Новый метод, цифровое сканирование генома обнаруживает усиление гена KRAS в рака желудка: вовлечение гиперэкспрессия дикого типа KRAS в вниз по течению сигнализации и раковых клеток growth

новый метод, цифровое сканирование генома обнаруживает Крас
амплификации гена в рака желудка: вовлечение гиперэкспрессия KRAS дикого типа в вниз по течению роста клеток сигнализации и рака
Аннотация
Справочная информация
Желудочный рак является третьим наиболее распространенным злокачественным влияющих на население в целом во всем мире. Аномальная активация KRAS является ключевым фактором в развитии многих видов опухолей, однако, онкогенные мутации KRAS
нечасты при раке желудка. Мы разработали новый количественный метод анализа числа копий ДНК, называемый цифровой геном сканирования (DGS), который основан на перечислении коротких фрагментов рестрикции, и не предполагает ПЦР или гибридизации. В настоящем исследовании мы использовали DGS для обследования копирования число изменений в раковых клетках желудка.
Методы
DGS желудка линий раковых клеток проводили с использованием последовательностей 5000 до 15000 фрагментов рестрикции. Мы экранированы 20 желудка клеточных линий рака и 86 первичных опухолей желудка для Крас
амплификации с помощью количественной ПЦР, и исследовали Крас
амплификации в ДНК, мРНК и белка уровнях путем мутационного анализа, ПЦР в реальном времени, анализ иммуноблот, ГТФ -RAS выпадающий анализ и иммуногистохимический анализ. Эффект KRAS
нокдауна на активацию р44 /42 МАР-киназы и АКТ и на рост клеток исследовали с помощью иммуноблот и колориметрического анализа соответственно. Результаты

АРД анализа клетку рака желудка HSC45 линия показала усиление 500 кб области на хромосоме 12p12.1, которая содержит Крас
локуса гена. Усиление карсте
локус был обнаружен у 15% (3/20) желудочных линий раковых клеток (усиление 8-18-кратное) и 4,7% (4/86) первичных опухолей желудка (8-50-кратное усиление ). Крас
мутации были идентифицированы в двух из трех клеточных линий, в которых Крас
амплифицировали, но не были обнаружены ни в одном из первичных опухолей. Избыточная экспрессия белка KRAS коррелирует напрямую с увеличенным Крас
числом копий. Уровень ГТФ-связанного KRAS был повышен после стимуляции сыворотки в клетках с усиливаемого дикого типа KRAS
, но не в клетках с мутантным KRAS усиленным
. Нокдауна от KRAS
в желудочном раковых клеток, которые несли усиленную KRAS дикого типа
приводит к ингибированию роста клеток и подавления P44 /42 МАР-киназы и АКТ активности.
Заключение
Наше исследование подчеркивает полезность DGS для идентификации копирования количество изменений. С помощью DGS, мы определили KRAS
как ген, который усиливается при раке желудка человека. Мы показали, что амплификации гена вероятно, образует молекулярную основу сверхактивация из KRAS при раке желудка. Дополнительные исследования с использованием большего когорту желудка образцов рака необходимы для определения диагностических и терапевтических последствий Крас
усиления и избыточной экспрессии.
Фона
рака желудка является третьим наиболее распространенным злокачественным влияющих на население в целом во всем мире [1 ]. Специфические генетические изменения были зарегистрированы в раке желудка, в том числе усилений KSAM
, Met
и ERBB2
и мутации в p53
, APC
и CDH1
[2] , В то время как усиление его функции, мутации KRAS
являются одними из наиболее часто наблюдаемых генетических изменений в различных опухолей, в том числе поджелудочной железы (60%), желчных путей (33%) и толстой кишки (32%) [3], эти мутации являются нечастыми в рак желудка (2-7%) [4-7]. В целом РАН
мутации, связанные с онкогенеза "замок" РАН в активном GTP-связанном состоянии. ГТФ-RAS связывается с числом эффекторных белков, чтобы стимулировать вниз по течению сигнальных путей, среди которых СРР-МАР-киназы каскад и фосфатидилинозитол 3-киназы (PI3K) -AKT путей клеточного роста и онкогенеза являются лучшими характеризуются [3]. Длительная активация RAS также может происходить через механизмы, которые не связаны с мутациями в РАН. Например, пониженную экспрессию LET-7 микроРНК, подавляющий RAS путем пристреливать 3'untranslated область Ras
мРНК, часто ассоциируется с более высоким уровнем белка РАН в опухолях [8]. На сегодняшний день молекулярные механизмы онкогенного активации РАН в раке желудка не были полностью выяснены.
Амплификация геномных последовательностей, содержащих гены, которые имеют решающее значение для роста клеток является одним из основных механизмов активации онкогенов в развитии рака, и часто связано с опухолевой прогрессии, плохим прогнозом и /или лекарственной устойчивости [9]. Из многочисленных методов, доступных в настоящее время для обнаружения изменений номер копии генома, нынешний золотой стандарт массив ГКГ метод (aCGH). За последние несколько лет, разрешение aCGH быстро улучшается за счет использования олигонуклеотидных зондов, и превзошло aCGH с использованием стандартных зондов BAC [10]. Тем не менее, aCGH также подвержен собственных шумов измерений интенсивности гибридизационных основе, поскольку качество сигнала зависит от повторяющихся последовательностей, и зависит от качества зонда [11]. На самом деле, оптимизация конструкции зонда была одной из основных проблем в развитии облицовочных массивов [12, 13].
Digital кариотипирование (DK) был разработан Wang и соавт. [14], и не ограничивается наличием имманентных проблем методов массива. DK включает в себя цифровое перечисление коротких фрагментов геномной ДНК (называемые теги), обеспечивая количественное измерение числа копий ДНК на основе анализа плотности тегов вдоль каждой хромосомы. ДК был успешно применен к различным типам опухолей для обнаружения копирования число изменений, в том числе усиление TYMS
, RSF1
и Otx2
и удаление MKK4
и дистрофина
[ ,,,0],15-19]. Несмотря на эффективность DK, это технически сложным для широкого применения, поскольку она включает в ПЦР-амплификации и генерацию тегов 21-пар оснований (п.о.) в длину, чтобы точно представлять расположение хромосом интерес.
Мы сообщаем здесь разработка нового метода, названного DGS, для количественного анализа вариации числа копий, которое основано на бирке подсчета концепции DK, но использует упрощенный процесс подготовки тегов. DGS желудка линий раковых клеток обнаружено усиление карсте
локуса на хромосоме 12p12.1. Наши результаты обеспечивают молекулярную основу для сверхактивация из KRAS, и предполагают, что активация KRAS вниз по течению сигнальных событий, может способствовать пролиферации клеток рака желудка.
Методы
клеточных линий и тканей
клеточных линий, проанализированные в токе исследование перечислены в дополнительном файле 1. клеточные линии HSC и SH101P4 были установлены Кадзуёси Янагихара [20]; все остальные были получены из Американской коллекции типовых культур или японской коллекции исследовательских биоресурсам (Токио, Япония). Все клеточные линии культивировали в рекомендуемых средах. Для стимуляции сывороткой, клетки инкубировали в средах, которые испытывали недостаток в сыворотке в течение 24 часов (ч), а затем либо нестимулируемый, или стимулировали в течение 1 ч со средами, содержащими 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Первичные желудка образцов рака были получены из отделения хирургии, Keiyukai Sapporo больницы, с информированного согласия от каждого пациента. Геномную ДНК экстрагировали с использованием метода фенол-хлороформ, с последующей обработкой РНКазой. Суммарную РНК экстрагировали с использованием Trizol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), в соответствии с инструкциями изготовителя. Геномную ДНК нормальных лейкоцитов периферической крови (Biochain, Hayward, Калифорния, США) и тотальной РНК из нормальной слизистой оболочки желудка у здоровых индивидуумов (Biochain и Invitrogen) были приобретены. Первичные виды рака желудка были классифицированы с использованием клинико-функции, как показано в дополнительном файле 2, в соответствии со схемой классификации pTNM (5-е издание, 1997) [21] и системы классификации Лорен [22]. Крас
статус -amplification по возрасту сравнивали с использованием критерия Стьюдента; согласно степени, статус пТл, статус П.Н., и стадии заболевания с использованием теста Манна-Уитни U; и в соответствии с полом, гистологии и статуса пМ с использованием точного критерия Фишера. Все тесты были 2-белохвост и P значение <
; 0,05 рассматривалось как статистически значимое.
Цифрового сканирования генома
Кратко, 40 мкг геномной ДНК подвергали рестриктазой с использованием MBO
I (Takara, Токио, Япония) и затем разделяли с помощью электрофореза на 3% NuSieve GTG агарозном геле. Короткие фрагменты (30-60 пар оснований, называемые реальные теги) электроэлюировали, сцепляются и субклонируют в Bam HI
переваренной pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) с использованием раствора для лигирования Могучий Mix ДНК (Takara). Кишечной палочки
DH10B трансформировали рекомбинантных плазмид, трансформанты, объединяли и ДНК плазмиды очищали для генерации 1-библиотеку. Concatemers реальных тегов вырезают с помощью Spe
I /Pst
Я расщеплению с 1-ой библиотеки, и фрагменты в пределах от 140 до 800 пар оснований электроэлюировали, сцепленных и субклонировали в pBluescript II KS + для генерации 2-ой библиотеки. Во-вторых плазмид библиотека, содержащая concatemers ДПО
I /Pst
фрагменты I секвенировали с использованием генетического ABI3130 Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), в соответствии с инструкциями изготовителя. Уникальные реальные метки были отображены в последовательности хромосом человека, а плотность тег, определяемый как отношение реальных тэгов к виртуальным тегов через перемещение окон, рассчитывалась с целью обнаружения отклонений в содержании ДНК с использованием пороговых значений, определенных имитаций АРД. позиции тегов и соотношения плотности тегов визуализировали с помощью пользовательских треков и генома графов из Университета Калифорнии, Санта-Крус (УСК) генома браузера (март 2006 замораживанием, hg18) [23-25]. Подробные протоколы для ДГУ, виртуальной характеристики тегов и в силикомарганца
моделирования доступны в дополнительном файле 3.
Количественная ПЦР в реальном времени
Относительное количество копий ДНК определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием SYBR Green Master Mix ПЦР (Applied Biosystems) и ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). Содержание ДНК на гаплоидный геном был нормализован на что повторяющегося элемента, линейный 1, и рассчитывается по сравнительному КТ (ΔΔCT) относительный метод количественного определения с помощью формулы 2 (Nt
- Nline
) - ( Xt
- Xline
), где N
<суб> т
это номер пороговый цикл наблюдается для экспериментального праймера в нормальной ДНК лейкоцитов, N
<суб> линия
является число порогового цикла наблюдается для линии-1 праймера в нормальной ДНК лейкоцитов, Xt
среднее число порогового цикла наблюдается для экспериментального праймера в ДНК раковых клеток, а X
<суб> линия
является среднее число порогового цикла наблюдается для линии-1 праймера в ДНК раковых клеток [14]. Геномные амплификация была определена как больше, чем 4-кратное увеличение содержания ДНК. Последовательности праймеров для каждого локуса доступны в дополнительном файле 4. аллельная доля мутантных Крас
(G12V, GGT → GTT) определяли с применением процедуры ПЦР модифицированной в режиме реального времени в соответствии с Itabashi и др
[26 ]. Подробный протокол доступен в дополнительном файле 3. кДНК получали с использованием SuperScript III обратной транскриптазы (RT, Invitrogen), а уровень мРНК каждого гена определяли в режиме реального времени RT-PCR с использованием TaqMan гена Анализ экспрессии (Applied Biosystems) , Относительные уровни мРНК были рассчитаны с помощью сравнительного метода КТ с использованием GAPDH
в качестве эндогенного контроля. Наборы праймер /зонд, используемый приведены в дополнительном файле 5.
Флуорецсенция Ситу
гибридизации (FISH)
БАС, содержащихся в Крас
локус (RP11-636P12) и хромосомный 12q24.2 (RP11 в -91M21) метили Cy3 и Cy5, соответственно, а затем инкубировали с горками, приготовленных с межфазных и метафазных хромосом. Ядра встречное окрашивали 4 ', 6-диамино-2-фенилиндола (DAPI), и слайды анализируют с использованием флуоресцентного микроскопа (Leica CW-4000).
Мутационный анализ KRAS
и PIK3CA

Усиленный геномные фрагменты либо секвенировали непосредственно, либо субклонировали с использованием ТОРО ТА-Cloning Kit (Invitrogen) и секвенировали. По крайней мере, десять клонов из двух независимых анализов ПЦР на локус секвенировали с использованием M13 прямого и обратного праймеров (Invitrogen). Последовательности праймеров, используемых для амплификации Крас
(экзонов 1 и 2) и PIK3CA
(экзоны 9 и 20) показаны в дополнительный файл 6.
иммуноблот-анализа
Клетки лизируют в Лизиса буфер, содержащий 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5) буфера, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х, 10% глицерина, 10 мМ NaF, 1 мМ ванадата натрия, 50 мМ β-глицерофосфата, 1 мМ фтористого phenylmethansulfonyl , 1 мМ дитиотреитола, и ингибитор протеаз (Roche, Mannheim, Германия). Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и электроблоттингу на качестве Immobilon-P мембраны (Millipore, Billerica, MA, USA). Мембраны анализировали при помощи иммуноблота с использованием следующих антител, как показано: мышиных моноклональных анти-KRAS, -NRAS и -HRAS антител (SC-30, SC-31 и SC-29, соответственно, Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, CA, USA); анти-актин антител (Millipore); кроличьи поликлональные анти-р44 /42 MAP киназы, -phosho-p44 /42 MAP киназы (Thr202 /Tyr204), -Akt и -phospho-Akt (Ser473) антисыворотки (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA).
GTP-RAS выпадающий анализа
активации РАН был обнаружен с помощью EZ-Detect Ras активации Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Вкратце, клеточный лизат (500 мкг) инкубировали с иммобилизованным Raf1 Ras-связывающий домен, слитый с глютатион-S-трансферазы (GST-Raf1-RBD). Преципитаты промывали 3 раза, и связанные белки элюировали кипячением в течение 5 минут (мин). Белки разделяли на полиакриламидном геле 12%, переносили в Immobilon-P мембрану и подвергали анализу иммуноблота с использованием анти-KRAS, -NRAS, или -HRAS антитела.
РНК-интерференции
специально разработанных KRAS
миРНК (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), нацеливание область KRAS
, который не связан с известными онкогенных мутаций, был синтезирован Dharmacon (Lafayette, Co, США). миРНК таргетингом LRMP
, LYRM5
и CASC1
были приобретены у Ambion (No.144181, 284911 и 147715). Универсальный ненацеливании миРНК (неспецифический контроль VII, Dharmacon) был использован в качестве отрицательного контроля. В каждом эксперименте, 5 × 10 6-клетки трансфицировали 7,5 мкл 20 мкМ миРНК путем электропорации (Amaxa, Кельн, Германия) с использованием Nucleofector комплект V или T, в соответствии с инструкциями изготовителя.
Сотовый анализ пролиферации
После трансфекции миРНК, желудочных линий раковых клеток HSC45, MKN1, АГС и NUGC4 высевали в 96-луночные планшеты при плотности 8000 клеток /100 мкл в стандартной среде, содержащей 10% FCS. Число клеток на 48, 72 и 96 ч после трансфекции определяли косвенным путем колориметрического анализа с использованием клеток счетная раствора Kit-8 (Dojindo, Кумамото, Япония). Анализ основан на восстановлении тетразолия соли ([2- (2-метокси-нитрофенил) -3- (4-нитрофенил) -5- (2,4-disulfophenyl) -2-тетразолия, мононатриевой соли], WST -8), и используется в качестве меры живых клеток. Поглощение каждой лунки при 450 нм измеряли с использованием микропланшет-ридера (Model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Проточной цитометрии
проточной цитометрии проводили, как описано ранее [27]. В кратком изложении, прилипшие и отдельные клетки собирали, фиксировали в 90% холодного этанола, обрабатывали РНКазой А (500 ед /мл), а затем окрашивали пропидийиодидом (50 мкг /мл). Для каждого образца 30000 событий были проанализированы с помощью анализа платформы клеточного цикла программы FlowJo (Tree Star, Ashland, Орегон, США).
Immunohistochemistry
формалине фиксированной, были депарафинировали парафином участки опухолей желудка, увлажненной , а затем обрабатывают пероксидазы блокирующим раствором (3% Н <к югу> 2O <суб> 2 в метаноле). Срезы обрабатывали в автоклаве при 105 ° С в течение 10 мин в растворе целевого поиска информации (Dako, Glostrup, Дания). Срезы инкубировали с мышиного анти-KRAS антителом. (Разведение 1: 100; Santa Cruz Biotechnology) в течение 1 ч при комнатной температуре, и иммунореактивность определяли с помощью ENVISION-Plus реагенты (Dako)

Результаты цифрового сканирования генома и характеристика виртуальных тегов в силикомарганца

цифрового сканирования генома (АРД) представляет собой метод количественного определения числа копий гена путем перечисления коротких фрагменты геномной ДНК (называемые реальные теги), которые генерируются экспериментально Mbo
I эндонуклеазой (Рисунок 1a). Для устранения сложных шагов, участвующих в подготовке тегов, мы вычислительно характеризовал короткие фрагменты ДНК, которые производятся одной ферментами рестрикции с MBO
I, признающей 4 п.н. последовательность GATC. В силикомарганца
переваривание генома человека по MBO
я добыла около 1,6 миллиона фрагментов рестрикции (называемые виртуальные метки) в диапазоне 20-130 б.п. (Дополнительный файл 7а). Нуклеотидная анализ последовательности показал, что примерно 65% виртуальных меток содержали повторяющиеся последовательности, как она определена в публичной базе данных повторяющихся элементов (Дополнительный файл 7а). Важно отметить, что последовательность сопоставления с базой данных генома человека показало, что около 85% виртуальных тегов отображаются однозначно к точным локализациях (Дополнительный файл 7b, с). Даже если виртуальные теги включают повторяющиеся последовательности частично, примерно 80% из повторяющихся тегов оказались уникальными. Среднее расстояние между двумя уникальными виртуальными метками от 30 до 60 пар оснований в длину составляла 7,6 т.п.н., медиана расстояние составляло 4,5 т.п.н. и 97,8% интервалов были короче, чем 30 т.п.н. (Дополнительный файл 7d). Сходные характеристики интервальных тег для виртуальных тегов в диапазоне от 70 до 100 базисных пунктов (среднее расстояние, 7,9 кб, медиана расстояние, 4,8 кб; 97,4% были короче, чем 30 кб), и от 100 до 130 пар оснований (среднее расстояние, 7,9 кб; средний показатель расстояния, 4,9 т.п.н.,.. 97,4% были короче, чем 30 т.п.н. (Дополнительный файл 7E, F) Кроме того, плотность уникальных виртуальных тегов была почти равна в каждой хромосоме (Дополнительный файл 7g) Эти в силикомарганца
результаты свидетельствуют о том, что большинство коротких MBO
теги я был бы информативен для ДГУ. Рисунок 1 DGS и получение реальных тегов. (а) Схематическое контур DGS. Цветные коробки представляют собой геномную MBO
I реальные теги См. текст для деталей. (б и в) Получение (б) и характеристика (с) вещественных тегов. Типичные результаты с использованием геномной ДНК из MKN1 клеток рака желудка показаны. (б) Короткие фрагменты MBO
I-переваренной геномной ДНК (от 30 до 60 п.н.) электроэлюировали из агарозного геля (I), сцепленных и субклонировали. Образующиеся рекомбинантные плазмиды были объединены, чтобы сформировать 1-библиотеку (II). Длинные concatemers (от 140 до 800 п.н.) вырезали из 1-ых векторов библиотеки, электроэлюировали (III), сцепленных и субклонировали. Полученные рекомбинантные плазмиды, представляют собой 2-ые библиотечные клоны (IV). Количество тегов, содержащихся в каждом клоне показан в верхней части каждой полосы. Вставки были рассмотрены Xho
I /Сак
I Пищеварение в панелях (II) и (IV). *, векторные фрагменты; **, Spe
I /Pst I
переваривания сайта множественного клонирования без вставки. (С) Фактическое число вещественных тегов из 2-й библиотеки показано на гистограмме (слева), и их характеристики приведены (справа).
DGS моделирование в силикомарганца

Способность DGS для обнаружения генома -ные изменения основаны на геномных характеристик, таких как количество копий и размер изменения, а количество реальных тегов, полученных из анализа последовательностей. Для того, чтобы предсказать размер изменения, которые могли бы быть надежно обнаружен, данное фиксированное число вычислительно выборки тегов, мы использовали моделирование методом Монте-Карло для расчета прогностической ценности положительного результата (PPV), что вероятность того, что обнаруженное изменение представляет собой истинное изменение. Например, мы обнаружили, что анализ 5000 тегов может надежно обнаружить 10-кратное усиление 500 кб, гомозиготное удаление 7,5 Мб, или единой потери копии 30 Мб региона, но не мог обнаруживать subchromosomal получить меньше 30 Мб (дополнительный файл 8). И чувствительность и специфичность обнаружения этих типов изменений были > 99% в случаях с высокими PPVs (> 90%)., Что указывает, что ни один не был ограничивающим фактором в данном анализе (данные не показаны)
Приготовление реальные теги геномной ДНК человека для
АРД линий рака желудка клеточных HSC45 и MKN1, мы подготовили библиотеки реальных тегов из геномной ДНК, как показано на рисунке 1a. В МВО
Я-переваренной геномной ДНК фракционировали (30-60 п.н.) и подвергали concatemerization, с последующим строительством 2-библиотеки, которая содержала приблизительно 10 реальных меток на клон (рисунок 1b). Анализ нуклеотидных последовательностей вещественных тегов показал, что 85,8% отображается на уникальных позиций, что согласуется с нашей характеристики виртуальных тегов (рис 1в).
амплификациях на хромосоме 12p в HSC45 рака желудка клетки
всему геному тег профиль плотности клеток HSC45 определяли, используя в общей сложности 5,462 уникальных реальных тегов. Для достижения высокого разрешения и чувствительности с экспериментальными данными, мы использовали окна размерами 1000 и 2100 виртуальных тегов (около 2300 кб и 4700 кб) для анализа усилений и удалений, соответственно. Отношение плотности тегов рассчитывалась как сумма вещественных тегов, деленное на среднее число реальных тегов в тех же размера окна по всему геному, в котором отношение нормальной плотности метка была определена как 1,0. Мы определили различные области subchromosomal повышенной плотности тегов на 8q24.21, 12p12.1 и 12p13.33, и снижение плотности тегов на 9p21.3 и длинном плече хромосомы 18 (Рисунок 2, Дополнительный файл 9a-d). Области повышенной плотности тегов (12p12.1, 12p13.33 и 8q24.21) содержали KRAS
, CACNA1C
(кальциевых каналов, зависящие от напряжения, л типа, альфа-субъединица 1c) и MYC
локусы, соответственно. Саузерн-блот-анализ подтвердил, что KRAS
и MYC
амплифицировали в клетках HSC45 (Дополнительный файл 9e). Каждый количественному изменение копирования число как определено из количественного ПЦР в реальном времени (КПЦР) геномной ДНК была удивительно похожа, что по оценкам АРД, когда размер окна для анализа плотности тега был подобран по размеру каждого изменения (Дополнительный файл 9а-й ). Эти результаты свидетельствуют о том, что анализ плотности тегов с помощью АРД может быть использован для проведения анализа количества копий, на протяжении всего генома человека. Рисунок 2 Обнаружение увеличения числа копий на хромосомах 8q и 12p по ДГУ в HSC45 раковых клетках желудка. (А) мнение целого генома отношения плотности тегов (с использованием окна 1000 виртуальных тегов) в клетках HSC45, как определено ДГУ. Значения по оси у показывают Наклоняемый изменения в плотности тега по отношению к средней плотности тегов всего генома, и представляют собой содержание ДНК на гаплоидный геном, в окнах. Ось х представляет собой число хромосом. (Б и в) расширенное представление коэффициентов плотности тегов на хромосомах 8 (б) и 12 (с). В каждой панели, верхний график показывает вид в целом хромосома соотношения плотности тегов (на основе окна 1000 виртуальных тегов). Нижний график показывает расширенный вид 8q24.21 и 12p12.1, в котором повышенную плотность тегов детектируют с помощью окна 1000 и 500 виртуальных тегов. Уникальные реальные метки обозначены как черные вертикальных полос, и уникальные виртуальные метки обозначены синим цветом (60 п.н. или короче) или светло-синим цветом (более чем на 60 б.п.) баров в плотном режиме. Позиции генов RefSeq, с некоторыми сплайсинга изоформ опущенных, показаны в нижней части нижних панелей.
Усиление KRAS
в желудочном линиях раковых клеток
Анализ 26 локусов внутри и сразу фланговые хромосому 12p12. 1 в клетках HSC45 КПЦР показал, что область примерно 500 кб, который включал карсте
локуса гена, амплифицировали (8-кратное усиление, рис 3а). Геномные КПЦР скрининг обнаружен Крас
амплификации в двух дополнительных желудочных линий раковых клеток, SH101P4 (18-кратное) и MKN1 (13-кратное) (рис 3а), в то время как мы не обнаружили усиление больше, чем в 4 раза в 17 другой желудочные клеточные линии рака предстательной, или в 10 рака толстой кишки и 11 панкреатических раковых клеточных линий (перечисленных в дополнительный файл 1, данные не показаны). DGS также обнаружено усиление карсте
локуса в MKN1 клетках (дополнительный файл 10). Соседние гены KRAS
в минимальной ампликоне были LRMP
(лимфоидной ограниченным мембранных белков), CASC1
(рак восприимчивость кандидат 1) и LYRM5
(LYR мотив, содержащий 5). BCAT1
(с разветвленной цепью аминотрансферазы 1, цитозольной) был также усиливается в SH101P4 и MKN1 клетках, но не в клетках HSC45. Мы подтвердили, что CACNA1C
амплифицировали в клетках HSC45, но не в других желудка, толстой кишки, поджелудочной железы или линий раковых клеток с использованием геномного анализа КПЦР (дополнительный файл 9b, данные не приведены). Ни NRAS
, HRAS
ни BRAF
усилений были обнаружены в вышеуказанных клеточных линий рака путем геномного анализа КПЦР (данные не показаны). Усиление KRAS
также проверяется двойственной анализа цвета FISH, в котором карсте
ампликонов было очевидно, как однородно окрашенного области в HSC45, SH101P4 и MKN1 клеток (рис 3b). Рисунок 3 амплификации гена из KRAS в клеток рака желудка. (А) Количественный геномный анализ ПЦР карсте
локуса в 12p12.1 в клетках HSC45. Дискретные усилений в 12p12.1 в двух других желудочных линий раковых клеток были также обнаружены (SH101P4 и MKN1). ДНК число копий по отношению к нормальной ДНК диплоидный лейкоцитов наносили на график против хромосомной нуклеотидной позиции (в megabases). Позиции генов RefSeq в соответствующих областях, показаны в нижней карте. Минимальная область усиления общей для всех 3-х желудочных линий раковых клеток представлен оранжевого цвета панели. (Б) Метафаза (слева) - и межфазного (справа)-FISH анализ амплифицированной Крас
локуса в желудочном линиях раковых клеток. Карсте
-специфический зонд находится в желтый цвет, а управление зондом, специфичным для длинного плеча хромосомы 12, в красном цвете. наблюдались тетраплоидия в HSC45 и триплоидия в SH101P4 и MKN1 клеток. (С) Количественное в реальном времени ОТ-ПЦР анализ Крас
экспрессии мРНК в клетках рака желудка с 12p12.1 амплификации. Анализ экспрессии генов (KRAS, LRMP, CASC1
и LYRM5
) находится в пределах минимального ампликона, и BCAT1
, которая фланкирует минимальное ампликона, проводили с использованием в режиме реального времени RT-PCR. Уровни экспрессии были нормализованы к GAPDH
мРНК, и изображены в виде градиента цвета, по отношению к нормальному желудка. Амплификации гена и мутации (кодон 12 или 13) статуса KRAS
для каждого образца суммированы в нужных двух столбцах. Заштрихованные кружки указывают на наличие амплификации или мутации KRAS
, и открытые кружки указывают на отсутствие амплификации или отсутствие мутации KRAS
.
Анализ последовательностей Крас
(дополнительный файл 11a) показал, что оба HSC45 и SH101P4 клетки таил мутацию в кодоне 12, что привело к одной аминокислотной замены в KRAS (GGT → GTT, G12V), в то время как MKN1 клетки не хватало Крас
мутации. Присутствие Крас
мутаций в AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) и НСТ116 (G13D) клеток сообщалось ранее [28, 29]. Из десяти ПЦР-клонов KRAS
из HSC45 и SH101P4 клеток, которые были подвергнуты мутационного анализа, восемь и три, соответственно, таил мутации в кодоне 12. Кроме того, геномный анализ в реальном времени с помощью ПЦР-зондов, которые были специфическими для дикого -типа и мутантных Крас
аллели (Дополнительный 11b файл) также показал, что HSC45 и SH101P4 клетки содержат различные пропорции мутантной аллели (80% и 50% соответственно). В целом, эти результаты показывают, что усиление мутантного аллеля Крас
также происходит в HSC45 и SH101P4 клеток.
Далее мы исследовали уровни Крас
мРНК в Крас
-amplified клеток рака желудка с помощью количественной реальной -time ОТ-ПЦР (QRT-PCR), (3в). Уровни Крас
мРНК достоверно коррелирует с Крас
числом копий. Соседние гены LYRM5
и CASC1
, которые локализованы к минимальному ампликоне, были также выражены на более высоких уровнях в клетках с усилением по сравнению с клетками без амплификации (рис 3в). Интересно отметить, что LRMP
подавлялась в раковых клетках по сравнению с нормальными клетками желудка. Иммуноблот анализ белков РАН (рис 4а) показали, что экспрессия KRAS была увеличена в Крас
-amplified клеток рака желудка (HSC45, SH101P4 и MKN1), в то время как ни один, ни NRAS HRAS были высоко экспрессирована (фиг.4А, данные не приведены ). Хотя выражение LET-7с и пусть-7g микроРНК сообщается регулировать RAS выражение [8], мы нашли небольшую корреляцию экспрессии этих микроРНК с уровнями белка KRAS (дополнительный файл 12), который предположил, что KRAS избыточная экспрессия при раке желудка клеточные линии объясняется главным образом геномной амплификации гена KRAS
. Рисунок 4 Сверхэкспрессия KRAS, и дифференциальная активация KRAS, P44 /42 МАР-киназы и AKT в KRAS -amplified клеток рака желудка. (А) анализ иммуноблот уровней экспрессии KRAS и NRAS в раковых клетках. Экспрессии актина было проанализировано в качестве нагрузочного контроля. (Б) базальный уровень ГТФ-KRAS был заметно высоким содержанием клеток рака желудка с усиленным мутантных Крас
(HSC45 и SH101P4). Общий лизат (500 мкг) подвергали раскрывающихся анализа ГТФ-RAS и GTP-KRAS и ГТФ-NRAS были обнаружены при помощи иммуноблота с использованием анти-KRAS и анти-НРО антител, соответственно. Общий лизат клеток (50 мкг) анализировали параллельно, чтобы определить уровень экспрессии KRAS и NRAS в клетках. (С) ГТФ-KRAS был повышен после сыворотки стимуляции в клетках MKN1. Клетки культивировали в регулярной среде, содержащей 10% FCS, (Н), с недостатком сыворотки в течение 24 ч (-) или с недостатком сыворотки затем стимулировали добавлением 10% FCS в течение 1 ч (+). Общий клеточный лизат подвергали понижающим анализа ГТФ-KRAS. (Г) активация р44 /42 МАР-киназы и АКТ в сыворотке голодали или -stimulated клеток рака желудка.

• Генома числа копий гена и экспрессии анализ первичных опухолей желудка и желудочных линий раковых клеток
• Механизмы gastroprotection метанола экстракт листьев меластома малабарская