoB
Sukupuoli
P = 0,62
Mies
50 (64) B 12,21 (+0,97-+17,53) B Nainen
28 (36) B-15.01 (7,34 -19,52) Sivuston kasvaimen
P = 0,910
Distal kolmas
18 (23) B 9.1 (1,37-14,12) B Lähi kolmas
20 (26)
7,96 (2,55-9,72) B proksimaalinen mahan
40 (51) B 7,76 (1,24-13,58) B Differentiation
P = 0,045
Poor
56 (72)
15,6 (6,25-20,36) B korkea /kohtalainen
22 (28) B 8,1 (0,98-11,14) B Imusolmuke etäpesäke
P = 0,005
N0
10 (13) B 1,14 (0,75-1,42) B N1
11 (14) B 3,44 (1,15-4,85) B N2
29 (37) B 11,99 (7.15- 14.77) B N3
28 (36) B-32.58 (7,34-36,27) B Metastaattinen tauti
P = 0,029
M0
64 (82) B 9,35 (2,53 -33,64) B M1
14 kuvassa
28.82 (16,39-39,39) B aMedian suhteellinen ilmaisun, jossa kahdeskymmenesviides-seitsemäskymmenesviides prosenttipiste suluissa. bP < 0,05 katsottiin merkitseväksi (Mann-Whitney U
testin välillä 2 ryhmien ja Kruskall-Wallisin testi 3 ryhmää).
Manipulointi hotair tasojen mahasyövässä soluissa
Me seuraavaksi suoritetaan qRT-PCR-analyysi tutkia ekspressiotasot hotair erilaisissa syöpäsolulinjoissa, mukaan lukien mahalaukun, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja rintasyöpä peräisin olevat solut. Kuten kuviossa 2A on esitetty, neljästä mahasyövän solulinjoissa tutkittiin (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, ja AGS), BGC-823 ilmaistuna korkeamman tason hotair (3,18-kertainen) kuin normaali mahan epiteelin solujen line (GES-1). Vastaavasti, NSCLC solulinja, SPC-A1, osoitti 3,73-kertainen säätelyä hotair yli normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolulinja, 16HBE. Erittäin metastaattinen rintasyöpä MDA-MB-231 osoitti 4,77-kertainen säätelyä hotair verrattuna MCF-7 (kuvio 2A). Tuloksemme viittaavat siihen, että hotair voidaan usein yläreguloituja monissa kasvainsoluissa. Kuva 2 taso hotair ilmentymisen mahasyövän soluissa ja sen vaikutus solujen proliferaatioon in vitro. (A) Tulokset qRT-PCR osoittavat hotair ekspressiotasot mahasyövän solulinjojen (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, ja AGS) verrattuna normaaliin mahalaukun epiteelin solulinja (GES-1), NSCLC solulinja ( SPC-A1) verrattuna normaaliin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen linja (16HBE), ja rintasyövän solulinjat MDA-MB-231 verrattuna MCF-7. (B) qRT-PCR-analyysit hotair ekspressiotason hoidon jälkeen BGC-823-solujen siRNA: t kohdistamista hotair ja hoito SGC-7901-solujen pCDNA /hotair vektori. (C) MTT-määritys suoritettiin sen määrittämiseksi, leviämisen si-hotair-transfektoiduissa BGC-823-soluja tai pCDNA /hotair-transfektoitujen SGC-7901-soluja. Tulokset edustavat keskiarvoa ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) Colony muodostava kasvun määritys suoritettiin sen määrittämiseksi, leviämisen si-hotair transfektoitiin BGC-823-soluja. Pesäkkeet laskettiin ja kiinni. * P < 0,05 ja ** P < 0,01.
Jotta manipuloida hotair tasoilla mahalaukun syövän soluja, pCDNA /hotair transfektoitiin SGC-7901-soluja ja SI-hotair transfektoitiin BGC-823-soluissa, vastaavasti. qRT-PCR-analyysi hotair tasojen suoritettiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja kävi ilmi, että hotair ekspressio lisääntyi 98-kertaisesti SGC-7901-soluissa, verrattuna kontrolli soluihin. Kuitenkin BGC-823-solut, hotair ilme oli käytännössä 75% tippuu alas si-HOTAIR2, tehokkain siRNA myöhemmin käytetään seuraavissa kokeissa (kuvio 2B).
Vaikutus hotair soluproliferaatioon ja apoptoosiin in vitro
merkitsevä lisääntyminen hotair ilmaisun mahasyövän näytteistä sai meidät tutkimaan mahdollisia biologista merkitystä hotair kasvainten synnyssä. MTT-analyysi paljasti, että solujen kasvu oli merkittävästi heikentynyt BGC-823-solut transfektoitu si-hotair, kun leviämisen SGC-7901-solujen lisääntynyt pCDNA /hotair transfektoitujen solujen verrattuna verrokkeihin nähden (kuvio 2C). Samoin tulos pesäkkeitä muodostumisen määritys paljasti, että klonogeeniset eloonjääminen väheni inhiboitu hotair in BGC-823-solut (kuvio 2D).
Sen määrittämiseksi, apoptoosin oli osasyynä solukasvuneston teimme Hoechst värjäystä ja flow-sytometrinen analyysi si-hotair-käsitellyn BGC-823-soluja. Tiedot osoittivat, että solujen lukumäärä ja kondensoitiin ja hajanaista ytimet osoittaa osa alussa apoptoottisten solujen oli merkitsevästi korkeampi si-hotair-käsitellyn BGC-823-soluja verrattuna si-NC-käsitellyissä soluissa (kuvio 3A ja B). Lisäksi olemme havainneet, että esto hotair tehostetun kaspaasi-3-riippuvaista apoptoosia, osoitettiin western blot-analyysi aktivoitua kaspaasi-3 jälkeen si-hotair transfektio (Additional tiedosto 1: Kuva S1). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että knockdovvn hotair estää mahalaukun syöpäsolujen proliferaatiota ja indusoi apoptoosia in vitro. Kuva 3 vaikutus hotair mahalaukun syöpäsolujen apoptoosin, muuttoliike ja invaasion in vitro. BGC-823-solut transfektoitiin si-hotair tai si-NC, ja SGC-7901-soluja transfektoitiin pCDNA /hotair vektorin tai tyhjän vektorin ohjaus. (A) Hoechst värjäys soluvil- apoptoosin; prosenttiosuus Hoechst-positiivisten ytimien kohti optisen alan (vähintään 50 kenttää) määritettiin. (B) Apoptoottiset määriä soluja havaittiin virtaussytometrialla. UL, nekroottiset solut; UR, terminaali apoptoottiset solut; LR, varhainen apoptoottisten solujen. (C ja D) TranswellTM analyysit suoritettiin tutkimaan muutoksia solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus. * P < 0,05 ja ** P < 0.01.
Hotair edistää muuttoliikkeen ja invaasion mahasyövän solujen in vitro
Cell invaasio on merkittävä näkökohta syövän etenemisen, johon liittyy kasvainsolujen vaeltamista perättäisiin kudoksiin ja purkamista soluväliaineen proteiinien. Täällä arvioimme syöpäsoluinvaasiota kautta Transvvell- määrityksissä. Kuten kuviossa 3C, transfektio hotair siRNA haitannut leviämiskyky BGC-823-soluissa noin 66%. Vastaava vaikutus invasiivisuus havaittiin myös rinnakkainen invaasiomääritys. Kääntäen, transfektointi SGC-7901-solujen pCDNA /hotair vektori edistetään solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus ~ 1,9-kertaiseksi (kuvio 3D). Nämä tiedot osoittavat, että hotair on onkogeenisiä ominaisuuksia, jotka voivat edistää muuttavien ja invasiivisen fenotyypin mahalaukun syöpäsoluja.
Hotair edistää kasvainten synnyssä mahasyövän solujen in vivo
Tutkitaan onko taso hotair ilmaisun vaikuttaa kasvainten synnyssä, BGC-823 solut transdusoitu sh-hotair /pENTR vektorin (EV) käytettiin nude hiirillä ksenograftimallissa. Enintään 16 päivän kuluttua knockdovvn hotair oli dramaattinen väheneminen kasvaimen tilavuus ja paino sh-hotair ryhmässä verrattuna kontrolleihin (kuvio 4A, B ja C). Seuraavaksi immunovärjäyty- analyysi leviämisen merkki PCNA suoritettiin resektoitiin tuumorikudoksissa. Verrattuna että kasvaimia muodostettu ohjaus soluista, sh-hotair johdettu kasvaimia osoitti vähensi merkitsevästi PCNA positiivisuus (kuvio 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että taso hotair ilmentyminen merkitsevästi liittyy in vivo leviämisen kapasiteetti mahalaukun syöpäsoluja. Kuva 4 Vaikutus hotair Knockdown kasvaimen kasvua in vivo. (A) Kasvaimen kasvukäyrät mitattiin injektion jälkeen BGC-823-solut transfektoitu sh-hotair tai pENTR vektorin. Kasvaimen tilavuus laskettiin joka 3 päivä. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. (N = 5). (B) Kasvaimen paino. Arvot ovat keskiarvoja kasvaimen paino ± S.D. (C) qRT-PCR-analyysi hotair ilmentymistä kudoksissa resekoituun kasvaimia. (D) Kasvaimet kehitetty BGC-823 /sh-hotair solut osoittivat alhaisempaa PCNA proteiinia kuin kasvaimia kehittyi BGC-823 /pENTR vektorin soluihin. Ylä: H & E värjäys; Alempi: immunovärjäystä. * P < 0,05 ja ** P < 0,01.
Hotair on tavoite miR-331-3P ja miR-124
Bioinformatics analyysi miRNA-tunnistuskohdat hotair paljasti 11 kasvaimen heikentävän miRNA sitoutumiskohtia. Hotair cDNA kloonattiin alavirtaan lusiferaasigeenin ja nimettiin RLuc-hotair (kuvio 5A), transfektoidaan sitten yhdessä erilaisten miRNA-koodaus plasmidit. RNO-miR-344 toimi negatiivisena kontrollina. Tulokset osoittivat, että lusiferaasiaktiivisuudeksi vähennettiin 48% ja 31% verrattuna tyhjän vektorisäätö kun miR-331-3p ja miR-124 esitettiin, vastaavasti. Nämä tiedot osoittavat, että sekä miR-331-3p ja miR-124 voi sitoutua suoraan hotair kautta vastaaviin miRNA tunnustamista sivustoja (kuva 5B vasen paneeli). Kuvio 5 hotair on tavoite miR-331-3P tai miR-124 ja ohjaa miR-331-3p tavoite. (EN) 11 otaksuttu miRNA sitoutumiskohdat hotair järjestyksessä. Hotair cDNA, joka sisälsi oletetun miRNA tunnistuskohtia kloonattiin alavirtaan lusiferaasigeenin ja nimettiin RLuc-hotair. (B) Vasemmalla: lusiferaasireportteriplasmidi (RLuc-hotair) oli kotransfektoitiin HEK-293-T-solujen kanssa 11 eri miRNA-koodaus plasmidit. Oikeassa: lusiferaasireportteriplasmidi, joka sisältää villin tyypin tai mutantti-hotair on kotransfektoitiin HEK-293-T-solujen miR-331-3p rinnakkain tyhjällä plasmidivektori. Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen Dual lusiferaasianalyysissä ja esitetty suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus normalisoitu renilla toimintaa. Histogrammi osoittaa arvot lusiferaasin mitattuna 48 tuntia transfektion jälkeen. (C) 3'-UTR HER2 fuusioitiin lusiferaasia koodaavan alueen (RLuc-HER2 3'-UTR) ja transfektoitiin HEK293T-solujen miR-331-3p vahvistaa HER2 on tavoite miR-331-3p. RLuc-HER2 3'-UTR ja miR-331-3p konstruktit kotransfektoitiin HEK293T-solut plasmideilla, jotka ilmentävät hotair (pCDNA /hotair) tai kontrollivektorilla tarkistaa cerna aktiivisuutta hotair. RNO-miRNA-344 käytettiin negatiivisena kontrollina. Histogrammi osoittaa arvot lusiferaasin mitattuna 48 tuntia transfektion jälkeen. (D) RIP hiiren monoklonaalisella anti-Ago2, esi IgG- tai 10% tulo BGC 823-solu-uutteiden. RNA-tasoissa immunosaostumissa määritettiin qRT-PCR. Top: tasot hotair, miRNA331-3P ja FOS RNA esitettiin kertaiseksi rikastumista Ago2 suhteessa IgG immunopresipitaatit. Pohja: suhteellinen RNA-tasot U1 snRNA vuonna SNRNP70 suhteessa IgG immunopresipitaatit. Numerot ovat keskiarvo ± S.D. (N = 3). (E) Western blot-analyysi HER2-proteiinin tason käsittelyn jälkeen BGC-823-solujen si-hotair tai pCDNA /hotair ja SGC-7901-solujen pCDNA /hotair. GAPDH käytettiin kontrollina. * P < 0,05, ** P < 0,01 ja N. S. ei merkittävää.
Tässä valitsimme miR-331-3p mallina miRNA lisätutkimuksiin. Edelleen vahvistaa, että vähentäminen lusiferaasin aktiivisuutta RLuc-hotair-WT vektori johtui suoraan vuorovaikutukseen miRNA ja sen oletetun sitoutumiskohdan, me mutatoitu MIR-331-3p sitoutumiskohtaa kohdennetulla mutageneesillä, jolloin RLuc -HOTAIR-Mut. Kuten odotettua, suppressio lusiferaasiaktiivisuus poistetaan kokonaan tällä mutantti konstruktio verrattuna villityypin vektorin (kuva 5B oikea paneeli).
Hotair ja miR-331-3p molemmat sitoutuvat kanssa AGO2 mahalaukun syöpäsoluissa
miRNA ovat tiedetään olevan läsnä solulimassa muodossa miRNA ribonukleoproteiini- komplekseja (miRNPs), jotka sisältävät myös Ago2, ydintekijä RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi (RISC) [17, 18]. Testata, onko hotair assosioituu miRNPs, RNA sitovan proteiinin immunosaostus (RIP) kokeet suoritettiin BGC-823 solu-uutteista käyttäen vasta-aineita Ago2. RNA-tasoissa immunosaostumissa määritettiin qRT-PCR. Hotair oli ensisijaisesti rikastunut (354-kertaisesti) Ago2 sisältävien miRNPs suhteessa kontrolliin immunoglobuliini G (IgG) immunopresipitaatit. Samoin, miRNA-331-3p havaittiin tasolle 840 kertaa suurempi kuin kontrolli anti-IgG: tä. Onnistunut immunosaostus Ago2 liittyvän RNA varmistettiin qRT-PCR käyttäen RIP alukkeita ihmisen FOS sisältyvät RIPAb + Ago2 kit (kuvio 5D, yläpaneeli). Lisäksi anti-SNRNP70 käytettiin positiivisena kontrollina RIP menettelyyn, ja U1 snRNA havaittiin myös tasolle 206 kertaa suurempi kuin anti-IgG (kuvio 5D, alapaneeli). Siten hotair on läsnä Ago2 sisältävien miRNPs, todennäköisesti läpi yhdessä miRNA-331-3p, vastaa meidän bioinformatiikka analyysin ja Lusiferaasimäärityksiä.
Hotair ohjaa miR-331-3p tavoite, HER2
Monista tavoitteita miR-331-3p keskityimme HER2 koska se koodaa transmembraanisen proteiinin relevantti funktio karsinogeneesissä ja kestävyys trastutsumabille perustuvaan hoitoon [19]. 3'-UTR HER2 fuusioitiin lusiferaasia koodaavan alueen (RLuc-HER2 3'-UTR) ja transfektoitiin plasmideilla, jotka koodaavat miR-331-3p ja tyhjä plasmidivektori. RNO-miRNA-344 toimi negatiivisena kontrollina. Lusiferaasimääritystä osoitti, että miR-331-3p merkittävästi esti lusiferaasiaktiivisuutta (~ 41% esto) ja RLuc-HER2 3'-UTR toimittaja, joka vahvistaa, että HER2 on tavoite miR-331-3p. RLuc-HER2 3'-UTR konstrukti transfektoidaan sen jälkeen yhdessä plasmideilla, jotka koodaavat miR-331-3p ja hotair (pCDNA /hotair). Lusiferaasimäärityksiä osoitti, että läsnä hotair, RLuc-HER2 3'-UTR tukahduttaminen palautettiin verrattiin verrokkiryhmään (kuvio 5C). Tämä osoittaa, että hotair toimii endogeeninen "sieni" sitomalla miR-331-3p poisti siten miRNA aiheuttama repressoiva toimintaa HER2 3'-UTR.
Lisäksi vaikutus hotair ilmentymisen endogeenisiin HER2 proteiinia yhdessä modulaatio miRNA tai lncRNA tasoja seurattiin erilaisia ​​lähestymistapoja kuvassa 5E: (1) miR-331-3p yliekspressio vastaan ​​HER2 BGC-823-solut; (2) hotair Knockdown vastaan ​​HER2 BGC-823-solut; (3) hotair yliekspressio varten HER2 SGC-7901-soluissa. Western blot-analyysi osoitti, että pakko ilmentymistä miR-331-3p tai knockdovvn hotair in BGC-823 solut laukaisi merkittävästi vaiennettu vaikutus omien HER2-proteiinin ilmentymistä. Lisäksi HER2-proteiinin ekspressio oli merkittävästi voimistunut transfektion jälkeen hotair in SGC-7901-soluissa, mikä osoittaa suhteellisen alhaisen endogeenisen hotair ekspressiotaso.
Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että sitomalla miR-331-3p, hotair toimii cerna varten kohde-HER2-mRNA, mikä moduloimalla derepressiota HER2 ja asetetaan ylimääräinen taso transkription jälkeisen sääntelyn.
miR-331-3p ja miR-124 estää mahalaukun syöpäsolujen lisääntymistä
toimia sisäsyntyinen upotetut tavoite miRNA, runsaasti hotair pitäisi olla verrattavissa tai suurempi kuin miR-331-3p /miR-124. Tutkimuksessamme qRT-PCR-analyysi osoitti, että miR-331-3p /miR-124-ekspressio korreloi käänteisesti hotair ekspression 20 paria pitkälle syöpien (kuvio 6A). Validoida onko miR-331-3p ja miR-124 voi myös estää mahalaukun syövän solujen lisääntymistä, me pakko niiden ilmaisun BGC-823-soluihin käyttämällä miRNA-koodaavaa plasmideja. Ilmaisu tasot miRNA-331-3p ja miR-124 transfektoitiin BGC-823 solut merkittävästi nousi 36-kertaiseksi ja 29-kertaiseksi verrattuna kontrolli soluihin (kuvio 6B). Seuraava, MTT: n ja pesäkkeiden muodostumista analyysit suoritettiin sen määrittämiseksi, solujen elinkelpoisuuden. Tulokset MTT-määritystä ja kasvukäyrät paljasti, että transfektoitujen solujen miR-331-3p tai miR-124 osoitti merkittävää kasvun hidastumisen verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla (kuvio 6C). Nämä tiedot osoittavat, että yli-ilmentyminen miR-331-3p tai miR-124 ekspressio voidaan pidättää mahasyövän solujen lisääntymistä, joka on yhdenmukainen tulosten kanssa hotair ilmentymisen pudotus in BGC-823-soluja. Kuva 6 positiivinen korrelaatio hotair ja HER2 ilmaisun ja merkitystä miR-331-3p /miR-124 ekspressiotasot. (A) kahden muuttujan korrelaatio analyysi suhdetta hotair ilmaisun ja miR-331-3p tai miR-124 tasolla. (B) BGC-823-solut transfektoitiin plasmideilla, jotka koodaavat miR-331-3p tai miR-124, ja qRT-PCR: ää käytettiin havaitsemaan miRNA tasot verrattuna kontrolleihin (miR-NC). (C) MTT-määritystä ja pesäkkeitä muodostavat kasvun määritys suoritettiin sen määrittämiseksi, leviämisen miR-331-3p tai miR-124 transfektoitiin BGC-823-soluja. (D) Vasen: immunovärjäyksen HER2-proteiinin edennyt mahasyöpä kudosnäytteitä. Ylä: immunovärjäyty- HER2 oli negatiivinen mahasyövän kudoksissa suhteellisen alhainen hotair ilme. Alempi: immunovärjäys HER2 oli positiivinen mahasyövän kudoksissa suhteellisen korkea hotair ilme. Oikea: bivariate korrelaatio analyysi suhdetta hotair ja HER2 ekspressiotaso. * P < 0,05, ** P < 0.01.
HER2 on ekspressoidaan kanssa hotair mahasyövän kudoksissa
yli-ilmentävät HER2 oli raportoitu olevan 7-34% mahasyövän, ja liittyi enemmän aggressiivinen sairaus ja huonompi selviytyminen mahasyövän [19]. Olemme havainneet ilmentyminen HER2 50 edennyt mahasyöpä kudoksiin (vaihe III /IV) valittu edellisestä 78 mahasyövän kudosten immunohistokemiallinen (IHC) ja qRT-PCR-analyysillä. Tulokset IHC värjäys osoitti HER2-proteiinia positiivisuuden 56% valitusta 50 mahasyövän kudoksiin. Kahdeksankymmentäkuusi prosenttia näistä HER2 positiiviset näytteet olivat peräisin pitkälle III /IV kasvaimet, ja 71% näytetään korkea hotair ilmaisu (kuvio 6D ja Additional tiedosto 2: Taulukko S2). Bivariate korrelaatio analyysi osoitti, että ilmentyminen HER2 korreloi merkitsevästi hotair transkriptin tasolla mahasyövän kudoksissa verrattuna normaaliin kollegansa (kuvio 6D). Nämä tiedot osoittavat, että ekspressio HER2 positiivisesti liittyy ilmen- tymisen lisääntymisen hotair mahasyövän kudosnäytteistä, mikä viittaa siihen, että luonnehdinta HER2 /hotair vuorovaikutus voi olla biologisesti merkittävä ihmisen mahalaukun kasvaimien syntyyn.
Erityisesti koska jatkuva vaiheen III /IV tutkimuksessa yli-ilmentävät HER2 korko havaittu tässä tutkimuksessa on korkeampi kuin aiemmin raportoitu mediaani alue. Tämä lisääntynyt määrä yli-ilmentävät HER2 liittyy vahvasti tai heikot tulokset metastasoituneen ja korkea-asteen lokalisoitu syöpien, jolloin korostetaan HER2 mahalaukun syövän kehittymisessä ja etäpesäkkeiden.
Keskustelu
LncRNAs, jotka ovat yli 200 nukleotidin pituinen rajoitettu proteiinia koodaavan kapasiteetin, usein ilmaistaan ​​tauteja, kudos- tai kehitysvaiheessa sopivalla tavalla, mikä osoittaa tiettyjä toimintoja varten lncRNAs kehitys- ja sairauksien ja tällaisen molekyylit houkuttelevia hoitotavoitteet [20-22]. Useat viimeaikaiset papereita ovat osoittaneet, että dysregulation näistä lncRNAs saattavat myös vaikuttaa sääntelyn eukaryoottigenomissa ja antaa solujen kasvua etu, jolloin etenevä ja hallitsematon kasvaimen kasvua [23-25]. Siksi lncRNAs voi tarjota puuttuva pala muuten tunnettua onkogeenisiä ja kasvaimia estävä verkon palapeli.
Tässä tutkimuksessa testasimme ilmentyminen hotair mahalaukun karsinoomanäytteistä ja niitä ympäröivien ei-syöpäkudoksissa. Olemme myös tunnistaneet funktio hotair mahalaukun syöpäsoluissa soveltamalla vahvistus- ja menettämisestä toiminnon lähestymistapoja. Tulokset osoittivat, että hotair on yliaktiivista mahakarsinoo- kudoksissa verrattuna viereisen normaalin mahan kudoksissa, ja että hotair upregulation korreloivat suurempi kasvaimen kokoa, pitkälle patologinen vaiheessa ja laaja etäpesäke. Lisäksi yleinen elinaika potilailla, joilla on alhaisempi hotair ekspressiotasot oli merkitsevästi pidempi kuin potilailla, joilla on kohtalainen tai voimakas hotair ekspressiotasoja. Lisäksi hotair yli-ilmentyminen edisti proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota mahalaukun syöpä solujen, kun taas hotair ehtyminen esti soluinvaasiota ja solujen elinkelpoisuuden, ja indusoi kasvun pysähtymisen sekä in vitro ja in vivo. Lisäksi hotair tukahduttaminen johti edistämiseen mahalaukun solujen apoptoosin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että hotair näyttelee suora rooli modulaatio useiden onkogeenisten ominaisuuksien ja mahalaukun syövän etenemisessä, stimuloivaa uusi tutkimus suuntiin ja hoitovaihtoehdot harkitsee hotair uutena prognostinen markkeri ja terapeuttinen kohde mahasyövän.
Merkitys lncRNAs vuonna ihmisen sairaus voi liittyä niiden kykyyn vaikuttaa solutoiminnoille eri mekanismien kautta. Tässä tutkimuksessa, sikäli kuin mekanismi hotair osalta, on syytä mainita, että solunosasijaintia analyysi hotair RNA-fluoresenssi in situ -hybridisaatiolla määritys osoittaa lokalisoinnin hotair sekä tuman ja sytoplasman [24]. On selvää, että ydin- hotair voidaan kohdistaa Polycomb tukahduttavaa kompleksi 2, muuttamalla H3K27 metylaatio ja geeniekspressiomalleja koko genomin [10, 11]. Viimeaikainen työ raportoitu tukirakenteen toiminto hotair sytoplasmassa kuin indusoi ubikitiinistä välittämän proteolyysin [26]. Kuitenkin kasvaimia ominaisuudet ja mekanistinen heterogeenisyys hotair, ja erityisesti sytoplasmisen muodon, ei ole läheskään täysin selvitetty.
Innoittamana "kilpailukykyinen endogeeninen RNA: t" sääntelyverkon ja kehittyvien todisteita, jotka viittaavat että lncRNAs voivat osallistua tähän sääntelyyn piiri, me arveltu, että hotair voi toimia myös Černá ja niin etsittiin mahdollisista yhteisvaikutuksista miRNA. Tueksi tätä käsitystä, käytimme bioinformatiikan analyysi ja Lusiferaasimäärityksiä validoida suoran sitoutumisen kyvyn ennustetun miRNA vastauksen elementtejä täyspitkän hotair transkriptin. * P < 0,05. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Elämänlaatu, immuunimodulaatio ja turvallisuutta adjuvanttia misteli potilailla mahalaukun syöpä - satunnaistettu, kontrolloitu pilotti study
• Down sääntely Thrombospondin2 ennustaa huonon ennusteen potilailla mahalaukun cancer