LNC RNA HotAir deluje kot konkurenčnega endogenega RNA za urejanje HER2 izražanje sponging MIR-331-3p pri raku želodca

LNC RNA HotAir deluje kot konkurenčnega endogenega RNA za urejanje HER2 izražanje sponging MIR-331-3p na raka želodca
Abstract
Ozadje
Kopičijo dokazov kaže, da ima dolgo nekodiranih RNA HotAir ključno vlogo pri napredovanje raka in metastaz. Vendar pa je celotna biološka vloga in klinični pomen HotAir želodčnega rakotvornost še vedno v veliki meri neznan.
Metode
HotAir izraz je bila izmerjena v 78 seznanjene rakave in noncancerous vzorce tkiva s PCR v realnem času. Učinki HotAir na želodčnih rakavih celic smo ugotavljali s prekomerno in RNA interferenca pristopov in vitro in in vivo. Vpogled mehanizma konkurenčnih endogenih RNA (ceRNAs) so bile pridobljene iz genske analize, luciferazne teste in RNA vezavni protein imuno (RIP). Pozitivna HotAir /HER2 interakcij ugotovljene in preverjene informacije, ki jih imunohistokemični testom in Dvomjerni korelacijsko analizo.
Rezultati
HotAir uravnavanjem bila povezana z večjo velikost tumorja, napredne patološko fazi in obsežne metastaz, pa tudi v korelaciji s krajše celokupno preživetje v želodcu bolniki z rakom. Poleg tega HotAir čezmernim spodbuja proliferacijo, migracijo in invazijo želodčnih celic karcinoma, medtem ko izčrpavanje HotAir zaviral tako celično invazijo in sposobnost preživetja celic in povzročeno aretacijo rasti in vitro in in vivo. Zlasti lahko HotAir deluje kot Cerna, dejansko postane korito za pokoj-331-3p, da moduliramo derepression HER2 in uvedbi dodatne ravni post-transkripcijske regulacije. Na koncu je bil pozitiven HotAir /HER2 korelacija značilno povezana z naprednimi želodčnega raka.
Sklepe
HotAir prekomerno predstavlja biomarker za slabo prognozo raka želodca, in lahko daje maligni fenotip v tumorske celice. Regulativni omrežje Cerna vključuje HotAir in pozitivno interakcijo med HotAir in HER2 lahko prispeva k boljšemu razumevanju želodčne patogeneze raka in olajšali razvoj lncRNA usmerjeno diagnostiko in terapije proti tej bolezni.
Ključne besede
Konkurenca endogeni RNA HER2 HotAir rak želodca orožja in invazija Ozadje
raka želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti raka povzroča, in je najpogostejši gastrointestinalni maligne bolezni v vzhodni Aziji, vzhodni Evropi in delih srednje in Južne Amerike. Pri večini bolnikov je rak želodca diagnosticiran v zaključni fazi in se skupaj z malignim orožja, obsežno invazijo in limfni metastaz. Uspešni terapevtske strategije so omejeni in umrljivost je visoka [1, 2]. Dolgi RNA nekodiran (lncRNAs) so se v zadnjem času veliko pozornosti pri razmejevanju zapletene mehanizme, ki podpirajo malignih procesov, kot so rakotvornost, metastaz in odpornosti na zdravila. Torej, če želimo v celoti razumeti želodčne rakotvornosti moramo upoštevati to družino regulatornih prepisov, ki dodajo novo raven zahtevnosti za tumorske biologije.
Čeprav so bile le manjše število funkcionalnih lncRNAs dobro označena do danes, so dokazano je, da regulira gensko ekspresijo na različnih ravneh, vključno kromatina modifikacije, transkripcijo in post-transkripcijsko predelavo [3, 4]. V zadnjem času je bil ugotovljen nov regulativni mehanizem, v katerem presluha med lncRNAs in mRNA pojavi zaradi tekmovanja za skupne microRNAs odzivanja (miRNAs). V tem primeru lahko lncRNAs deloval kot konkurenčna endogeni RNA (ceRNAs) za gobo miRNAs, da moduliramo derepression ciljev miRNA in uvedbi dodatne ravni post-transkripcijske regulacije [5]. V prejšnjih poročilih, je bila mišica specifične lncRNA, Linc-MD1, je poročal, da je Cerna, ki ščiti MyoD messenger RNA (mRNA) od miRNA posredovano degradacijo [6]. Pluripotency povezano LNC-ROR lahko deluje kot ključni Cerna za povezavo omrežja miRNAs in temeljnih transkripcijskih faktorjev, npr, Oct4, Sox2 in Nanog v izvornih celic človeških zarodkov. Predvsem lncRNA HULC je zelo povečana pri raku na jetrih in ima pomembno vlogo pri tumorigeneze [7]. Zlasti lahko HULC deluje kot endogeni "igrišče", ki navzdol ureja vrsto aktivnosti miRNAs, vključno z miR-372 [8]. Zato predlagamo, da imajo lahko tudi nekateri lncRNAs vlogo kot ceRNAs, povezujejo miRNAs in post-transkripcijski omrežja v želodcu patogenezo.
HotAir (Hox prepis protismiselna medgenskega RNA
) je ~ 2,2 kb dolgo nekodiran RNA prepisane iz HOXC
lokusu, ki lahko zatiranju transkripcijo v trans
za HOXD
in kožico fibroblastov [9]. Kot nove molekule na področju tumorja biologije, HotAir najprej postal znan po svoji vpletenosti v tumorjih primarni dojke in raka dojke z metastazami, pri čemer zvišanje HotAir spodbuja invazivnosti in metastaze [10]. Poleg tega HotAir izraz pozitivno korelira z malignih procesov in slabim izidom pri raku debelega črevesa, karcinomom jetrnih celic, raka trebušne slinavke in gastrointestinalni stromalni tumorji [11-14]. Nedavne študije so poročali, da je bil HotAir povečana pri raku želodca [15, 16]. Kljub temu je splošna biološka vloga in osnovni molekularni mehanizem HotAir želodčnega rakotvornost še vedno v veliki meri določena.
V tej študiji smo poročajo, da je HotAir Povecanje značilnost molekularne spremembe raka želodca in preiskovanje biološke vloge HotAir na fenotipe želodčnih rakave celice in vitro in in vivo. Poleg tega mehanistični analiza pokaže, da HotAir deluje kot CERNA za regulacijo ekspresije humanega epitelijskih rastnega faktorja receptorja 2 (HER2) s tekmovanjem za miR-331-3p, tako igrajo onkogenega vlogo v želodcu patogenezo. Sedanje delo zagotavlja prvi dokaz za pozitiven HotAir /HER2 korelacije in presluha med pokoj-331-3p, HotAir in HER2, poraja nova spoznanja o zdravljenju raka želodca.
Rezultati
HotAir izražanja molekul v človekovih želodca raka tkiva
stopnja HotAir izražanja je bila določena v 78 parnih vzorcih raka na želodcu in sosednjih, histološko normalno tkivo, ki ga QRT-PCR, in normaliziran GAPDH. HotAir izraz je bistveno povečana pri rakavih tkivih (pomeni razmerje 14,35-krat, P < 0,01) v primerjavi z običajnimi kolegi (Slika 1A). Preizkus korelacije med HotAir izražanja in kliničnih patoloških funkcij, je pokazala, da je bila HotAir Povecanje povezana z večjo velikost tumorja, napredne patološkega fazi, oddaljenih metastaz (slika 1B in C), bezgavk metastaz in diferenciacije tumorskih celic (tabela 1). Vendar HotAir izraz ni bila povezana s položajem tumorja ali spol bolnika (tabela 1). Glede na celokupno preživetje so imeli bolniki z visokim HotAir izražanja bistveno slabšo prognozo kot tisti z nizkimi HotAir izražanja (P < 0,001, test log-ranga; Slika 1D). Ti rezultati kažejo, da lahko HotAir overexpression uporabne pri razvoju novih prognostičnih ali napredovanja markerji raka želodca. Slika 1 Relativna HotAir izraz v želodcu tkivih z rakom in njegov klinični pomen. (A) Relativna izraz HotAir v želodčnih rakavih tkiv (n = 78), v primerjavi z ustreznimi normalnimi tkivi niso tumorji (n = 78). HotAir izraz je pregledal QRT-PCR in normalizirana na GAPDH izražanja. Podatki so predstavljeni kot kratna sprememba v tumorskih tkivih, v primerjavi z običajnimi tkiva. (B) Preizkus korelacije med HotAir izražanja in kliničnih patoloških lastnosti pokazala, da HotAir uravnavanjem korelaciji z večjo velikost tumorja in napredno patološko fazi. (C) HotAir izraz je bila bistveno višja pri bolnikih z oddaljenih metastaz kot pri tistih, ki imajo ne-daljni metastaz. (D) Kaplan-Meier splošni krivulji preživetja po HotAir nivo ekspresije. Splošni preživetje skupine High-HotAir (n = 39: HotAir razmerje izraz ≥ srednja stopnja) je bila bistveno višja od Low-HotAir skupini (n = 39; HotAir razmerje razmerje izraz ≤ mediana; P < 0,001, log- rang test). * P < 0,05, ** P < 0.01.
Tabela 1 Korelacija izražanja HotAir z clinicopathologic funkcij
Clinicopathologic funkcije
n (%)
Relativna izraz HOTAIRa
P-VALUE mrd
Spol
P = 0,62
Moški
50 (64)
12.21 (0,97-17,53)
Moški
28 (36)
15.01 (7.34 -19,52)
stran tumorja
P = 0,910
Distalno tretji
18 (23)
9.1 (1,37-14,12)
Srednja tretji
20 (26)
7,96 (2,55-9,72)
proksimalni želodcu
40 (51)
7,76 (1.24-13.58)
Diferencirane
P = 0,045
Poor
56 (72)
15,6 (6,25-20,36)
visoko /zmerno
22 (28)
8.1 (0,98-11,14)
limfnega vozla Metastasis
P = 0,005
N0
10 (13)
1,14 (0,75-1,42)
N1
11 (14)
3,44 (1,15-4,85)
N2
29 (37)
11.99 (7.15- 14.77)
N3
28 (36)
32.58 (7,34-36,27)
metastatske bolezni
P = 0,029
M0
64 (82)
9,35 (2,53 -33,64)
M1
14 fig
28.82 (16.39-39.39)
aMedian relativnega izražanja, s 25., 75. percentila v oklepajih. BP < 0.05 je zdelo pomembno (Mann-Whitney U
preizkus med 2 skupini in Kruskall-Wallis test za 3 skupine).
Manipulacija ravni HotAir v želodcu rakavih celic
smo poleg opravljenih analiza QRT-PCR preizkusiti ekspresijski nivoji HotAir v različnih rak celičnih linij, vključno z želodčno, nedrobnoceličnim pljučnim rakom (NSCLC) in celice raka dojke izpeljana. Kot je prikazano na sliki 2A, za preiskane štiri želodca rakave celične linije (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, in AGS), BGC-823 izraženo višjo stopnjo HotAir (3,18-krat) od normalne želodca epitelijskega celice linije (GES-1). Podobno NSCLC celične linije, SPC-A1, pokazali 3,73-kratno uravnavanjem HotAir nad normalne človeške bronhialne epitelijske celične linije, 16HBE. Zelo metastatskega raka dojk celične linije MDA-MB-231 je pokazala 4,77-kratno uravnavanjem HotAir primerjavi z MCF-7 (slika 2A). Naši podatki kažejo, da se HotAir lahko pogosto povečana pri številnih tumorskih celic. Slika 2 Stopnja HotAir izražanja v želodcu rakavih celic in njegovim učinkom na proliferacijo celic in vitro. (A) Rezultati QRT-PCR, ki dokazujejo HotAir raven izražanja želodčnega raka celičnih linijah (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, in AGS), v primerjavi z običajnimi epitelija celične linije želodca (GES-1), pljuč celične linije ( SPC-A1) v primerjavi z normalno človeško bronhialno epitelijskega linije (16HBE), in dojk rak celičnih linijah MDA-MB-231 v primerjavi z MCF-7. (B) QRT-PCR analize celic po zdravljenju HotAir izraz ravni BGC-823 z siRNAs ciljanje HotAir in zdravljenja SGC-7901 celic z pCDNA /HotAir vektor. (C) MTT test smo izvedli za določitev širjenja si-HotAir-transfekciji BGC-823 celic ali pCDNA /HotAir-transfekciji SGC-7901 celic. Podatki predstavljajo povprečje ± SD iz treh neodvisnih eksperimentov. (D) test rast, ki tvorijo kolonije je bila izvedena za določitev širjenja SI-HotAir transfektirali BGC-823 celic. Kolonije so bili prešteti in ujeli. * P < 0,05 in ** P < 0.01.
Za manipulirati ravni HotAir v želodčnih rakavih celic, je bil pCDNA /HotAir vektor transfektirali v SGC-7901 celice in si-HotAir transficiramo v BGC-823 celic, oz. Analiza QRT-PCR ravni HotAir je bila izvedena na 48 h post-transfekciji in pokazala, da je HotAir izraz povečal 98-krat v SGC-7901 celic, v primerjavi s kontrolnimi celicami. Vendar pa je v BGC-823 celic, je HotAir izraz dejansko 75% podrli s SI-HOTAIR2, najbolj učinkovit siRNA pozneje uporabili v naslednjih poskusih (slika 2b).
Učinek HotAir na celično proliferacijo in apoptozo in vitro
znaten porast HotAir izražanja v vzorcih raka želodca nas je spodbudilo, da razišče morebitno biološki pomen HotAir v tumorigeneze. MTT test je pokazala, da je bila rast celic precej oslabljena v BGC-823 celic, transfektiranih s SI-HotAir, medtem ko je širjenje SGC-7901 celic v pcDNA /HotAir transfekcije celic povečala v primerjavi z ustreznimi kontrolami (slika 2C). Podobno je posledica kolonije oblikovanja testom je pokazala, da je bila klonogene preživetje zmanjšal po inhibicijo HotAir v BGC-823 celic (slika 2D).
Želite ugotoviti, ali je bila apoptoza dejavnik, ki prispeva k celične zaviranja rasti, smo izvedli Hoechst obarvanje in flow-citometrična analiza si-HotAir zdravljenih BGC-823 celic. Podatki so pokazali, da je bilo število celic z kondenzira in razdrobljeno jeder z navedbo del zgodnjih apoptotskih celic bistveno višja v si-HotAir obdelani BGC-823 celic v primerjavi s si-NC-obdelanih celic (Slika 3A in B). Poleg tega smo ugotovili, da zaviranje HotAir okrepljeno kaspazo-3-odvisno apoptozo, ki ga zahodni analizo blot aktivirane kaspaze-3, potem ko si-HotAir transfekciji (Dodatni datotek 1: Slika S1) dokazana. Vzeta skupaj, ti rezultati kažejo, da rasklapanje od HotAir zavira proliferacijo želodčni rak celic in inducira apoptozo in vitro. Slika 3 Učinek HotAir na želodčnega raka celice apoptoza, migracije in invazije in vitro. BGC-823 celic so transfekciji s SI-HotAir ali Si-NC, in SGC-7901 Celice so transfekciji s pCDNA /HotAir vektorja ali prazno nadzor vektorja. (A) Hoechst obarvanje vsebnosti celic apoptoze; odstotek Hoechst pozitivnih jeder na optičnem področju (najmanj 50 polj) je bila določena. (B) apoptoze stopnje celic so odkrile citometrije toka. UL nekrotične celice; UR, terminal apoptotske celice; LR, zgodnje apoptotske celice. testi (C in D) Transwell smo izvedli raziskati spremembe v celični migraciji in invazivnosti. * P < 0,05 in ** P < 0.01.
HotAir spodbuja migracije in vdor želodčnih rakavih celic in vitro
Cell invaziji je pomemben vidik napredovanja raka, ki vključuje migracijo tumorskih celic v sosednjih tkiv in razpustitev proteini zunajcelične matrice. Tukaj smo ocenili rakavih celic invazijo skozi transwell testih. Kot je prikazano na sliki 3C je transfekcija HotAir siRNA oviran BGC-823 celice migracijski sposobnost za približno 66%. Ustrezen učinek na invazivnosti je bilo opaziti tudi v vzporednem invazijo testu. Nasprotno, transfekcija SGC-7901 celic z pCDNA /HotAir vektorja spodbujati migracije celic in invazivnosti ~ 1,9-krat (slika 3D). Ti podatki kažejo, da ima HotAir onkogeni lastnosti, ki lahko spodbujajo migracijsko in invazivne fenotip v želodcu rakavih celic.
HotAir spodbuja tumorigeneze želodčnih rakavih celic in vivo
želite raziskati, ali je raven HotAir izražanja vpliva tumorigeneze, BGC-823 celice transducirani s sh-HotAir /pENTR vektorja (EV), so bili uporabljeni v golih modelu miši ksenotransplantskih. Do 16 dni po rasklapanje za HotAir, se je dramatično zmanjšanje obsega tumorja in težo v sh-HotAir skupini v primerjavi s kontrolno skupino (slika 4A, B in C). Nato je bil imunskim barvanjem analiza marker orožja PCNA je izvedena v odstranjenimi tumorskih tkivih. V primerjavi s tisto v tumorjih, sestavljeni iz kontrolnih celic, je pokazala, sh-HotAir-izpeljani tumorji znatno zmanjša PCNA pozitivnosti (slika 4D). Ti rezultati kažejo, da je stopnja HotAir izražanja značilno povezana z in vivo zmogljivosti jedrskega orožja želodca rakavih celic. Slika 4 Učinek HotAir rasklapanje na rast tumorja in vivo. (A) krivulje rasti tumorjev smo izmerili po injiciranju BGC-823 celic, transfektiranih s sh-HotAir ali pENTR vektor. Volumen tumorja smo izračunali vsakih 3 dni. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD (N = 5). (B) teža tumorja. Vrednosti so sredstva za maso tumorja ± SD (C) analiza QRT-PCR HotAir izražanja v tkivih odstranjenimi tumorjev. (D) Tumorji razvili iz BGC-823 /sh-HotAir celic je pokazala nižjo raven PCNA beljakovin kot tumorji razvili iz BGC-823 /pENTR vektorskih celic. Zgornji del: H & E barvanje; Spodnji: imunskim barvanjem. * P < 0,05 in ** P < 0.01.
HotAir je cilj miR-331-3P in MIR-124
analizo bioinformatiko zaporedij miRNA priznanje na HotAir pokazala prisotnost 11 tumorskih-omejevalno miRNAs veznih mest. CDNA HotAir smo klonirali dolvodno gena luciferaze in imenovan Rluc-HotAir (slika 5A), nato transfekcirajo skupaj z različnimi-miRNA kodiranje plazmidov. rno-miR-344 je deloval kot negativno kontrolo. Rezultati so pokazali, da je bila luciferazno aktivnost zmanjšala za 48% in 31% v primerjavi s praznim nadzor vektorja ko miR-331-3p in miR-124 so bili izraženi oz. Ti podatki kažejo, da se lahko tako miR-331-3p in miR-124 veže direktno na HotAir prek ustreznih priznanje mestih miRNA (slika 5B levi plošči). Slika 5 HotAir je cilj miR-331-3P ali miR-124 in nadzira miR-331-3p cilja. (A) 11 domnevnih Mirna veznih mest v zaporedju HotAir. CDNA HotAir vsebuje mest za priznanje domnevnih miRNAs smo klonirali dolvodno od gena luciferaze in imenovan Rluc-HotAir. (B) Levo: luciferaza reporter plazmid (Rluc-HotAir) je bil co-transfektirali v HEK-293 T celic z 11 različnimi-miRNA kodiranje plazmidov. Prav: luciferaza reporter plazmid vsebuje divjim tipom ali mutirani HotAir je co-transfektirali v HEK-293 T celic s pokoj-331-3p vzporedno s praznim plazmida vektor. Luciferazno aktivnost določimo z uporabo dvojne luciferazno testa in prikazan kot relativna luciferazno aktivnost normalizirano na renilla aktivnost. Histogram kaže vrednosti luciferaze izmeri 48 ur po transfekciji. (C) 3'-UTR HER2 je pripojen na luciferazno kodirni regiji (Rluc HER2 3'-UTR) in transfektirali v HEK293T celicah z miR-331-3p potrditi HER2 je cilj miR-331-3p. Rluc-HER2 3'-UTR in miR-331-3p konstrukti so co-transfektirali v HEK293T celic s plazmidi, ki izražajo HotAir (pCDNA /HotAir) ali s kontrolnim vektor za preverjanje aktivnosti Cerna v HotAir. rno-miRNA-344 je bila uporabljena kot negativno kontrolo. Histogram kaže vrednosti luciferaze izmeri 48 ur po transfekciji. (D) RIP z mišjimi monoklonskimi anti-Ago2, preimmune IgG ali 10% prispevku BGC 823-celičnih ekstraktov. RNA v immunoprecipitates smo določili s QRT-PCR. Top: ravni HotAir, miRNA331-3P in FOS RNA so bili predstavljeni kot kratno obogatitev Ago2 glede na IgG immunoprecipitates. Spodaj: relativni RNA iz U1 snRNA v SNRNP70 glede na IgG immunoprecipitates. Številke so povprečje ± SD (N = 3). (E) Western analiza blot stopnje HER2 proteina po zdravljenju BGC-823 celic, s SI-HotAir ali pcDNA /HotAir in SGC-7901 celic z pcDNA /HotAir. GAPDH smo uporabili kot kontrolo. * P < 0,05, ** P < 0,01 in N.S. ni pomemben.
tukaj, smo se odločili, MIR-331-3p kot model miRNA za nadaljnji študij. Da bi še dodatno potrjujejo, da je bilo zmanjšanje luciferazne aktivnosti od Rluc-HotAir-WT vektorja zaradi neposredne interakcije med miRNA in njeni domnevni vezavno mesto, smo mutirani MIR-331-3p vezavno mesto s položajno usmerjeno mutagenezo, kar Rluc -HOTAIR-Mut. Kot je bilo pričakovati, je bilo zatiranje luciferazne aktivnosti popolnoma odpravijo v tem mutant konstrukt v primerjavi z divjim tipom vektorja (slika 5B desno plošče).
HotAir in MIR-331-3p tako vežejo z AGO2 v želodčnih rakave celice
miRNAs so znano je, da je prisotna v citoplazmi v obliki miRNA ribonucleoprotein kompleksov (miRNPs), ki vsebuje tudi Ago2, jedro komponento RNA-inducirane utišanje kompleks (RISC) [17, 18]. Če želite preveriti, ali HotAir sodelavci z miRNPs, RNA in veže protein imunoprecipitacije (RIP) Poskuse smo izvedli na celičnih ekstraktov BGC-823, ki uporabljajo protitelesa proti Ago2. RNA v immunoprecipitates smo določili s QRT-PCR. HotAir je prednostno obogaten (354-krat) v Ago2 vsebujejo miRNPs relativno nadzor imunoglobuline G (IgG) immunoprecipitates. Podobno je miRNK-331-3p zaznan na ravni 840-krat večja od kontrole anti-IgG. Uspešno imuno na Ago2-povezanega RNA je bila preverjena s QRT-PCR, z uporabo RIP temeljni premazi proti človeški FOS vključeni v RIPAb + Ago2 komplet (Slika 5D, top plošče). Poleg tega je anti-SNRNP70 uporabljena kot pozitivna kontrola za postopek RIP in tudi bila odkrita U1 snRNA na ravni 206-krat večja od anti-IgG (Slika 5D, spodnji plošči). Tako HotAir je prisotna v Ago2, ki vsebujejo miRNPs, verjetno zaradi povezanosti z miRNA-331-3p, ki je skladen z našimi genske analize in luciferazne teste.
HotAir nadzoruje miR-331-3p cilj, HER2
Med mnogimi cilji pokoj-331-3p, smo osredotočeni na HER2 saj kodira transmembranski protein z ustrezno funkcijo v kancerogenosti in odpornosti, ki temelji na trastuzumab zdravljenja [19]. 3'-UTR HER2 je pripojen na luciferazno kodirni regiji (Rluc HER2 3'-UTR) in transfekciji s plazmidi, ki kodirajo MIR-331-3p in prazno plazmidni vektor. rno-miRNA-344 je deloval kot negativno kontrolo. Luciferazni test je pokazal, da miR-331-3p močno zavrl luciferazno aktivnost (~ 41% zaviranja) z Rluc HER2 3'-UTR poročevalko, ki potrjuje, da je HER2 cilj miR-331-3p. Rluc-HER2 3'-UTR konstrukt je bil nato transfektirali skupaj s plazmidi kodiranje miR-331-3p in HotAir (pCDNA /HotAir). Luciferazne teste je pokazala, da je v prisotnosti HotAir je Rluc HER2 3'-UTR zatiranje obnovljena v primerjavi s kontrolno skupino (slika 5C). To kaže, da HotAir deluje kot endogeni "gobice" z vezavo MIR-331-3p, s čimer se odpravi zatiranje dejavnost-Mirna povzroča na HER2 3'-UTR.
Poleg tega je učinek HotAir izražanja na endogeni HER2 proteina v v kombinaciji z modulacijo ravni miRNA ali lncRNA smo kontrolirali s različnih pristopov, prikazanih na sliki 5E: (1) miR-331-3p čezmernim proti HER2 pri 823 BGC celic; (2) HotAir razgradljiv proti HER2 pri 823 BGC celic; (3) HotAir prekomerno za HER2 v SGC-7901 celic. Western blot analiza je pokazala, da je prisilno izraz miR-331-3p ali rasklapanje za HotAir v BGC-823 celic povzročila znatno dušenje zvoka vpliva na endogeno izražanja HER2 proteina. Poleg tega je bila HER2 proteina izraz izrazito molekul po transfekciji s HotAir v SGC-7901 celic, kar dokazuje relativno nizko raven endogenega HotAir izražanja.
Vsi ti podatki kažejo, da se veže MIR-331-3p, HotAir deluje kot Cerna za cilj HER2 mRNA, kar moduliranje derepression HER2 in uvedbi dodatne ravni post-transkripcijske regulacije.
MIR-331-3p in miR-124 zaviranje želodčne rakavih celic širjenja
služiti kot endogenega korito za tarčo miRNAs je treba številčnost HotAir primerljiva ali višja od pokoj-331-3p /miR-124. V naši raziskavi, analiza QRT-PCR je pokazala, da je bila miR-331-3p /miR-124 izraz obratno povezana z HotAir izražanja v 20 parov naprednih želodčnega raka (slika 6a). Za potrditev, ali bi miR-331-3p in miR-124 inhibira tudi proliferacijo želodčni rak celic, smo prisiljeni njihovo izražanje v BGC-823 celic, s pomočjo miRNA, ki kodirajo plazmidov. Stopnje izraženosti Mirna-331-3p in pokoj-124 transficirane v BGC 823 celic so znatno povečal za 36-krat, 29-krat, v primerjavi s kontrolnimi celicami (slika 6b). Dalje, MTT in kolonija-formation teste smo izvedli za določitev preživetja celic. Rezultate testa in rastnih krivulj MTT pokazala, da celice transficirane z miR-331-3p ali miR-124 v primerjavi s celicami transficirane s praznim vektorjem (slika 6C) so pokazali znatno zaostajanje v rasti. Ti podatki kažejo, da lahko prekomerno miR-331-3p ali miR-124 izražanja aretirati rak proliferacije celic v želodcu, ki je v skladu z rezultati HotAir izražanja rasklapanje v BGC-823 celic. Slika 6 Pozitivna korelacija med HotAir in HER2 izražanja in pomena za miR-331-3p /miR-124 stopnjah izražanja. (A) Dvomjerni primerjalno analizo odnosa med HotAir izražanja in pokoj-331-3p ali stopnjo miR-124. (B) BGC-823 celic so transfekciji s plazmidi, ki kodirajo miR-331-3p ali MIR-124, in QRT-PCR smo uporabili za ugotavljanje ravni Mirne v primerjavi s kontrolno skupino (miR-NC). (C) MTT test in test rast, ki tvorijo kolonije so bili izvedeni za določitev širjenja miR-331-3p ali miR-124 transfekciji BGC-823 celic. (D) Levo: imunskim barvanjem HER2 proteina v naprednih želodčnih vzorcih raka tkiva. Zgornji: imunskim barvanjem HER2 je bil negativen v želodčnih rakavih tkivih z relativno nizko izražanje HotAir. Spodnji: imunskim barvanjem HER2 je bil pozitiven v želodčnih rakavih tkivih z relativno visoko ekspresijo HotAir. Desno: Dvomjerni primerjalno analizo odnosa med HotAir in HER2 ravni izražanja. * P < 0,05, ** P < 0.01.
HER2 ki je hkrati izraženi z HotAir v želodčnih tkivih raka
Stopnja prekomerno HER2 so poročali, da je 7-34% pri raku želodca, in je bila povezana z bolj agresivnim bolezni in slabše preživetje pri raku želodca [19]. Zaznali smo ekspresije HER2 v 50 naprednih želodčnih tkiv rakom (odrskih III /IV) izbranimi izmed prejšnjih 78 želodčnega raka tkiva z imunohistokemijo (IHK) in analizo QRT-PCR. Rezultati IHC obarvanjem pokazali HER2 protein pozitivnosti v 56% izbranih 50 želodčnega tkiva raka. Osemdeset-šest odstotkov teh HER2 pozitivnih vzorcev je bilo iz fazi III /IV tumorjev, in 71% prikazani visoko HotAir izraz (slika 6D in dodatno datoteko 2: Tabela S2). Dvomjerni Korelacijska analiza je pokazala, da je izražanje HER2 močno povezana s stopnjo HotAir Prepis v želodcu tkivih rakom v primerjavi z običajnimi kolegi (slika 6d). Ti podatki kažejo, da je izražanje HER2 pozitivno povezana z molekul HotAir v vzorcih želodca raka tkiva, kar kaže, da je karakterizacija interakcije HER2 /HotAir lahko biološko pomembno človeške želodčne tumorigeneze.
Predvsem zaradi tekoče faze III /IV poskus, stopnja prekomerno HER2 odkriti v tej študiji je višja od prej poročali srednjo območju. Ta povečana stopnja čezmernega izražanja HER2 je močno povezana s slabimi rezultati pri bolnikih z metastatskim in visoke stopnje lokalizirano želodčni rak, s čimer poudarja pomen HER2 v razvoj želodčnega raka in metastaz.
Razprava
LncRNAs, ki so več kot 200 nukleotidov z omejeno zmogljivostjo kodiranje proteina, so pogosto izražene v obolenja, tkivo ali razvojni fazi specifični način, kar kaže posebne funkcije za lncRNAs v razvoju in bolezni ter izdelavo teh molekul privlačne terapevtskih ciljev [20-22]. Številne nedavne dokumenti so pokazali, da lahko disregulacijo teh lncRNAs vpliva tudi ureditev evkariontskih genoma in zagotavlja celično prednost rasti, kar je povzročilo progresivno in nenadzorovano rast tumorjev [23-25]. Zato se lahko lncRNAs zagotovijo manjkajoči del sicer znane onkogenih in tumorski supresor omrežju sestavljanke.
V tej študiji smo testirali izražanje HotAir v želodčnih vzorcih karcinoma in okoliških niso tumorskih tkiv. Identificirali smo tudi funkcijo HotAir v želodčnih celic karcinoma z uporabo gain- in izpadu funkcije pristopi. Rezultati so pokazali, da je bila HotAir povečana pri želodčnih karcinomom tkiva v primerjavi s sosednjimi normalnih želodca tkiv, in da HotAir Povecanje povezana z večjo velikost tumorja, napredne patološko fazi in obsežne metastaz. Poleg tega je bil skupni čas preživetja bolnikov z nižjo stopnjo izraženosti HotAir bistveno daljši kot pri bolnikih z zmernimi ali močnimi ravni HotAir izražanja. Poleg tega HotAir čezmernim spodbuja proliferacijo, migracijo in invazijo želodčnih celic karcinoma, medtem ko izčrpavanje HotAir zaviral celično invazijo in sposobnost preživetja celic in povzročeno aretacijo rasti in vitro in in vivo. Poleg tega HotAir zatiranje vodila za spodbujanje celične apoptoze želodca. Te ugotovitve kažejo, da ima HotAir neposredno vlogo pri modulaciji več onkogenih lastnosti in želodca napredovanje raka, spodbujanje novih raziskovalnih smeri in terapevtske možnosti razmišljajo HotAir kot nove prognostični označevalec in terapevtske tarče raka želodca.
Pomen lncRNAs v človeških bolezni je lahko povezano z njihovo sposobnostjo, da vplivajo celične funkcije preko različnih mehanizmov. V tej študiji, v kolikor se zadeva mehanizem HotAir, je treba omeniti, da subceličnih analiza lokalizacija HotAir s RNK fluorescence in situ hibridizacijo test kaže na lokalizacijo HotAir tako jedra in citoplazmo [24]. Jasno je, da lahko jedrska HotAir ciljno polycomb represivne kompleks 2, spreminjanje H3K27 metilacije in genske ekspresije vzorce po genomu [10, 11]. Najnovejše delo poročali funkcijo oder za HotAir v citoplazmi kot induktor-ubikvitina posredovana proteolize [26]. Kljub temu, tumorogen lastnosti in mehanične heterogenost HotAir, še posebej tiste iz citoplazemske obliki, še zdaleč niso v celoti pojasnjen.
Navdih regulativni mreži "konkurenčna endogenega RNA" in novih dokazov, ki kaže, da se lncRNAs sodelujejo v tem regulativni vezje, smo predpostavili, da se lahko HotAir služi tudi kot Cerna in tako smo iskali potencialne interakcije z miRNAs. V podporo tej ideji, smo uporabili bioinformatiÄŤnih analizo in luciferazne teste za potrditev neposredno zavezujoče sposobnost napovedanih odzivanja miRNA na celovečerni HotAir prepisa. GAPDH smo uporabili kot kontrolo. * P < Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Kakovost življenja, imunomodulacija in varnosti adjuvantno zdravljenje omelo pri bolnikih z rakom želodca - randomizirana, kontrolirana pilotna študija
• Dol ureditev Thrombospondin2 napoveduje slabo prognozo pri bolnikih z razjedo cancer