Une nouvelle méthode, la numérisation du génome numérique détecte l'amplification du gène KRAS dans les cancers gastriques: participation de type sauvage KRAS surexprimé dans la signalisation en aval et à la croissance des cellules cancéreuses

Un nouveau procédé, l'analyse du génome numérique détecte l'amplification du gène de KRAS dans les cancers gastriques: participation de type sauvage KRAS surexprimé dans la croissance de signalisation et de cellules cancéreuses aval
Résumé de l'arrière-plan
Le cancer gastrique est la troisième plus courante malignité affectant la population en général dans le monde entier. activation aberrante de KRAS est un facteur clé dans le développement de nombreux types de tumeurs, cependant, les mutations oncogéniques de KRAS
sont rares dans le cancer gastrique. Nous avons développé une nouvelle méthode quantitative de l'analyse du nombre de copies d'ADN, appelée balayage du génome numérique (DGS), qui est basé sur la numération des fragments de restriction de courte durée, et ne comporte pas de PCR ou d'hybridation. Dans l'étude actuelle, nous avons utilisé pour étudier DGS nombre de copies des modifications dans les cellules de cancer gastrique.
Méthodes
DGS de lignées cellulaires de cancer gastrique a été réalisée en utilisant les séquences de 5000 à 15000 fragments de restriction. Nous avons criblé 20 lignées cellulaires de cancer gastrique et 86 tumeurs gastriques primaires pour KRAS de l'amplification par PCR quantitative et étudié KRAS de l'amplification au niveau de l'ADN, de l'ARNm et de protéines niveaux par analyse mutationnelle, PCR en temps réel, l'analyse par immunotransfert, GTP test déroulant -ras et analyse immunohistochimique. Les résultats de l'effet de KRAS
knock-down sur l'activation de p44 /42 MAP kinase et AKT et sur la croissance cellulaire ont été examinés par immunoblot et essai colorimétrique, respectivement.
analyse DGS de la cellule de cancer gastrique HSC45 la ligne a révélé l'amplification d'une région de 500 kb sur le chromosome 12p12.1, qui contient le locus du gène KRAS de. L'amplification du locus du gène KRAS a été détectée dans 15% (20/03) des lignes gastriques de cellules cancéreuses (8-18 fois) et de l'amplification de 4,7% (4/86) des tumeurs gastriques primaires (8-50 fois l'amplification ). KRAS de les mutations ont été identifiées dans deux des trois lignées cellulaires dans lesquelles Kras
a été amplifié, mais ne sont pas détectés dans l'une des tumeurs primaires. La surexpression de la protéine KRAS directement corrélée avec une augmentation de KRAS le nombre de copies. Le niveau de KRAS GTP a été élevée après la stimulation de sérum dans les cellules avec amplifié type sauvage KRAS
, mais pas dans les cellules avec amplifié mutant KRAS
. Knock-down de KRAS
dans les cellules de cancer gastrique qui a porté amplifié KRAS de type sauvage
a entraîné l'inhibition de la croissance cellulaire et la suppression de p44 /42 MAP kinase et l'activité de AKT.
Conclusion
Notre étude met en évidence l'utilité de DGS pour l'identification des modifications du nombre de copies. Utilisation de DGS, nous avons identifié KRAS
comme un gène qui est amplifié dans le cancer gastrique humain. Nous avons montré que l'amplification du gène constitue probablement la base moléculaire de la suractivation des KRAS dans le cancer gastrique. Des études supplémentaires utilisant une cohorte plus importante de spécimens de cancer gastrique sont nécessaires pour déterminer les implications diagnostiques et thérapeutiques de l'amplification et la surexpression de KRAS.
Contexte
Le cancer gastrique est le troisième cancer le plus fréquent affectant la population en général dans le monde entier [1 ]. modifications génétiques spécifiques ont été rapportés dans le cancer gastrique, y compris les amplifications de KSAM
, MET
et ERBB2
, et des mutations dans p53
, APC
et CDH1
[2] . Alors que les mutations gain de fonction de KRAS
sont quelques-unes des altérations génétiques les plus fréquemment observés dans une variété de tumeurs, y compris du pancréas (60%), des voies biliaires (33%) et du côlon (32%) [3], ces mutations sont rares dans le cancer gastrique (2-7%) [4-7]. En général, RAS de les mutations associées à la tumorigenèse "verrouiller" RAS dans un état lié au GTP actif. GTP-RAS se lie à un certain nombre de protéines effectrices pour stimuler les voies de signalisation en aval, parmi lesquelles la RAF kinase MAP en cascade et les phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), les voies de -AKT de la croissance cellulaire et l'oncogenèse sont les mieux caractérisés [3]. activation prolongée de RAS peut également se produire à travers des mécanismes qui ne comportent pas des mutations dans RAS. Par exemple, l'expression de let-7 microARN, qui supprime RAS en ciblant la région 3 'non traduite du RAS de mARN réduite, est souvent associée à un niveau plus élevé de la protéine RAS dans les tumeurs [8]. A ce jour, les mécanismes moléculaires de l'activation oncogénique de RAS dans le cancer gastrique n'a pas été totalement élucidé.
L'amplification des séquences génomiques contenant des gènes qui sont essentiels pour la croissance des cellules est l'un des principaux mécanismes d'activation des oncogènes dans le cancer, et souvent associée à la progression de la tumeur, un mauvais pronostic et /ou la résistance aux médicaments [9]. Parmi les nombreuses méthodes actuellement disponibles pour détecter le nombre de copies des altérations du génome entier, l'étalon-or actuel est la matrice méthode CGH (aCGH). Au cours des dernières années, la résolution de aCGH a rapidement améliorée grâce à l'utilisation de sondes d'oligonucléotides, et a dépassé celle de aCGH en utilisant des sondes standards BAC [10]. Cependant, aCGH est également sensible au bruit inhérent des mesures d'intensité à base d'hybridation, comme la qualité du signal est affecté par des séquences répétitives et est dépendant de la qualité de la sonde [11]. En fait, l'optimisation de la conception de la sonde a été un défi majeur dans le développement de réseaux de carrelage [12, 13] Le caryotype Digital. (DK) a été développé par Wang et al. [14] et ne se limite pas aux problèmes inhérents aux techniques de tableau. DK implique l'énumération numérique de courts fragments d'ADN génomique (balises appelées), fournissant une mesure quantitative du nombre de copies d'ADN par l'analyse de la densité de l'étiquette le long de chaque chromosome. DK a été appliquée avec succès à une variété de types de tumeurs pour détecter des altérations du nombre de copies, y compris l'amplification de TYMS
, RSF1
et OTX2
, et la suppression de MKK4
et dystrophine
[ ,,,0],15-19]. En dépit de l'efficacité de NSP, il est techniquement difficile pour les applications générales, car elle implique une amplification par PCR et la génération d'étiquettes de paires de 21 bases (bp) de longueur pour représenter avec précision la localisation chromosomique d'intérêt.
Nous rapportons ici le développement d'une nouvelle méthode, appelée DGS, pour l'analyse quantitative du nombre de copies de variation, qui est basé sur le concept tag comptage de DK, mais utilise un procédé simplifié de préparation de l'étiquette. DGS de lignées cellulaires de cancer gastrique a détecté l'amplification du locus des KRAS sur le chromosome 12p12.1. Nos résultats fournissent une base moléculaire pour la suractivation du KRAS, et suggèrent que l'activation de KRAS événements de signalisation en aval peut favoriser gastrique prolifération des cellules cancéreuses.
Méthodes
lignées cellulaires et tissus
Les lignées cellulaires analysées dans le courant étude sont répertoriés dans les fichiers supplémentaires 1. Les lignées de cellules HSC et SH101P4 ont été établies par Kazuyoshi Yanagihara [20]; tous les autres ont été obtenus à partir de American Type Culture Collection ou la collection japonaise de bioressources recherche (Tokyo, Japon). Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées dans les milieux recommandés. Pour une stimulation de sérum, les cellules ont été incubées dans des milieux dépourvus de sérum qui pendant 24 heures (h), et ensuite, soit non stimulées ou stimulées pendant 1 h avec des milieux contenant 10% de sérum de foetus de veau (FCS). spécimens de cancer gastrique primaires ont été obtenues auprès du Département de chirurgie, Hôpital Keiyukai Sapporo, avec le consentement éclairé de chaque patient. L'ADN génomique a été extrait en utilisant le procédé au phénol-chloroforme, suivie d'un traitement RNase. L'ARN total a été extrait en utilisant Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), selon les instructions du fabricant. L'ADN génomique de leucocytes normaux du sang périphérique (BIOCHAIN, Hayward, CA, USA) et l'ARN total de la muqueuse gastrique normale d'individus sains (BIOCHAIN ​​et Invitrogen) ont été achetés. cancers gastriques primaires ont été classés selon les caractéristiques clinico, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 2, selon le schéma de classification des pTNM (5e édition, 1997) [21] et le système de classification de l'Lauren [22]. le statut de -amplification de KRAS selon l'âge a été comparée à l'aide du test t de Student; selon le grade, le statut pT, pN état, et le stade de la maladie à l'aide du test de Mann-Whitney U; et selon le sexe, l'histologie et le statut pM en utilisant le test exact de Fisher. Tous les tests ont été 2 à queue, et un P
valeur de < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.
Balayage du génome numériques
Brièvement, 40 ng d'ADN génomique ont été soumis à une digestion en utilisant l'enzyme de restriction Mbo I
(Takara, Tokyo, Japon), puis séparés par électrophorèse sur un 3% Nusieve GTG gel d'agarose. fragments courts (30-60 pb, appelés vrais tags) ont été électroélués, concaténation et sous-cloné dans Bam
HI-digéré pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) en utilisant une solution de ligature d'ADN Mix Puissant (Takara). Escherichia coli DH10B
ont été transformées avec des plasmides recombinants, les transformants ont été rassemblées et on a purifié l'ADN de plasmide pour générer la première bibliothèque. Concatémères de véritables balises ont été excisées par Spe
I /Pst
je digestion de la première bibliothèque, et des fragments dans la gamme de 140 à 800 pb ont été électroélués, concaténation et sous-clonés dans pBluescript II KS + pour générer la deuxième bibliothèque. plasmides de la banque deuxième contenant concatémères de Spe
I /Pst
fragments I ont été séquences en utilisant un analyseur génétique ABI3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), selon les instructions du fabricant. réelles balises uniques ont été cartographiés à des séquences de chromosomes humains, et la densité de tag, défini comme le rapport des véritables balises à des balises virtuelles sur les fenêtres en mouvement, a été calculée pour détecter des anomalies dans le contenu de l'ADN en utilisant des valeurs de seuil définies par simulations DGS. positions des balises et des ratios de densité d'étiquette ont été visualisées en utilisant les chansons personnalisées et Genome graphiques de l'Université de Californie, Santa Cruz (UCSC) navigateur génome (mars 2006 gel, hg18) [23-25]. Les protocoles détaillés pour DGS, étiquette virtuelle et la caractérisation dans les simulations silico de sont disponibles dans les fichiers supplémentaires 3.
quantitative PCR en temps réel de Relative nombre de copies d'ADN a été déterminée par PCR quantitative en temps réel à l'aide d'un vert SYBR PCR master Mix (Applied Biosystems) et l'ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). la teneur en ADN par génome haploïde a été normalisée à celle d'un élément répétitif, Line-1, et calculé par la CT comparatif (ΔΔCT) Méthode de quantification relative en utilisant la formule 2 (Nt
- Nline
) - ( xt
- Xline
), où N
t
est le nombre de cycles de seuil observé pour une amorce expérimentale dans l'ADN leucocytaire normal, ligne
N est le nombre de cycles de seuil observé pour la ligne-1 amorce dans l'ADN leucocytaire normal, Xt
est le nombre de cycles de seuil moyen observé pour l'amorce expérimentale dans l'ADN des cellules cancéreuses, et X
ligne
est le nombre de cycles de seuil moyenne observée pour la ligne d'amorce-1 dans l'ADN des cellules cancéreuses [14]. l'amplification génomique a été définie comme une augmentation de plus de 4 fois la teneur en ADN. Les séquences d'amorces pour chaque locus sont disponibles dans les fichiers supplémentaires 4. La proportion allélique de KRAS mutant s (G12V, GGT → GTT) a été déterminée en utilisant une procédure de PCR en temps réel modifié selon Itabashi et al
[26 ]. Le protocole détaillé est disponible dans le fichier additionnel 3. L'ADNc a été préparé en utilisant SuperScript III transcriptase inverse (RT, Invitrogen), et le niveau de chaque gène d'ARNm a été déterminée en temps réel par RT-PCR en utilisant l'expression TaqMan Gene Assay (Applied Biosystems) . les taux d'ARNm relatifs ont été calculés par le procédé CT comparatif utilisant la GAPDH
comme contrôle endogène. Les ensembles d'amorce /sonde utilisées sont indiquées dans le fichier supplémentaire 5.
Fluorescence l'hybridation (FISH)
BACs qui contenaient le locus du gène KRAS (de RP11-636P12) et le chromosome 12q24.2 (RP11 de in situ -91M21) ont été marquées avec Cy3 et Cy5, respectivement, et ensuite mis en incubation avec des lames préparées avec interphase et des chromosomes métaphasiques. Les noyaux ont été contre-colorées avec 4 ', 6-diamino-2-phénylindole (DAPI), et les diapositives ont été analysées en utilisant un microscope à fluorescence (Leica CW-4000). Une analyse mutationnelle de
KRAS hôtels et PIK3CA

fragments génomiques amplifiés ont été séquencées, soit directement, soit sous-clonées en utilisant le kit de clonage TOPO TA (Invitrogen), puis séquencés. Au moins dix clones provenant de deux essais de PCR indépendantes par locus ont été séquencées à l'aide de M13 amorces avant et inverse (Invitrogen). Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification de KRAS de (les exons 1 et 2) et (les exons 9 et 20) de PIK3CA sont présentés dans le fichier supplémentaire 6.
analyse immunoblot
Les cellules ont été lysées dans Lysis un tampon contenant 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5) tampon NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X, 10% de glycerol mM, NaF 10, vanadate de sodium 1 mM, 50 mM de β-glycérophosphate, le fluorure de phenylmethansulfonyl 1 mM , dithiothréitol 1 mM, et un cocktail d'inhibiteurs de protease (Roche, Mannheim, Allemagne). Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE et électrotransfert sur une membrane Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA, USA). Les membranes ont été analysées par immunoblot en utilisant les anticorps suivants, comme indiqué: monoclonal de souris anti-KRAS, -NRAS et -HRAS anticorps (sc-30, sc-31, et sc-29, respectivement, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); un anticorps anti-actine (Millipore); polyclonaux de lapin anti-p44 /42 MAP kinase, -phosho-p44 /42 MAP kinase (Thr202 /Tyr204), -Akt et -phospho-Akt (Ser473) antisérums (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA).
test déroulant GTP-RAS
L'activation de RAS a été détectée en utilisant un kit de EZ-détecter Ras activation (Pierce, Rockford, IL, USA). En bref, le lysat cellulaire (500 ug) a été incubé avec immobilisée raf1 Ras domaine de liaison fusionné à la glutathion-S-transférase (GST-Raf1-RBD). Les précipités ont été lavés 3 fois, et les protéines liées ont été éluées en faisant bouillir pendant 5 minutes (min). Les protéines ont été résolues sur un gel de polyacrylamide 12%, transférés sur une membrane Immobilon-P, et on les soumet à une analyse par immunotransfert utilisant un anticorps anti-KRAS, -NRAS, ou -HRAS anticorps.
ARN interférents
Un KRAS conçu sur mesure
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), en ciblant une région de KRAS
qui est pas associée à des mutations oncogènes connus, a été synthétisé par Dharmacon (Lafayette, Co, États-Unis). siRNA ciblant LRMP
, LYRM5
et CASC1
ont été achetés auprès de Ambion (No.144181, 284911 et 147715). A (contrôle non spécifique VII, Dharmacon) non-ciblage siRNA universel a été utilisé comme témoin négatif. Dans chaque expérience, 5 x 10 6 cellules ont été transfectées avec 7,5 pi de 20 uM siRNA par électroporation (Amaxa, Cologne, Allemagne) en utilisant le kit Nucleofector V ou T, selon les instructions du fabricant. Essai de prolifération
Cell
Après la transfection avec des ARNsi, les lignées cellulaires de cancer gastrique HSC45, MKN1, AGS et NUGC4 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 8000 cellules /100 ul dans un milieu standard contenant 10% de FCS. Le nombre de cellules à 48, 72 et 96 h post-transfection a été déterminée indirectement par dosage colorimétrique utilisant Comptage des cellules Kit-8 solution (Dojindo, Kumamoto, Japon). L'essai est basé sur la réduction d'un sel de tétrazolium ([2- (2-méthoxy-nitrophényl) -3- (4-nitrophényl) -5- (2,4-disulfophényl) -2-tétrazolium, sel monosodique] WST -8) et est utilisée comme une mesure de cellules vivantes. L'absorbance de chaque puits à 450 nm a été mesurée en utilisant un lecteur de microplaques (Modèle 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Cytométrie de flux
par cytométrie de flux a été réalisée comme décrit précédemment [27]. Brièvement, les cellules adhérentes et isolées ont été récoltées, fixées dans 90% d'éthanol froid, traité avec de la RNase A (500 unités /ml), puis colorées avec de l'iodure de propidium (50 ug /ml). Pour chaque échantillon, 30000 événements ont été analysées à l'aide du cycle cellulaire plate-forme d'analyse de programme FlowJo (Arbre Star, Ashland, OR, USA).
Immunohistochimie
Formol-fixe, des sections de paraffine de tumeurs gastriques ont été déparaffinées, hydratées et ensuite traité avec une solution de peroxydase de blocage (3% de H 2 O 2 dans le methanol). Les sections ont été stérilisés à l'autoclave à 105 ° C pendant 10 min dans une solution de récupération cible (Dako, Glostrup, Danemark). Les résultats de 1 h à température ambiante, et l'immunoréactivité a été détectée en utilisant des réactifs ENVISION-Plus (Dako)
balayage du génome numérique;: (Santa Cruz Biotechnology 100 dilution 1) Les coupes ont été mises en incubation avec un anticorps de souris anti-KRAS. et la caractérisation des balises virtuelles en silico
balayage du génome numérique (DGS) est une méthode de quantification le nombre de copies en énumérant des fragments génomiques courts d'ADN (appelées réelles balises) qui sont générés expérimentalement par Mbo
I endonucléase digestion (figure 1a). Afin d'éliminer les étapes compliquées impliquées dans la préparation d'étiquettes, nous avons caractérisé les calculs de courts fragments d'ADN qui sont produits par simple digestion par l'enzyme de restriction Mbo avec de I, qui reconnaît la séquence GATC 4 pb. Dans silico
digestion du génome humain par Mbo
I produit environ 1,6 million de fragments de restriction (appelés balises virtuelles) dans l'intervalle de 20-130 pb (fichier supplémentaire 7a). analyse de la séquence nucléotidique a révélé qu'environ 65% des étiquettes virtuelles contenait des séquences répétitives, telles que définies dans la base de données publique des éléments de répétition (fichiers supplémentaires 7a). Fait important, la séquence correspondant à la base de données du génome humain a révélé qu'environ 85% des étiquettes virtuelles mappé uniquement à des emplacements chromosomiques précises (fichiers supplémentaires 7b, c). Même si les balises virtuelles comprennent des séquences répétitives dans une partie, environ 80% des étiquettes répétitives avéré être unique. La distance moyenne entre deux balises virtuelles uniques de 30 à 60 pb de longueur était de 7,6 kb, la distance médiane était de 4,5 kb et 97,8% des intervalles étaient plus courtes que 30 kb (7d de fichier supplémentaire). Similaires caractéristiques tag d'intervalle ont été observées pour les étiquettes virtuelles la gamme de 70 à 100 pb (distance moyenne, 7,9 kb, la distance médiane de 4,8 kb; 97,4% étaient plus courtes que 30 kb), et 100 à 130 pb (distance moyenne, 7,9 kb; distance médiane, 4,9 kb;.. 97,4% étaient de moins de 30 kb (7e fichier supplémentaire, f) en outre, la densité de balises virtuelles uniques était à peu près égale dans chaque chromosome (7g de fichier supplémentaire) Ces in silico
résultats suggèrent que la majorité des courts Mbo
balises I serait informatif pour DGS. Figure 1 DGS et la préparation de véritables balises. (a) Représentation schématique des boîtes de couleur représentent. DGS génomique Mbo
I réels tags. Voir le texte pour plus de détails. (b et c) Préparation (b), et la caractérisation (c) de véritables mots clés. les résultats représentatifs en utilisant l'ADN génomique de cellules de cancer gastrique MKN1 sont représentés. (b) de courts fragments d'ADN génomique digéré par Mbol de (30-60 pb) ont été électroélué à partir d'un gel d'agarose (i), et sous-cloné concaténé. les plasmides recombinants résultants ont été mis en commun pour générer la première bibliothèque (ii). concatémères longs (140-800 pb) ont été excisés à partir du 1er vecteurs de bibliothèque, électroélué (iii), et sous-cloné concaténé. Les plasmides recombinants résultants représentent 2e clones de bibliothèque (iv). Le nombre de balises contenues dans chaque clone est indiqué en haut de chaque voie. Inserts ont été examinés par I /Sac de Xho
je digestion dans les panneaux (ii) et (iv). *, fragments de vecteurs; **, Spe
I /Pst
je digestion du site de clonage multiple sans insert. (C) Le nombre réel de véritables balises de la 2e bibliothèque est représentée dans l'histogramme (à gauche), et leurs caractéristiques sont résumées (à droite)
DGS simulation in silico
La capacité de détecter le génome DGS. les changements -Wide sont basées sur les caractéristiques du génome, tels que le nombre de copies et la taille de l'altération, et le nombre de balises réelles obtenues à partir d'une analyse de séquence. Pour prédire la taille de l'altération qui pourrait sûrement être détecté, étant donné un nombre fixe de balises informatiquement échantillonnés, nous avons utilisé la simulation de Monte Carlo pour calculer une valeur prédictive positive (VPP), qui est la probabilité qu'une altération détectée représente un véritable changement. Par exemple, nous avons constaté que l'analyse de 5000 étiquettes pourrait détecter de manière fiable une amplification de 10 fois de 500 kb, une délétion homozygote de 7,5 Mb, ou une seule perte d'une région de 30 Mb de copie, mais n'a pas pu détecter un subchromosomal gagner plus petit que 30 Mb (fichier supplémentaire 8). Préparation de, qui a indiqué que ni était un facteur limitant dans cette analyse (données non présentées) de la sensibilité et la spécificité de la détection de ces types d'altération sont >; 99% des cas avec de hauts VPP (90% >). réelles des balises à partir de l'ADN génomique humain
Pour DGS des lignées cellulaires de cancer gastrique et HSC45 MKN1, on a préparé les bibliothèques de balises réelles à partir d'ADN génomique, comme représenté sur la figure 1a. L'ADN génomique digéré par l'Mbo a été fractionné par taille (30 à 60 pb) et soumis à une concatémérisation, suivie par la construction d'une deuxième bibliothèque, qui contenait environ 10 balises réelles par clone (figure 1b). analyse de la séquence nucléotidique des véritables balises a révélé que 85,8% mappé à des positions uniques, ce qui était conforme à notre caractérisation des balises virtuelles (figure 1c).
amplifications sur le chromosome 12p dans les cellules cancéreuses gastriques HSC45
L'étiquette du génome entier profil de densité des HSC45 cellules a été déterminée en utilisant un total de 5.462 réelles étiquettes uniques. Pour atteindre une haute résolution et la sensibilité avec les données expérimentales, nous avons utilisé des tailles de 1000 et 2100 balises virtuelles (environ 2300 kb et 4700 kb) fenêtre pour l'analyse des amplifications et des délétions, respectivement. Le rapport de densité de l'étiquette a été calculé comme la somme des véritables balises divisé par le nombre moyen de véritables balises en même taille des fenêtres dans l'ensemble du génome, dans lequel le rapport de densité normale de l'étiquette a été définie comme 1.0. Nous avons identifié les régions subchromosomal distinctes de densité de tag augmenté à 8q24.21, 12p12.1 et 12p13.33, et une diminution de la densité des mots-clés 9p21.3 et le bras long du chromosome 18 (Figure 2, les fichiers supplémentaires 9a-d). Les régions de densité accrue d'étiquette (12p12.1, 12p13.33 et 8q24.21) contenaient KRAS
, CACNA1C
(canal de calcium, dépendant de la tension, le type de l, sous-unité alpha-1c) et MYC
loci, respectivement. l'analyse par transfert de Southern a confirmé que KRAS
et MYC
ont été amplifiés dans les cellules HSC45 (9e fichier supplémentaire). Chaque changement quantifiée nombre de copies tel que déterminé à partir quantitative PCR en temps réel (qPCR) de l'ADN génomique a été remarquablement similaire à celle estimée par DGS lorsque la taille de la fenêtre pour l'analyse de la densité de la balise a été adaptée à la taille de chaque modification (fichier supplémentaire 9a-d ). Ces résultats suggèrent que l'analyse de la densité de la balise par DGS pourrait être utilisé pour effectuer des copies d'analyse de numéro dans le génome humain. Figure 2: Détection de l'augmentation du nombre de copies sur les chromosomes 8q et 12p par DGS dans les cellules cancéreuses gastriques HSC45. (A) une vue du génome entier du rapport de la densité de l'étiquette (en utilisant une fenêtre de 1000 balises virtuelles) dans des cellules HSC45 tel que déterminé par la DGS. Les valeurs sur l'axe des y indiquent facteurs de variation de la densité de l'étiquette par rapport à la densité de l'étiquette moyenne de l'ensemble du génome, et représentent la teneur en ADN par génome haploïde, dans les fenêtres. L'axe des abscisses représente le nombre de chromosomes. (B et c) vue élargie des rapports de densité d'étiquette sur les chromosomes 8 (b) et 12 (c). Dans chaque panneau, le graphique supérieur montre une vue entière chromosome du rapport de densité de tag (basé sur une fenêtre de 1000 balises virtuelles). Le graphique du bas montre une vue agrandie de 8q24.21 et 12p12.1, en ce qui a augmenté la densité de la balise a été détectée en utilisant des fenêtres de 1000 et 500 balises virtuelles. réelles balises uniques sont indiquées sous forme de barres verticales noires et étiquettes virtuelles uniques sont indiquées en bleu (60 pb ou plus court) ou bleu clair (plus de 60 pb) barres en mode dense. Les positions des gènes RefSeq, avec quelques isoformes d'épissage omis, sont présentés au bas des panneaux inférieurs.
Amplification de KRAS
dans des lignées cellulaires de cancer gastrique
Analyse des 26 loci à l'intérieur et flanquant immédiatement chromosome 12p12. 1 dans les cellules HSC45 par qPCR ont démontré qu'une région d'environ 500 kb, qui comprend le locus du gène de la KRAS, a été amplifié (amplification de 8 fois, la figure 3a). Genomic qPCR dépistage détecté KRAS de l'amplification en deux lignes supplémentaires de cellules de cancer gastrique, SH101P4 (18 fois) et MKN1 (13 fois) (Figure 3a), alors que nous ne détectons une amplification de plus de 4 fois dans 17 autres gastriques lignes de cellules cancéreuses, ou dans 10 le cancer du côlon et de 11 lignées de cellules du cancer du pancréas (voir la liste dans le fichier, les données supplémentaires 1 non représenté). DGS a également détecté une amplification du locus du gène KRAS dans MKN1 cellules (fichier supplémentaire 10). Les gènes voisins de KRAS
dans la amplicon minimale étaient LRMP
(protéine de membrane lymphoïde restreinte), (susceptibilité au cancer candidat 1) de CASC1 et LYRM5 s (motif LYR contenant 5). BCAT1
(ramifiés aminotransférase de chaîne 1, cytosolique) a également été amplifiée dans les cellules et SH101P4 MKN1, mais pas dans les cellules HSC45. Nous avons confirmé que CACNA1C
a été amplifié dans les cellules HSC45, mais pas dans les autres gastriques, du côlon, ou de lignées cellulaires de cancer du pancréas à l'aide de l'analyse génomique qPCR (9b fichiers supplémentaires; données non présentées). Ni NRAS
, HRAS
ni BRAF
amplifications ont été détectés dans les lignes ci-dessus de cellules cancéreuses par l'analyse génomique qPCR (données non présentées). L'amplification du gène KRAS
a également été vérifiée par une double analyse couleur FISH, dans lequel l'amplicon du KRAS était évident comme une région homogène teinté dans HSC45, les cellules SH101P4 et MKN1 (Figure 3b). Figure 3 L'amplification génique du gène KRAS dans les cellules cancéreuses gastriques. (A) l'analyse par PCR quantitative génomique du locus des KRAS à 12p12.1 dans les cellules HSC45. amplifications discrets à 12p12.1 dans deux autres lignées cellulaires de cancer gastrique ont également été détectés (SH101P4 et MKN1). ADN nombre de copies par rapport à l'ADN leucocytaire diploïde normale a été tracée contre la position chromosomique de nucléotides (en mégabases). Les positions des gènes RefSeq dans les régions correspondantes sont représentées sur la carte du bas. La région d'amplification minimum commun à tous les 3 lignées cellulaires de cancer gastrique est représenté par la barre de couleur orange. (B) Metaphase (à gauche) - et interphase (à droite) analyse -Poissons du locus des KRAS amplifiés dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Le KRAS de sonde spécifique de est en jaune, et la sonde de contrôle, spécifique pour le bras long du chromosome 12, est en rouge. Tétraploïdie en HSC45 et triploïdie dans les cellules SH101P4 et MKN1 ont été observées. (C) analyse en temps réel RT-PCR quantitative de l'expression de l'ARNm de KRAS dans les cellules de cancer gastrique avec 12p12.1 amplification. Analyse de l'expression des gènes (KRAS, PGRT, CASC1 hôtels et LYRM5
) situé dans l'amplicon minimale et BCAT1
, qui flanque l'amplicon minimale, a été réalisée en utilisant en temps réel RT-PCR. Les niveaux d'expression ont été normalisés par rapport à la GAPDH de l'ARNm, et sont représentées par un dégradé de couleur, par rapport à l'estomac normal. L'amplification du gène et de la mutation (codon 12 ou 13) le statut de KRAS
pour chaque échantillon est résumé dans les deux colonnes de droite. Les cercles pleins indiquent la présence d'amplification ou mutation de KRAS
, et les cercles ouverts indiquent aucune amplification ou aucune mutation du gène KRAS
.
analyse de la séquence du gène KRAS de (11a de fichier supplémentaire) a montré que les deux HSC45 et cellules SH101P4 hébergeaient une mutation dans le codon 12 qui a abouti à une substitution d'un seul acide aminé dans KRAS (GGT → GTT, G12V), alors que les cellules MKN1 manquaient KRAS de les mutations. La présence de KRAS de les mutations dans AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) et les cellules HCT116 (G13D) a été rapporté précédemment [28, 29]. Sur les dix PCR clones de KRAS
à partir de cellules HSC45 et SH101P4 qui ont été soumis à une analyse mutationnelle, huit et trois, respectivement, des mutations dans le codon 12. En outre hébergé, l'analyse génomique par PCR en temps réel en utilisant des sondes qui étaient spécifiques aux sauvages type et les allèles de KRAS mutant (fichier supplémentaire 11b) ont également révélé que HSC45 et les cellules SH101P4 contiennent des proportions différentes de l'allèle mutant (80% et 50%, respectivement). Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que l'amplification de l'allèle d'un KRAS mutant se produit également dans les cellules HSC45 et SH101P4.
Nous avons ensuite étudié les niveaux de KRAS de l'ARNm dans les cellules cancéreuses gastriques -amplified de KRAS par réelle quantitative -temps RT-PCR (qRT-PCR) (figure 3c). Les niveaux de KRAS de l'ARNm en corrélation significative avec le nombre de copies de KRAS. Les gènes voisins LYRM5 de
et CASC1
qui localisés à l'amplicon minimal, ont également été exprimées à des niveaux plus élevés dans les cellules avec une amplification par rapport aux cellules sans amplification (Figure 3c). Fait intéressant, LRMP
a été régulée à la baisse dans les cellules cancéreuses par rapport aux cellules normales de l'estomac. analyse immunoblot des protéines RAS (figure 4a) a révélé que l'expression du gène KRAS a été augmentée en -amplified gastriques cellules cancéreuses de KRAS (HSC45, SH101P4 et MKN1), alors que ni NRAS ni HRAS ont été fortement exprimés (figure 4a; données non présentées ). Bien que l'expression de laissez-7c et laissez-7g microARN a été rapporté pour réguler l'expression RAS [8], nous avons trouvé peu de corrélation d'expression de ces microARN avec des niveaux de protéine KRAS (fichier supplémentaire 12), qui a suggéré que KRAS surexpression dans le cancer gastrique lignées cellulaires est principalement due à l'amplification génomique de KRAS
. Figure 4 surexpression de KRAS, et l'activation différentielle de KRAS, p44 /42 MAP kinase et AKT dans KRAS -amplified cellules de cancer gastrique. (A) Analyse par immunotransfert des taux d'expression de KRAS et les ARN dans les cellules cancéreuses. expression actine a été analysée comme un contrôle de chargement. (B) Le niveau de base de GTP-KRAS était nettement élevée dans les cellules de cancer gastrique avec (HSC45 et SH101P4) de KRAS mutant amplifiés. lysat total (500 pg) a été soumis à un essai de traction vers le bas GTP-RAS et GTP GTP KRAS et NRAS ont été détectés par immunobuvardage en utilisant des anticorps anti-anti NRAS KRAS et, respectivement. lysat cellulaire total (50 ug) a été analysée en parallèle pour déterminer le niveau d'expression de KRAS et les ARN dans les cellules. (C) GTP-KRAS a été élevée après stimulation du sérum dans les cellules MKN1. Les cellules ont été cultivées dans un milieu normal, contenant 10% de FCS (N), privées de sérum pendant 24 h (-) ou privées de sérum, puis stimulées avec 10% de FCS pendant 1 h (+). lysat cellulaire total a été soumis à un essai de traction vers le bas GTP KRAS. (D) L'activation de p44 /42 et de la MAP kinase AKT dans les cellules cancéreuses gastriques privées de sérum ou stimulée. lysat cellulaire total a été analysé comme décrit pour la figure c.

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