LNC RNA hotair fungerer som en konkurrerende endogen RNA til at regulere HER2 ekspression ved sponging miR-331-3p i gastrisk kræft

LNC RNA hotair fungerer som en konkurrerende endogen RNA til at regulere HER2 ekspression ved sponging miR-331-3p i mavekræft
Abstract
Baggrund
mere tyder, at den lange ikke-kodende RNA hotair spiller en afgørende rolle i cancer progression og metastase. Men den overordnede biologiske rolle og kliniske betydning af hotair i gastrisk carcinogenese forbliver stort set ukendt.
Metoder
hotair ekspression blev målt i 78 parrede kræft og noncancerous vævsprøver af real-time PCR. Virkningerne af hotair på gastriske cancerceller blev undersøgt ved overekspression og RNA-interferens tilgange in vitro og in vivo. Insights af mekanismen af ​​konkurrencedygtige endogene RNA (ceRNAs) blev opnået fra bioinformatik analyse, luciferaseassays og RNA-bindende protein immunoprecipitation (RIP). Den positive hotair /HER2 interaktion blev identificeret og verificeret af immunhistokemi assay og bivariate korrelationsanalyse.
Resultater
hotair opregulering var forbundet med større tumorstørrelse, avanceret patologisk stadium og omfattende metastase, og også korreleret med kortere samlet overlevelse af gastrisk kræftpatienter. Endvidere hotair overekspression fremmet proliferation, migration og invasion af gastriske carcinomaceller, medens hotair udtømning hæmmede både celleinvasion og cellelevedygtighed, og induceret vækststandsning in vitro og in vivo. Især kan hotair fungere som Cerna, effektivt ved at blive en vask for miR-331-3p og derved modulere derepression af HER2 og indførelse af en ekstra niveau af post-transkriptionel regulering. Endelig blev den positive hotair /HER2 korrelation signifikant associeret med avancerede gastrisk kræft.
Konklusioner
hotair overekspression repræsenterer en biomarkør for dårlig prognose i mavekræft, og kan give maligne fænotype til tumorceller. Den Cerna regulatoriske netværk involverer hotair og det positive samspil mellem hotair og HER2 kan bidrage til en bedre forståelse af mavekræft patogenese og lette udviklingen af ​​lncRNA-rettet diagnostik og terapi mod denne sygdom.
Nøgleord
Konkurrerende endogene RNA HER2 hotair mavekræft spredning og invasion Baggrund
mavekræft er den anden hyppigste årsag til kræft-induceret død, og er den mest almindelige gastrointestinale malignitet i Østasien, Østeuropa og dele af Central- og Sydamerika. Hos de fleste patienter er gastrisk kræft diagnosticeret på et fremskredent stadium og er ledsaget af ondartet spredning, omfattende invasion og lymfe metastaser. Succesfulde terapeutiske strategier er begrænsede, og dødeligheden er høj [1, 2]. Lange ikke-kodning RNA (lncRNAs) har for nylig fået stor opmærksomhed i afgrænse de komplekse mekanismer underliggende maligne processer såsom carcinogenese, metastaser og resistens. Derfor, hvis vi ønsker at forstå gastrisk carcinogenese, er vi nødt til at overveje denne familie af regulatoriske udskrifter, der tilføjer et nyt lag af kompleksitet til tumor biologi.
Selv om kun et lille antal funktionelle lncRNAs er blevet godt karakteriseret til dato, de har vist sig at regulere genekspression på forskellige niveauer, herunder kromatin modifikation, transkription og post-transkriptionel bearbejdning [3, 4]. For nylig har en ny reguleringsmekanisme blevet identificeret, hvor krydstale mellem lncRNAs og mRNA sker ved at konkurrere om fælles microRNA (miRNA) respons elementer. I dette tilfælde kan lncRNAs fungere som konkurrerende endogene RNA (ceRNAs) til svamp miRNA og dermed modulere derepression af miRNA mål og indførelse af en ekstra niveau af post-transkriptionel regulering [5]. I tidligere rapporter, har en muskel-specifik lncRNA, Linc-MD1, blevet rapporteret at være en Cerna der beskytter MyoD messenger RNA (mRNA) fra miRNA-medieret nedbrydning [6]. Pluripotens-associeret LNC-RoR kan fungere som en nøgle Cerna at knytte netværk af miRNA og centrale transkriptionsfaktorer, fx Oct4, Sox2, og Nanog, i humane embryonale stamceller. Især lncRNA HULC er stærkt opreguleret i leverkræft og spiller en vigtig rolle i tumorigenese [7]. Især kan HULC virke som en endogen 'svamp ", der nedregulerer en række miRNA aktiviteter, herunder MIR-372 [8]. Vi foreslår derfor, at nogle lncRNAs også kan have roller som ceRNAs, der forbinder miRNA og post-transkriptionel netværk i gastrisk patogenese.
Hotair (Hox udskrift antisense intergeniske RNA
) er en ~ 2,2 kb lange ikke-kodende RNA transkriberet fra HOXC
locus, som kan undertrykke transkription i trans
af Hoxd
i forhudsfibroblaster [9]. Som en roman molekyle inden for tumor biologi, hotair oprindeligt blev kendt for sin deltagelse i den primære brysttumorer og brystkræft metastaser, hvor forhøjelse af hotair fremmet invasionsevne og metastase [10]. Desuden hotair udtryk positivt korrelerer med maligne processer og dårligt resultat i kolorektal cancer, hepatocellulært carcinom, bugspytkirtelkræft og gastrointestinale stromale tumorer [11-14]. Nylige undersøgelser rapporteret, at hotair blev opreguleret i gastrisk cancer [15, 16]. Alligevel forbliver stort set udefineret den samlede biologiske rolle og underliggende molekylære mekanisme hotair i gastrisk carcinogenese.
I denne undersøgelse rapporterer vi at hotair opregulering er en karakteristisk molekylær ændring i gastrisk cancer og undersøge de biologiske roller hotair på fænotyper af gastriske cancerceller in vitro og in vivo. Desuden mekanistisk analyse afslører, at hotair kan fungere som en černá at regulere ekspression af human epithelial vækstfaktor receptor 2 (HER2) gennem konkurrence for MIR-331-3p, spiller således en onkogen rolle i gastrisk patogenese. Den nuværende arbejde giver de første beviser for en positiv hotair /HER2 korrelation og krydstale mellem miR-331-3p, hotair og HER2, kaste nyt lys over behandlingen af ​​mavekræft.
Resultater
hotair udtryk opreguleret i humane mavekræft væv
niveauet af hotair ekspression blev bestemt i 78 parrede gastrisk kræft prøver og tilstødende, histologisk normale væv ved QRT-PCR, og normaliseret til GAPDH. Hotair ekspression blev signifikant opreguleret i cancervæv (mean ratio af 14,35-fold, P < 0,01) sammenlignet med normale modstykker (figur 1A). Undersøgelse af sammenhængen mellem hotair ekspression og klinisk patologiske træk viste, at hotair opregulering var korreleret med større tumorstørrelse, avanceret patologisk stadium, fjernmetastaser (figur 1B og C), lymfeknudemetastase og tumorcelledifferentiering (tabel 1). Imidlertid blev hotair ekspression ikke forbundet med tumor position eller patient køn (tabel 1). Med hensyn til den samlede overlevelse, patienter med forhøjet hotair udtryk havde en signifikant dårligere prognose end dem med lav hotair udtryk (P < 0,001, log-rank test, figur 1D). Disse resultater antyder, at hotair overekspression kan være nyttige ved udvikling af nye prognostiske eller progression markører for gastrisk cancer. Figur 1 Relativ hotair ekspression i gastrisk cancer væv og dets kliniske betydning. (A) Relativ ekspression af hotair i gastrisk cancer væv (n = 78) i sammenligning med tilsvarende ikke-tumor normale væv (n = 78). Hotair ekspression blev undersøgt ved QRT-PCR og normaliseret til GAPDH udtryk. Dataene blev præsenteret som fold-ændring i tumorvæv i forhold til normale væv. (B) Undersøgelse af sammenhængen mellem hotair udtryk og kliniske patologiske træk viste, at hotair opregulering korreleret med større tumorstørrelse og avanceret patologisk stadium. (C) hotair ekspression var signifikant højere hos patienter med fjernmetastaser end hos dem med ikke-fjernt metastase. (D) Kaplan-Meier samlede overlevelseskurver ifølge hotair udtryk niveau. Den samlede overlevelse på højt hotair (n = 39: hotair udtryk forholdet ≥ median forhold) var signifikant højere end for Low-hotair (n = 39; hotair udtryk forholdet ≤ median-forholdet; P < 0,001, log- rank test). * P < 0,05, ** P < 0.01.
Tabel 1 Korrelation af ekspressionen af ​​hotair med clinicopathologic funktioner
Clinicopathologic funktioner
n (%)
Relativ udtryk for HOTAIRa
P-værdiB
Gender
P = 0,62
Mand
50 (64)
12,21 (0,97-17,53)
Female
28 (36)
15,01 (7,34 -19,52)
site tumor
P = 0,910
Distal tredje
18 (23)
9,1 (1,37-14,12)
Mellemøsten tredje
20 (26)
7,96 (2,55-9,72)
proksimal mave
40 (51)
7,76 (1,24-13,58)
Differentiering
P = 0,045
Poor
56 (72)
15,6 (6,25-20,36)
høj /moderat
22 (28)
8,1 (0,98-11,14)
lymfeknudemetastase
P = 0,005
n0
10 (13)
1,14 (0,75-1,42)
N1
11 (14)
3,44 (1,15-4,85)
N2
29 (37)
11.99 (7.15- 14,77)
N3
28 (36)
32,58 (7,34-36,27)
metastatisk sygdom
P = 0,029
M0
64 (82)
9,35 (2,53 -33,64)
M1
14 figen
28,82 (16,39-39,39)
aMedian relativ udtryk, med 25-75. percentil i parentes. bP < 0,05 blev betragtet som signifikant (Mann-Whitney U
test mellem 2 grupper og Kruskall-Wallis test i 3 grupper).
Manipulation af hotair niveauer i gastriske cancerceller
Dernæst udføres QRT-PCR-analyse for at undersøge ekspressionsniveauer af hotair i forskellige cancercellelinier, herunder gastrisk, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og brystcancer-afledte celler. Som vist i figur 2A, af de fire gastriske cancercellelinjer undersøgt (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, og AGS), BGC-823 udtrykte højere niveauer af hotair (3,18 gange) end den normale gastriske epitel celle line (GES-1). Tilsvarende NSCLC cellelinie, SPC-A1, viste en 3,73-fold opregulering af hotair over normal human bronchial epitel cellelinie, 16HBE. Den stærkt metastatisk brystcancer cellelinje MDA-MB-231 viste en 4,77-fold opregulering af hotair forhold til MCF-7 (figur 2A). Vore data antyder, at hotair kan ofte opreguleret i mange tumorceller. Figur 2 Niveauet af hotair ekspression i gastriske cancerceller og dens virkning på celleproliferation in vitro. (A) Resultater fra QRT-PCR demonstrerer hotair ekspressionsniveauer af gastrisk kræft cellelinier (MGC-803, SGC-7901, BGC-823, og AGS) sammenlignet med normale gastrisk epitel celle linje (GES-1), NSCLC cellelinje ( SPC-A1) i forhold til normal human bronchial epitel cellelinie (16HBE), og brystcancercellelinier MDA-MB-231 sammenlignet med MCF-7. (B) QRT-PCR-analyser af hotair udtryk niveau efter behandling BGC-823 celler med siRNA'er rettet mod hotair og behandling SGC-7901 celler med pCDNA /hotair vektor. (C) MTT assay blev udført for at bestemme proliferationen af ​​si-hotair-transficerede BGC-823 celler eller pCDNA /hotair-transficerede SGC-7901 celler. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± s.d. fra tre uafhængige forsøg. (D) Koloni-dannende vækst-assay blev udført for at bestemme proliferationen af ​​si-hotair transficerede BGC-823 celler. Kolonier blev talt og fanget. * P < 0,05 og ** P < 0.01.
At manipulere hotair niveauer i gastrisk kræftceller, blev en pCDNA /hotair vektor transficeret i SGC-7901 celler og si-hotair blev transficeret i BGC-823 celler. QRT-PCR-analyse af hotair niveauer blev udført ved 48 timer efter transfektion og afslørede, at hotair ekspression blev øget 98-fold i SGC-7901 celler, sammenlignet med kontrolceller. Men i BGC-823 celler, hotair udtryk var effektivt 75% slået af si-HOTAIR2, den mest effektive siRNA efterfølgende anvendes i de følgende forsøg (Figur 2B).
Effekt af hotair på celledeling og apoptose in vitro
den betydelige stigning i hotair udtryk i mavekræft prøver fik os til at undersøge mulige biologiske betydning af hotair i tumorigenese. MTT-analysen viste, at cellevækst blev væsentligt forringet i BGC-823 celler transficeret med si-hotair, mens spredning af SGC-7901 celler blev øget i pcDNA /hotair transficerede celler sammenlignet med de respektive kontroller (Figur 2C). Ligeledes er resultatet af koloni-dannelse assay viste, at klonogene overlevelse faldt efter hæmning af hotair i BGC-823 celler (figur 2D).
At bestemme om apoptose var en medvirkende faktor til celle væksthæmning, vi udførte Hoechst farvning og flow-cytometri af si-hotair-behandlede BGC-823 celler. Dataene viste, at antallet af celler med kondenseret og fragmenteret kerner angiver den del af tidlige apoptotiske celler var signifikant højere i si-hotair-behandlede BGC-823-celler sammenlignet med si-NC-behandlede celler (figur 3A og B). Desuden fandt vi, at inhibering af hotair forbedret caspase-3-afhængig apoptose, påvist ved Western blot-analyse af aktiveret caspase-3 efter si-hotair transfektion (Yderligere fil 1: Figur S1). Taget sammen indikerer disse resultater, at knockdown af hotair undertrykker mavekræft celleproliferation og inducerer apoptose in vitro. Figur 3 Virkningen af ​​hotair på gastrisk cancercellelinie apoptose, migration og invasion in vitro. BGC-823 celler blev transficeret med si-hotair eller si-NC, og SGC-7901 celler blev transficeret med pCDNA /hotair vektor eller tom vektor kontrol. (A) Hoechst-farvning-assay af celle apoptose; procentdelen af ​​Hoechst-positive kerner pr optiske felt (mindst 50 felter) blev bestemt. (B) De apoptotiske satser af celler blev påvist ved flowcytometri. UL, nekrotiske celler; UR, terminal apoptotiske celler; LR, tidlige apoptotiske celler. (C og D) Transwell assays blev udført for at undersøge ændringer i cellemigrering og invasionsevne. * P < 0,05 og ** P < 0,01.
Hotair fremmer migration og invasion af gastriske cancerceller in vitro
celleinvasion er et væsentligt aspekt af cancer progression, der involverer migrationen af ​​tumorceller i sammenhængende væv og opløsningen af ​​ekstracellulære matrixproteiner. Her evalueret vi cancercelleinvasion gennem Transwell assays. Som vist i figur 3C, transfektion af hotair siRNA hindret migreringsevnen BGC-823-celler med omkring 66%. En tilsvarende virkning på invasionsevne blev også observeret i et parallelt invasion assay. Omvendt transfektion af SGC-7901 celler med pCDNA /hotair vektor fremmes cellevandring og invasivitet ~ 1,9 gange (figur 3D). Disse data indikerer, at hotair har onkogene egenskaber, der kan fremme en vandrende og invasiv fænotype i gastriske kræftceller.
Hotair fremmer tumorigenese af gastriske kræftceller in vivo
At udforske, om niveauet for hotair udtryk påvirker tumorigenese, BGC-823 celler transduceret med sh-hotair /pENTR vektor (EV) blev anvendt i en nøgen mus xenograft model. Op til 16 dage efter knockdown af hotair, der var et dramatisk fald i tumor volumen og vægt i sh-hotair sammenlignet med kontroller (figur 4A, B og C). Dernæst blev immunfarvning analyse af proliferationsmarkør PCNA udført i resektion tumorvæv. I sammenligning med det i tumorer dannet ud fra kontrolceller, viste sh-hotair-afledte tumorer signifikant reduceret PCNA positivitet (figur 4D). Disse resultater antyder, at niveauet af hotair ekspression er signifikant associeret med in vivo proliferation kapacitet af gastriske cancerceller. Figur 4 Virkning af hotair knockdown på tumorvækst in vivo. (A) Tumor vækstkurver blev målt efter injektion af BGC-823-celler transficeret med SH-hotair eller pENTR vektor. Tumorvolumen blev beregnet hver 3. dag. Data er præsenteret som middelværdi ± s.d. (N = 5). (B) Tumor vægt. Værdier er gennemsnit af tumorvægt ± s.d. (C) QRT-PCR-analyse af hotair ekspression i væv af operativt fjernede tumorer. (D) Tumorer udviklet fra BGC-823 /sh-hotair celler viste et lavere niveau af PCNA protein end tumorer udviklet fra BGC-823 /pENTR vektor celler. Øvre: H & E farvning; Lavere: immunfarvning. * P < 0,05 og ** P < 0.01.
Hotair er et mål for miR-331-3P og miR-124
Bioinformatik analyse af miRNA anerkendelse sekvenser på hotair afslørede tilstedeværelsen af ​​11 tumor-undertrykkende miRNA bindingssteder. Den hotair cDNA blev klonet nedstrøms for luciferasegenet og navngivet Rluc-hotair (figur 5A), derefter transficeret sammen med forskellige miRNA-kodende plasmider. RNO-miR-344 fungerede som en negativ kontrol. Resultaterne viste, at luciferaseaktivitet blev reduceret med 48% og 31% sammenlignet med tom vektor kontrol, når MIR-331-3p og MIR-124 blev udtrykt henholdsvis. Disse data viser, at både MIR-331-3p og MIR-124 direkte kan binde til hotair gennem respektive miRNA genkendelsessteder (figur 5B, venstre panel). Figur 5 hotair er et mål for miR-331-3P eller miR-124 og styrer miR-331-3p mål. (A) De 11 formodede miRNA bindingssteder i hotair sekvensen. Den hotair cDNA indeholdende de formodede miRNA genkendelsessites blev klonet nedstrøms luciferasegenet og navngivet Rluc-hotair. (B) Venstre: Luciferase reporter plasmid (Rluc-hotair) blev co-transficeret ind i HEK-293 T-celler med de 11 forskellige miRNA-kodende plasmider. Højre: luciferase reporter plasmid indeholdende vildtype eller mutant hotair blev co-transficeret ind i HEK-293 T-celler med MIR-331-3p parallelt med en tom plasmidvektor. Luciferaseaktivitet blev bestemt ved anvendelse af dual luciferase assay og vist som den relative luciferaseaktivitet normaliseret til renilla aktivitet. Histogram viser værdien af ​​luciferase målt 48 timer efter transfektion. (C) 3'-UTR af HER2 blev fusioneret til luciferase-kodende region (Rluc-HER2 3'-UTR) og transficeret i HEK293T celler med MIR-331-3p at bekræfte HER2 er målet for MIR-331-3p. Rluc-HER2 3'-UTR og MIR-331-3p konstruktioner blev cotransficeret ind HEK293T celler med plasmider, der udtrykker hotair (pCDNA /hotair) eller med en kontrol vektor for at verificere Cerna aktivitet hotair. RNO-miRNA-344 blev anvendt som en negativ kontrol. Histogram viser værdien af ​​luciferase målt 48 timer efter transfektion. (D) RIP med muse-monoklonalt anti-Ago2, præimmunt IgG eller 10% input fra BGC 823-celleekstrakter. RNA-niveauer i immunopræcipitater blev bestemt ved QRT-PCR. Top: niveauer af hotair, miRNA331-3P og FOS-RNA blev præsenteret som fold berigelse i Ago2 forhold til IgG immunpræcipitater. Nederst: relative RNA niveauer af U1 snRNA i SNRNP70 forhold til IgG immunpræcipitater. Tal er gennemsnit ± standardafvigelse (N = 3). (E) Western blot analyse af HER2 protein niveau efter behandling af BGC-823 celler med si-hotair eller pCDNA /hotair, og SGC-7901 celler med pCDNA /hotair. GAPDH blev anvendt som kontrol. * P < 0,05, ** P < 0,01 og N.S. ikke signifikant.
Heri valgte vi miR-331-3p som model miRNA for yderligere undersøgelser. For yderligere at bekræfte, at reduktionen i luciferaseaktivitet fra Rluc-hotair-WT vektor skyldtes direkte interaktion mellem miRNA og dets formodede bindingssted, muterede vi den MIR-331-3p bindingssted ved site-directed mutagenese, hvilket resulterer i Rluc -HOTAIR-Mut. Som forventet blev undertrykkelse af luciferaseaktiviteten helt afskaffet i denne mutant konstruktion sammenlignet med vildtype-vektor (figur 5B højre panel).
Hotair og miR-331-3p både binder med AGO2 i gastrisk kræftceller
miRNA er vides at være til stede i cytoplasmaet i form af miRNA ribonukleoprotein komplekser (miRNPs), der også indeholder Ago2, kernekomponenten af ​​RNA-inducerede silencing kompleks (RISC) [17, 18]. For at teste, om hotair forbinder med miRNPs, RNA-bindende protein immunopræcipitation blev udført (RIP) eksperimenter på BGC-823 celleekstrakter ved anvendelse af antistoffer mod Ago2. RNA-niveauer i immunopræcipitater blev bestemt ved QRT-PCR. Hotair blev fortrinsvis beriget (354 gange) i Ago2-holdige miRNPs forhold til at styre immunglobulin G (IgG) immunpræcipitater. Tilsvarende blev miRNA-331-3p detekteres på et niveau 840 gange større end den for kontrol-anti-IgG. Vellykket immunpræcipitering af Ago2-associerede RNA blev verificeret ved QRT-PCR, ved anvendelse af RIP primere mod humane FOS inkluderet i RIPAb + Ago2 kit (figur 5D, øverste panel). Desuden blev anti-SNRNP70 anvendt som en positiv kontrol for undersøgelsesperioden procedure, og U1 snRNA blev også påvist på et niveau 206 gange større end den for anti-IgG (figur 5D, bundpanel). Således hotair er til stede i Ago2-holdige miRNPs, sandsynligvis gennem samarbejde med miRNA-331-3p, i overensstemmelse med vores bioinformatiske analyse og luciferaseassays.
Hotair styrer miR-331-3p mål, HER2
Blandt de mange mål for mIR-331-3p koncentrerede vi os om HER2, da det koder for et transmembrant protein med en relevant funktion i carcinogenese og modstandsdygtighed over for trastuzumab-baseret behandling [19]. 3'-UTR af HER2 blev fusioneret til luciferase-kodende region (Rluc-HER2 3'-UTR) og transficeret med plasmider kodende MIR-331-3p og en tom plasmidvektor. RNO-miRNA-344 fungerede som en negativ kontrol. Luciferase assay viste, at MIR-331-3p signifikant hæmmet luciferaseaktivitet (~ 41% inhibering) af Rluc-HER2 3'-UTR reporter, der bekræfter, at HER2 er et mål på MIR-331-3p. Den Rluc-HER2 3'-UTR-konstruktionen blev efterfølgende transficeret sammen med plasmider kodende MIR-331-3p og hotair (pCDNA /hotair). Luciferaseassays indikerede, at i nærvær af hotair blev Rluc-HER2 3'-UTR undertrykkelse restaureret sammenlignet med kontrolgruppen (figur 5C). Dette indikerer, at hotair fungerer som en endogen "svamp" ved binding MIR-331-3p, således afskaffe miRNA-inducerede undertrykkende aktivitet på HER2 3'-UTR.
Endvidere virkningen af ​​hotair ekspression på endogent HER2 protein i kombination med graduering af miRNA eller lncRNA niveauer blev overvåget af de forskellige tilgange, der er vist i figur 5E: (1) miR-331-3p overekspression mod HER2 i BGC-823 celler; (2) hotair knockdown mod HER2 i BGC-823 celler; (3) hotair overekspression for HER2 i SGC-7901 celler. Western blot analyse viste, at tvungen udtryk for miR-331-3p eller knockdown af hotair i BGC-823 celler udløste en signifikant lyddæmpning effekt på endogene HER2 protein udtryk. Endvidere blev HER2-protein-ekspression markant opreguleret efter transfektion med hotair i SGC-7901-celler, hvilket viser en forholdsvis lav endogen hotair ekspressionsniveau.
Sammen indikerer disse data, at ved binding MIR-331-3p, hotair fungerer som en Cerna for målet HER2 mRNA og derved modulere derepression af HER2 og indførelse af en ekstra niveau af post-transkriptionel regulering.
mIR-331-3p og miR-124 undertrykke gastrisk kræftceller spredning
at tjene som en endogen vask til målet miRNA, bør den overflod af hotair være sammenlignelig med eller højere end miR-331-3p /miR-124. I vores undersøgelse viste QRT-PCR-analyse, at MIR-331-3p /MIR-124-ekspression er omvendt var korreleret med hotair ekspression i 20 par avancerede gastriske cancere (figur 6A). For at validere, om miR-331-3p og miR-124 også kunne hæmme mavekræft celleproliferation, tvang vi deres udtryk i BGC-823 celler ved hjælp af miRNA-koder plasmider. Ekspressionsniveauerne af miRNA-331-3p og miR-124 transficeret i BGC-823 celler blev øget væsentligt med 36 gange og 29 gange, sammenlignet med kontrol-celler (Figur 6B). Dernæst MTT og koloni-dannelse-assays blev udført for at bestemme cellernes levedygtighed. Resultaterne af MTT-assayet og vækstkurver viste, at celler transficeret med MIR-331-3p eller MIR-124 viste signifikant væksthæmning i sammenligning med celler transficeret med tom vektor (figur 6C). Disse data indikerer, at overekspression af MIR-331-3p eller MIR-124-ekspression kan standse gastrisk cancer celleproliferation, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne af hotair ekspression knockdown i BGC-823 celler. Figur 6 Positiv korrelation mellem hotair og HER2 udtryk og relevans til miR-331-3p /miR-124 ekspressionsniveauerne. (A) Bivariate korrelation analyse af forholdet mellem hotair ekspression og MIR-331-3p eller MIR-124 niveau. (B) BGC-823 celler blev transficeret med plasmider, der koder MIR-331-3p eller MIR-124, og QRT-PCR blev anvendt til at påvise de miRNA niveauer sammenlignet med kontroller (MIR-NC). (C) MTT assay og koloni-dannende vækst-assay blev udført for at bestemme proliferationen af ​​MIR-331-3p eller MIR-124 transficerede BGC-823 celler. (D) Venstre: immunfarvning af HER2 protein i avancerede gastrisk cancer vævsprøver. Øvre: immunfarvning af HER2 var negativ i gastrisk kræft væv med forholdsvis lav hotair udtryk. Lavere: immunfarvning af HER2 var positiv i gastrisk kræft væv med relativ høj hotair udtryk. Til højre: bivariate korrelation analyse af forholdet mellem hotair og HER2 udtryk niveau. * P < 0,05, ** P < 0.01.
HER2 er co-udtrykt med hotair i gastrisk kræft væv
HER2 overekspression sats blev rapporteret til at være 7-34% i mavekræft, og var forbundet med en mere aggressiv sygdom og dårligere overlevelse i gastrisk kræft [19]. Vi har registreret ekspression af HER2 i 50 avancerede gastric cancer væv (fase III /IV) udvalgt fra de tidligere 78 gastrisk cancer væv ved immunhistokemi (IHC) og QRT-PCR-analyse. Resultaterne af IHC-farvning viste HER2-protein positivitet i 56% af de udvalgte 50 mavekræft væv. Firs-seks procent af disse HER2-positive prøver var fra fremskredent stadium III /IV tumorer, og 71% viste høj hotair udtryk (figur 6D og Yderligere fil 2: Tabel S2). Bivariate korrelation analyse viste, at ekspressionen af ​​HER2 var signifikant korreleret med hotair udskrift niveau i mavekræft væv sammenlignet med normale modstykker (figur 6D). Disse data indikerer, at ekspressionen af ​​HER2 er positivt associeret med opreguleret hotair i gastrisk cancer vævsprøver, hvilket antyder, at karakterisering af HER2 /hotair interaktion kan være biologisk signifikant i human gastrisk tumorigenese.
Især på grund af en igangværende fase III /IV forsøg, HER2 overekspression sats detekteret i den foreliggende undersøgelse er højere end den tidligere rapporterede midterfeltet. Denne øgede hastighed på HER2 overekspression er stærkt knyttet til fattige resultater for patienter med metastatisk og høj kvalitet lokaliseret gastrisk kræft, og derved fremhæve betydningen af ​​HER2 i gastrisk udvikling af kræft og metastaser.
Diskussion
LncRNAs, som er mere end 200 nukleotider langt med begrænset protein-kodende kapacitet, ofte udtrykt i en sygdomsmodificerende, vævs- eller udviklingstrin-specifik måde, hvilket indikerer specifikke funktioner for lncRNAs i udvikling og sygdomme og gøre disse molekyler attraktive terapeutiske mål [20-22]. En række nylige papirer har afsløret, at dysregulering af disse lncRNAs også kan påvirke reguleringen af ​​den eukaryote genom og tilvejebringe et cellulært vækstfordel, hvilket resulterer i progressiv og ukontrolleret tumorvækst [23-25]. Derfor kan lncRNAs tilvejebringe en manglende stykke af den ellers velkendte onkogene og tumor suppressor netværk puslespil.
I denne undersøgelse testede vi ekspressionen af ​​hotair i gastriske carcinoma prøver og de omgivende ikke-tumor-væv. Vi identificerede også funktionen af ​​hotair i gastrisk carcinomceller ved at anvende GAIN- og tab af funktion tilgange. Resultaterne viste, at hotair blev opreguleret i gastriske carcinoma væv sammenlignet med tilstødende normale gastriske væv, og at hotair opregulering korreleret med større tumorstørrelse, avanceret patologisk stadium og omfattende metastase. Endvidere er den overordnede overlevelsestid for patienter med lavere hotair ekspressionsniveauer var signifikant længere end for patienter med moderate eller stærke hotair ekspressionsniveauer. Endvidere hotair overekspression fremmet proliferation, migration og invasion af gastriske carcinomaceller, medens hotair udtømning inhiberede celleinvasion og cellelevedygtighed, og induceret vækststandsning både in vitro og in vivo. Derudover hotair undertrykkelse førte til fremme af gastrisk celle apoptose. Disse resultater tyder på, at hotair spiller en direkte rolle i modulering af flere onkogene egenskaber og mavekræft progression, stimulere ny forskning retninger og terapeutiske muligheder overvejer hotair som en ny prognostisk markør og terapeutisk mål i mavekræft.
Betydningen af ​​lncRNAs i human sygdom kan være forbundet med deres evne til at påvirke cellulære funktioner gennem forskellige mekanismer. I denne undersøgelse, så vidt mekanismen hotair angår, er det værd at nævne, at subcellulære lokalisering analyse af hotair ved RNA fluorescens in situ hybridisering assay demonstrerer lokaliseringen af ​​hotair til både kernen og cytoplasmaet [24]. Det er indlysende, at nuklear hotair kan målrette Polycomb undertrykkende kompleks 2, ændring H3K27 methylering og genekspressionsmønstre tværs genomet [10, 11]. Nyligt arbejde rapporteret et stillads funktion for hotair i cytoplasmaet som en inducer af ubiquitinmedieret proteolyse [26]. Ikke desto mindre er tumorigene egenskaber og mekanistisk heterogenitet hotair og især dem i den cytoplasmatiske form er langt fra fuldt belyst.
Inspireret af konkurrencemæssige endogene RNA 'regulatoriske netværk og nye beviser på, at lncRNAs kan deltage i dette regulerende kredsløb, vi hypotese, at hotair også kan fungere som en Cerna og så vi søgte for potentielle interaktioner med miRNA. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Livskvalitet, immunmodulation og sikkerhed adjuverende mistelten behandling af patienter med gastrisk karcinom - et randomiseret, kontrolleret pilotstudie
• Nedregulering af Thrombospondin2 forudser dårlig prognose hos patienter med gastrisk cancer