Roman metoda, digitalni genom skeniranje zazna KRAS amplifikacijo gena v želodcu raka: udeležba prekomerno divjim tipom KRAS v prodajnem signalizacijo in raka celice growth

novo metodo, digitalni genom skeniranje zazna Kras
amplifikacijo gena v želodcu raka: vključevanje prekomerno divjega tipa KRAS v signalizacije in raka rasti nadaljnjega celic
Abstract
Ozadje
raka želodca je tretji najpogostejši malignom, ki vplivajo na splošno populacijo po vsem svetu. Aberrant aktivacija KRAS je ključni dejavnik pri razvoju številnih vrst tumorja pa onkogenih mutacij KRAS
so redek pojav pri raku želodca. Razvili smo novo kvantitativno metodo analize števila kopij DNA, imenovano digitalno genoma skeniranje (GD), ki temelji na štetje kratkih restrikcijskih fragmentov, in ne vključuje PCR ali hibridizacijo. V sedanji raziskavi smo uporabili zajamčenih vlog za raziskavo copy-številčne spremembe v želodcu rakavih celic.
Metode
je DGS želodca raka celičnih linij izvajajo z uporabo zaporedja 5000 do 15000 restrikcijskih fragmentov. pregledani smo 20 želodčni rak celične linije in 86 osnovnih želodčnih tumorjev za Kras
ojačanje ga kvantitativno PCR, in raziskovali Kras
ojačanje na DNK, mRNA in beljakovin ravni, kar mutacijsko analizo PCR v realnem času, analiza imunoblot, GTP -RAS spustnem test in imunohistokemični analiza. Učinek KRAS
je pregledal imunoblot in kolorimetričnim testom oz knock-down na aktivacijo p44 /42 MAP kinaze in AKT in rast celic.
Rezultati
DGS analizo HSC45 želodčne celice raka linija pokazala pomnoževanja 500 kb regije na kromosomu 12p12.1, ki vsebuje Krasu
genski lokus. Amplification Krasa
locus so odkrili pri 15% (3/20) želodca raka celičnih linij (8-18-kratno ojačanja) in 4,7% (4/86) primarnih želodčnih tumorjev (8-50-kratno ojačanje ). KRAS
mutacije so bile ugotovljene pri dveh od treh celičnih linij, v kateri KRAS
smo pomnožili, vendar niso bili odkriti v kateremkoli izmed primarnih tumorjev. Čezmerno KRAS beljakovin povezana neposredno s povečano Kras
številu kopij. Stopnja GTP vezani KRAS je bila povzdignjena po stimulaciji serumu v celicah z ojačeno z divjim tipom KRAS
, vendar ne v celicah z ojačeno mutiranim KRAS
. Knock navzdol Krasa
v želodcu rakave celice, ki prenesejo, ojačani z divjim tipom KRAS
povzročilo inhibicijo celične rasti in zatiranje P44 /42 MAP kinaze in AKT dejavnosti.
Zaključek
Naša študija poudarja uporabnost sistema zajamčenih vlog za prepoznavanje copy-število sprememb. Uporaba sistema zajamčenih vlog, smo ugotovili KRAS
kot gena, ki je dopolnjena z rakom človeške želodčne. Pokazali smo, da je pomnožitev gena verjetno predstavlja molekularno osnovo overactivation Krasa raka želodca. Dodatne študije z uporabo večjega kohorto želodčnih vzorcev raka morajo določiti diagnostične in terapevtske posledice Krasa
pomnoževanje in prekomerno.
Ozadje
raka želodca je tretji najpogostejši malignom, ki vplivajo na splošno populacijo na svetu [1 ]. Posebne genetske spremembe so poročali pri raku želodca, vključno z ojačanji KSAM
, MET
in erbB2
in mutacijami p53
, APC
in CDH1
[2] . Medtem ko je dobiček-of-funkcijo mutacije KRAS
so nekatere od najbolj pogosto opaziti genskih sprememb v različnih tumorjev, vključno trebušne slinavke (60%), žolčevodov (33%) in debelega črevesa (32%) [3], te mutacije so redek pojav pri raku želodca (2-7%) [4-7]. Na splošno velja, Ras
mutacije, povezane z tumorigeneze "lock" RAS v aktivnem-GTP vezani stanju. GTP-RAS veže na število efektorskih proteinov za spodbujanje nadaljnjim signalizacijskim poti, med katerimi so RAF-MAP kinaze kaskadnega in fosfatidilinozitol 3-kinazo (PI3K) -AKT poti rasti celic in onkogenezo najboljše označen [3]. Podaljšanim aktivacija RAS se lahko pojavi tudi z mehanizmi, ki ne vključujejo mutacije pri RAS. Na primer, zmanjšano izražanje pustijo-7 microRNAs, ki zatira RAS z usmerjanjem 3'untranslated regijo Ras
mRNA, ki je pogosto povezana z višjo stopnjo RAS beljakovin v tumorjih [8]. Doslej so molekularne mehanizme onkogenih aktivacije RAS raka želodca niso povsem pojasnjen.
Pomnoževanje genomskih sekvenc, ki vsebujejo gene, ki so kritični za rast celic, je eden glavnih mehanizmov aktiviranja onkogenov pri raku, in pogosto povezana z napredovanja tumorja, slabo prognozo in /ali odpornosti na zdravila [9]. Izmed številnih metod, so trenutno na voljo za odkrivanje genoma široko številka copy spremembe, sedanji zlati standard je matrika CGH metoda (aCGH). V zadnjih nekaj letih se je resolucija aCGH hitro izboljšati z uporabo oligonukleotidnih sond, pa je presegel aCGH uporabo standardnih sonde koncentracije alkohola v krvi [10]. Vendar aCGH prav tako občutljiv na inherentne hrup meritev intenzivnosti temelji na hibridizacije, kot je kakovost signala vplivala ponavljajočih se sekvencah in je odvisna od kakovosti sondo [11]. Pravzaprav je optimizacija oblikovanje sonde bil velik izziv pri razvoju polaganje ploščic nizi [12, 13] je bil.
Digital kariotip (DK) razvili Wang et al. [14], in ni omejen z lastnimi problemi tehnik nizov. DK vključuje digitalno naštevanje kratkih fragmentov genomske DNA (ti tags), ki zagotavlja kvantitativno merjenje števila kopij DNA s pomočjo analize gostote oznake vzdolž vsakega kromosoma. DK je bil uspešno uporablja za različne vrste tumorja za odkrivanje copy-število sprememb, vključno s pomnoževanjem TYMS
, RSF1
in OTX2
in izbris MKK4
in distrofinske
[ ,,,0],15-19]. Kljub učinkovitosti DK, je tehnično zahtevna za širše aplikacije, saj vključuje PCR pomnoževanja in ustvarjanje oznak za 21 baznih parov (bt) v dolžini natančno predstavljajo lokacijo kromosomsko zanimanja.
Poročamo tukaj razvoj metode nove, imenovane zajamčenih vlog, za kvantitativno analizo kopiranja variacije števil, ki temelji na konceptu tag štetje DK, vendar pa uporablja poenostavljen postopek priprave oznak. DGS želodcu raka celičnih linij zaznali pomnoževanje Krasu
lokus na kromosomu 12p12.1. Naši rezultati zagotavljajo molekularno osnovo za overactivation Krasa, in kažejo, da se lahko aktivacija KRAS dolvodno signalnih dogodkov, spodbujanje širjenja želodčni rak celic.
Metode
Celične linije in tkiv
celičnih linij analizirane v toku študija so navedeni v dodatni datoteki 1. celične linije HSC in SH101P4 sta bila ustanovljena z Kazuyoshi Yanagihara [20]; vsi drugi so bili pridobljeni iz American Type Culture Collection ali japonski zbirke raziskovalnih BioResources (Tokyo, Japonska). Vse celične linije kultiviramo pri priporočenih medijih. Za stimulacijo seruma smo celice inkubirali v mediju, ki niso imeli seruma za 24 ur (h) in nato bodisi nestimulirano ali stimulirano za 1 uro pri medijih, ki vsebujejo 10% fetalnega telečjega seruma (FCS). Primarni želodca vzorce raka smo pridobili iz oddelka za kirurgijo, Keiyukai Sapporo Hospital, z informirano soglasje iz vsakega bolnika. Genomsko DNA smo ekstrahirali z metodo fenol-kloroform, ki mu sledi zdravljenje RNaze. Total RNA je bila vzeta s pomočjo TRIzola (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA), v skladu z navodili proizvajalca. Genomsko DNA normalnih levkocitov periferne krvi (Biochain, Hayward, CA, ZDA) in celotno RNA iz normalnega želodčne sluznice zdravih posameznikih (Biochain in Invitrogen) so bile kupljene. Primarni želodca raka so razvrščena na clinicopathological funkcije, kot je prikazano v dodatni datoteki 2, v skladu s shemo razvrščanja pTNM (5. izdaja, 1997) [21] in klasifikacijskega sistema na Lauren [22]. KRAS
stanje -amplification glede na starost je bila v primerjavi s testom Student t; glede na razred, status pT, status PN, in fazo bolezni s testom Mann-Whitney U; in glede na spol, histologijo in status pM pomočjo natančnega testa Fisher. Vsi testi so bili 2-repa in P
vrednost < 0.05 smo imeli statistično značilne.
Digitalni genom skeniranje
Na kratko, 40 mikrogramov genomske DNA izpostavimo restrikcijsko encimsko digestijo uporabo MBO
I (Takara, Tokio, Japonska), in nato ločimo z elektroforezo na 3% Nusieve GTG agaroznega gela. Kratki fragmenti (30-60 bp, skupen izraz prave oznake) so elektroeluiramo, sestavljenim in subklonirali v Bam
HI-prebavi pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) z raztopino Mighty Mix DNA ligacijskega (Takara). Escherichia coli
DH10B bila transformirana z rekombinantnim plazmidov so bile transformanti združili in plazmid DNA čistimo za ustvarjanje 1. knjižnico. Concatemers realnih oznak smo izrezali z Spe
I /PST
I razklopom iz 1. knjižnice, in smo elektroeluiramo, sestavljenim in subkloniramo v pBluescript II KS + ustvariti 2. knjižnico fragmenti v območju od 140 do 800 bp. Drugi knjižnica plazmidi, ki vsebujejo concatemers SPE
I /Pst
so fragmenti I sekvenco uporabo ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA), v skladu z navodili proizvajalca. Edinstvene pravi oznake so preslikani v človeških kromosomov sekvenc in gostota tag, ki je opredeljena kot razmerje med dejanskimi oznake do virtualnih oznak nad premikanjem okna, je bila izračunana za odkrivanje nepravilnosti v vsebini DNK uporabljajo mejne vrednosti, ki jih je določil zajamčenih vlog simulacij. Tag pozicije in razmerja gostote tag smo prikazali uporabo Skladbe meri in genoma in tokov iz University of California, Santa Cruz (UCSC) genoma brskalnika (marec 2006 zamrznitev, hg18) [23-25]. Podrobni protokoli za sistem zajamčenih vlog, virtualno karakterizacijo tag in silico
simulacije so na voljo v dodatni datoteki 3.
Kvantitativni PCR v realnem času
Relativno število kopij DNA je bila določena s kvantitativno PCR v realnem času z uporabo SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) in ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). vsebnost DNA na haploidnega genoma je bil normaliziran, da ponavljajoče elementa, Line-1, in izračuna primerjalni CT (ΔΔCT) relativna metoda kvantifikacije s pomočjo formule 2 (Nt
- PLETNA
) - ( xt
- Xline
), kjer
t
je število prag cikel opazovati poskusno temeljni premaz pri normalnem levkocitov DNA, N
linija
N število prag cikel upoštevati pri Line-1 osnovni premaz pri normalnem levkocitov DNA, Xt
je povprečno število prag cikel upoštevati pri eksperimentalnem temeljni premaz na rakave celice DNK, in X
linija
je povprečno število prag cikel upoštevati pri Line-1 osnovni premaz na rakave celice DNK [14]. Genomsko pomnoževanje je bil definiran kot večji kot 4-kratno povečanje vsebnosti DNA. V začetnih oligonukleotidov zaporedja za vsako rastišče so na voljo v dodatni datoteki 4. alelna delež mutiranih KRAS
(G12V, GGT → GTT) je bila določena z zaposlujejo spremenjen v realnem času postopka PCR po Itabashi et al
[26 ]. Podroben protokol je na voljo v dodatni datoteki 3. cDNK smo pripravili s pomočjo nadpisano III reverzno transkriptazo (RT, Invitrogen) in raven mRNA vsakega gena določimo z realnem času RT-PCR z uporabo TaqMan Gene Expression Vsebnost (Applied Biosystems) . Relativne ravni mRNA smo izračunali po metodi primerjalni CT uporabo GAPDH
kot endogeni kontrolo. nize primer /sonda, ki se uporabljajo, so prikazani v dodatni datoteki 5.
fluorescence in situ
hibridizacija (FISH)
koncentracije alkohola v krvi, ki vsebuje Krasu
locus (RP11-636P12) in kromosomsko 12q24.2 (RP11 -91M21) so označeni s Cy3 in Cy5, v tem zaporedju, in nato inkubirali s tobogani, pripravljene z medfaznih in metafaznih kromosomov. Jedra so bili nasprotni obarvali s 4 ", 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) in diapozitivi so bili analizirani s pomočjo fluorescence mikroskopom (Leica CW-4000).
Mutacij analiza KRAS
in PIK3CA

Amplified genomske fragmente ali zaporedje neposredno ali subklonirali uporabo TOPO TA-kloniranje komplet (Invitrogen) in nato zaporedju. Vsaj deset klonov iz dveh neodvisnih PCR teste na zemljišču so sekvenco uporabo M13 naprej in nazaj, temeljni premazi (Invitrogen). Sekvence oligonukleotidnih začetnikov uporabili za pomnoževanje Kras
(eksonov 1 in 2) in PIK3CA
(eksoni 9 in 20) so prikazani v dodatni datoteki 6.
imunoblot analizo
smo celice lizirali v lizo pufer, ki vsebuje 20 mM Tris-HCl (pH7.5) blažilnika, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 10% glicerol, 10 mM Naf, 1 mM natrijevega vanadata, 50 mM β-glicerofosfat, 1 mM phenylmethansulfonyl fluorid , 1 mM ditiotreitola in koktajl inhibitor proteaze (Roche, Mannheim, Nemčija). Proteine ​​smo ločili s SDS-PAGE in electroblotted na izvedeni Immobilon-P membrano (Millipore, Billerica, MA, ZDA). Membrane smo analizirali z imunoblot uporabo naslednjih protiteles, kot je navedeno: miška monoklonsko anti-KRAS, -NRAS in -HRAS protitelesa (sc-30, SC-31 in SC-29, v tem zaporedju, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ZDA); anti-aktina protitelesa (Millipore); rabbit poliklonalni anti-p44 /42 MAP kinaze, -phosho-p44 /42 MAP kinaze (Thr202 /Tyr204), -Akt in -phospho-Akt (Ser473) antiserumi (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ZDA).
GTP-RAS spustnem test
aktivacija RAS je bila odkrita z uporabo EZ-Detect Ras Activation Kit (Pierce, Rockford, IL, ZDA). Na kratko, je celični lizat (500 mikrogramov) inkubiramo z imobiliziranim Raf1 Ras-veznim področjem pripojenega na glutation S-transferaze (GST-Raf1-RBD). Precipitate smo sprali 3-krat, in vezane proteine ​​smo eluirali s kuhanjem v 5 minutah (min). Beljakovine so razrešili na 12% poliakrilamidnem gelu, prenese na Immobilon-P membrane za, in podvržejo analizi imunoblot uporabo anti-KRAS, -NRAS, ali -HRAS protitelesa.
Interference RNA
po meri izdelana KRAS A
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), ki je usmerjena na Krasu
, ki ni povezan z znanimi onkogenih mutacij, sintetiziramo z Dharmacon (Lafayette, Co., ZDA). siRNAs ciljanje LRMP
, LYRM5
in CASC1
so kupili od Ambion (No.144181, 284911 in 147715). Univerzalna niso usmerjene siRNA (nespecifičnega nadzor VII, Dharmacon) uporabimo kot negativno kontrolo. V vsakem poskusu, 5 x 10 6 celic so transfekciji s 7,5 ul po 20 LM siRNA z elektroporacijo (Amaxa, Köln, Nemčija) z uporabo Nucleofector komplet V ali T, v skladu z navodili proizvajalca.
Cell proliferacije
po transfekciji s siRNAs, želodčni rak celičnih linij HSC45, MKN1, AGS in NUGC4 smo zasejali v 96 vdolbinami z gostoto 8000 celic /100 ml v standardnem mediju, ki vsebuje 10% FCS. Cell število na 48, 72 in 96 h post-transfekciji je bila določena posredno s kolorimetrično testu, ki uporablja mobilni Counting Kit-8 raztopino (Dojindo, Kumamoto, Japonska). Test temelji na redukcijo tetracolij soli ([2- (2-metoksi-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfofenil) -2-tetrazolij mononatrijeve soli], WST -8) in se uporablja kot merilo živih celic. Absorbanco vsake vdolbine pri 450 nm smo merili z uporabo mikroploščnega čitalnika (Model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA).
Pretočna citometrija
Pretočna citometrija je bila izvedena kot prej [27] opisano. Na kratko, požanjemo adherentne in dodeljeni celic, določen pri 90% hladnim etanolom, obdelanega z RNazo A (500 enot /ml) in nato obarvali s propidijevim jodidom (50 mg /ml). Za vsak vzorec smo analizirali 30.000 dogodki pomočjo platforme za analizo celičnega ciklusa programa FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, ZDA).
Imunohistokemija
formalin določen, so deparaffinized-parafin vgrajeni deli želodčnih tumorjev, hidrirani in jo nato obdelamo z raztopino peroksidaze blokiranje (3% H 2O 2 v metanol). Oddelki so bili v avtoklavu pri 105 ° C za 10 minut v ciljni arhiviranje raztopine (Dako, Glostrup, Danska). Oddelki so inkubirana z miško anti-KRAS protitelesa. (1: 100 redčenje; Santa Cruz Biotechnology) za 1 uro pri sobni temperaturi, in radioinkorporacijo smo ugotovili s pomočjo ENVISION-Plus reagentov (Dako)
Rezultati
Digital genoma skeniranje in karakterizacija virtualnih oznak v silicij
Digital genom skeniranje (GD) je metoda za kvantificiranje gen število kopij, ki jih naštevanjem kratkih fragmentov genomske DNA (imenovana prave oznake), ki nastajajo eksperimentalno MBO
I endonukleazo prebavo (Slika 1a). Za odpravo zapletenih korakov, ki sodelujejo pri pripravi tag, smo računsko značilna kratkih DNK fragmente, ki jih proizvaja en sam restrikcijsko encimsko prebavo z MBO
I, ki priznava 4-bp zaporedje kode GATC. Silico
prebave človeškega genoma, ki ga MBO
I proizvedeno približno 1,6 milijona restrikcijskih fragmentov (imenovane virtualne oznake) v območju od 20-130 bp (Dodatna datoteka 7a). Nukleotidov, sekvenčna analiza je pokazala, da je približno 65% virtualnih oznak vsebuje ponavljajoče sekvence, kot je opredeljeno v javne zbirke podatkov o ponovnih elementov (Dodatna datoteka 7a). Pomembno je, da zaporedje ujemanje z genoma podatkovno bazo človeškega pokazala, da je približno 85% virtualnih oznak preslika nedvomno natančnih lokacij kromosomskih (Dodatni datoteka 7b, c). Tudi če virtualne oznake vključujejo ponavljajoče sekvence v delu, približno 80% ponavljajočih oznak izkazalo, da je edinstvena. Povprečna razdalja med dvema unikatnih virtualnimi oznake za 30 do 60 bp v dolžini je bilo 7,6 kb, mediana razdalja je 4,5 kb in 97,8% intervalov je bilo krajših od 30 kb (Dodatni datoteka 7d). virtualne oznake so opazili podobne značilnosti interval tag razpon 70 do 100 bp (povprečna razdalja, 7.9 kb; srednjo razdaljo, 4,8 kb, 97,4% je bilo krajših od 30 kb) in 100-130 bp (povprečna razdalja, 7,9 kb; srednja razdalja 4,9 kb,.. je bilo 97,4% krajši od 30 kb (Dodatni datoteka 7e, f) Poleg tega je bila gostota edinstvenih virtualnih oznak skoraj enaka v vsakem kromosomu (Dodatna datoteka 7g) To silico
ugotovitve kažejo, da večina kratkem MBO
bi oznake I informativne za sistem zajamčenih vlog. Slika 1 zajamčenih vlog in pripravo pravih oznak. (a) Shematski oris DGS. škatel Colored predstavljajo genomske MBO
I pravi oznak. Glej besedilo za podrobnosti. (b in c) Priprava (b) in karakterizacija (c) realnih oznak. Reprezentativni rezultati z uporabo genomske DNA iz MKN1 raka želodca celice so prikazani. (b) Kratke fragmente MBO
I-prebavljeni genomske DNA (30 do 60 bp) smo elektroeluiramo iz agaroznega gela (i), sestavljenim in subkloniramo. Dobljene rekombinantne plazmide zberemo ustvariti 1. knjižnice (ii). Dolge concatemers (140-800 bp) smo izrezali iz 1st vektorjev knjižnice, elektroeluiramo (iii), sestavljenim in subkloniramo. Dobljene rekombinantne plazmide predstavljajo 2nd knjižnice klonov (iv). Število oznak, vsebovanih v vsaki klona je prikazana na vrhu vsakega pasu. Vložki so pregledali Xho
I /Sac
sem prebavo v plošče (ii) in (iv). * vektorskih fragmentov; ** Spe
I /Pst
I prebavo mesta večkratni kloniranje brez vložka. (C) Dejansko število pravih oznak iz 2. knjižnice je prikazano v histogram (levo), in njihove značilnosti so povzete (desno).
DGS simulacije na silicij
Sposobnost sistema zajamčenih vlog za odkrivanje genoma -Wide spremembe temelji na značilnostih genomu, kot sta številu kopij in velikosti sprememb in števila dejanskih oznak dobljenih iz sekvenčno analizo. Napovedati velikost spremembe, da bi lahko zanesljivo zazna, glede na določeno število računsko vzorčenih oznak, smo uporabili Monte Carlo simulacije za izračun pozitivno napovedno vrednost (PPV), ki je verjetnost, da je zaznana sprememba predstavlja resnično spremembo. Na primer, smo ugotovili, da lahko analiza 5000 tags zanesljivo zaznati 10-kratno ojačanje 500 kb, homozigoten izbris 7,5 Mb, ali eno samo izgubo kopijo za 30 Mb regije, vendar ni mogel zaznati subchromosomal pridobili manjši od 30 Mb (Dodatni datotek 8). Tako občutljivost in specifičnost odkrivanje te vrste spreminjanja bili > 99% v primerih z visokimi PPV (> 90%)., Ki je pokazala, da je ne omejujoč dejavnik pri tej analizi (podatki niso prikazani)
Priprava pravi oznake iz človeškega genoma
DNK za generalne direktorate za rakom želodca celičnih linij HSC45 in MKN1, smo pripravili knjižnice pravih oznak iz genomske DNA, kot je prikazano na sliki 1a. V MBO
I-prebavi genomske DNA je velikost razbita (30-60 bp) in na njem concatemerization, sledila izgradnja 2. knjižnice, ki je vsebovala približno 10 pravih oznak klonom (slika 1b). Analiza nukleotidno zaporedje dejanskih oznak, je pokazala, da 85,8% preslika v edinstvenih položajih, kar je bilo v skladu z našo karakterizacijo virtualnih oznak (slika 1c).
ojačitve na kromosomu 12p v HSC45 raka želodca celic
genoma vsej oznako profil gostota HSC45 celic smo določili z uporabo skupno 5,462 edinstvenih pravih oznak. Da bi dosegli visoko ločljivost in občutljivost z eksperimentalnimi podatki, smo uporabili velikosti oken za 1000 in 2100 virtualnih oznake (približno 2.300 kb in 4700 kb) za analizo ojačanj in izbrisi oz. Razmerje gostota oznaka je bila izračunana kot vsota dejanskih oznak deljeno s povprečnim številom realnih oznake v enakih velikosti oken celotni genom, v katerem je razmerje normalna gostota oznaka definirana kot 1,0. Identificirali smo različne subchromosomal regije povečane gostote oznake na 8q24.21, 12p12.1 in 12p13.33, in zmanjšano gostoto tag na 9p21.3 in dolgo roko kromosoma 18 (slika 2, Dodatna datoteka 9a-d). Regije povečane gostote oznake (12p12.1, 12p13.33 in 8q24.21) vsebuje KRAS
, CACNA1C
(kalcijevih kanalov, napetosti odvisnih tipa l, alfa-1c podenote) in myc
loci oz. Southern blot analiza je potrdila, da je KRAS
in MYC
smo pomnožili v HSC45 celic (Dodatni datoteka 9e). Vsak kvantitativno spremembo copy-številko, kot je določena s kvantitativno PCR v realnem času (qPCR) genomske DNK je izredno podoben tistemu, ki po oceni sistem zajamčenih vlog, ko je velikost okna za analizo gostote tag ujema z velikostjo vsake spremembe (Dodatna datoteka 9a-d ). Ti rezultati kažejo, da je analiza gostote tag, ki ga sistem zajamčenih vlog, se lahko uporabijo za izvedbo kopiranja analizo številko celotnem človeškem genomu. Slika 2 Odkrivanje povečanim številom kopij na kromosomi 8q in 12p generalni direktorati v HSC45 raka želodca celic. (A) pogled celotnega genoma razmerja gostote oznake (z uporabo okno 1000 virtualnih oznak) v HSC45 celicah, kot je določeno z zajamčenih vlog. Vrednosti na y-osi kažejo raztegljiv spremembe gostote oznaka glede na povprečno gostoto tag celotnega genoma, in predstavljajo vsebino DNK na haploidnega genoma, v operacijskem sistemu Windows. X-os predstavlja kromosomsko število. (B in c) Razširjen pogled razmerij gostote oznake na kromosomih 8 (b) in 12 (c). V vsaki plošči, zgornji graf prikazuje pogled na celih kromosomov razmerja gostote tag (ki temelji na okno 1000 virtualnih tags). Spodnji graf prikazuje razširjen pogled na 8q24.21 in 12p12.1, v kateri je gostota tag je bila odkrita s pomočjo oken 1000 in 500 virtualnih oznake povečano. Edinstvene pravi oznake so označeni kot črne navpične palice, in edinstvenih virtualne oznake so navedene v modri (60 bp ali krajši) ali svetlo modre (dlje kot 60 bp), bari v gosto načinu. Stališča refseq genov, z nekaterimi spajanje izooblik izpusti, so prikazane na dnu spodnjih plošč.
Pomnoževanje KRAS
v želodcu raka celičnih linijah
Analiza 26 lokusov znotraj in takoj spremljajočih kromosom 12p12. 1 v HSC45 celic z qPCR je pokazala, da je regija približno 500 kb, ki je vključevala Krasu
genski lokus, smo pomnožili (8-kratno ojačanje, slika 3a). Genomske qPCR presejanju najdenih Kras
ojačanja v dveh dodatnih želodčnega raka celičnih linijah, SH101P4 (18-krat) in MKN1 (13-krat) (slika 3a), medtem ko mi ni zaznal ojačanje več kot 4-krat v 17 drugih linije želodčne rakava celica, ali v 10 raka debelega črevesa in 11 pankreatičnih raka celičnih linijah (navedene v dodatni datoteki 1, podatki niso prikazani). DGS zaznali tudi ojačanje Krasu
locus v MKN1 celic (Dodatni datotek 10). Sosednji geni KRAS
v minimalno AMPLICON so LRMP
(-limfnega omejen membrane), CASC1
(rak dovzetnost kandidat 1) in LYRM5
(LYR motiv, ki vsebuje 5). BCAT1
(razvejeno aminotransferaze 1, citosolno) smo pomnožili tudi SH101P4 in MKN1 celicah, vendar ne v HSC45 celicah. Potrdili smo, da je bila CACNA1C
pomnožili v HSC45 celicah, vendar ne v drugih želodca, debelega črevesa ali trebušne slinavke raka celičnih linijah z uporabo genomske analize qPCR (Dodatne datoteke 9b, podatki niso prikazani). Niti nacionalni regulativni organi
, HRAS
niti BRAF
ojačitve bili odkriti v zgornjih vrsticah rakavih celic z genomsko analizo qPCR (podatki niso prikazani). Ojačanje KRAS
je bila preverjena tudi dvojno analizo barva FISH, v katerem je Krasu
pomnožkov očitna kot homogeno, obarvajo regiji HSC45, SH101P4 in MKN1 celic (slika 3b). Slika 3 Gene pomnoževanje KRAS v želodčnih rakavih celic. (A) Kvantitativna genomsko analizo PCR Krasa
locus na 12p12.1 v HSC45 celicah. so bile ugotovljene tudi diskretne ojačitve na 12p12.1 v dveh drugih želodčnih raka celičnih linijah (SH101P4 in MKN1). DNA število kopij glede na normalno diploidna levkocitov DNA odvisnosti kromosomskih nukleotidov položaja (v megabaz). Pozicije refseq genov v ustreznih območjih so prikazani v spodnjem zemljevidu. Minimalna pomnoževanja regija skupna vsem 3 želodčnega raka celičnih linijah predstavlja vrat-oranžno obarvana. (B) metafaza (levo) - in medfazno (desno) -ribe analiza pomnoženih KRAS
locus v želodcu raka celičnih linijah. Kraško
-specifične sonda je v rumeni barvi in ​​je sonda nadzor, specifični za dolgo roko kromosoma 12, je v rdeči barvi. Opazili so tetraploidnost v HSC45 in triploidnost v SH101P4 in MKN1 celic. (C) Kvantitativna realnem času RT-PCR analizo KRAS
mRNA izražanja v želodcu rakavih celic z 12p12.1 ojačanja. Analiza izražanje genov (KRAS, LRMP, CASC1
in LYRM5
), ki se nahajajo znotraj minimalno AMPLICON in BCAT1
, ki boki minimalno amplikona, je bila izvedena z realnem času RT-PCR. stopnje izraženosti smo normalizirali na GAPDH
mRNA in so prikazani kot barvni preliv, relativno glede na normalno želodec. Gen ojačitev in mutacija (kodon 12 ali 13) statusa KRAS
za vsak vzorec je povzeta v pravih dveh stolpcih. Polnjena krogi kažejo na prisotnost ojačanje ali mutacijo KRAS
in odprti krogi ne dopolnijo ali ne mutacijo KRAS
.
Analiza Zaporedje KRAS
(Dodatni datoteke 11a), je pokazala, da sta HSC45 in SH101P4 celice gojila mutacijo v kodon 12, ki je povzročilo v enem substitucijo amino kisline v KRAS (GGT → GTT, G12V), medtem ko MKN1 celice manjkalo Kras
mutacije. Prisotnost KRAS
mutacij v letnem pregledu rasti (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) in HCT116 (G13D) celice, ki je bila pred [28, 29] poročajo. Od desetih PCR klonov KRAS
iz HSC45 in SH101P4 celice, ki so bile izpostavljene mutacijsko analizo, osem in tri, oziroma, gojila mutacije v kodon 12. Nadalje, genomske realnem času analize PCR z uporabo sonde, ki so bili značilni za divje -Type in mutiranih Kras
alelov (Dodatni datoteka 11b), prav tako pokazala, da HSC45 in SH101P4 celice vsebujejo različne deleže mutirane alele (80% in 50%, v tem zaporedju). Na splošno so ti rezultati so pokazali, da pomnoževanje mutanta KRAS
alel se pojavi tudi v HSC45 in SH101P4 celic.
Smo zraven raziskovali ravni KRAS
mRNA na Krasu
-amplified želodčnih rakavih celic s kvantitativno resnično -time RT-PCR (QRT-PCR) (slika 3c). Ravni Kras
mRNA bistveno povezana s Kras
številu kopij. Sosednje geni LYRM5
in CASC1
, ki so lokalizirane na minimalno AMPLICON so bili izraženi tudi na višji ravni v celicah s pomnoževanjem, v primerjavi s celicami, brez ojačanja (slika 3c). Zanimivo je, da LRMP
je navzdol urejena v rakave celice v primerjavi z običajnimi želodčnih celic. Analiza imunoblot Ras proteinov (slika 4a), je pokazala, da je bil izraz KRAS na Krasu
-amplified želodčnih rakavih celic (HSC45, SH101P4 in MKN1) povečala, medtem ko so bili niti nacionalni regulativni organi ne HRAS močno izražena (Slika 4a; podatki niso prikazani ). Čeprav je izraz naj-7c in naj-7g microRNAs so poročali urediti RAS izraz [8], ki smo ga našli majhno korelacijo izražanja teh microRNAs s koncentracijo beljakovin KRAS (Dodatni datotek 12), ki je predlagal, da KRAS prekomerno raka želodca celične linije je predvsem posledica genomske ojačitve KRAS
. Slika 4 Čezmerno KRAS, in razlika aktivacija KRAS, P44 /42 MAP kinaze in AKT v KRAS -amplified želodčne rakave celice. (A) analiza Imunoblot od izražanjem KRAS in nacionalnim regulativnim organom pri rakavih celic. Aktina izraz smo analizirali kot kontrolo obremenitve. (B) bazalni nivo GTP-KRAS je bila precej visoka v želodčnih rakavih celic z ojačeno mutantnim KRAS
(HSC45 in SH101P4). Skupaj lizat (500 mikrogramov), je bil opravljen v spustnem testu GTP-RAS in GTP-KRAS in GTP-nacionalni regulativni organi so odkrile imunoblot uporabo anti-KRAS in protitelesa anti-nacionalnih regulativnih organov, oz. Skupaj celični lizat (50 mikrogramov), je bil analiziran vzporedno, da se določi raven izražanja KRAS in nacionalni regulativni organi v celicah. (C) GTP-KRAS je bila povzdignjena po serumu stimulacije v MKN1 celicah. Celice smo kultivirali v rednem mediju, ki vsebuje 10% FCS (N), serum siromašen 24 h (-) ali-serumskih izstradana nato stimulirali z 10% FCS za 1 uro (+). Skupno celični lizat smo podvržemo GTP-KRAS pull-down testu. (D) Aktiviranje p44 /42 MAP kinaze in AKT v želodčnih rakavih celic, seruma sestradana ali -stimulated.

• Genome vsej število kopij genov in analiza izraz primarnih želodčnih tumorjev in želodčnega raka celičnih linijah
• Mehanizmi prebavila metanola ekstrakt Melastoma malabathricum listov