Nova metoda, digitalno skeniranje genom otkriva KRAS gena pojačanje u želučanog karcinoma: Uključenost prekomjerno izražen divljeg tipa Kraš u nizvodnom signalizacije i stanica raka growth

novi postupak, digitalno skeniranje genom otkriva Kraš pregled gena pojačanje u želučanog karcinoma: sudjelovanje prekomjerno izražen divlji tip KRAS u nizvodno rastu signalno stanica raka
apstraktne pregled pozadine
rak želuca je treći najčešći zloćudni tumor koji utječe na opću populaciju u svijetu. Netipična aktivacija Kraš je ključni faktor u razvoju mnogih vrsta tumora, međutim, onkogeni mutacije KRAS pregled su rijetki kod raka želuca. Mi smo razvili novu kvantitativnu metodu analize broja DNK kopija, nazvao digitalnu skeniranje genoma (DG), koja se temelji na popisivanju kratkih restrikcijskih fragmenata, i ne uključuju PCR ili hibridizaciju. U trenutnoj studiji, koristili smo DGS pregledati copy-broj promjene u želučane stanice raka.
Metode pregled DGS želučanih staničnim linijama karcinoma izvedena je pomoću sekvence 5000 do 15000 restrikcijskih fragmenata. prikazan smo 20 želučanog raka stanične linije i 86 osnovnih želučanih tumora za Kraš pregled amplifikacije od kvantitativnog PCR i istražuju Kraš
pojačanje na DNK, mRNA i proteina razini da bi se mutacije analizu, real-time PCR, analiza imunoblot, GTP ras pull-down test i imunohistokemijska analiza. Učinak Kraša
knock-down o aktivaciji P44 /42 MAP kinaze i AKT i na rast stanica je ispitana je pomoću imunoblota i kolorimetrijski, redom. Rezultati pregled
DGS analize HSC45 želučanog stanici raka linija otkrila pojačanje od 500 kb regije na kromosomu 12p12.1, koji sadrži Kraš pregled genski lokus. Pojačanje Kraš pregled lokusa otkriven je u 15% (3/20) želučanog karcinoma staničnih linija (8-18 puta pojačanje) i 4,7% (4/86) od primarnih želučanih tumora (8-50 puta pojačanje ). Kraš pregled mutacije identificirane u dvije od tri stanične linije na kojoj Krasu pregled je pojačan, ali nije bilo uočeno u bilo kojem od primarnih tumora. Prekomjerna ekspresija Kraš proteina povezana izravno s povećanim Kraš
broju kopija. Razina GTP vezanog Kraš je povišen nakon stimulacije u serumu u stanicama s pojačanim divljeg tipa Kraš Netlogu, ali ne u stanicama s umnoženi mutanta Kraš Netlogu. Knock-down Kraša pregled u želučanih stanica raka koje su nosile pojačan divljeg tipa Kraš pregled rezultat inhibiciju rasta stanica i suzbijanje P44 /42 MAP kinaze i AKT aktivnosti. Pregled Zaključak
naše studije naglašava korisnost DGS za identifikaciju copy-broj promjena. Koristeći DGS, utvrdili smo Kraš
kao gen koji je pojačan u ljudskoj raka želuca. Pokazali smo da je gen pojačanje vjerojatno čini molekularne osnove hiperaktivaciji Kras u raka želuca. Dodatne studije koje koriste veću skupinu želučanog uzoraka raka su potrebni kako bi se utvrdilo dijagnostičke i terapijske implikacije Kraša pregled pojačanja i pojačane ekspresije. Pregled Pozadina pregled, raka želuca je treći najčešći zloćudni tumor koji utječe na opću populaciju u svijetu [1 ]. Specifične genetske promjene zabilježene su kod raka želuca, uključujući i pojačanja iz KSAM Netlogu sastali
i erbB2 Netlogu te mutacije u p53 Netlogu, APC Netlogu i CDH1 pregled [2] , Dok dobitak-of-funkcije mutacije KRAS pregled su neke od najčešće promatrana genetske promjene u različitim tumorima, uključujući i pankreasa (60%), bilijarnog trakta (33%) i debelog crijeva (32%) [3], ove mutacije su rijetke kod raka želuca (2-7%), [4-7]. Općenito, Ras
mutacije povezane s tumorigenezi "zaključati" RAS u aktivnom GTP-bound države. GTP-RAS veže na broj efektorskim proteinima stimulirati nizvodno signalne putove, od kojih je RAF-MAP kinaza kaskade i fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K) -AKT putovi staničnog rasta i onkogenezom se najbolje karakterizira [3]. Dugotrajno aktivacija RAS također može pojaviti kroz mehanizme koji ne uključuju mutacije u RAS. Na primjer, smanjenje ekspresije omogućuju-7 mikroRNA, koji suprimiraju RAS ciljanjem 3 'netranslatirano područje Ras
mRNA, često povezan s višom razinom RAS proteina u tumorima [8]. Do sada, molekularni mehanizmi onkogenim aktivaciji ras u raka želuca nisu potpuno razjašnjeni. Pregled pojačavanje genomske sekvence sadrže gene koji su ključni za rast stanica je jedan od primarnih mehanziama aktiviranja onkogena u karcinoma, te je često povezan s progresijom tumora, lošom prognozom i /ili otpornosti na lijekove [9]. Od brojnih metoda koje se trenutno na raspolaganju za otkrivanje broj kopija promjene genoma svijeta, trenutni zlatni standard je niz CGH metoda (aCGH). Tijekom posljednjih nekoliko godina, u rješavanju aCGH naglo poboljšala kroz korištenje oligonukleotidnih sondi, te je nadišla onu aCGH koristeći standardne BAC probi [10]. Međutim, aCGH je također osjetljiv na inherentne buke mjerenja intenziteta hibridizacije bazi, kao što je kvaliteta signala utječe ponavljaju sekvencama i ovisi o kvaliteti sonda [11]. U stvari, optimizacija sonde dizajn je bio veliki izazov u razvoju pločica polja [12, 13]. Pregled, digitalni karyotyping (DK) je razvijen od strane Wang et al. [14] i nije ograničena inherentnih problema array tehnike. Ne zna uključuje digitalni nabrajanje kratkih fragmenata genomske DNA (tzv oznake), pod uvjetom da kvantitativno mjerenje broja DNK kopija kroz tag analiza gustoće uz svaki kromosom. DK je uspješno primijeniti na različitim vrstama tumora za otkrivanje copy-brojčane promjene, uključujući pojačanje TYMS Netlogu, RSF1 Netlogu i OTX2
i brisanje MKK4 Netlogu i distrofin Netlogu [ ,,,0],15-19]. Unatoč učinkovitosti DK, to je tehnički izazov za široke primjene, jer uključuje PCR amplifikacije i generiranje oznaka 21-parova baza (bp) u dužini precizno predstavljaju položaj kromosoma interesa.
Prijavljujemo ovdje razvoj metoda roman, nazvan DGS, za kvantitativnu analizu broj kopija varijacije, koja se temelji na konceptu tag-prebrojavanja DK, ali koristi pojednostavljeni postupak pripreme tag. DGS želučanih staničnim linijama karcinoma otkrije pojačanje Kraš
lokus na kromosomu 12p12.1. Naši rezultati pružaju molekularna osnova za hiperaktivaciji Kraš, i sugeriraju da aktivacija Kraš nizvodno signalnih događaja može promovirati želučane proliferaciju stanica raka.
Metode pregled Stanične linije i tkiva
stanične linije su analizirani u struji istraživanje su navedeni u dodatne datotečne 1. HSC i SH101P4 stanične linije su postavljene od strane Kazuyoshi Yanagihara [20]; svi ostali su dobivene od American Type Culture Collection, ili japanske zbirke Research Bioresources (Tokyo, Japan). Sve stanične linije uzgojene su u preporučenim medijima. Za stimulaciju seruma, stanice su bile inkubirane u mediju koji nisu sadržavali serum na 24 sati (h), a potom bilo nestimulirana ili stimulirane 1 h s medijem koji je sadržavao 10% fetalnog telećeg seruma (FCS). Primarni želučani uzoraka raka dobiveni su iz Odjela za kirurgiju Keiyukai Sapporo bolnici, uz informirani pristanak od svakog pacijenta. Genomska DNK je ekstrahirana primjenom metode fenol-kloroform, zatim obradom RNazom. Ukupna RNA je ekstrahirana pomoću Trizola (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), u skladu s uputama proizvođača. Genomska DNA normalnih leukocita periferne krvi (Biochain, Hayward, Kalifornija, SAD), a ukupna RNA iz normalne sluznice želuca od zdravih pojedinaca (Biochain i Invitrogen) su kupljeni. Primarni želučani karcinom su klasificirani pomoću kliničkopatološka značajke, kao što je prikazano na dodatne datotečne 2, prema shemi pTNM klasifikacije (5. izdanje, 1997) [21] i Laurenov klasifikacijskog sustava [22]. Kraš
-amplification status s obzirom na dob uspoređena je korištenjem Student t-test; prema razredu, status PT, status PN i stadiju bolesti pomoću Mann-Whitney U test; a prema spolu, histologiju i PM statusa pomoću Fisher točan test. Svi testovi su dva kraka, a P pregled vrijednost < 0.05 se smatra statistički signifikantnim. Pregled digitalnog genom skeniranje
Ukratko, 40 ug genomne DNA podvrgava restrikcijskim enzimima koristeći MBO pregled I (Takara, Tokyo, Japan), a zatim odvojeni elektroforezom na 3% Nusieve GTG agarozni gel. Kratki fragmenti (30-60 bp, nazvao stvarne oznake) su electroeluted, spojene i subkloniran u Bam
HI-digested pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) koristeći moćni Mix DNA rješenje podvezivanja (Takara). Escherichia coli DH10B pregled su transformirane rekombinantnim plazmida, Transformanti su skupljeni i plazmidna DNK je pročišćena generirati 1. knjižnice. Concatemers realnih oznake su izdvojeni po Spe
I /PST pregled, ja probavu iz 1. biblioteci, a fragmenti u rasponu od 140 do 800 bp su electroeluted, spojene i subkloniran u pBluescript II KS + generirati 2. knjižnicu. Druga biblioteka plazmidi koji sadrže concatemers od Spe
I /Pst pregled I fragmenti su sekvencirani pomoću ABI3130 genetski Analyzer (tnom City, CA, USA), u skladu s uputama proizvođača. Jedinstveni stvarni oznake su mapirani na ljudskom kromosomu sekvenci, a gustoća oznaka, definirana kao omjer stvarnih oznake na virtualni oznake preko premještanja prozora, izračunat je za otkrivanje abnormalnosti u sadržaju DNA pomoću granične vrijednosti definirane DGS simulacije. Tag pozicije i omjeri gustoće oznaka su vizualizirani pomoću prilagođene pjesme i genoma grafova na Sveučilištu u Kaliforniji, Santa Cruz (UCSC) genoma preglednika (ožujak 2006, zamrzavanjem, hg18) [23-25]. Detaljni protokoli za DGS, virtualni tag karakterizaciju i kompjutora pregled simulacije su dostupni u dodatnoj datoteci 3. pregled Kvantitativna realnom vremenu PCR pregled Relativan broj DNK kopija je određena kvantitativnom realnom vremenu PCR korištenjem SYBR Green PCR glavne smjese (Applied Biosystems) i ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). Sadržaj DNA po haploidne genoma je normaliziran na koji je ponavljajući element Line-1, a izračunata komparativne CT (ΔΔCT) relativna metoda kvantifikacije pomoću formule 2 (Nt pregled - Nline pregled) - ( Xt pregled - Xline pregled), gdje je N pregled t pregled je broj prag ciklusa praćen eksperimentalnoj početnica u normalnom leukocita DNK, A pregled linija pregled je broj prag ciklusa zabilježena za Line-1 početnica u normalnom leukocita DNK, Xt pregled je prosječan broj prag ciklusa praćen eksperimentalnom početnica u stanice raka DNK, i X pregled, linija pregled je prosječan broj prag ciklusa zabilježena za Line-1 početnica u stanice raka DNA [14]. Genomska amplifikacija je definirana kao više od 4-struko povećanje sadržaja DNA. Nizovi primera za svaki lokusa koji su dostupni u dodatne datoteke 4. alelne udio mutiranih Kraša
(G12V, ggt → GTT) je određena korištenjem modificirane u realnom vremenu PCR postupkom prema Itabashi sur pregled [26 ]. Detaljan protokol je dostupan u dodatne datoteke 3. cDNA je pripremljena pomoću Superscript III reverzne transkriptaze (RT, Invitrogen), te je razina mRNA svakog gena određuje se u realnom vremenu RT-PCR pomoću TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) , Relativna razina mRNA su izračunate iz komparativne CT metodom koristeći GAPDH pregled kao endogeni kontrolom. Na primer /sonda postavlja se koriste prikazana su dodatne datotečne 5.
fluorescentne in situ hibridizacije (FISH pregled)
BACs koji su sadržavali Kraš pregled lokusa (RP11-636P12) i kromosomski 12q24.2 (RP11 -91M21) obilježene su s Cy3 i Cy5, odnosno, i zatim inkubirane s pločice pripremljene s međufaznim i metafazi kromosoma. Jezgre su protu-obojenu s 4 ', 6-diamino-2-fenilindolom (DAPI) i objektna stakalca su analizirani pomoću fluorescencijskog mikroskopa (Leica CW-4000). Pregled Mutationalna analiza KRAS pregled i PIK3CA
pregled genomske amplificirani fragmenti su sekvencirani direktno ili ili subklonirana korištenjem kompleta TOPO TA-kloniranja (Invitrogen) i zatim sekvencirano. Najmanje deset klonova iz dva neovisna pokusa PCR po lokusu su sekvencirane koristeći M13 napredne i reverzne početnice (Invitrogen). Sekvence prajmera koristiti za amplifikaciju Kras pregled (eksona 1 i 2) i PIK3CA pregled (eksoni 9 i 20) prikazana su dodatne datoteke 6. pregled imunoblot analiza pregled Stanice su lizirane u Lysis pufer koji sadrži 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) pufera, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 10% glicerol, 10 mM NaF, 1 mM natrijev vanadat, 50 mM β-glicerofosfat, 1 mM phenylmethansulfonyl fluorida , 1 mM ditiotreitola, te koktel proteaznog inhibitora (Roche, Mannheim, Njemačka). Proteini su odvojeni pomoću SDS-PAGE i elektroblotiran na imobilon-P membrane (Millipore, Billerica, MA, USA). Membrane su analizirani imunoblotom pomoću sljedećih antitijela, kao što je prikazano: mišjim monoklonskim anti-Krasu -NR i -HRAS antitijela (sc-30, SC-31, i SC-29, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-aktin antitijelo (Millipore); zečji poliklonski anti-P44 /42 MAP kinaze, -phosho-P44 /42 MAP kinaza (Thr202 /Tyr204) -Akt i -phospho-Akt (Ser473) antiserum (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). pregled GTP-RAS padajući test pregled aktivaciji ras je otkriven pomoću EZ-Detect Ras aktivaciju Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Ukratko, stanični lizat (500 ug) se inkubira s imobiliziranim Raf1 Ras-vezne domene fuzioniranog na glutation S-transferaze (GST-Raf1-RBD). Talozi su isprane 3 puta, a vezani proteini eluirani kuhanjem tijekom 5 minuta (min). Proteini se mogu razdvojiti na 12% poliakrilamid gelu, prebaci na Immobilon-P membranu, i podvrgnut imunoblot analizom korištenjem anti-KRAS, -NR, ili -HRAS antitijela. Pregled RNA interferencije
običaj-dizajniran Kraš
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), ciljanje regiju Kraš pregled koji nije povezan s poznatim onkogenih mutacija, sintetiziranje Dharmacon (Lafayette, CO, USA). siRNA ciljanja LRMP
, LYRM5
i CASC1 pregled su kupili od Ambion (No.144181, 284911 i 147715). Univerzalni ne ciljaju siRNA (nespecifično kontrolu VII, Dharmacon) je korišten kao negativna kontrola. U svakom eksperimentu, 5 × 10 6 stanice su transfektirane sa 7,5 ul 20 uM siRNA elektroporacijom (Amaxa, Cologne, Njemačka) upotrebom Nucleofector kit V ili T, u skladu s uputama proizvođača. Pregled Test stanične proliferacije
Nakon transfekcije s iRNK, želučanih staničnim linijama raka HSC45, MKN1, AGS i NUGC4 su nasađene na ploče s 96 jažica u gustoći od 8000 stanica /100 ul u standardnom mediju koji sadrži 10% FCS. broj stanica na 48, 72 i 96 sati nakon transfekcije je određena posredno kolorimetrijski koristeći brojanja Kit-8 Otopina (Dojindo, Kumamoto, Japan). Ispitivanje se temelji na smanjenje soli tetrazolina ([2- (2-metoksi-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfophenyl) -2-tetrazolijev, mononatrijeva sol], WST -8), a koristi se kao mjera živih stanica. Apsorbancija svake jažice na 450 nm je mjerena pomoću čitača mikroploče (Model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Protočnom citometrijom pregled Protočna citometrija se izvodi kao što je ranije [27] opisano. Ukratko, pričvršćene i odvoje stanice su ekscidirane, fiksirane u 90% hladnim etanolom obrađena RNAzom A (500 jedinica /ml), a zatim bojaju s propidij jodidom (50 ug /ml). Za svaki uzorak, 30000 događaji su analizirani pomoću staničnog ciklusa analize platformu FlowJo programa (Tree Star, Ashland, OR, USA). Pregled Imunohistokem pregled formalinom fiksiranih, sekcije parafin uklopljenih želučane tumora su deparafmizirane, hidratizirani i zatim obrađena s otopinom peroksidaze blokiranje (3% 'H sub> 2O 2 u metanolu). Sekcije su u autoklavu na 105 ° C tijekom 10 min u meta dohvat otopini (Dako, Glostrup, Danska). Sekcije su inkubirane s mišjim anti-Kraša antitijela. (1: 100 razrjeđenje; Santa Cruz Biotechnology) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi, i imunoreaktivnost je otkriven pomoću isplanirati-Plus reagensa (Dako) pregled Rezultati
digitalni genoma skeniranje i karakterizacija virtualnih oznake kompjutora
digitalni genom skeniranja (DGS) je metoda kvantitativnog određivanja broja kopija gena nabrajanjem kratke genomske DNA fragmenata (tzv stvarne oznake) koje generiraju eksperimentalno MBO
i endonukleaze probavu (Slika 1a). Kako bi se eliminirale komplicirane korake u pripremi oznaka, mi računski karakteriziraju kratke fragmente DNA, koje su proizvedene jednom restrikcije s MBO pregled, I., koji prepoznaje 4-bp sekvencu GATC. U silico
probavu ljudskog genoma MBO pregled sam proizveo je približno 1,6 milijuna restrikcijskih fragmenata (tzv virtualne oznake) u rasponu od 20-130 bp (Dodatni file 7a). Nukleotida analiza sekvenci pokazala je da oko 65% od virtualne oznake sadržane ponavljaju sekvence, kao što je definirano u javnoj bazi podataka ponavljanja elemenata (Dodatni file 7a). Važno je, slijed odgovara na bazi ljudskog genoma otkrila je da je oko 85% od virtualne oznake mapirati jedinstveno preciznim kromosomskim mjestima (dodatni file 7b, c). Čak i ako virtualni oznake sadrže ponavljajuće sekvence u dijelu, oko 80% koji se ponavljaju oznaka ispostavilo se da budu jedinstveni. Prosječna udaljenost između dvije jedinstvene virtualne oznake od 30 do 60 bp duljine je 7,6 kb, srednja udaljenost 4,5 kb i 97,8% intervala su kraći od 30 kb (Dodatni file 7d). Slične karakteristike oznaka intervala uočene su za virtualne oznake raspon od 70 do 100 bp (prosječna udaljenost, 7.9 KB; medijan udaljenosti od 4,8 kb, 97,4% su bili kraći od 30 kb) i 100-130 bp (prosječna udaljenost 7,9 kb; srednja udaljenost, 4,9 kb;.. 97,4% su manji od 30 kb (Dodatni file 7e, f) Nadalje, gustoća jedinstvenih virtualnih oznaka je gotovo jednaka u svakom kromosomu (Dodatni file 7g) to je u silico
nalaza predložio da većina kratkom MBO pregled I. oznake će biti korisno za DGS. Slika 1 DGS i pripremu pravih oznaka. (a) Shematski prikaz DGS. boji kutije predstavljaju genomske MBO
i pravi oznake. Vidi tekst za detalje. (b i c) Pripravljanje (b) i svojstva (c) realnih oznaka. prikazati Reprezentativni koriste genomne DNA iz MKN1 stanica raka želuca. (b) kratki fragmente MBO pregled i probavljenog genomske DNA (30 do 60 bp) electroeluted iz agaroza gela (i), spojene i suklonirana. Dobivene rekombinantni plazmidi su sakupljene za generiranje biblioteka 1. (ii). Dugo concatemers (140-800 bp) izrezani su iz 1. biblioteka vektora electroeluted (iii), spojene i suklonirana. Dobivene Rekombinantni plazmidi predstavlja 2. klonova biblioteke (iv). Broj oznaka koji se nalaze u svakom klona je prikazana na vrhu svake pruge. Umeci su pregledane Xhol pregled I /Sac
sam probavu u pločama (ii) i (iv). *, vektorske fragmenti; **, Spe pregled I /Pst pregled I probavu mjestu višestrukog kloniranja bez umetka. (C) stvarni broj stvarnih oznaka iz 2. knjižnici prikazan u histogramu (lijevo) i njihove karakteristike su sažeti (desno). Pregled DGS simulacija kompjutora
Sposobnost DGS za otkrivanje genoma -wide promjene s obzirom na karakteristike genoma, kao što su broj kopija i veličini promjene i broj stvarnih oznake dobivenih analizom sekvence. Za predviđanje veličine promjene koje pouzdano mogao biti otkriven, s obzirom na fiksni broj računski uzorkovanih oznaka, koristili smo Monte Carlo simulacija za izračun pozitivnu prediktivnu vrijednost (PPV), koja je vjerojatnost da je otkrivena promjena predstavlja pravu promjenu. Na primjer, otkrili smo da je analiza 5000 oznaka može pouzdano otkriti 10-struki pojačanje od 500 kb, a homozigotni brisanje 7,5 Mb, ili jedan gubitak kopijom 30 MB regiji, ali nije mogao otkriti subchromosomal dobije manji od 30 Mb (dodatne datotečne 8). I osjetljivost i specifičnost u otkrivanju ove vrste promjene bile su 99% u slučajevima s visokim PPVs (> 90%)., Što pokazuje da niti je ograničavajući faktor u ovoj analizi (podaci nisu prikazani) pregled Priprema pravi oznake iz ljudske genomske DNA Netlogu za DGS od raka želuca staničnih linija HSC45 i MKN1, pripremili smo biblioteke stvarne oznake iz genomske DNA, kao što je prikazano na slici 1a. MBO pregled I digestiran genomske DNA veličina razdijeljen (30-60 bp) i podvrgnut concatemerization, nakon čega slijedi konstrukcija je 2. biblioteke, koji je sadržavao oko 10 pravi oznake na klona (Slika 1b). Analiza sekvenca nukleotida od stvarne oznake pokazala je da 85,8% preslikati na jedinstvene pozicije, što je u skladu s našim karakterizaciju virtualnih oznake (slika 1c).
pojačanja na kromosomu 12P u HSC45 stanica raka želuca
genoma širom oznaku profil gustoća HSC45 stanicama određena je ukupno 5,462 jedinstvenih stvarnih oznaka. Da bi se postigla visoku rezoluciju i osjetljivost s eksperimentalnim podacima, koristili smo prozor veličine 1000 i 2100 virtualnih oznake (oko 2300 kb i 4700 kb) za analizu pojačanja i brisanja, respektivno. Omjer gustoće oznaka je izračunata kao zbroj stvarnih oznake podijeljen s prosječnim brojem stvarnih oznake na istim veličine prozora u cijelom genomu, u kojoj je normalna omjer gustoće oznaka definirana kao 1,0. Identificirali smo različite subchromosomal područja povećane gustoće oznaka na 8q24.21, 12p12.1 i 12p13.33 i smanjenje gustoće oznake na 9p21.3 i dugo kraku kromosoma 18 (slika 2, Dodatni file 9a-d). Područja povećane gustoće oznaka (12p12.1, 12p13.33 i 8q24.21) sadržana Kraš
, CACNA1C
(kalcijevog kanala, naponski ovisan, ja tipa, alfa-1c podjedinica) i myc
loci, respektivno. Southern blot analiza potvrdila je da KRAS pregled i myc pregled pojačane su u HSC45 stanicama (Dodatni file 9e). Svaki kvantificira promjene copy-broj kao što je određeno kvantitativno realnom vremenu PCR (qPCR) genomske DNA je nevjerojatno slična onoj procjenjuje DGS kada je uparen veličina prozora za analizu gustoće oznaka za veličinu svake promjene (dodatni file 9a-d ). Ovi rezultati ukazuju na to da analiza gustoće tag by DGS može se koristiti za obavljanje broj kopija analizu cijelom ljudskom genomu. Slika 2 Detekcija povećanog broja kopija na kromosomima 8q i 12P strane DGS-u HSC45 stanica raka želuca. (A) pogled na cijelo Genom omjer gustoće tag (pomoću prozora od 1000 virtualnih oznaka) u HSC45 stanicama kao što je određeno DGS. Vrijednosti na y-osi označavaju sjedeća promjene gustoće oznaka u odnosu na prosječnu gustoću oznake cijelog genoma, te predstavljaju sadržaj DNA po haploidne genom, prozorima. X-os predstavlja broj kromosoma. (B i c) Prošireni prikaz omjera gustoća oznaka na kromosomima 8 (b) i 12 (c). U svakoj ploči, gornji graf prikazuje pogled na cijeli kromosom omjera gustoće oznaka (na temelju prozora od 1000 virtualnih oznake). Donji graf prikazuje prošireni pogled 8q24.21 i 12p12.1, u kojem povećana gustoća otkrivena oznaka koristite Windows 1000 i 500 virtualnih oznaka. Jedinstveni stvarni oznake označene su kao crne okomite trake i jedinstvene virtualne oznake navedene su u plavom (60 bp ili kraće) ili svijetlo plava (više od 60 bp) rešetaka u gustoj modu. Položaji refseq gena, s nekim razdvajanje izoformi izostavljenih, prikazane su na dnu donjeg panela. Pregled Pojačanje Kraša pregled u želučanim staničnim linijama karcinoma pregled Analiza 26 lokusa unutar i odmah uz bok kromosom 12p12. 1 u HSC45 stanicama s qPCR pokazala da je područje od oko 500 kb, što je uključivalo Kraš
gen lokusa, je bio pojačan (8 puta pojačanje, slika 3a). Genomska qPCR probira otkriti Kraš
pojačanje u još dvije stanične linije karcinoma želuca, SH101P4 (18 puta) i MKN1 (13 puta) (slika 3a), dok nismo otkrili pojačanje veći od 4 puta u 17 druga želučani stanične linije raka ili u 10 raka debelog crijeva i 11 staničnim linijama karcinoma gušterače (navedene u dodatne datoteke 1, podaci nisu prikazani). DGS je također otkrila pojačanje Kraš pregled lokusa u MKN1 stanica (dodatne datotečne 10). Susjedne geni Kraša Netlogu u minimalnom produkta amplifikacije su LRMP pregled (limfnog ograničena membranskog proteina), CASC1 pregled (rak kandidat osjetljivost 1) i LYRM5 pregled (LYR motiv sadrži 5). BCAT1 pregled (aminotransferaza razgranatog lanca 1, citosolni) također je pojačan u SH101P4 i MKN1 stanicama, ali ne u HSC45 stanicama. potvrdili smo da CACNA1C pregled je bio pojačan u HSC45 stanicama, ali ne iu drugim želuca, debelog crijeva, ili staničnim linijama karcinoma gušterače koriste genomske qPCR analizu (dodatne datoteke 9b, podaci nisu prikazani). Ni nacionalna regulatorna tijela
, HRAS
, niti BRAF
amplifikacije su nađeni u gornjim raka stanične linije genomske qPCR analize (podaci nisu prikazani). Pojačavanje Kraša Netlogu također je potvrđena dvostrukom analizom boje riba, u kojima Kraš pregled produkt amplifikacije je vidljivo kao homogeno obojenog područja u HSC45, SH101P4 i MKN1 stanica (Slika 3b). Slika 3 Gene pojačanje Kraša u želučanim stanicama raka. (A) Kvantitativna genomska PCR analiza Kraš
lokusa na 12p12.1 u HSC45 stanicama. Diskretni pojačanja u 12p12.1 u dvije druge želučane staničnim linijama karcinoma također su otkrivene (SH101P4 i MKN1). DNA broj kopija u odnosu na normalnu diploidna leukocita DNK prikazana je prema kromosomske položaja nukleotida (u megabases). Položaji refseq gena u odgovarajućim područjima su prikazani na karti dna. Amplifikacije područje minimum zajednički svim 3 želučani staničnim linijama raka predstavljen bar narančasto obojen. (B) metafazi (lijevo) - i međufaza (desno) -ribice analiza pojačanih Kraša
lokusa u želučanom staničnim linijama karcinoma. Kraš pregled specifičnih sonda je žutom bojom, a kontrolna sonda, specifičan za dugom kraku kromosoma 12, nalazi se u crvenoj boji. Tetraploidy u HSC45 i triploidije u SH101P4 i MKN1 stanica zabilježene. (C) Kvantitativna u realnom vremenu RT-PCR analiza Kraša pregled ekspresije mRNA u stanicama raka želuca s 12p12.1 pojačanja. Ekspresijska analiza gena (KRAS, LRMP, CASC1 pregled i pregled LYRM5) se nalazi unutar minimalne amplikona i BCAT1 pregled, koji na rubnom dijelu minimalnu amplikon, provedena je pomoću real-time PCR. Razine ekspresije normalizirane su na GAPDH mRNA pregled, a prikazani kao gradijent boje, u odnosu na normalnu želuca. Gen pojačanje i mutacija (kodon 12 ili 13) status Kraš Netlogu za svaki uzorak se sažeti u pravim dva stupca. Ispunjeni krugovi ukazuju na prisutnost pojačavanja ili mutacija Kras Netlogu i prazni krugovi ne pokazuju pojačanje ili nema mutacije KRAS pregled. Pregled Slijed analiza Kraša pregled (dodatne datoteke 11a) pokazali su da su i HSC45 i SH101P4 stanice gajili mutaciju u kodon 12 koji je rezultirao u jednom supstitucijom aminokiselina u Krasu (GGT → GTT, G12V), dok MKN1 stanice nedostajalo Kraša
mutacije. Prisutnost Kraša pregled mutacija u AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) i HCT 116 (G13D) stanica je ranije [28, 29] prijavljen. Od deset PCR-klonova Kraša pregled iz HSC45 i SH101P4 stanicama koje su bile podvrgnute mutacije analize, osam i tri, odnosno, gajio mutacije u kodon 12. Nadalje, genomska real-time PCR analiza pomoću sonde koje su specifične za divlje -tipa i mutanta Kraš
alela (Dodatni file 11b) su također pokazali da HSC45 i SH101P4 stanice sadrže različite omjere mutiranog alela (80% i 50%, redom). Sveukupno, ovi rezultati pokazuju da pojačanje mutant Kraša
alel također pojavljuje u HSC45 i SH101P4 stanica. Pregled Potom smo istražili razinu Kraš pregled mRNA u Krasu pregled -amplified stanica raka želuca kvantitativnom real Vremenski RT-PCR (QRT-PCR) (slika 3c). Razine Kraš pregled mRNA značajno korelira s Kraš
broju kopija. Susjednih gena LYRM5
i CASC1
koji lokalizirani na minimalnu amplikona, također su se na višim razinama u stanicama s pojačanjem u usporedbi sa stanicama bez pojačanja (Slika 3c). Zanimljivo, LRMP pregled je dolje regulirano u stanicama raka u usporedbi s normalnim želuca stanice. Imunoblot analiza RAS proteina (Slika 4a) je otkrila da je ekspresija Kraša je povećan pregled Krasu -amplified želuca stanica raka (HSC45, SH101P4 i MKN1), a ne nacionalna regulatorna tijela, niti HRAS vrlo su izraženi (Slika 4a, podaci nisu prikazani ). Iako je izraz pustiti-7c i neka-7g mikroRNA je izvijestila da regulira RAS izraza [8], pronašli smo mali korelacija ekspresije tih mikroRNA s razinama Kraš proteina (dodatne datotečne 12), koji je predložio da KRAS pojačana ekspresija kod raka želuca stanične linije je prvenstveno zbog genomske pojačanje Kraš Netlogu. Slika 4 Prekomjerna ekspresija Kraša i diferencijalna aktivacija Kraš, P44 /42 MAP kinaze i Akt u Kraš -amplified želučanih stanica raka. (A) Analiza imunoblot razinama ekspresije Kraša i nacionalna regulatorna tijela u stanicama raka. Aktin ekspresija je analizirana kao kontrola za punjenje. (B) bazalna razina GTP-Kras je bio izrazito visok u želučanih stanica raka s umnoženi mutant Kraš
(HSC45 i SH101P4). Ukupno lizat (500 ug) podvrgnut je testu padajućeg GTP-RAS i GTP-KRAS i GTP-nacionalna regulatorna tijela su detektirani pomoću imunoblota upotrebom anti-Kraša i anti-nacionalna regulatorna tijela protutijela, respektivno. Ukupno stanični lizat (50 ug) je analiziran paralelno za određivanje razine ekspresije Kraša i nacionalna regulatorna tijela u stanicama. (C) GTP-KRAS je povišen nakon seruma stimulacije u MKN1 stanicama. Stanice su uzgojene u mediju koji sadrži redovito 10% FCS (N), serum izgladnjele tijekom 24 sati (-) ili serumski izgladnjene zatim stimulirane s 10% FCS kroz 1 sat (+). Ukupni lizat stanica podvrgnut je GTP-Kraš padajućeg testu. (D) Aktivacija P44 /42 MAP kinaze i AKT u stanicama raka želuca izgladnjivanja bez seruma ili -stimulated.

• broj kopija gena Genome-wide i izraz analiza primarnih želučanih tumora i želučanih staničnim linijama karcinoma
• Mehanizmi gastroprotection metanol ekstrakt Melastoma malabathricum ostavlja