Lnc RNA hotair fungerer som en konkurrerende endogen RNA til å regulere HER2 uttrykk ved snyltende MIR-331-3p i mage cancer

lnc RNA hotair fungerer som en konkurrerende endogen RNA til å regulere HER2 uttrykk ved snyltende MIR-331-3p i magekreft
Abstract
Bakgrunn
Samler bevis indikerer at den lange ikke-kodende RNA hotair spiller en avgjørende rolle i kreft progresjon og metastasering. Men den totale biologiske rolle og kliniske betydningen av hotair i magekreft fortsatt i stor grad ukjent.
Metoder
hotair uttrykk ble målt i 78 paret kreft og noncancerous vevsprøver ved real-time PCR. Effektene av varmluft på gastrisk kreft celler ble studert ved overekspresjon og RNA interferens tilnærminger in vitro og in vivo. Innsikt i mekanismen av konkurranse endogene RNA (ceRNAs) ble ervervet fra bioinformatiske analyse, luciferase analyser og RNA bindende protein immunoprecipitation (RIP). Den positive hotair /HER2 interaksjon ble identifisert og bekreftet ved immunhistokjemi analyse og bivariat korrelasjonsanalyse.
Resultater
hotair oppregulering var assosiert med større tumorstørrelse, avansert patologisk stadium og omfattende metastasering, og også korrelert med kortere total overlevelse av mage kreftpasienter. Videre hotair overekspresjon fremmet spredning, migrasjon og invasjon av magekreft celler, mens hotair uttømming hemmet både celle invasjon og celle levedyktighet, og indusert vekst arrest in vitro og in vivo. Spesielt kan hotair virke som en CERNA, effektivt bli en vask for MIR-331-3p, for derved å modulere derepresjon av HER2 og å innføre et ekstra nivå av post-transkripsjonell regulering. Til slutt, den positive hotair /HER2 korrelasjon ble signifikant assosiert med avansert magekreft.
Konklusjoner
hotair overekspresjon representerer en biomarkør for dårlig prognose i magekreft, og kan gi malign fenotype til kreftceller. Cerna regulatoriske nettverk som involverer hotair og positiv samhandling mellom hotair og HER2 kan bidra til en bedre forståelse av magekreft patogenesen og legge til rette for utvikling av lncRNA styrt diagnostikk og terapi mot denne sykdommen.
Nøkkelord
Konkurrerende endogen RNA HER2 hotair Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP spredning og invasjon Bakgrunn
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den nest største årsaken til kreft-indusert død, og er den vanligste gastrointestinal malignitet i Øst-Asia, Øst-Europa, og deler av Sentral- og Sør-Amerika. Hos de fleste pasienter er magekreft diagnostisert på et avansert stadium og er ledsaget av ondartet spredning, omfattende invasjon og lymfatiske metastasering. Vellykket terapeutiske strategier er begrenset, og dødeligheten er høy [1, 2]. Lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) har nylig fått betydelig oppmerksomhet i opptegning av komplekse mekanismer underliggende ondartede prosesser som kreftutvikling, metastaser og resistens. Derfor, hvis vi ønsker å forstå magekreftutvikling, må vi vurdere denne familien av regulatoriske transkripsjoner som legger et nytt lag av kompleksitet til tumorbiologi.
Selv om bare et lite antall funksjonelle lncRNAs har blitt godt karakterisert hittil, de er blitt vist å regulere genekspresjon på forskjellige nivåer, inkludert kromatin modifikasjon, transkripsjon og post-transkripsjonell bearbeiding [3, 4]. Nylig har en ny reguleringsmekanisme blitt identifisert som crosstalk mellom lncRNAs og mRNA skjer ved å konkurrere for delte microRNAs (mirnas) responselementer. I dette tilfellet kan lncRNAs fungere som konkurrerende endogene RNA (ceRNAs) å svamp mirnas, og dermed modulerende derepresjon av miRNA mål og innføre et ekstra nivå av post-transcriptional regulering [5]. I tidligere rapporter har en muskel-spesifikke lncRNA, Linc-MD1, er rapportert å være en Cerna som beskytter myod budbringer RNA (mRNA) fra miRNA-mediert degradering [6]. Pluripotency-assosiert lnc-RoR kan fungere som en nøkkel Cerna å knytte nettverk av miRNAs og kjernetranskripsjonsfaktorer, for eksempel, Oct4, Sox2, og Nanog, i humane embryonale stamceller. Spesielt er lncRNA HULC sterkt oppregulert i leverkreft og spiller en viktig rolle i tumorigenesis [7]. Spesielt kan HULC fungere som en endogen "svamp" som nedregulerer en serie av mirnas aktiviteter, inkludert MIR-372 [8]. Vi foreslår derfor at noen lncRNAs kan også ha roller som ceRNAs, knytte mirnas og post-transcriptional nettverk i mage patogenesen.
Hotair (Hox avskrift anti intergeniske RNA
) er en ~ 2,2 kb lange ikke-kodende RNA transkribert fra HOXC
locus, som kan undertrykke transkripsjon i trans
av HOXD
i forhuden fibroblaster [9]. Som en roman molekyl innen tumorbiologi, hotair opprinnelig ble kjent for sitt engasjement i primær brystsvulster og brystkreft metastaser, der heving av hotair fremmet invasivitet og metastasering [10]. Videre hotair uttrykk positivt korrelerer med maligne prosesser og dårlig utfall i tykk- og endetarmskreft, leverkreft, kreft i bukspyttkjertelen og gastrointestinal stromal tumor [11-14]. Nyere studier har rapportert at hotair ble oppregulert i magekreft [15, 16]. Likevel, den totale biologiske rolle og underliggende molekylære mekanismen av hotair i magekreft fortsatt i stor grad udefinert.
I denne studien rapporterer vi at hotair oppregulering er et karakteristisk molekylær endring i magekreft og undersøke de biologiske roller hotair på fenotyper av magekreftceller in vitro og in vivo. Videre avslører mekanistisk analyse som hotair kan fungere som en Cerna å regulere uttrykk for menneskelig epitelial vekstfaktor-reseptor 2 (HER2) gjennom konkurranse for MIR-331-3p, og dermed spille en onkogen rolle i mage patogenesen. Dette arbeidet gir det første bevis for en positiv hotair /HER2 korrelasjon og crosstalk mellom MIR-331-3p, hotair og HER2, kaster nytt lys på behandling av magekreft.
Resultater
hotair uttrykk er oppregulert i menneskelige mage kreft vev
nivå hotair ble bestemt i 78 parvise magekreftprøver og tilstøtende, histologisk normalt vev ved QRT-PCR, og normalisert til GAPDH. Hotair ekspresjon var signifikant oppregulert i cancervev (bety forholdet mellom 14,35-fold, P < 0,01) sammenlignet med normale motstykker (figur 1A). Undersøkelse av korrelasjonen mellom hotair ekspresjon og klinisk patologiske funksjoner viste at hotair oppregulering ble korrelert med større svulststørrelsen, avansert patologisk stadium, fjernmetastaser (figur 1 B og C), lymfeknutemetastase og tumor-celledifferensiering (tabell 1). Men hotair uttrykk var ikke assosiert med tumor posisjon eller pasient kjønn (tabell 1). Med hensyn til total overlevelse, pasienter med høyt hotair uttrykk hatt en vesentlig dårligere prognose enn de med lav hotair uttrykk (P < 0,001, log-rank test, figur 1D). Disse resultatene antyder at hotair overekspresjon kan være nyttig i utviklingen av nye prognostiske eller progresjon markører for magekreft. Figur 1 Relativ hotair uttrykk i mage kreft vev og klinisk betydning. (A) Relativ ekspresjon av varmluft i magekreft vev (n = 78) sammenlignet med tilsvarende ikke-tumor normale vev (n = 78). Hotair uttrykk ble undersøkt ved QRT-PCR og normalisert til GAPDH uttrykket. Dataene ble presentert som fold-endring i tumorvev, i forhold til normalt vev. (B) Undersøkelse av sammenhengen mellom hotair uttrykk og kliniske patologiske funksjoner viste at hotair oppregulering korrelert med større tumorstørrelse og avansert patologisk stadium. (C) hotair uttrykk var signifikant høyere hos pasienter med fjernmetastaser enn hos dem med ikke-fjernmetastaser. (D) Kaplan-Meier generelle overlevelseskurver ifølge hotair uttrykk nivå. Den totale overlevelsen av High-hotair gruppe (n = 39: hotair uttrykk forholdet ≥ median ratio) var betydelig høyere enn for lav-hotair gruppe (n = 39; hotair uttrykk ratio ≤ median forhold; P < 0,001, log rank test). * P < 0,05, ** P < 0.01.
Tabell 1 Korrelasjon av uttrykket av hotair med clinicopathologic funksjoner
Clinicopathologic funksjoner
n (%)
Relativ uttrykk for HOTAIRa
P-verdiB
Kjønn
P = 0,62
Mann fra 50 (64)
12,21 (0,97 til 17,53)
Kvinne
28 (36)
15,01 (7,34 -19,52)
Site of tumor
P = 0.910
Distal tredje
18 (23)
9,1 (1,37 til 14,12)
Middle tredje
20 (26)
7,96 (2,55 til 9,72)
Proximal magen
40 (51)
7,76 (1,24 til 13,58)
Differensiering
P = 0.045
Dårlig
56 (72)
15,6 (6,25 til 20,36)
høy /moderat
22 (28)
8,1 (0,98 til 11,14)
lymfeknutemetastase
P = 0.005
N0
10 (13)
1,14 (0,75 til 1,42)
N1
11 (14)
3,44 (1,15 til 4,85)
N2
29 (37)
11.99 (7.15- 14.77)
N3
28 (36)
32,58 (7,34 til 36,27)
metastatisk sykdom
P = 0,029
M0
64 (82)
9,35 (2,53 -33,64)
M1
14 fig
28,82 (16,39 til 39,39)
aMedian av relative uttrykk, med 25.-75-persentil i parentes. BP < 0,05 ble betraktet som signifikant (Mann-Whitney U
test mellom 2 grupper og Kruskall-Wallis test for 3 grupper).
Manipulering av hotair nivåer i magekreftceller
Vi neste utførte QRT-PCR-analyse for å undersøke uttrykk nivåer av hotair i ulike kreftcellelinjer, inkludert mage, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og brystkreft-avledet celler. Som vist i figur 2A, av de fire mage cancer-cellelinjer undersøkt (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, og AGS), BGC-823 uttrykte høye nivåer av varmluft (3,18 ganger) enn den normale gastriske epitel celle linje (GES-1). Tilsvarende NSCLC cellelinje, SPC-A1, viste en 3,73 gangers oppregulering av varmluft i løpet av den normale humane bronkiale epitel cellelinje, 16HBE. Den svært metastatisk brystkreft cellelinjen MDA-MB-231 viste en 4,77 gangers oppregulering av varmluft mot MCF-7 (figur 2A). Våre data antyder at varmluft kan ofte oppregulert i mange tumorceller. Figur 2 Nivået av varmluft ekspresjon i magekreftceller og dens effekt på celleproliferasjon in vitro. (A) Resultater fra QRT-PCR som viser hotair ekspresjonsnivåer av magecancercellelinjer (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, og AGS) sammenlignet med normale gastriske epitel cellelinje (GES-1), NSCLC-cellelinje ( SPC-A1) sammenlignet med normal menneskelig bronkial epitel cellelinje (16HBE), og brystkreft cellelinjer MDA-MB-231 sammenlignet med MCF-7. (B) QRT-PCR analyser av hotair uttrykk nivå etter behandling BGC-823 celler med sirnas målgruppe hotair og behandlings SGC-7901 celler med pcDNA /hotair vektor. (C) MTT-analysen ble utført for å bestemme spredning av si-hotair-transfektert BGC-823-celler eller pcDNA /varmluft-transfekterte SGC-7901-celler. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. (D) kolonidannende vekstanalyse ble utført for å bestemme spredning av Si-hotair transfektert BGC-823-celler. Koloniene ble talt og tatt til fange. * P < 0,05 og ** P < 0.01.
Til manipulere hotair nivåer i mage kreftceller, ble en pcDNA /hotair vektor transfektert inn SGC-7901 celler og si-hotair ble transfektert inn i BGC-823 celler, henholdsvis. QRT-PCR analyse av hotair nivåer ble utført ved 48 timer etter transfeksjon og avslørte at hotair uttrykk ble økt 98 ganger i SGC-7901 celler, sammenlignet med kontrollceller. Men i BGC-823 celler, hotair uttrykk var effektivt 75% kjørt ned av Si-HOTAIR2, den mest effektive siRNA senere brukt i de følgende forsøk (figur 2B).
Effekt av hotair på celleproliferasjon og apoptose in vitro
den betydelige økningen av hotair uttrykk i magekreftprøver bedt oss om å utforske mulige biologiske betydningen av hotair i tumorigenesis. MTT-analyse viste at cellevekst ble betydelig svekket i BGC-823 celler transfektert med SI-hotair, mens spredning av SGC-7901-celler ble økt i pcDNA /hotair transfekterte celler sammenlignet med respektive kontroller (Figur 2C). Tilsvarende resultat av koloni-formasjon analysen viste at klonogene overlevelse ble redusert etter hemming av hotair i BGC-823 celler (figur 2D).
Å avgjøre om apoptose var en medvirkende faktor til celle veksthemming, utførte vi Hoechst flekker og flow-cytometri analyse av si-hotair-behandlede BGC-823 celler. Dataene viste at antallet av celler med kondensert og fragmentert kjerner som angir den fraksjon av tidlige apoptotiske celler var signifikant høyere i si-hotair-behandlede BGC-823-celler sammenlignet med si-NC-behandlede celler (figur 3A og B). I tillegg har vi funnet at inhibering av varmluft forbedret caspase-3-avhengig apoptose, demonstrert ved Western blot analyse av aktivert kaspase-3 etter at Si-hotair transfeksjon (Tilleggs fil 1: Figur S1). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at knockdown av hotair undertrykker magekreft celleproliferasjon og induserer apoptose in vitro. Figur 3 Effekten av varmluft på magekreft celle apoptose, migrering og invasjon in vitro. BGC-823 celler ble transfektert med SI-hotair eller si-NC, og SGC-7901 celler ble transfektert med pcDNA /hotair vektor eller tom vektor kontroll. (A) Hoechst farging analyse av celle apoptose; prosentandelen av Hoechst-positive kjerner pr optiske felt (minst 50 felt) ble bestemt. (B) Den apoptotiske rater celler ble detektert ved strømningscytometri. UL, nekrotiske celler; UR, terminal apoptotiske celler; LR, tidlige apoptotiske celler. (C og D) Transwell analyser ble utført for å undersøke forandringer i cellemigrering og invasivitet. * P < 0,05 og ** P < 0.01.
Hotair fremmer migrasjon og invasjon av magekreftceller in vitro
Cell invasjonen er en betydelig del av kreft progresjon som involverer migrering av kreftceller til sammenhengende vev og oppløsningen av ekstracellulære matrix proteiner. Her vurderte vi kreftcelle invasjon gjennom Transwell analyser. Som vist i figur 3C, transfeksjonen av varmluft siRNA hemmes de trekkende evne BGC-823-celler med omtrent 66%. En tilsvarende effekt på invasivitet ble også observert i en parallell invasjon assay. Motsatt, transfeksjon av SGC-7901 celler med pcDNA /hotair vektor fremmet cellemigrasjon og invasivitet ~ 1,9 ganger (figur 3D). Disse dataene indikerer at hotair har onkogene egenskaper som kan fremme en trekkfugl og invasiv fenotype i magekreftceller.
Hotair fremmer tumorigenesis av magekreftceller in vivo
å undersøke om nivået av hotair uttrykk påvirker tumorigenesis, BGC-823 celler transdusert med den sh-hotair /pENTR vektor (EV) ble anvendt i en naken mus xenograft modell. Opp til 16 dager etter knockdown av varmluft, var det en dramatisk reduksjon i tumorvolum og vekt i den sh-hotair gruppe sammenliknet med kontroller (figur 4A, B og C). Deretter ble utført farging analyse av markør spredning PCNA i resekterte tumorvev. I sammenligning med den i tumorer dannet fra kontrollceller, viste sh-hotair-avledede tumorer betydelig redusert PCNA positivitet (figur 4D). Disse resultatene tyder på at nivået av ekspresjon hotair er signifikant assosiert med in vivo spredning kapasitet av gastrisk kreft celler. Figur 4 Effekt av varmluft knockdown på tumorvekst in vivo. (A) tumorvekst kurver ble målt etter injeksjon av BGC-823 celler transfektert med sh-hotair eller pENTR vektor. Tumor volum ble beregnet hver 3. dag. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. (N = 5). (B) Tumorvekt. Verdier er hjelp av tumor vekt ± S.D. (C) QRT-PCR analyse av hotair uttrykk i vev av resected svulster. (D) Svulster utviklet fra BGC-823 /sh-hotair celler viste et lavere nivå av PCNA protein enn svulster utvikles fra BGC-823 /pENTR vektor celler. Øvre: H & E farging; Nedre: farging. * P < 0,05 og ** P < 0.01.
Hotair er et mål på MIR-331-3P og MIR-124
Bioinformatikk analyse av miRNA gjenkjenningssekvenser på hotair avslørte tilstedeværelsen av 11 kreftundertrykkende mirnas bindingssteder. Den hotair cDNA ble klonet nedstrøms for luciferase genet og heter RLuc-hotair (figur 5A), deretter transfektert sammen med ulike miRNA-koding plasmider. RNO-MIR-344 fungerte som en negativ kontroll. Resultatene viste at luciferaseaktivitet ble redusert med 48% og 31% sammenlignet med tom vektorkontroll når MIR-331-3p og MIR-124 ble uttrykt, respektivt. Disse dataene viser at både MIR-331-3p og MIR-124 kan direkte binde seg til hotair gjennom respektive miRNA gjenkjenningsseter (figur 5B venstre panel). Figur 5 hotair er et mål på MIR-331-3P eller MIR-124 og kontrollerer MIR-331-3p mål. (A) De 11 antatte miRNA bindingsseter i hotair sekvens. Den hotair cDNA som inneholder de antatte mirnas gjenkjenningsseter ble klonet nedstrøms for luciferase genet og heter RLuc-hotair. (B) Venstre: Den luciferase reporter plasmid (RLuc-hotair) var co-transfektert inn i HEK-293 T-celler med de 11 ulike miRNA-koding plasmider. Høyre: luciferase reporter plasmid inneholdende villtype eller mutant hotair ble ko-transfektert inn i HEK-293 T-celler med MIR-331-3p i parallell med et tomt plasmid vektor. Luciferase-aktiviteten ble bestemt ved anvendelse av den doble luciferase-analysen og vist som den relative luciferaseaktiviteten normalisert til Renilla aktivitet. Histogrammet indikerer verdiene for luciferaseaktivitet målt 48 timer etter transfeksjon. (C) 3'-UTR av HER2 ble smeltet til lusiferasekodende region (RLuc-HER2 3'-UTR) og transfektert i HEK293T celler med MIR-331-3p å bekrefte HER2 er målet for MIR-331-3p. RLuc-HER2 3'-UTR og MIR-331-3p konstruksjonene ble ko-transfektert inn HEK293T celler med plasmider som uttrykker hotair (pcDNA /hotair) eller med en kontroll vektor for å verifisere Cerna aktivitet hotair. RNO-miRNA-344 ble anvendt som en negativ kontroll. Histogrammet indikerer verdiene for luciferaseaktivitet målt 48 timer etter transfeksjon. (D) RIP med muse-monoklonalt anti-Ago2, preimmun IgG eller 10% inndata fra BGC 823-celleekstrakter. RNA-nivåer i immunutfelninger ble bestemt ved QRT-PCR. Topp: nivåer av hotair, miRNA331-3P og FOS RNA ble presentert som fold berikelse i Ago2 forhold til IgG immunpresipitatene. Bunn: relative RNA nivåer av U1 snRNA i SNRNP70 forhold til IgG immunpresipitatene. Tallene er gjennomsnitt ± standardavvik (N = 3). (E) Western blot analyse av HER2 protein nivå etter behandling av BGC-823 celler med SI-hotair eller pcDNA /hotair, og SGC-7901 celler med pcDNA /hotair. GAPDH ble anvendt som kontroll. * P < 0,05, ** P < 0,01 og N.S. ikke signifikant.
Heri, valgte vi MIR-331-3p som modell miRNA for videre studier. For ytterligere å bekrefte at reduksjonen i luciferase aktivitet fra RLuc-hotair-WT vektor var på grunn av direkte interaksjon mellom miRNA og dens antatte bindingssetet, muterte vi Mir-331-3p bindingssetet ved seterettet mutagenese, som resulterer i RLuc -HOTAIR-Mut. Som ventet ble undertrykkelse av luciferase aktivitet fullstendig avskaffet i denne mutant konstruksjon sammenlignet med vill-type vektor (panel figur 5B høyre).
Hotair og MIR-331-3p både bind med AGO2 i magekreftceller
miRNAs er kjent for å være til stede i cytoplasma i form av miRNA ribonucleoprotein komplekser (miRNPs) som også inneholder Ago2, kjernekomponenten av RNA-indusert stanse kompleks (RISC) [17, 18]. For å teste om hotair forbinder med miRNPs, RNA binding protein immunoprecipitation (RIP) eksperimenter ble utført på BGC-823 celleekstrakter ved hjelp av antistoffer mot Ago2. RNA-nivåer i immunutfelninger ble bestemt ved QRT-PCR. Hotair ble fortrinnsvis beriket (354 ganger) i Ago2 holdig miRNPs i forhold til å kontrollere immunglobulin G (IgG) immunpresipitatene. Tilsvarende ble miRNA-331-3p påvist ved et nivå 840 ganger større enn den for kontrollen anti-IgG. Vellykket immunoprecipitation av Ago2-assosiert RNA ble verifisert ved QRT-PCR, ved hjelp av RIP primere mot menneskelige FOS inkludert i RIPAb + Ago2 kit (Figur 5D, topp panel). I tillegg ble anti-SNRNP70 anvendt som en positiv kontroll for RIP prosedyre, og U1 snRNA ble også påvist ved et nivå 206 ganger større enn for anti-IgG (figur 5D, nedre panel). Dermed er hotair stede i Ago2 holdige miRNPs, sannsynligvis gjennom samarbeid med miRNA-331-3p, i samsvar med våre bioinformatiske analyse og luciferase analysene.
Hotair styrer MIR-331-3p målet, HER2
Blant de mange mål av MIR-331-3p, konsentrerte vi på HER2 siden det koder for et transmembranprotein med en relevant funksjon i kreftutvikling og motstand mot trastuzumab basert terapi [19]. 3'-UTR av HER2 ble fusjonert til luciferase-kodende region (RLuc-HER2 3'-UTR) og transfektert med plasmider som koder for MIR-331-3p og et tomt plasmid vektor. RNO-miRNA-344 fungerte som en negativ kontroll. Den luciferase assay viste at Mir-331-3p betydelig hemmet luciferase aktivitet (~ 41% hemming) av RLuc-HER2 3'-UTR reporter, som bekrefter at HER2 er et mål på MIR-331-3p. Den RLuc-HER2 3'-UTR-konstruksjonen ble deretter transfektert sammen med plasmider som koder MIR-331-3p og hotair (pcDNA /hotair). Luciferase-analyser indikerte at, i nærvær av varmluft, ble RLuc-HER2 3'-UTR undertrykkelse gjenopprettet sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5C). Dette indikerer at hotair fungerer som en endogen "svamp" ved binding MIR-331-3p, således avskaffe miRNA-indusert undertrykkende aktivitet på HER2 3'-UTR.
Videre er effekten av varmluft uttrykk på endogent protein i HER2 kombinasjon med modulering av miRNA eller lncRNA nivåer ble overvåket ved de forskjellige metoder som er vist i figur 5E: (1) MIR-331-3p overekspresjon mot HER2 i BGC-823 celler; (2) hotair knockdown mot HER2 i BGC-823 celler; (3) hotair overekspresjon for HER2 i SGC-7901 celler. Western blot analyse viste at tvangs uttrykk for MIR-331-3p eller knockdown av hotair i BGC-823 celler utløste en betydelig lyddemping effekt på endogen HER2 protein uttrykk. Videre HER2-protein-ekspresjon ble markert oppregulert etter transfeksjon med varmluft i SGC-7901-celler, noe som viser en forholdsvis lav endogen hotair ekspresjonsnivået.
Sammen indikerer disse data at ved å binde MIR-331-3p, hotair fungerer som en CERNA for målet HER2 mRNA, og dermed modulerende derepresjon av HER2 og imponerende et ekstra nivå av post-transcriptional regulering.
MiR-331-3p og MIR-124 undertrykke magekreftceller spredning
å fungere som en endogen synke for target mirnas, overflod av hotair bør være sammenlignbar med eller høyere enn MIR-331-3p /MIR-124. I vår studie, QRT-PCR-analyse viste at MIR-331-3p /MIR-124 uttrykk ble omvendt korrelert med hotair uttrykk i 20 par avanserte mage kreft (Figur 6A). For å validere om MIR-331-3p og MIR-124 kan også hemme magekreft celleproliferasjon, tvinges vi til uttrykk i BGC-823 celler ved hjelp av miRNA-koder plasmider. Uttrykket nivåer av miRNA-331-3p og MIR-124 transfektert inn i BGC-823 celler ble signifikant økt med 36 ganger og 29 ganger, sammenlignet med kontrollceller (Figur 6b). Deretter MTT og koloni-formasjons analyser ble utført for å bestemme cellenes levedyktighet. Resultatene av MTT-analysen og vekstkurver viser at celler transfektert med MIR-331-3p eller MIR-124 viste en betydelig veksthemming sammenlignet med celler transfektert med tom vektor (figur 6C). Disse dataene indikerer at overekspresjon av MIR-331-3p eller Mir-124 uttrykk kan arrestere magekreft celleproliferasjon, som er konsistent med resultatene av hotair uttrykk knockdown i BGC-823 celler. Figur 6 Positiv korrelasjon mellom hotair og HER2 uttrykk og relevansen til MIR-331-3p /MIR-124 uttrykk nivåer. (A) bivariat korrelasjonsanalyse av forholdet mellom hotair uttrykk og MIR-331-3p, eller MIR-124 nivå. (B) BGC-823 celler ble transfektert med plasmider som koder MIR-331-3p eller MIR-124, og QRT-PCR ble brukt til å detektere miRNA nivåer sammenlignet med kontroller (MIR-NC). (C) MTT-analyse, og kolonidannende vekstanalyse ble utført for å bestemme spredning av MIR-331-3p eller MIR-124 transfektert BGC-823-celler. (D) Venstre: farging av HER2 protein i avansert ventrikkelcancer vevsprøver. Øvre: farging av HER2 var negativ i mage kreft vev med relativt lav hotair uttrykk. Nedre: farging av HER2 var positiv i mage kreft vev med relativt høy hotair uttrykk. Høyre: bivariate korrelasjonsanalyse av forholdet mellom hotair og HER2 ekspresjonsnivå. * P < 0,05, ** P < 0.01.
HER2 er koekspresjon med hotair i mage kreft vev
økt forekomst av HER2 hastighet ble rapportert å være 7-34% i magekreft, og ble assosiert med mer aggressiv sykdom og dårligere overlevelse i magekreft [19]. Vi oppdaget uttrykk for HER2 i 50 avansert ventrikkelcancer vev (stadium III /IV) valgt fra de foregående 78 mage kreft vev ved immunhistokjemi (IHC) og QRT-PCR-analyse. Resultatene av IHC-farging viste HER2-protein positivitet i 56% av de valgte 50 magekreft vev. Åtti-seks prosent av disse HER2 positive prøvene var fra avansert stadium III /IV svulster, og 71% viste høy hotair uttrykk (Figur 6D og tilleggsfiler 2: Tabell S2). Bivariat korrelasjonsanalyse viste at uttrykket av HER2 var signifikant korrelert med hotair karakternivået i magekreft vev sammenlignet med vanlige kolleger (Figur 6D). Disse data indikerer at ekspresjon av HER2 er positivt forbundet med oppregulert hotair i gastrisk kreft vevsprøver, noe som tyder på at karakterisering av HER2 /hotair interaksjonen kan være biologisk betydnings i human gastrisk tumorigenesis.
Spesielt, på grunn av en pågående fase III /IV studien var økt forekomst av HER2 rente påvist i denne studien er høyere enn tidligere rapportert gjennomsnittlig nivå. Denne økte frekvensen av økt forekomst av HER2 er sterkt knyttet til dårlige resultater for pasienter med metastatisk og høyverdig lokalisert mage kreft, og dermed fremhever betydningen av HER2 i magekreftutvikling og metastasering.
Diskusjon
LncRNAs, som er mer enn 200 nukleotider i lengde med begrenset proteinkodende kapasitet blir ofte uttrykt i en sykdoms, vevs- eller utviklingsstadiet spesifikk måte, noe som indikerer spesifikke funksjoner for lncRNAs i utvikling og sykdommer og gjøre disse molekylene attraktive terapeutiske mål [20-22]. En rekke nyere papirer har vist at dysregulering av disse lncRNAs også kan påvirke reguleringen av den eukaryotiske genomet og gir en cellulær vekstfordel, noe som resulterer i progressiv og ukontrollert tumorvekst [23-25]. Derfor kan lncRNAs tilveiebringe et manglende stykke av den ellers kjente onkogen og tumor suppressor nettverk puslespillet.
I denne studien, testet vi ekspresjonen av varmluft i gastrisk karsinom prøver og deres omkringliggende ikke-tumorvevet. Vi identifiserte også funksjonen av hotair i mage carcinoma celler ved å bruke gevinst-og tap-av-funksjon tilnærminger. Resultatene viste at hotair ble oppregulert i magekarsinom vev sammenlignet med tilstøtende normal gastrisk vev, og at hotair oppregulering korrelert med større svulststørrelsen, avansert stadium patologisk og omfattende metastasering. Videre er total overlevelse tiden av pasienter med lavere hotair uttrykk nivåer var signifikant lengre enn for pasienter med moderate eller sterke hotair uttrykk nivåer. Videre hotair overekspresjon fremmet proliferasjon, migrering og invasjon av gastrisk karsinom-celler, mens hotair uttømming hemmet celle invasjon og celle-levedyktighet, og indusert veksthemming både in vitro og in vivo. I tillegg hotair undertrykkelse førte til fremme av mage celle apoptose. Disse funnene tyder på at hotair spiller en direkte rolle i modulering av flere onkogene egenskaper og magekreft progresjon, stimulere nye forskningsretninger og behandlingsalternativer vurderer hotair som en roman prognostisk markør og terapeutisk mål i magekreft.
Betydningen av lncRNAs i human sykdom kan være forbundet med deres evne til å påvirke cellulære funksjoner gjennom ulike mekanismer. I denne studien, så langt som til mekanismen for varmluft er opptatt, er det verdt å nevne at subcellulære lokalisering analyse av varmluft ved RNA fluorescens in situ hybridisering forsøk viser lokalisering av varmluft til både kjernen og cytoplasma [24]. Det er tydelig at atom hotair kan målrette polycomb undertrykkende kompleks 2, endre H3K27 metylering og genuttrykksmønster over genomet [10, 11]. Nyere arbeider rapporterte et stillas funksjon for hotair i cytoplasma som induserer ubiquitin-mediert proteolyse [26]. Likevel, de tumorigene egenskaper og mekanistisk heterogenitet av hotair, og særlig de av cytoplasma form, er langt fra å bli helt klarlagt.
Inspirert av 'konkurranse endogene RNA regulerings nettverk og nye bevis som tyder på at lncRNAs kan delta i denne regulerende kretser, vi en hypotese om at hotair kan også tjene som en Cerna og så vi søkte etter potensielle interaksjoner med miRNAs. 0,05. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Livskvalitet, immunmodulering og sikkerhet for adjuvant misteltein behandling hos pasienter med magekreft - en randomisert, kontrollert pilotstudie
• Nedregulering av Thrombospondin2 spår dårlig prognose hos pasienter med magekreft