LNC RNA hotair funguje ako konkurenčné endogénne RNA regulovať HER2 expresie hubou Mir-331-3p u karcinómu žalúdka

LNC RNA hotair funguje ako konkurenčné endogénne RNA pre reguláciu expresie HER2 hubou MIR-331-3p u karcinómu žalúdka
abstraktné
pozadia
Hromadí sa dôkazy naznačuje, že dlhá nekódujúcej RNA hotair hrá rozhodujúcu úlohu v progresie rakoviny a metastáz. Avšak, celková biologická úloha a klinický význam hotair v žalúdočnej karcinogenéze zostáva do značnej miery neznámy.
Metódy
hotair expresie bola meraná v 78 párované vzorky nádorové a nenádorové tkaniva pomocou real-time PCR. Účinky na hotair buniek karcinómu žalúdka boli študované nadmernej expresie a RNA interferencie prístupov in vitro a in vivo. Insights mechanizmu konkurencieschopných endogénnych RNA (ceRNAs) boli získané z bioinformačných analýzy, luciferázové testy a RNA viažuci proteín imunoprecipitáciou (RIP). Pozitívne hotair /HER2 interakcie bola identifikovaná a overená pomocou imunohistochemického testu a bivariate porovnávacie analýzy.
Výsledky
hotair up reguláciu bola spojená s väčšou veľkosti nádoru, pokročilý patologickým štádiom a rozsiahle metastázy, a tiež korelujú s kratším celkovým prežitím žalúdočných pacientov s rakovinou. Okrem toho, že nadmerná expresia hotair podporoval proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka, zatiaľ čo úbytok hotair inhibovala invázie buniek a životaschopnosť buniek a vyvoláva zastavenie rastu in vitro a in vivo. Najmä hotair môže pôsobiť ako Čierna, účinne sa stávať umývadlo pre mier-331-3p, čím sa moduluje derepresi HER2 a uloženie dodatočného úrovne post-transkripčný regulácia. Konečne, pozitívne hotair /HER2 korelácia bola významne spojená s pokročilými karcinómov žalúdka.
Závery
hotair nadmerná expresia predstavuje biomarker zlou prognózou u rakoviny žalúdka, a môžu zveriť malígne fenotyp na nádorové bunky. Regulačný sieť Čierna zahŕňajúce hotair a pozitívnu interakciu medzi hotair a HER2 môže prispieť k lepšiemu porozumeniu žalúdočnej rakoviny patogenézy a uľahčiť rozvoj lncRNA riadená diagnostika a Therapeutics proti tejto chorobe.
Kľúčové
Konkurenčné endogénne RNA HER2 hotair karcinóm žalúdka proliferáciu a inváziu na pozadí
rakovina žalúdka je druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu vyvolanú, a je najčastejšou gastrointestinálne zhubné bujnenie vo východnej Ázii, východnej Európe a časti strednej a Južnej Amerike. U väčšiny pacientov, rakovina žalúdka je diagnostikovaná v pokročilom štádiu a je sprevádzaný malígny proliferácie, rozsiahle inváziu a lymfatické metastázy. Úspešné terapeutické stratégie sú obmedzené a úmrtnosť je vysoká [1, 2]. Dlhé nekódujúca RNA (lncRNAs) v poslednom čase získali značnú pozornosť pri vymedzovaní zložité mechanizmy podkladové zhubné procesy, ako je karcinogenézy, metastázy a rezistencie. Preto, ak chceme plne pochopiť žalúdočné karcinogenéze, musíme vziať do úvahy túto rodinu regulačných prepisov, ktoré pridávajú novú vrstvu zložitosti biológie nádorov.
Hoci len malý počet funkčných lncRNAs boli dobre charakterizované k dnešnému dňu, oni bolo preukázané, že regulujú génovú expresiu na rôznych úrovniach, vrátane modifikácie chromatínu, transkripciu a post-transkripčný spracovanie [3, 4]. V poslednej dobe nový regulačný mechanizmus bol identifikovaný v ktorom presluchy medzi lncRNAs a mRNA dochádza z dôvodu súťaženie o spoločnej mikroRNA (miRNA) prvky odozvy. V tomto prípade, lncRNAs môže fungovať ako konkurenčné endogénne RNA (ceRNAs) špongiu miRNA, a tým moduláciu derepresi miRNA cieľov a uloženie dodatočného úrovne post-transkripčný regulácia [5]. V predchádzajúcich správach, je lncRNA špecifickou pre svaly, LINC-MD1, bolo hlásené, že je čierna, ktorá chráni MyoD messenger RNA (mRNA) z miRNA sprostredkovanú degradáciu [6]. Pluripotence spojené s LNC-RoR môže fungovať ako kľúčový Čierna prepojiť sieť miRNA a kľúčových transkripčných faktorov, napríklad Oct4, Sox2 a nanog v ľudských embryonálnych kmeňových buniek. Pozoruhodne, lncRNA prútiku je vysoko up-regulované v rakoviny pečene a hrá dôležitú úlohu pri vzniku nádorov [7]. Najmä prútiku môže pôsobiť ako endogénne "huby", ktorý sa reguluje rad aktivít, vrátane miRNA MIR-372 [8]. Navrhujeme preto, že niektoré lncRNAs môže mať tiež role ako ceRNAs, spájať miRNA a post-transkripčný sieť v žalúdku patogenéze.
Hotair (HOx prepis nezmyselné RNA intergenový
) je ~ 2,2 kb dlhá nekódujúcej RNA prepisuje z HOXC
oku, ktorý môže potláčať transkripciu v trans
z HOXD
v predkožka fibroblastov [9]. Ako nové molekuly v oblasti biológie nádorov, hotair spočiatku stal sa dobre známy pre jeho účasť v nádoroch prsníka primárnej a rakovinou prsníka metastázy, kde výška hotair propagované invazívnosti a metastázovaniu [10]. Okrem toho hotair výraz pozitívne koreluje s zhubných procesov a zlou prognózou u kolorektálneho karcinómu, hepatocelulárneho karcinómu, rakoviny pankreasu a zažívacom strómovými tumorom [11-14]. Nedávne štúdie uvádzajú, že hotair bola up-regulovaná u karcinómu žalúdka [15, 16]. Avšak celková biologická úloha a základné molekulárnej mechanizmus hotair v žalúdočnej karcinogenéze zostáva z veľkej časti definovaný.
V tejto štúdii sme sa uvádza, že up-regulácia hotair je charakteristické molekulárne zmeny u karcinómu žalúdka a skúmať biologickej role hotair na fenotypmi buniek karcinómu žalúdka in vitro a in vivo. Okrem toho, mechanický analýza ukazuje, že hotair môžu fungovať ako Čierna regulovať expresiu ľudského epitelu receptora rastového faktora 2 (HER2), cez súťaži o MIR-331-3p, ktoré tak plní onkogénne úlohu v patogenéze žalúdku. Súčasná práca poskytuje prvý dôkaz o pozitívnom hotair /HER2 korelácia a presluch medzi MIR-331-3p, hotair a HER2, vrhá nové svetlo na liečbu rakoviny žalúdka.
Výsledky
hotair prejavu je up-regulovaná v rakovina žalúdka u ľudí tkaniva
hladina hotair expresie bola stanovená na 78 párových vzoriek s rakovinou žalúdka a priľahlých, histologicky normálnych tkanivách QRT-PCR, a normalizované k GAPDH. Hotair expresie bola up-regulovaná významne v rakovinových tkanivách (priemerný pomer 14.35-krát, P < 0,01) v porovnaní s normálnymi náprotivkami (obrázok 1a). Vyšetrenie korelácia medzi expresiou hotair a klinických patologických funkcií ukázalo, že up-regulácia hotair korelovala s väčšiu veľkosť nádoru, patologické pokročilom štádiu, vzdialené metastázy (obrázok 1B a C), lymfatických uzlín a diferenciáciu nádorových buniek (Tabuľka 1). Avšak, hotair expresia nebola spojená s polohou tumoru alebo pohlavie pacienta (Tabuľka 1). S ohľadom na celkové prežívanie u pacientov s vysokým hotair expresiou mal podstatne horšiu prognózu ako tí s nízkou expresiou hotair (p 0,001, log-rank test, obr 1D). Tieto výsledky naznačujú, že zvýšená expresia hotair môžu byť užitočné pri vývoji nových prognostických markerov alebo progresie rakoviny žalúdka. Obrázok 1 Relatívny hotair výraz v žalúdku rakovinových tkanív a jej klinický význam. (A) Relatívna expresie hotair v žalúdočných rakovinových tkanivách (n = 78) v porovnaní so zodpovedajúcimi nenádorových normálnou tkanive (n = 78). Hotair expresia bola skúmaná pomocou QRT-PCR a normalizované k GAPDH výrazu. Dáta bola prezentovaná ako rozkladací zmeny v nádorovom tkanive v porovnaní s normálnou tkanív. (B) Vyšetrenie korelácia medzi hotair prejavu a klinických patologických rysov ukázali, že hotair upregulaci koreluje s väčšou veľkosťou nádoru a pokročilom štádiu patologického. (C) hotair expresie bola významne vyššia u pacientov s vzdialených metastáz ako u pacientov s non-vzdialených metastáz. Krivky celkovej doby prežívania (D) Kaplan-Meierovej podľa hotair hladinou expresie. Celkové prežívanie v skupine s vysokým hotair (n = 39: hotair výraz pomer ≥ medián ratio) bola významne vyššia ako u Low-hotair skupine (n = 39; hotair pomer expresie pomer ≤ medián; P < 0,001, záznamníka rank test). * P < 0,05, ** P < 0.01.
Tabuľka 1 Korelácia expresie hotair s patologickým funkciami
patologickým funkcie
n (%)
Relatívna expresia hotair
P-hodnotu B
Pohlavie
P = 0,62
Muž
50 (64)
12,21 (0,97 - 17,53)
Žena
28 (36)
15,01 (7,34 -19,52)
stránok nádoru
p = 0,910
distálnej tretej
18 (23)
9,1 (1,37 - 14,12)
Middle tretej
20 (26)
7,96 (2,55-9,72)
proximálny žalúdok
40 (51)
7,76 (1.24-13.58)
diferenciácie
p = 0,045
Poor
56 (72)
15,6 (6,25 - 20,36)
Vysoká /mierne
22 (28)
8,1 (0,98 - 11,14)
lymfatických uzlín
P = 0,005
N0
10 (13)
1,14 (0,75-1,42)
N1
11 (14)
3,44 (1,15-4,85)
N2
29 (37)
11,99 (7.15- 14,77)
N3
28 (36)
32,58 (7,34 - 36,27)
Metastázy
P = 0,029
M0
64 (82)
9,35 (2,53 -33,64)
M1
14 obr
28,82 (16.39-39.39)
aMedian relatívna vyjadrenie, sa na 25. 75. percentil v zátvorkách. bp lt; 0,05 bola považovaná za významný (Mann-Whitney U testu
medzi 2 skupinami a skúšky Kruskall-Wallis počas 3 skupiny).
Manipulácia úrovňou hotair v žalúdku rakovinových bunkách
Ďalej sme vykonaných QRT-PCR analýza skúmať expresné hladiny hotair v rôznych nádorových bunkových línií, vrátane žalúdka, nemalobunkového karcinómu pľúc (NSCLC) a prsníka rakovinových odvodených. Ako je ukázané na obrázku 2A, zo štyroch žalúdočné rakovina bunkové línie skúmané (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, a AGS), BGC-823 exprimovaný vyššie hladiny hotair (3,18-násobné), než je normálne žalúdočnej epitelu bunky linka (GES-1). Podobne, bunkové línie NSCLC, SPC-A1, vykázal 3,73-násobné upregulaci hotair nad normálne ľudské bronchiálne epitelové bunkové línie, 16HBE. Vysoko metastatického karcinómu prsníka bunkové línie MDA-MB-231 vykazoval 4,77-násobnú upregulaci hotair v porovnaní s MCF-7 (obrázok 2A). Naše údaje naznačujú, že môžu byť často hotair up-regulovaná v mnohých nádorových buniek. Obrázok 2 Hladina expresie v hotair buniek karcinómu žalúdka a jeho vplyv na proliferáciu buniek in vitro. (A) Výsledky QRT-PCR preukazujúce hotair úrovne expresie žalúdočných nádorových bunkových línií (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, a AGS) v porovnaní s normálnou žalúdočnej epitel bunkové línie (GES-1), NSCLC bunkové línie ( SPC-A1), v porovnaní s normálnou bronchiálna ľudskej bunkové línie epiteliálneho (16HBE) a nádorových bunkových línií prsníka MDA-MB-231 v porovnaní s MCF-7. (B) QRT-PCR analýzy hotair hladina expresie po ošetrení buniek BGC-823 s siRNA cielia hotair a liečebných buniek SGC-7901 s pCDNA /hotair vektora. (C) MTT test bol vykonaný na stanovenie proliferácie si-hotair transfekciou BGC-823 buniek alebo pCDNA /hotair-transfekciou SGC-7901 bunky. Dáta predstavujú priemer ± štandardná odchýlka z troch nezávislých pokusov. (D) test rastu kolónie tvoriacich sa vykonáva na stanovenie proliferácie si-hotair transfekovány BGC-823 buniek. Kolónie boli spočítané a zachytil. * P < 0,05 a ** P < 0.01.
K manipulácii s úrovňou hotair v rakovinových bunkách žalúdka, je pCDNA /hotair vektor bol transfekován do SGC-7901 bunky a Si-hotair bola transfekována do BGC-823 buniek, resp. QRT-PCR analýza hladín hotair bola vykonaná pri 48 h po transfekciu a bolo zistené, že hotair expresia bola zvýšená 98-násobne v SGC-7901 buniek, v porovnaní s kontrolnými bunkami. Avšak, v BGC-823 buniek, hotair výraz bol v skutočnosti 75% zráža Si-HOTAIR2, najviac efektívne siRNA následne použité v týchto experimentoch (obrázok 2b).
Vplyv hotair na bunkovej proliferáciu a apoptózu in vitro
významný nárast hotair expresie vo vzorkách s karcinómom žalúdka nás viedla k skúmaniu možného biologický význam hotair na vzniku nádorov. MTT test ukázal, že rast buniek bola významne znížená v BGC-823 buniek transfektovaných si-hotair, zatiaľ čo proliferácia SGC-7901 buniek bola zvýšená v /hotair transfekciou bunkách pcDNA v porovnaní s príslušnými kontrolami (obr 2c). Podobne, je výsledok testu tvorby kolónií, bolo zistené, že klonogenní prežitie bola znížená na základe inhibície hotair v BGC-823 bunkách (Obrázok 2D). Pre stanovenie, či
apoptóza bola faktorom, ktorý prispieva k bunkovej inhibíciu rastu, sme vykonali farbenie a Hoechst flow-cytometria si-hotair liečených BGC-823 buniek. Dáta ukázali, že počet buniek s kondenzovaným a fragmentované jadier označujúce zlomok skorých apoptotických buniek bola významne vyššia u si-hotair ošetrené BGC-823 buniek v porovnaní s Si-NC-ošetrených bunkách (Obrázok 3A a B). Okrem toho sme zistili, že inhibícia hotair zvýšenú kaspasy-3-závislú apoptosu, preukázaná analýzou Westernového prenosu aktívneho kaspázy-3 po transfekciu si-hotair (ďalšie súbor 1: Obrázok S1). Dohromady tieto výsledky naznačujú, že Vyradenie hotair potláča žalúdočnú proliferáciu rakovinových buniek a indukuje apoptózu in vitro. Obrázok 3 Účinok hotair na žalúdočné rakovina apoptózu buniek, migrácie a invázie in vitro. BGC-823 bunky boli transfekovány Si-hotair alebo Si-NC, a SGC-7901 bunky boli transfekovány pCDNA /hotair vektora alebo prázdne vektorovým riadením. (A), Hoechst farbenie test bunkovej apoptózy; percento Hoechst-pozitívnych jadier na optickom obore (minimálne 50 polsnímkov) bola stanovená. (B) apoptotické miera buniek boli detekované pomocou prietokovej cytometrie. UL nekrotické bunky; UR, terminál apoptotické bunky; LR, čoskoro apoptotické bunky. (C a D) transjamkových testy boli vykonávané skúmať zmeny v oblasti migrácie a invazívnosti buniek. * P < 0,05 a ** P < 0.01.
Hotair podporuje migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka in vitro
invázie buniek je významným aspektom progresie rakoviny, ktorý zahŕňa migráciu nádorových buniek do susediacich tkanív a rozpustenie proteínov extracelulárnej matrice. Tu sme hodnotili rakovinových buniek inváziu cez transwell testy. Ako je ukázané na obrázku 3C, transfekcia siRNA hotair bránené sťahovavé schopnostiach BGC-823 bunky, o približne 66%. Zodpovedajúce účinok na invazivitě bol pozorovaný tiež v paralelnom invázii teste. Naopak, transfekcia SGC-7901 buniek s pCDNA /hotair vektora podporoval migráciu a invasiveness 1,9-násobne (3D obrázok) ~ buniek. Tieto dáta ukazujú, že hotair má onkogénne vlastnosti, ktoré môžu podporiť na migračné a invazívne fenotypu buniek karcinómu žalúdka.
Hotair podporuje tumorigenezi z buniek karcinómu žalúdka in vivo
zisťovať, či hladina expresie ovplyvňuje hotair tumorigenezi, BGC-823 transdukovaných s sh-hotair /pentru vektora (EV) boli použité v modeli nahých myší xenoimplantátu. Až do 16 dní po Vyradenie hotair, došlo k dramatickému zníženiu objemu a hmotnosti nádoru na SH-hotair skupiny v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr 4A, B a C). Ďalšie, imunologické farbenie analýza proliferačnej marker PCNA bolo vykonané v resekcii nádorových tkanivách. V porovnaní s tým v nádoroch, vytvorených z kontrolných buniek, sh-hotair odvodené nádory vykazovali významne znížená PCNA pozitivity (obrázok 4D). Tieto výsledky naznačujú, že hladina expresie hotair je významne spojená s in vivo proliferácie kapacity buniek karcinómu žalúdka. Obrázok 4 Účinok hotair Knockdown na rast nádoru in vivo. (A) rastovej krivky nádorov boli merané po injekcii BGC-823 buniek transfektovaných sh-hotair alebo pentru vektora. Objem nádoru bol vypočítaný za 3 dni. Dáta sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka (N = 5). (B) Hmotnosť nádoru. Hodnoty sú stredná hodnota s hmotnosťou nádoru ± S.D. (C) QRT-PCR analýza expresie hotair v tkanivách po resekcii nádoru. (D) Nádory sa vyvíjali z BGC-823 /sh-hotair bunky vykazovali nižšiu úroveň PCNA bielkovín, ako sú nádory vyvinutých z vektorových buniek BGC-823 /pentru. Zvršok: H & E farbenie; Dolné: imunologické. * P < 0,05 a ** P < 0.01.
Hotair je cieľom Mir-331-3P a mier-124
Bioinformatics analýzu sekvencií miRNA uznanie na hotair preukázala prítomnosť 11 nádor potláčajúcich miRNA väzobných miest. Hotair cDNA bol klonovaný po smere od génu luciferázy a pomenovaný Rluc-hotair (Obrázok 5A), potom transfekovány spoločne s rôznymi miRNA-kódujúce plazmidy. RNO-MIR-344 sa správal ako negatívna kontrola. Výsledky ukázali, že aktivita luciferázy bola znížená o 48% a 31% v porovnaní s prázdnym vektorom kontroly pri Mir-331-3p a mier-124 boli vyjadrené, resp. Tieto údaje ukazujú, že obaja Mir-331-3p a mier-124 môže priamo viazať na hotair prostredníctvom konkrétnych miestach miRNA rozpoznávacích (obrázok 5B ľavý panel). Obrázok 5 hotair je cieľom MIR-331-3P alebo MIR-124 a riadi Mir-331-3p cieľ. (A) 11 zdanlivá väzbové miesta Mirna v sekvencii hotair. Hotair cDNA obsahujúca rozpoznávacie miesta predpokladanej miRNA bol klonovaný po smere od génu luciferázy a pomenovaný Rluc-hotair. (B) Vľavo: luciferázy reportéri plazmid (Rluc-hotair) bol kotransfekovány do HEK-293 T buniek s 11 rôznymi miRNA-kódujúce plazmidy. Doprava: reportér luciferázy plazmid obsahujúci divoký typ alebo mutantný hotair bola kotransfekovány do HEK-293 T buniek s Mir-331-3p súbežne s prázdnym plazmidového vektora. Aktivita luciferázy bola stanovená s použitím luciferázového testu dvojaký a sú uvedené ako relatívna aktivita luciferázy Renilla normalizovanej k aktivite. Histogram označuje hodnoty luciferázy meria 48 hodín po transfekciu. (C) 3'-UTR HER2 bola fúzovania k luciferázové kódujúce oblasti (Rluc-HER2 3'-UTR) a transfekovány v bunkách HEK293T s Mir-331-3p pre potvrdenie HER2 je cieľom MIR-331-3p. Rluc-HER2 3'-UTR a mier-331-3p konštrukty boli kotransfekovány do buniek HEK293T plazmidy exprimujúce hotair (pCDNA /hotair) alebo s kontrolným vektorom pre overenie aktivity Čierna z hotair. RNO-miRNA-344 bola použitá ako negatívna kontrola. Histogram označuje hodnoty luciferázy meria 48 hodín po transfekciu. (D) RIP s myšou monoklonálnou anti-Ago2, preimunním IgG alebo 10% vstupov z BGC 823-bunkových extraktov. Úrovne RNA v imunoprecipitátech boli určené pomocou QRT-PCR. Vrchol: úrovne hotair, miRNA331-3P a FOS RNA boli prezentované ako násobok obohatenie Ago2 vzhľadom k IgG imunoprecipitátech. Dole: relatívna hladiny RNA U1 snRNA v SNRNP70 vzhľadom k IgG imunoprecipitátech. Čísla sú priemery ± s.d. (N = 3). (E) Analýza Western blot hladiny proteínu HER2 po liečbe BGC-823 buniek s Si-hotair alebo pcDNA /hotair a SGC-7901 buniek s pcDNA /hotair. GAPDH bola použitá ako kontrola. * P < 0,05, ** P < 0,01 a N.S. nevýznamný.
v tomto texte sme zvolili Mir-331-3p ako model miRNA pre ďalšie štúdium. Pre ďalšie potvrdenie, že zníženie aktivity luciferázy z vektora Rluc-hotair-WT bolo v dôsledku priamej interakcie medzi miRNA a jeho väzbovými stránkach, mutované na Mir-331-3p väzobné miesto lokálne-riadené mutagenézy, čo má za následok Rluc -HOTAIR-Mut. Ako sa dalo očakávať, potlačenie luciferázové aktivity bol úplne zrušený v tomto konštruktu zmutovaného v porovnaní s divokým typom vektora (obrázok 5B pravý panel).
Hotair a mier-331-3p ako viazať sa AGO2 do buniek karcinómu žalúdka
miRNAs sú známe, že je prítomná v cytoplazme vo forme miRNA ribonucleoprotein komplexy (miRNPs), ktoré tiež obsahujú Ago2, hlavná súčasť RNA indukovanej umlčanie komplexu (RISC) [17, 18]. Ak chcete otestovať, či hotair asociuje s miRNPs, RNA viazanie bielkovina Imunoprecipitácia (RIP) pokusy boli vykonávané na BGC-823 bunkových extraktov za použitia protilátok proti Ago2. Úrovne RNA v imunoprecipitátech boli určené pomocou QRT-PCR. Hotair sa prednostne obohatený (354-krát) v Ago2 obsahujúce miRNPs v porovnaní s kontrolou imunoglobulínu G (IgG) imunoprecipitátech. Podobne, miRNA-331-3p bola zistená na úrovni 840-krát väčší, než pokiaľ ide o kontrolu anti-IgG. Úspešné Imunoprecipitácia Ago2-spojené RNA bola overená pomocou QRT-PCR, za použitia primerov proti RIP ľudských FOS zahrnuté do RIPAb + Ago2 sade (obrázok 5D, horný panel). Okrem toho, anti-SNRNP70 bola použitá ako pozitívna kontrola pre riadenie RIP, a bolo tiež zistené U1 snRNA na úrovni 206-krát väčší, ako je anti-IgG (obrázok 5D, spodný panel). Tak hotair je prítomný v Ago2 obsahujúcich miRNPs, pravdepodobne v dôsledku spojenia s miRNA-331-3p, v súlade s našimi bioinformačných analýzy a luciferázové testy.
Hotair ovláda cieľ MIR-331-3p, HER2
Medzi veľa ciele MIR-331-3p, sme sa zamerali na HER2, pretože kóduje transmembránový proteín s príslušnú funkciu v karcinogenéze a odolnosťou proti trastuzumabu terapiu na báze [19]. 3'-UTR HER2 bola fúzovania k luciferázové kódujúce oblasti (Rluc-HER2 3'-UTR) a transfekovány plazmidy kódujúcim Mir-331-3p a prázdne plazmidovej vektor. RNO-miRNA-344 pôsobí ako negatívna kontrola. Test luciferázy ukázalo, že mier-331-3p významne inhibujú aktivitu luciferázy (~ 41% inhibícia) na Rluc-HER2 3'-UTR reportér, čo potvrdzuje, že HER2 je cieľom MIR-331-3p. Rluc-HER2 3'-UTR konštrukt bol následne transfekován spoločne s plazmidy kódujúce Mir-331-3p a hotair (pCDNA /hotair). Luciferázové testy ukázali, že, v prítomnosti hotair, Rluc-HER2 3'-UTR represie bola obnovená v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr 5C). To znamená, že hotair pôsobí ako endogénne "huba" väzbou Mir-331-3p, čím sa ruší potláčať aktivitu miRNA indukované na HER2 3'-UTR.
Navyše účinok hotair prejave na endogénneho proteínu HER2 v kombinácia s moduláciou hladín miRNA alebo lncRNA sa sleduje pomocou rôznych prístupov uvedených na obrázku 5E: (1) Nadmerná expresia MIR-331-3p proti HER2 v BGC-823 buniek; (2) hotair porazený proti HER2 v BGC-823 buniek; (3) hotair nadmernej expresie HER2 v SGC-7901 buniek. Western blot analýza ukázala, že nútená expresie MIR-331-3p alebo Vyradenie hotair v BGC-823 buniek vyvolala značný tlmiaci efekt na endogénne expresie HER2 proteínu. Okrem toho, expresia HER2 proteínu sa významne up-regulovaná po transfekciu s hotair v SGC-7901 buniek, ktorý ukazuje, relatívne nízku úroveň endogénnej hotair expresie.
Dohromady tieto údaje naznačujú, že nadviazaním Mir-331-3p, hotair pôsobí ako Čierna pre cieľová HER2 mRNA, čím sa moduluje derepresi HER2 a uloženie dodatočného úrovne post-transkripčný regulácia.
mir-331-3p a mier-124 potláča žalúdočné rakovinové bunky šírenie
slúžiť ako endogénne drezu pre cieľové miRNA, množstvo hotair by mala byť porovnateľná alebo vyššia ako MIR-331-3p /MIR-124. V našej štúdii QRT-PCR analýza ukázala, že mier-331-3p /MIR-124 expresia bola nepriamo úmerná hotair expresiou v 20 párov pokročilých karcinómov žalúdka (obrázok 6a). Ak chcete overiť, či Mir-331-3p a mier-124 by tiež inhibujú žalúdočné proliferáciu nádorových buniek, sme nútení svoj výraz v BGC-823 buniek pomocou miRNA-kódujúcich plazmidy. Hladiny expresie miRNA-331-3p a mier-124 prenesené do BGC-823 buniek sa významne zvýšil o 36-krát a 29-krát, v danom poradí, v porovnaní s kontrolnými bunkami (obrázok 6B). Ďalšie, MTT a kolónie tvorenie testy boli vykonávané na stanovenie životaschopnosti buniek. Výsledky MTT testom a rastové krivky bolo zistené, že bunky transfekované s Mir-331-3p alebo MIR-124 vykazovali významné spomalenie rastu v porovnaní s bunkami transfekovanými prázdnym vektorom (obrázok 6C). Tieto údaje ukazujú, že zvýšená expresia MIR-331-3p alebo expresie MIR-124 môže zadržať žalúdočné proliferáciu rakovinových buniek, ktorý je v súlade s výsledkami hotair expresie porazený v BGC-823 buniek. Obrázok 6 pozitívna korelácia medzi hotair a HER2 prejavu a význam pre mier-331-3p /MIR-124 expresných hladín. (A) Bivariate korelačný analýza vzťahu medzi hotair prejavu a mier-331-3p alebo MIR-124 úrovni. (B) BGC-823 bunky boli transfekovány plazmidy kódujúcim MIR-331-3p alebo MIR-124, a QRT-PCR bola použitá pre detekciu hladiny miRNA v porovnaní s kontrolami (Mir-NC). (C) MTT test a analýza rastu tvoriacich kolónie boli vykonané na stanovenie proliferácie mier-331-3p alebo MIR-124 transfektovaných BGC-823 buniek. (D) Vľavo: imunologické HER2 proteínu vo vyspelých vzoriek žalúdočnej rakovina tkaniva. Zvršok: imunologické farbenie HER2 bol negatívny v žalúdku rakovinových tkanív s relatívne nízkou expresiou hotair. Nižšia: imunologické HER2 bola pozitívna v žalúdočných rakovinových tkanivách s relatívne vysokou hotair expresiu. Doprava: bivariate korelačný analýza vzťahu medzi hotair a HER2 úrovne expresie. * P < 0,05, ** P < 0.01.
HER2 je koexprimován s hotair v žalúdočných rakovinových tkanív
Zvýšená expresia HER2 sadzba bola hlásená byť 7-34% u karcinómu žalúdka, a bola spojená s agresívnejším ochorením a horšie prežitia u rakoviny žalúdka [19]. Zistili sme expresiu HER2 v 50 pokročilým karcinómom žalúdka tkanív (stupeň III /IV), vybranými z predchádzajúcich 78 rakovina žalúdka tkaniva imunohistochemicky (IHC) a QRT-PCR analýzou. Výsledky IHC farbenie ukázalo proteínu HER2 pozitivitu u 56% vybraných 50 žalúdočných rakovinových tkanív. Osemdesiat šesť percent z týchto pozitívnych vzoriek HER2 boli od pokročilom štádiu III /IV nádory, a 71% vykazoval veľkú hotair expresie (obrázok 6D a ďalší súbor 2: Tabuľka S2). Bivariate korelačný analýza ukázala, že expresia HER2 významne koreluje s hotair úrovni transkriptov v tkanivách karcinómu žalúdka v porovnaní s normálnymi náprotivkami (Obrázok 6d). Tieto dáta ukazujú, že expresia HER2 je pozitívne spojený s up-regulovaná v hotair vzoriek žalúdočnej rakovina tkaniva, čo naznačuje, že charakterizáciu interakcie HER2 /hotair môže byť biologicky významná v ľudskom žalúdku vzniku nádorov.
Najmä, pretože pokračujúca fázy III /skúšobné IV, nadmerná expresia HER2 rýchlosť detekovaná v tejto štúdii je vyššia, než predtým publikovaného stredný rozsah. Táto zvýšená miera zvýšenej expresie HER2 je silne viazaný na zlé výsledky u pacientov s metastatický a vysoko kvalitné lokalizované karcinómov žalúdka, čím sa zdôrazní význam HER2 vo vývoji žalúdočné rakoviny a metastáz.
Diskusia
LncRNAs, ktoré sú viac ako 200 nukleotidov s obmedzenou kapacitou kódujúcich proteíny, sú často vyjadrené k chorobe, tkanivového alebo vývojové štádiá spôsobom špecifická, čo naznačuje špecifické funkcie pre lncRNAs vo vývoji a ochoreniach a robiť tieto molekuly atraktívne terapeutických cieľov [20-22]. Rad nedávnych prác bolo zistené, že porucha regulácie týchto lncRNAs môže tiež mať vplyv na reguláciu eukaryotického genómu a poskytujú výhodu bunkový rast, čo vedie k postupnému a nekontrolovaným rastom nádoru [23-25]. Preto môže lncRNAs poskytnúť chýbajúci kus inak známeho onkogénne a supresorových siete puzzle.
V tejto štúdii sme testovali expresiu hotair vo vzorkách karcinómu žalúdka a ich okolie bez nádorových tkanív. Tiež sme identifikovali funkciu hotair v bunkách karcinómu žalúdka za použitia gain- a so stratou funkcie prístupy. Výsledky ukázali, že hotair bola up-regulovaná v karcinómu žalúdka tkanivách v porovnaní so susednými normálne žalúdočné tkaniva, a že up-regulácia hotair koreláciu s väčšiu veľkosť nádoru, patologické pokročilom štádiu a rozsiahle metastázy. Okrem toho, celkový čas prežitia u pacientov s nižšou úrovňou expresie hotair bola významne dlhší ako u pacientov so stredne silnými úrovňou hotair expresie. Okrem toho, že nadmerná expresia hotair podporoval proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka, zatiaľ čo úbytok hotair inhiboval invázie buniek a životaschopnosť buniek a vyvoláva zastavenie rastu a to ako in vitro, tak in vivo. Navyše, potlačenie hotair viedli k podpore žalúdočnej bunkovej apoptózy. Tieto nálezy naznačujú, že hotair hrá priamu úlohu v modulácii rôznych onkogénnych vlastností a progresii rakoviny žalúdka, stimulácii nových výskumných smerov a liečebné možnosti uvažujú hotair ako nový prognostický marker a terapeutický cieľ u rakoviny žalúdka.
Význam lncRNAs v ľudská choroba môže byť spojená s ich schopnosťou ovplyvniť bunkové funkcie prostredníctvom rôznych mechanizmov. V tejto štúdii, v súvislosti s mechanizmom hotair, stojí za zmienku, že subcelulárnu lokalizácia analýza hotair RNA fluorescenčnej in situ hybridizácia teste ukazuje lokalizáciu hotair ako jadru a cytoplazme [24]. Je zrejmé, že jadrová hotair môžu zacieliť polycomb represívne komplex 2, mení H3K27 metylácie a génová expresia vzorov v rámci genómu [10, 11]. Nedávna práca vykázala funkciu lešenia pre hotair v cytoplazme ako induktor ubiquitin-sprostredkovanej proteolýzy [26]. Napriek tomu, tumorigénny vlastnosti a mechanistické heterogenita hotair, a najmä tí cytoplazmatickej formy, zďaleka nie sú úplne objasnený.
Inšpirovaný regulačné siete ďalej len "konkurencieschopných endogénnych RNA" a objavujúce sa dôkaz, ktorý by naznačoval, že lncRNAs sa môžu zúčastniť v tomto regulačné obvody, my sme predpokladali, že hotair môže tiež slúžiť ako čierna a tak sme hľadali potenciálnych interakcií s miRNA. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Kvalita života, imunomodulácia a bezpečnosti adjuvantnej liečbe imelom u pacientov s karcinómom žalúdka - randomizovanej kontrolovanej pilotnej štúdie
• Down regulácia Thrombospondin2 predpovedá zlú prognózu u pacientov so žalúdočnými cancer