En ny metod, upptäcker digital genom scanning KRAS genamplifiering i gastric cancer: inblandning av överuttryckt vildtyp KRAS i nedströms signalering och cancercelltillväxt

En ny metod, digital genom skanning upptäcker KRAS
genamplifiering i gastric cancer: inblandning av överuttryckt vildtyp KRAS i nedströms signalering och cancercelltillväxt Bild Sammanfattning
Bakgrund
Gastric cancer är den tredje vanligaste malignitet påverkar den allmänna befolkningen i världen. Avvikande aktivering av KRAS är en nyckelfaktor för utvecklingen av många typer av tumörer, dock onkogena mutationer av KRAS
är ovanliga i magcancer. Vi har utvecklat en ny kvantitativ metod för analys av DNA-kopia nummer, kallas digital genom scanning (DGS), som är baserad på den uppräkning av korta restriktionsfragment, och innebär inte PCR eller hybridisering. I den aktuella studien använde vi DGS att kartlägga kopietal förändringar i gastric cancerceller.
Metoder
DGS av magcancer cellinjer utfördes med hjälp av sekvenser av 5000 till 15000 restriktionsfragment. Vi skärmad 20 gastric cancercellinjer och 86 primära gastriska tumörer för KRAS
förstärkning genom kvantitativ PCR, och undersökte KRAS
förstärkning på DNA, mRNA och proteinnivåer genom mutationsanalys, realtids-PCR, immunoblotanalys, GTP -RAS neddragnings analys och immunohistokemisk analys. Effekten av KRAS
knock-ner på aktiveringen av p44 /42 MAP-kinas och AKT och på celltillväxt undersöktes genom immunoblot och kolorimetrisk analys, respektive.
Resultat
DGS-analys av den HSC45 gastric cancercell linje avslöjade amplifiering av ett 500-kb region på kromosom 12p12.1, som innehåller KRAS
genlocus. Förstärkning av KRAS
locus upptäcktes hos 15% (3/20) av magcancer cellinjer (8-18-faldigt förstärkning) och 4,7% (4/86) av primära gastriska tumörer (8-50-faldig förstärkning ). KRAS
mutationer identifierades i två av de tre cellinjema i vilka KRAS
amplifierades, men detekterades inte i någon av de primära tumörer. Överuttryck av KRAS-proteinet korrelerade direkt med ökade KRAS
kopietal. Nivån av GTP-bundet KRAS upphöjdes efter serumstimulering i celler med amplifierad vildtyp KRAS
, men inte i celler med förstärkt mutant KRAS
. Knock-down av KRAS
i gastric cancerceller som bar förstärkta vildtyp KRAS
resulterade i hämning av celltillväxt och hämning av p44 /42 MAP-kinas och AKT-aktivitet.
Slutsats
Vår studie belyser nyttan av DGS för identifiering av kopietal förändringar. Använda DGS, identifierade vi KRAS
som en gen som förstärks i human magcancer. Vi visade att genamplifiering bildar sannolikt den molekylära grunden för överaktivering av KRAS i magcancer. Ytterligare studier med hjälp av en större kohort av magcancer prover krävs för att fastställa de diagnostiska och terapeutiska effekterna av KRAS
förstärkning och överuttryck.
Bakgrund
Gastric cancer är den tredje vanligaste malignitet påverkar den allmänna befolkningen i världen [1 ]. Specifika genetiska förändringar har rapporterats i magcancer, inklusive förstärkningar av KSAM
, MET Mössor och erbB2
, och mutationer i p53
, APC
och CDH1
[2] . Medan vinst-of-funktion mutationer av KRAS
är några av de vanligaste observerade genetiska förändringar i en mängd olika tumörer, däribland pankreas (60%), gallvägarna (33%) och kolon (32%) [3], dessa mutationer är ovanliga i magcancer (2-7%) [4-7]. I allmänhet, RAS
mutationer associerade med tumörbildning "låsa" RAS i en aktiv GTP-bundet tillstånd. GTP-RAS binder till ett antal effektorceller proteiner för att stimulera nedströms signalvägar, bland vilka RAF-MAP-kinaskaskad och fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K) -AKT vägar av celltillväxt och onkogenes är de bäst karaktäriserade [3]. Långvarig aktivering av RAS kan också ske genom mekanismer som inte involverar mutationer i RAS. Till exempel, minskat uttryck av Let-7 mikroRNA, som undertrycker RAS genom att fokusera på 3'untranslated regionen RAS
mRNA, förknippas ofta med en högre RAS proteinnivå i tumörer [8]. Hittills har de molekylära mekanismerna för onkogen aktivering av RAS i magcancer har inte helt klarlagd.
Förstärkning av genomiska sekvenser som innehåller gener som är kritiska för celltillväxt är en av de främsta mekanismerna för aktivering av onkogener i cancer, och är ofta i samband med tumörprogression, dålig prognos och /eller läkemedelsresistens [9]. Av de många metoder finns för närvarande för att upptäcka kopietal förändringar genomet hela, är den nuvarande guldmyntfoten arrayen CGH-metoden (aCGH). Under de senaste åren har upplösningen av aCGH förbättrats snabbt genom användning av oligonukleotidprober, och har överträffat det av aCGH användning av standard BAC sonder [10]. Emellertid är aCGH också mottagliga för den inneboende buller i hybridiseringsbaserade intensitetsmätningar, eftersom signalkvaliteten påverkas av upprepade sekvenser och är beroende av sond kvalitet [11]. I själva verket har optimering av sond design varit en stor utmaning i utvecklingen av kakel arrayer [12, 13] var
. Digital karyotypering (DK) som utvecklats av Wang et al. [14], och är inte begränsad av de inneboende problemen med arraytekniker. DK innebär den digitala uppräkning av korta fragment av genomiskt DNA (benämnda taggar), vilket ger ett kvantitativt mått på DNA-kopietalet genom taggdensitetsanalys längs varje kromosom. DK har tillämpats med framgång på en mängd olika tumörtyper för att detektera kopietal avvikelser, inklusive amplifiering av Tyms
, RSF1
och OTX2
, och radering av MKK4
och dystrofin
[ ,,,0],15-19]. Trots effektiviteten i DK, är det tekniskt utmanande för breda tillämpningar, eftersom det innebär PCR-amplifiering och generering av taggar av 21-baspar (bp) i längd för att exakt representera kromosomen platsen av intresse.
Vi rapporterar här den utveckling av en ny metod, benämnd DGS, för kvantitativ analys av kopietal variation, som är baserad på taggen räkning begreppet DK, men använder en förenklad process för taggen beredning. DGS för magcancer cellinjer upptäckta förstärkningen av KRAS
locus på kromosom 12p12.1. Våra resultat ger en molekylär grund för överaktivering av KRAS, och tyder på att aktivering av KRAS nedströms signaleringshändelser kan främja magcancer cellproliferation.
Metoder
Cellinjer och vävnader sälja The cellinjer som analyserats i den aktuella studie listas i Ytterligare fil 1. HSC och SH101P4 cellinjer etablerades genom Kazuyoshi Yanagihara [20]; alla andra erhölls från American Type Culture Collection eller japanska Insamling av forsknings bioresurser (Tokyo, Japan). Alla cellinjer odlades i de rekommenderade media. För serumstimulering, inkuberades cellerna i medium som saknade serum under 24 timmar (h), och sedan antingen ostimulerade eller stimulerades under 1 h med media innehållande 10% fetalt kalvserum (FCS). Primära magcancer prover erhölls från Department of Surgery, Keiyukai Sapporo sjukhus, med informerat samtycke från varje patient. Genomiskt DNA extraherades med användning av fenol-kloroform-metoden, följt av RNas behandling. Totalt RNA extraherades med användning av Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), enligt tillverkarens instruktioner. Genomiskt DNA av normala perifera blodleukocyter (BioChain, Hayward, CA, USA) och totalt RNA från normal magslemhinna från friska individer (BioChain och Invitrogen) köptes. Primära gastric cancer klassificerades med hjälp av kliniskt patologiska funktioner, som visas i kompletterande fil 2, enligt pTNM klassificeringssystem (5: e upplagan, 1997) [21] och Laurens klassificeringssystemet [22]. KRAS
-amplification status enligt ålder jämfördes med användning av Students t-test; enligt sort, pT status, pN status och sjukdomsstadium med hjälp av Mann-Whitney U-test; och beroende på kön, histologi och PM status med hjälp av Fisher exakta test. Alla tester 2-tailed, och en P
värde < 0,05 ansågs statistiskt signifikant. Review, Digital genomet skanning
korthet 40 ^ g av genomiskt DNA utsattes för restriktionsenzymdigerering med användning av Mbo
I (Takara, Tokyo, Japan) och separerades sedan genom elektrofores på en 3% NuSieve GTG agarosgel. Korta fragment (30-60 bp, benämnda riktiga taggar) elektroeluerades, sammanlänkade och subklonades in i Bam
Hl-digererad pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) med användning av Mighty Mix DNA ligeringslösning (Takara). Escherichia coli
DH10B transformerades med de rekombinanta plasmider, var transformanterna poolades och plasmid-DNA renades för att generera den 1. Biblioteket. Konkatemerer av riktiga etiketter skars av Spe
I /Pst
I nedbrytnings från 1. Bibliotek och fragment i området 140 till 800 bp elektroeluerades, sammanlänkade och subklonades in i pBluescript II KS + för att generera den 2. Biblioteket. Andra biblioteket plasmider innehållande konkatemerer av Spe
I /Pst
-fragmenten sekvenserades med användning av en ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), enligt tillverkarens instruktioner. Unika riktiga taggar kartlades till humana kromosomsekvenser, och tagg täthet, definieras som förhållandet av verkliga taggar till virtuella taggar över rörliga fönster, beräknades för att detektera abnormiteter i DNA-innehåll med hjälp av tröskelvärden definieras av DGS simuleringar. Tag positioner och tag densitet förhållanden visualiserades med hjälp av Custom Tracks och Genome Grafer från University of California, Santa Cruz (UCSC) genomet webbläsare (mars 2006 frysa, hg18) [23-25]. De detaljerade protokoll för DGS, virtuell tag karaktärisering och in silico
simuleringar finns i kompletterande fil 3.
Kvantitativ realtids-PCR
Relativt DNA kopietalet bestämdes genom kvantitativ realtids-PCR med hjälp av en SYBR Green PCR master Mix (Applied Biosystems) och ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). DNA-innehållet per haploidgenom normaliserades till den hos en repetitiv elementet, Line-1, och beräknas av den jämförande CT (ΔΔCT) relativ kvantifiering metod med hjälp av formeln 2 (Nt
- nline
) - ( xt Omdömen - Xline
), där N
t
tröskelcykelantalet observerades för en experimentell primer i normal leukocyter DNA, är N
linje
tröskelcykelantalet observerades för line-en primer i normal leukocyter DNA, är Xt
det genomsnittliga tröskelcykelantalet observerades för försöks primer i cancercellens DNA och X
linje
är genomsnittligt gränsvärde cykelantalet observerades för Line-en primer i cancercellens DNA [14]. Genomisk amplifiering definierades som en större än 4-faldig ökning av DNA-innehåll. Primersekvenserna för varje locus finns i kompletterande fil 4. allel andelen muterade KRAS
(G12V, GGT → GTT) bestämdes genom att använda en modifierad realtids-PCR-metoden enligt Itabashi et al
[26 ]. Den detaljerat protokoll finns i ytterligare fil 3. cDNA framställdes med användning av Superscript III omvänt transkriptas (RT, Invitrogen), och mRNA-nivån av varje gen bestämdes genom realtids-RT-PCR med användning av TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) . Relativa mRNA-nivåer beräknades genom den jämförande CT-metoden med användning GAPDH
som en endogen kontroll. Primer /probuppsättningar som används visas i kompletterande fil 5.
Fluorescens in situ
hybridisering (FISH) Review BAC som innehöll KRAS
locus (RP11-636P12) och kromosom 12q24.2 (RP11 -91M21) märktes med Cy3 och Cy5, respektive, och sedan inkuberas med bilder som framställts med interfas och metafas kromosomer. Kärnorna motfärgades med 4 ', 6-diamino-2-fenylindol (DAPI), och objektglasen analyserades med användning av ett fluorescensmikroskop (Leica CW-4000).
Mutationsanalys av KRAS
och PIK3CA

Amplified iska fragment antingen sekvens direkt eller klonades med hjälp av TOPO TA-kloningssats (Invitrogen) och därefter sekvenseras. Minst tio kloner från två oberoende PCR-analyser per locus sekvenserades med hjälp av M13 framåt och bakåt primers (Invitrogen). Sekvenserna för de primrar som används för amplifiering av KRAS
(exoner 1 och 2) och PIK3CA
(exonerna 9 och 20) visas i kompletterande fil 6.
Immunoblotanalys
Celler lyserades i Lysis buffert innehållande 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) buffert, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 10% glycerol, 10 mM NaF, 1 mM natriumvanadat, 50 mM β-glycerofosfat, 1 mM phenylmethansulfonyl fluorid , 1 mM ditiotreitol, och en proteasinhibitorcocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). Proteiner separerades genom SDS-PAGE och elektroblottades på ett Immobilon-P-membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Membranen analyserades med immunoblot med användning av följande antikroppar, såsom anges: musmonoklonal anti-KRAS, -NRAS och -HRAS antikroppar (sc-30, sc-31, och SC-29, respektive, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-aktin-antikropp (Millipore); kanin-polyklonal anti-p44 /42 MAP-kinas, -phosho-p44 /42 MAP-kinas (Thr202 /Tyr204), -Akt och -fosfo-Akt (Ser473) antisera (Cell Signa Technology, Danvers, MA, USA).
GTP-RAS neddragningsanalys
aktivering av RAS detekterades med användning av en EZ-Detect Ras Activa Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). I korthet framställdes cellysat (500 ^ g) inkuberades med immobiliserat Raf1 Ras-bindande domän smält till glutation-S-transferas (GST-Raf1-RBD). Fällningarna tvättades 3 gånger, och bundna proteiner eluerades genom kokning i 5 minuter (min). Proteiner löstes på en 12% polyakrylamidgel, överfördes till ett Immobilon-P-membran och utsattes för immunoblotanalys med användning av anti-KRAS, -NRAS, eller -HRAS antikroppar.
RNA-interferens Review, en specialdesignade KRAS
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), inriktning på en region av KRAS
som inte är förknippad med kända onkogena mutationer, syntetiserades av Dharmacon (Lafayette, CO, USA). siRNA riktar LRMP
, LYRM5 Mössor och CASC1
köptes från Ambion (No.144181, 284.911 och 147.715). En universell icke-inriktning siRNA (icke-specifik kontroll VII, Dharmacon) användes som en negativ kontroll. I varje experiment, 5 × 10 6-celler transfekterades med 7,5

• Genomvid antal genkopior och expressionsanalys av primära gastriska tumörer och magcancer cell lines
• Mekanismer för gastro av metanolextrakt av melastoma malabathricum leaves