En ny metode, digital genom scanning registrerer KRAS genamplifikation i gastrisk kræft: inddragelse af overudtrykt vildtype-KRAS i nedstrøms signalering og kræft cellevækst

​​ En ny metode, digital genom scanning registrerer KRAS
genamplifikation i gastrisk kræft: inddragelse af overudtrykt vildtype-KRAS i nedstrøms signalering og kræft cellevækst
Abstract
Baggrund
mavekræft er den tredje mest almindelige malignitet berører den almindelige befolkning i hele verden. Afvigende aktivering af KRAS er en vigtig faktor i udviklingen af ​​mange typer af tumor, dog onkogene mutationer af KRAS
er sjældne i mavekræft. Vi har udviklet en hidtil ukendt kvantitativ fremgangsmåde til analyse af DNA kopital, betegnet digital genom scanning (DGS), som er baseret på tælling af korte restriktionsfragmenter, og involverer ikke PCR eller hybridisering. I den aktuelle undersøgelse anvendte vi DGS til undersøgelse kopital ændringer i gastriske cancerceller. Salg Metoder
DGS af gastriske cancercellelinier blev udført ved anvendelse sekvenserne af 5000 til 15000 restriktionsfragmenter. Vi screenede 20 gastriske cancercellelinier og 86 primære gastriske tumorer for KRAS
amplifikation ved kvantitativ PCR og undersøgt KRAS
amplifikation på DNA, mRNA og protein-niveauer ved mutationsanalyse, real-time PCR, immunoblotanalyse, GTP -RAS pull-down assay og immunhistokemisk analyse. Virkningen af ​​KRAS
knock-down på aktiveringen af ​​p44 /42 MAP-kinase og AKT og på cellevækst blev undersøgt ved immunblot og kolorimetrisk assay, henholdsvis.
Resultater Salg DGS analyse af HSC45 gastrisk cancercellelinie linje afslørede amplifikationen af ​​et 500-kb region på kromosom 12p12.1, som indeholder KRAS
gen locus. Forstærkning af KRAS
locus blev påvist i 15% (3/20) af gastrisk kræft cellelinier (8-18 gange forstærkning) og 4,7% (4/86) af primære gastriske tumorer (8-50 gange forstærkning ). KRAS
mutationer blev identificeret i to af de tre cellelinier, hvor KRAS
blev amplificeret, men blev ikke påvist i nogen af ​​de primære tumorer. Overekspression af KRAS-protein korrelerede direkte med forøgede KRAS
kopital. Niveauet af GTP-bundne KRAS var forhøjet efter serumstimulering i celler med amplificeret vildtype-KRAS
, men ikke i celler med forstærket mutant KRAS
. Knock-down af KRAS
i gastrisk kræftceller, der udføres forstærket vildtype KRAS
resulterede i hæmning af cellevækst og undertrykkelse af P44 /42 MAP-kinase og AKT-aktivitet.
Konklusion
Vores undersøgelse fremhæver nytten af ​​DGS til identifikation af kopi-nummer ændringer. Brug af DGS identificerede vi KRAS
som et gen, der forstærkes i human gastrisk cancer. Vi viste, at genamplifikation sandsynligvis danner det molekylære grundlag for overaktivering af KRAS i gastrisk cancer. Yderligere undersøgelser ved hjælp af en større kohorte af mavekræft prøver er nødvendige for at bestemme de diagnostiske og terapeutiske konsekvenser af KRAS
forstærkning og overekspression.
Baggrund
mavekræft er den tredje mest almindelige malignitet påvirker den almindelige befolkning på verdensplan [1 ]. Der er rapporteret om specifikke genetiske ændringer i gastrisk kræft, herunder amplifikationer af KSAM
, MET
ERBB2
, og mutationer i p53
, APC
, og CDH1
[2] . Mens gain-of-funktion mutationer af KRAS
er nogle af de mest almindeligt observerede genetiske ændringer i en række tumorer, herunder pancreas (60%), galdevejene (33%) og kolon (32%) [3], disse mutationer er sjældne i gastrisk cancer (2-7%) [4-7]. Generelt RAS
mutationer forbundet med tumorigenese "lock" RAS i en aktiv GTP-bundne tilstand. GTP-RAS binder til en række effektorproteiner at stimulere nedstrøms signalveje, blandt hvilke RAF-MAP-kinase kaskade og phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt veje for cellevækst og onkogenese er bedst karakteriseret [3]. Langvarig aktivering af RAS kan også forekomme gennem mekanismer, der ikke involverer mutationer i RAS. For eksempel reduceret ekspression af lad-7 microRNA, der undertrykker RAS ved at målrette den 3'-utranslaterede region af RAS
mRNA'er, er ofte forbundet med en højere RAS proteinniveauet i tumorer [8]. Til dato er de molekylære mekanismer i onkogen aktivering af RAS i gastrisk cancer er ikke blevet fuldstændigt belyst.
Amplifikation af genomiske sekvenser indeholdende gener, der er kritiske for cellevækst er en af ​​de primære mekanismer for aktivering af onkogener i cancer, og er ofte forbundet med tumorprogression, dårlig prognose og /eller medikamentresistens [9]. Af de mange metoder aktuelt tilgængelige til påvisning kopital ændringer hele genomet, den nuværende guldstandarden er matrixen CGH metoden (aCGH). I løbet af de sidste par år, har løsningen af ​​aCGH forbedret hurtigt gennem brug af oligonucleotidprober, og har overgået den af ​​aCGH ved hjælp af standard BAC sonder [10]. Men aCGH er også modtagelige for den iboende støj af hybridiseringsbaserede intensitetsmålinger, da kvaliteten signalet påvirkes af repetitive sekvenser og er afhængig af probe kvalitet [11]. Faktisk har optimering af sonde design været en stor udfordring i udviklingen af ​​flisebelægning arrays [12, 13] blev.
Digital karyotypebestemmelse (DK) er udviklet af Wang et al. [14], og er ikke begrænset af de iboende problemer med array-teknikker. DK involverer digitale tælling af korte fragmenter af genomisk DNA (betegnet tags), hvilket giver en kvantitativ måling af DNA kopital gennem tag densitetsanalyse langs hvert kromosom. DK er blevet anvendt med succes til en lang række tumortyper at detektere copy-nummer ændringer, herunder forstærkning af Tyms
, RSF1
OTX2
, og sletning af MKK4
og dystrofin
[ ,,,0],15-19]. På trods af den effektivitet DK, er det teknisk udfordrende for brede anvendelsesområder, fordi det involverer PCR-amplifikation og generering af tags af 21-basepar (bp) i længde til præcist repræsenterer kromosomet interesseområde.
Vi rapporterer her den udvikling af en ny fremgangsmåde, betegnet DGS, til kvantitativ analyse af kopital variation, som er baseret på tag-optælling begrebet DK, men anvender en forenklet fremgangsmåde til fremstilling tag. DGS af gastrisk kræft cellelinjer opdaget forstærkningen af ​​KRAS
locus på kromosom 12p12.1. Vores resultater giver en molekylær basis for overaktivering af KRAS, og antyder, at aktivering af KRAS nedstrøms signaleringsbegivenheder kan fremme mavekræft celleproliferation. Salg Metoder
cellelinjer og væv
Cellelinjerne analyseret i den aktuelle undersøgelse er opført i supplerende fil 1. HSC og SH101P4 cellelinjer blev oprettet ved Kazuyoshi Yanagihara [20]; alle andre blev opnået fra American Type Culture Collection eller den japanske Indsamling af Research Bioressourcer (Tokyo, Japan). Alle cellelinier blev dyrket i de anbefalede medier. For serum stimulering blev celler inkuberet i medier, der manglede serum i 24 timer (h), og derefter enten ustimuleret eller stimuleret i 1 time med medium indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS). Primære mavekræft prøver blev opnået fra Institut for Kirurgi, Keiyukai Sapporo Hospital, med informeret samtykke fra hver patient. Genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af phenol-chloroform metode efterfulgt af RNase-behandling. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ifølge producentens anvisninger. Genomisk DNA fra normale perifere blodleukocytter (Biochain, Hayward, CA, USA) og totalt RNA fra normale maveslimhinden fra raske individer (Biochain og Invitrogen) blev erhvervet. Primære gastrisk kræft blev klassificeret ved hjælp af klinisk-patologiske træk, som vist i supplerende fil 2, i henhold til ordningen pTNM klassifikation (5. udgave, 1997) [21] og Laurens klassifikationssystem [22]. KRAS
-amplification status efter alder blev sammenlignet ved hjælp af Student t-test; ifølge klasse, pT status PN status, og sygdomsstadie ved anvendelse af Mann-Whitney U test; og efter køn, histologi og pM status ved hjælp af Fisher eksakte test. Alle tests blev 2-sidede, og en P
værdi på < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Digital genom scanning
Kort fortalt 40 ug af genomisk DNA blev underkastet restriktionsenzymfordøjelse ved hjælp Mbol
I (Takara, Tokyo, Japan) og derefter separeret ved elektroforese på en 3% NuSieve GTG agarosegel. Korte fragmenter (30-60 bp, der betegnes virkelige tags) blev elektroelueret, sammenkædet og subklonet ind Bam
HI-fordøjet pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) under anvendelse Mighty Mix DNA ligering opløsning (Takara). Escherichia coli
DH10B blev transformeret med de rekombinante plasmider, blev transformanterne samlet, og plasmid-DNA blev oprenset for at generere den 1. bibliotek. Concatemerer af rigtige tags blev udskåret af Spe
I /Pst
digestion fra 1. bibliotek og fragmenter i området på 140 til 800 bp blev elektroelueret, sammenkædet og subklonet i pBluescript II KS + til frembringelse 2nd bibliotek. Sekundære bibliotek plasmider indeholdende concatemerer af Spe
I /Pst
I-fragmenter blev sekventeret under anvendelse af en ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), ifølge producentens instruktioner. Unikke virkelige tags blev kortlagt til humant kromosom sekvenser, og tag tæthed, defineret som forholdet af reelle mærker til virtuelle tags løbet bevægelige vinduer, blev beregnet til at detektere abnormiteter i DNA-indhold under anvendelse af tærskelværdier defineret af DGS simuleringer. Tag holdninger og forhold tag tæthed blev visualiseret ved hjælp af brugerdefinerede Spor og Genome Grafer fra University of California, Santa Cruz (UCSC) genom browser (marts 2006 fryse, hg18) [23-25]. De detaljerede protokoller for DGS, virtuel tag karakterisering og i silico
simuleringer er tilgængelige i supplerende fil 3.
Kvantitativ realtids-PCR
Relativ DNA kopital blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR under anvendelse af en SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) og ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). DNA-indholdet pr haploide genom blev normaliseret til den for et repetitivt element, Line-1, og beregnet af sammenlignende CT (ΔΔCT) relativ kvantificering metode ved hjælp af formlen 2 (Nt
- nline
) - ( xt
- Xline
), hvor N
t
er tærsklen cyklus nummer observeret for en eksperimentel primer i normal leukocyt DNA, N
line
er tærsklen cyklus nummer observeret for line-1 primer i normal leukocyt DNA, Xt
er den gennemsnitlige tærskel cyklus nummer observeret for den eksperimentelle primer i kræft celle-DNA, og X
line
er gennemsnitlige tærskelcyklus nummer observeret for line-1 primer i cancercellelinie-DNA [14]. Genomisk amplifikation blev defineret som en større end 4 gange stigning i DNA-indhold. Primersekvenserne for hvert locus findes i supplerende fil 4. allele andel af mutante KRAS Salg (G12V, GGT → GTT) blev bestemt ved anvendelse af en modificeret realtids-PCR procedure ifølge Itabashi et al
[26 ]. Den detaljerede protokol er tilgængelig i supplerende fil 3. cDNA blev fremstillet under anvendelse af SuperScript III revers transkriptase (RT, Invitrogen), og mRNA-niveauet af hvert gen blev bestemt ved real-time RT-PCR under anvendelse af TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) . Relative mRNA-niveauer blev beregnet ved den sammenlignende CT metoden under anvendelse af GAPDH
som en endogen kontrol. De primer /probe-sæt, der anvendes, er vist i supplerende fil 5.
Fluorescens in situ
hybridisering (FISH)
AKB, der indeholdt KRAS
locus (RP11-636P12) og kromosom 12q24.2 (RP11 -91M21) blev mærket med Cy3 og Cy5 henholdsvis og derefter inkuberet med lysbilleder fremstillet med interfase og metafase kromosomer. Kerner blev modfarvet med 4 ', 6-diamino-2-phenylindol (DAPI), og objektglassene blev analyseret under anvendelse af et fluorescensmikroskop (Leica CW-4000).
Mutationsanalyse af KRAS
og PIK3CA

Amplified genomiske fragmenter blev enten sekvenseret direkte eller subklonet under anvendelse af TOPO TA-kloning (Invitrogen) og derefter sekventeret. Mindst ti kloner fra to uafhængige PCR-assays pr locus blev sekventeret under anvendelse af M13 Forward og reverse primere (Invitrogen). Sekvenserne af primerne anvendes til amplifikation af KRAS
(exon 1 og 2) og PIK3CA
(exon 9 og 20) er vist i supplerende fil 6.
Immunblotanalyse
Celler blev lyseret i Lysis puffer indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7,5) buffer, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 10% glycerol, 10 mM NaF, 1 mM natriumvanadat, 50 mM β-glycerophosphat, 1 mM phenylmethansulfonyl fluorid , 1 mM dithiothreitol og en proteasehæmmer cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og elektroblottet på en Immobilon-P membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Membranerne blev analyseret ved immunblot under anvendelse af de følgende antistoffer, som anført: monoklonalt muse-anti-KRAS, -NRAS, og -HRAS antistoffer (sc-30, SC-31, og sc-29 henholdsvis Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-actin-antistof (Millipore); kanin polyklonalt anti-p44 /42 MAP kinase, -phosho-p44 /42 MAP kinase (Thr202 /Tyr204), -Akt og -phospho-Akt (Ser473) antisera (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA).
GTP-RAS pull-down assay
aktiveringen af ​​RAS blev detekteret under anvendelse af en EZ-Detect Ras Activation Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Kort fortalt blev cellelysat (500 ug) inkuberet med immobiliseret Raf1 Ras-bindende domæne fusioneret til glutathion S-transferase (GST-Raf1-RBD). Bundfald blev vasket 3 gange, og bundne proteiner blev elueret ved kogning i 5 minutter (min). Proteiner blev opløst på en 12% polyacrylamidgel, overført til en Immobilon-P membran, og underkastet immunoblotanalyse under anvendelse af anti-KRAS, -NRAS, eller -HRAS antistoffer.
RNA-interferens
En specialdesignet KRAS
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), rettet mod en region af KRAS
som ikke er forbundet med kendte onkogene mutationer, blev syntetiseret ved Dharmacon (Lafayette, Co, USA). siRNA'er rettet LRMP
, LYRM5
CASC1
blev købt fra Ambion (No.144181, 284.911 og 147.715). En universel ikke-targeting siRNA (ikke-specifik kontrol VII, Dharmacon) blev anvendt som en negativ kontrol. I hvert forsøg 5 × 10 6 celler blev transficeret med 7,5 pi 20 pM siRNA ved elektroporering (Amaxa, Köln, Tyskland) under anvendelse Nucleofector kit V eller T, ifølge producentens instruktioner.
Celleproliferationsassay
Efter transfektion med siRNA'er, mavens cancercellelinier HSC45, MKN1, AGS og NUGC4 blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 8000 celler /100 pi i standardmedium indeholdende 10% FCS. Celletal på 48, 72 og 96 h efter transfektion blev bestemt indirekte ved kolorimetrisk assay under anvendelse af celle Counting Kit-8-opløsning (Dojindo, Kumamoto, Japan). Bestemmelsen er baseret på reduktion af et tetrazoliumsalt ([2- (2-methoxy-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2-tetrazolium, mononatriumsalt], WST -8) og anvendes som et mål for levende celler. Absorbansen af ​​hver brønd ved 450 nm blev målt under anvendelse af en mikropladelæser (model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Flowcytometri
Flowcytometri blev udført som tidligere [27] beskrevne. Kort fortalt blev adhærente og løsnede celler høstet, fikseret i 90% kold ethanol, behandlet med RNase A (500 enheder /ml), og derefter farvet med propidiumiodid (50 ug /ml). For hver prøve blev 30000 begivenheder analyseret ved hjælp cellecyklus analyse platform FlowJo program (Tree stjerne, Ashland, OR, USA).
Immunhistokemi
formalin-fikseret, paraffinindlejrede sektioner af gastriske tumorer blev deparaffineret, hydreret og derefter behandlet med peroxidase blokerende opløsning (3% H 2O 2 i methanol). Snit blev autoklaveret ved 105 ° C i 10 minutter i Target Retrieval Solution (Dako, Glostrup, Danmark). Snit blev inkuberet med et muse anti-KRAS-antistof. (1: 100 fortynding; Santa Cruz Biotechnology) i 1 time ved stuetemperatur, og immunoreaktivitet blev påvist under anvendelse ENVISION-Plus reagenser (Dako)
Resultater Salg Digital genom scanning og karakterisering af virtuelle tags i silico
Digital genom scanning (DGS) er en metode til kvantificering af genkopital ved direkte at nævne korte genomiske DNA-fragmenter (betegnet reelle tags), der genereres eksperimentelt ved Mbol
i endonucleasefordøjelse (figur 1a). For at eliminere de komplicerede trin i fremstillingen tag, vi beregningsmæssigt kendetegnet de korte DNA-fragmenter, der er produceret af enkelt restriktionsenzymfordøjelse med Mbo
I, som genkender 4-bp sekvens GATC. In silico
fordøjelse af det humane genom ved Mbol
Jeg produceret ca. 1,6 millioner restriktionsfragmenter (betegnet virtuelle tags) i området 20-130 bp (Supplerende fil 7a). Nukleotidsekvensanalyse afslørede, at ca. 65% af de virtuelle tags indeholdt repetitive sekvenser, som defineret i den offentlige database af gentagne elementer (Supplerende fil 7a). Vigtigere, sekvens matcher til det humane genom databasen viste, at ca. 85% af de virtuelle tags kortlagt entydigt til præcis kromosomal steder (Supplerende fil 7b, c). Selv om de virtuelle mærker inkluderer repetitive sekvenser i en del, ca 80% af de repetitive tags viste sig at være unik. Den gennemsnitlige afstand mellem to unikke virtuelle tags af 30 til 60 bp i længde var 7,6 kb, median afstand var 4,5 kb og 97,8% af intervaller var kortere end 30 kb (Supplerende fil 7d). Lignende tag interval karakteristika blev observeret for virtuelle tags området fra 70 til 100 bp (gennemsnitlig afstand, 7,9 kb; median afstand, 4,8 kb; 97,4% var kortere end 30 kb), og 100 til 130 bp (gennemsnitlig afstand, 7,9 kb; median afstand, 4,9 kb;.. 97,4% var kortere end 30 kb (Ekstra fil 7e, f) Desuden tætheden af ​​unikke virtuelle tags var næsten ens i hvert kromosom (Ekstra fil 7g) Disse i silico
resultater viste, at størstedelen af ​​korte Mbo
i tags ville være oplysende for DGS. Figur 1 DGS og udarbejdelse af reelle tags. (a) Skematisk oversigt over DGS. Farvede kasser repræsenterer genomisk Mbo
i reelle tags. Se teksten for detaljer. (b og c) Fremstilling (b) og karakterisering (c) af reelle tags. Repræsentative resultater under anvendelse af genomisk DNA fra MKN1 gastrisk cancerceller er vist. (b) Korte fragmenter af Mbol
i-spaltet genomisk DNA (30 til 60 bp) blev elektroelueret fra en agarosegel (i), sammenkædet og subklonet. Resulterende rekombinante plasmider blev samlet til frembringelse af 1st bibliotek (ii). Lange concatemerer (140 til 800 bp) blev udskåret fra 1st bibliotek vektorer, elektroelueret (iii), sammenkædet og subklonet. De resulterende rekombinante plasmider repræsenterer 2. bibliotek kloner (iv). Antallet af mærker indeholdt i hver klon er vist i toppen af ​​hver bane. Indsætter blev undersøgt af Xho
I /Sac
jeg fordøjelse i paneler (ii) og (iv). *, vektorfragmenter; **, Spe
I /Pst
jeg fordøjelse af multiple-kloningsstedet uden indsats. (C) Det faktiske antal reelle tags fra 2. bibliotek vises i histogrammet (til venstre), og deres karakteristika er sammenfattet (til højre).
DGS simulering i silico
evne DGS at opdage genom -dækkende ændringer er baseret på genom egenskaber, såsom kopitallet og størrelsen af ​​ændringen, og antallet af reelle tags opnået fra sekvensanalyse. At forudsige størrelsen af ​​ændring, der kunne pålideligt detekteres, givet et fast antal tags beregningsmæssigt i stikprøven, anvendte vi Monte Carlo simulation at beregne en positiv prædiktiv værdi (PPV), som er sandsynligheden for, at en detekteret ændring repræsenterer en sand ændring. For eksempel fandt vi, at en analyse af 5000 tags pålideligt kunne registrere en 10-fold forstærkning på 500 kb, en homozygot deletion på 7,5 Mb, eller et enkelt tab af en 30 Mb region kopi, men kunne ikke finde en subkromosomal vinde mindre end 30 Mb (Ekstra fil 8). Både følsomheden og specificiteten af ​​detektering disse typer af ændringer var > 99% i tilfælde med høje PPVs (> 90%)., Hvilket indikerede, at hverken var en begrænsende faktor i denne analyse (data ikke vist)
Fremstilling af virkelige tags fra human genomisk DNA Hus til DGS af mavens cancercellelinier HSC45 og MKN1 fremstillede vi biblioteker af rigtige tags fra genomisk DNA, som vist i figur 1a. MBO
I-fordøjet genomisk DNA blev størrelsesfraktioneret (30-60 bp) og underkastet concatemerization, efterfulgt af konstruktion af en 2. bibliotek, der indeholdt ca. 10 reelle tags pr klon (figur 1b). Nukleotidsekvensanalyse af de reelle tags afslørede, at 85,8% kortlagt til unikke positioner, hvilket var i overensstemmelse med vores karakteriseringen af ​​virtuelle tags (figur 1c).
Amplifikationer på kromosom 12p i HSC45 gastrisk cancerceller
hele genomet tag densitet profil HSC45 celler blev bestemt under anvendelse af i alt 5.462 unikke reelle tags. At opnå høj opløsning og følsomhed med de eksperimentelle data, vi brugt vinduesstørrelser på 1000 og 2100 virtuelle tags (2300 kb og 4700 kb) til analyse af amplifikationer og deletioner, hhv. Koden tæthed forholdet blev beregnet som summen af ​​reelle tags divideret med det gennemsnitlige antal rigtige tags i samme størrelse vinduer i hele genomet, hvor den normale tag densitetsforhold blev defineret som 1,0. Vi identificerede distinkte subkromosomale områder med forøget tag massefylde ved 8q24.21, 12p12.1 og 12p13.33 og nedsat tag massefylde ved 9p21.3 og den lange arm af kromosom 18 (figur 2, Supplerende fil 9a-d). Regionerne øget tag densitet (12p12.1, 12p13.33 og 8q24.21) indeholdt KRAS
, CACNA1C
(calcium-kanal, spændingsafhængige, l type, alfa-1c subunit) og MYC
loci hhv. Southern blot analyse bekræftede, at KRAS
MYC
blev opformeret i HSC45 celler (Ekstra fil 9e). Hver kvantificeret kopital ændring som bestemt ud fra kvantitativ realtids-PCR (qPCR) af genomisk DNA var bemærkelsesværdigt svarende til den anslås af DGS når vinduet størrelse for tag density analyse blev matchet til størrelsen af ​​hver ændring (Supplerende fil 9a-d ). Disse resultater antyder, at tag density analyse ved DGS kunne anvendes til at udføre kopital analyse hele det humane genom. Figur 2 Påvisning af øget kopi nummer på kromosomer 8q og 12p ved DGS i HSC45 gastrisk kræftceller. (A) en hel-genom visning af tag densitetsforhold (ved hjælp af et vindue på 1000 virtuelle tags) i HSC45 celler som bestemt ved DGS. Værdier på y-aksen angiver fold-ændring i tag densitet i forhold til den gennemsnitlige tag tæthed af hele genomet, og repræsenterer DNA-indhold pr haploide genom, i vinduer. X-aksen repræsenterer kromosom nummer. (B og c) Udvidet visning af nøgletal tag massefylde på kromosomerne 8 (b) og 12 (c). I hvert panel, den øverste graf viser en hel-kromosom visning af tag densitetsforhold (baseret på et vindue på 1000 virtuelle tags). Den nederste graf viser en udvidet visning af 8q24.21 og 12p12.1, hvor øget tag tæthed blev detekteret ved anvendelse vinduer af 1000 og 500 virtuelle tags. Unikke reelle tags er angivet som sorte lodrette stænger, og unikke virtuelle tags er angivet i blå (60 bp eller kortere) eller lyseblå (længere end 60 bp) barer i tæt tilstand. Positionerne af refseq gener, med nogle splejsnings- isoformer udeladt, er vist nederst i de nedre paneler.
Amplifikation af KRAS
i gastrisk cancer cellelinjer
Analyse af 26 loci inden og umiddelbart flankerende kromosom 12p12. 1 i HSC45 celler ved qPCR vist, at en region på ca. 500 kb, som omfattede KRAS
gen locus, blev amplificeret (8-fold amplifikation, figur 3a). Genomisk qPCR screening detekterede KRAS
amplifikation i to yderligere gastriske cancercellelinier, SH101P4 (18 gange) og MKN1 (13 gange) (figur 3a), mens vi ikke påvise amplificering af mere end 4 gange i 17 andre gastrisk cancer cellelinjer, eller i 10 tyktarmskræft og 11 bugspytkirtelkræft cellelinier (opført i supplerende fil 1, data ikke vist). DGS opdaget også forstærkning af KRAS
locus i MKN1 celler (ekstra fil 10). De omkringliggende gener af KRAS
i den minimale amplikon var LRMP
(lymfoide-begrænset membranprotein), CASC1
(kræft modtagelighed kandidat 1) og LYRM5
(LYR motiv indeholdende 5). BCAT1
(forgrenet aminotransferase 1, cytosolisk) blev også amplificeret i SH101P4 og MKN1 celler, men ikke i HSC45 celler. Vi bekræftede, at CACNA1C
blev forstærket i HSC45 celler, men ikke i de andre gastrisk, colon eller kræft i bugspytkirtlen cellelinjer ved hjælp af genomisk qPCR-analyse (Ekstra fil 9b, data ikke vist). Hverken de nationale tilsynsmyndigheder
, HRAS
heller BRAF
amplifikationer blev påvist i ovenstående cancer cellelinier ved genomisk qPCR-analyse (data ikke vist). Forstærkningen af ​​KRAS
blev også bekræftet af dobbelt farve FISH-analyse, hvor KRAS
amplikon var tydeligt som en homogent-farvet region i HSC45, SH101P4 og MKN1 celler (figur 3b). Figur 3 Genamplifikation af KRAS i gastriske cancerceller. (A) Kvantitativ genomisk PCR-analyse af de KRAS
locus på 12p12.1 i HSC45 celler. Diskrete amplifikationer på 12p12.1 i to andre gastrisk cancer cellelinjer blev også påvist (SH101P4 og MKN1). DNA kopital i forhold til normal diploid leukocyt DNA blev plottet mod kromosomale nukleotidposition (i megabaser). Positionerne af refseq gener i de tilsvarende regioner er vist i den nederste kort. Den mindste amplifikation region er fælles for alle 3 gastriske cancercellelinier er repræsenteret ved den orangefarvede bar. (B) Metafase (venstre) - og interfase (højre) -Fisk analyse af de amplificerede KRAS
locus i gastriske cancercellelinier. KRAS
-specifik sonden er i gul, og kontrollen probe, der er specifik for den lange arm af kromosom 12, er i rødt. Tetraploidy i HSC45 og triploidy i SH101P4 og MKN1 celler blev observeret. (C) kvantitativ real-time RT-PCR-analyse af KRAS
mRNA-ekspression i gastriske cancerceller med 12p12.1 amplifikation. Expression analyse af gener (KRAS, LRMP, CASC1
og LYRM5
) beliggende inden for minimal amplikon, og BCAT1
, som flankerer den minimale amplikon, blev udført ved hjælp af real-time RT-PCR. Ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH
mRNA, og er afbildet som en farveovergang, i forhold til normal mave. Genet amplifikation og mutation (kodon 12 eller 13) status KRAS
for hver prøve er sammenfattet i de højre to kolonner. Udfyldte cirkler indikerer tilstedeværelsen af ​​forstærkning eller mutation af KRAS
, og åbne cirkler indikerer ingen forstærkning eller ingen mutation af KRAS
.
Sekvensanalyse af KRAS
(Ekstra fil 11a) viste, at både HSC45 og SH101P4 celler nærede en mutation i codon 12, der resulterede i en enkelt aminosyre substitution i KRAS (GGT → GTT, G12V), mens MKN1 celler manglede KRAS
mutationer. Tilstedeværelsen af ​​KRAS
mutationer i AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) og HCT116 (G13D) celler har tidligere [28, 29] blevet rapporteret. Af de ti PCR-kloner af KRAS
fra HSC45 og SH101P4 celler, der blev udsat for mutationsanalyse, otte og tre henholdsvis nærede mutationer i codon 12. Endvidere genomisk realtids-PCR-analyse under anvendelse af prober, der var specifikke for vildtype -type og mutant KRAS
alleler (Ekstra fil 11b) viste også, at HSC45 og SH101P4 celler indeholder forskellige andele af den mutante allel (80% og 50%, henholdsvis). Samlet set har disse resultater viste, at amplifikation af en mutant KRAS Salg allel forekommer også i HSC45 og SH101P4 celler.
Derefter undersøgte vi niveauerne af KRAS
mRNA i KRAS
-amplified gastriske cancerceller ved kvantitativ real -tid RT-PCR (QRT-PCR) (figur 3c). Niveauerne af KRAS
mRNA korreleret signifikant med KRAS
kopi nummer. De omkringliggende gener LYRM5
og CASC1
, der lokaliseret til den minimale amplikon, blev også udtrykt på højere niveauer i celler med forstærkning i forhold til celler uden forstærkning (figur 3c). Interessant, LRMP
blev nedreguleret i cancerceller sammenlignet med normale mave celler. Immunoblotanalyse af RAS-proteiner (figur 4A) afslørede, at ekspressionen af ​​KRAS blev øget i KRAS
-amplified gastriske cancerceller (HSC45, SH101P4 og MKN1), mens hverken NTM eller HRAS blev højt udtrykt (figur 4A; data ikke vist ). Selvom ekspression af lad-7c og lad-7g microRNA er blevet rapporteret til at regulere RAS udtryk [8], fandt vi lidt korrelation mellem ekspressionen af ​​disse microRNA med KRAS protein niveauer (Ekstra fil 12), som foreslog, at KRAS overekspression i gastrisk kræft cellelinjer skyldes primært genomisk forstærkning af KRAS
. Figur 4 Overekspression af KRAS, og differentieret aktivering af KRAS, P44 /42 MAP-kinase og AKT i KRAS -amplified gastrisk kræftceller. (A) Immunoblotanalyse af ekspressionsniveauerne af KRAS og NTM cancerceller. Actin ekspression blev analyseret som en loading kontrol. (B) Det basale niveau af GTP-KRAS var markant høj i gastrisk cancer celler med amplificeret mutant KRAS Salg (HSC45 og SH101P4). Samlede lysat (500 ug) blev underkastet en GTP-RAS pull-down assay og GTP-KRAS og GTP-NTM blev påvist ved immunoblot ved anvendelse af anti-KRAS og anti-NTM antistoffer hhv. Samlede cellelysat (50 ug) blev analyseret parallelt at bestemme niveauet af ekspression af KRAS og NTM i celler. (C) GTP-KRAS blev forhøjet efter serum stimulering i MKN1 celler. Celler blev dyrket i regelmæssig medium indeholdende 10% FCS (N), serum-udsultet i 24 timer (-) eller serumudsultede derefter stimuleret med 10% FCS i 1 time (+). Totalt cellelysat blev udsat for en GTP-KRAS pull-down assay. (D) Aktivering af P44 /42 MAP-kinase og AKT i serum-sultede eller -stimulerede gastriske kræftceller. Totalt cellelysat blev analyseret som beskrevet for Figur C.

• Genom-dækkende genkopital og udtryk analyse af primære gastriske tumorer og mavekræft celle lines
• Mekanismer af gastrobeskyttelse methanol ekstrakt af Melastoma malabathricum blade