Un nuovo metodo, la scansione del genoma digitale rileva l'amplificazione del gene KRAS nel cancro gastrico: il coinvolgimento di sovraespresso KRAS wild-type nella segnalazione a valle e delle cellule del cancro growth

un nuovo metodo, la scansione del genoma digitale rileva KRAS
amplificazione genica nel cancro gastrico: il coinvolgimento di sovraespresso KRAS wild-type a valle di segnalazione e il cancro crescita delle cellule
Abstract
sfondo
cancro gastrico è il terzo tumore maligno più comune che colpisce la popolazione in generale in tutto il mondo. attivazione aberrante di KRAS è un fattore chiave per lo sviluppo di molti tipi di tumore, tuttavia, le mutazioni oncogeniche di KRAS Quali sono infrequenti nel carcinoma gastrico. Abbiamo sviluppato un metodo quantitativo romanzo analitico del numero di copie di DNA, denominato digitale genoma scansione (DGS), che si basa sul conteggio dei frammenti di restrizione brevi, e non comporta PCR o ibridazione. In questo studio, abbiamo utilizzato DGS di rilevare alterazioni copia numero di cellule di cancro gastrico.
Metodi
DGS di linee di cellule di cancro gastrico è stata effettuata utilizzando le sequenze di 5000 a 15000 frammenti di restrizione. Abbiamo proiettato 20 linee di cellule di cancro gastrico e 86 tumori gastrici primarie per KRAS
l'amplificazione mediante PCR quantitativa, e indagato KRAS
amplificazione il DNA, mRNA e di proteine ​​livelli di analisi mutazionale, PCR in tempo reale, l'analisi immunoblot, GTP -RAS test di pull-down e analisi immunoistochimica. L'effetto di KRAS
knock-down sulla attivazione di p44 /42 MAP chinasi e AKT e sulla crescita delle cellule sono stati esaminati rispettivamente immunoblot e test colorimetrico,.
Risultati
analisi DGS della cellula cancro gastrico HSC45 linea rivelato l'amplificazione di una regione di 500 kb sul cromosoma 12p12.1, che contiene il KRAS
locus genico. L'amplificazione del KRAS
locus è stata rilevata nel 15% (3/20) delle linee di cellule di cancro gastrico (amplificazione 8-18 volte) e 4,7% (4/86) dei tumori gastrici primari (amplificazione 8-50 volte ). KRAS
mutazioni sono state identificate in due delle tre linee cellulari in cui Kraš
è stato amplificato, ma non sono stati rilevati in nessuno dei tumori primari. Sovraespressione di proteina KRAS correlato direttamente con un aumento del KRAS
numero di copie. Il livello di KRAS GTP-bound è stato elevato in seguito a stimolazione siero in cellule con amplificato KRAS wild-type
, ma non in cellule con amplificata mutante KRAS
. Knock-down di KRAS
in cellule di cancro gastrico che portava amplificato KRAS wild-type
portato alla inibizione della crescita cellulare e la soppressione di p44 /42 MAP chinasi e l'attività AKT.
Conclusione
Il nostro studio mette in evidenza l'utilità di DGS per l'identificazione di alterazioni copia-numero. Utilizzando DGS, abbiamo identificato KRAS
come un gene che viene amplificato nel cancro gastrico umano. Abbiamo dimostrato che l'amplificazione del gene probabilmente costituisce la base molecolare di iperattivazione di KRAS nel cancro gastrico. Ulteriori studi che utilizzano una grande coorte di campioni di cancro gastrico sono necessari per determinare le implicazioni diagnostiche e terapeutiche di KRAS
amplificazione e sovraespressione.
Sfondo
cancro gastrico è il terzo tumore maligno più comune che colpisce la popolazione in generale in tutto il mondo [1 ]. cambiamenti genetici specifici sono stati riportati nel cancro gastrico, comprese le amplificazioni di KSAM
, MET
e ERBB2
, e mutazioni in p53
, APC
, e CDH1
[2] . Mentre guadagno di funzione mutazioni di KRAS
sono alcune delle alterazioni genetiche più comunemente osservati in una varietà di tumori, tra cui pancreas (60%), tratto biliare (33%) e del colon (32%) [3], queste mutazioni non sono frequenti nel carcinoma gastrico (2-7%) [4-7]. In generale, RAS
mutazioni associate a tumori "Lock" RAS in uno stato GTP-bound attiva. GTP-RAS lega ad un certo numero di proteine ​​effettrici per stimolare vie di segnalazione a valle, tra cui il RAF-MAP chinasi in cascata e fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) percorsi -AKT di crescita cellulare e oncogenesi sono i migliori caratterizzati [3]. attivazione prolungata di RAS può avvenire anche attraverso meccanismi che non comportano mutazioni in RAS. Ad esempio, l'espressione di let-7 microRNA, che sopprime RAS di mira la regione 3'untranslated di RAS
mRNA ridotto, è spesso associato un livello di proteina RAS più alto nei tumori [8]. Fino ad oggi, i meccanismi molecolari di attivazione oncogenica di RAS nel cancro gastrico non sono stati completamente chiariti.
Amplificazione di sequenze genomiche contenenti i geni che sono critici per la crescita cellulare è uno dei meccanismi principali di attivazione di oncogeni in cancro, ed è spesso associato con la progressione del tumore, cattiva prognosi e /o resistenza ai farmaci [9]. Tra i numerosi metodi attualmente disponibili per rilevare le alterazioni del numero di copie del genoma a livello, il gold standard attuale è la matrice metodo di CGH (aCGH). Negli ultimi anni, la risoluzione di aCGH è migliorata rapidamente attraverso l'uso di sonde oligonucleotidiche, e ha superato quello dei aCGH utilizzando sonde standard BAC [10]. Tuttavia, aCGH è anche suscettibile al rumore inerente di misure di intensità di ibridazione basato, come la qualità del segnale è affetto da sequenze ripetitive e dipende qualità probe [11]. In realtà, l'ottimizzazione del design della sonda è stata una sfida importante nello sviluppo di array di piastrelle [12, 13].
Cariotipo digitale (DK) è stato sviluppato da Wang et al. [14], e non è limitato dai problemi inerenti di tecniche di matrice. DK comporta l'enumerazione digitale di brevi frammenti di DNA genomico (tag chiamati), che fornisce una misura quantitativa del numero di copie di DNA attraverso l'analisi di densità di tag lungo ciascun cromosoma. DK è stato applicato con successo ad una varietà di tipi di tumore per rilevare alterazioni copia-numero, compreso l'amplificazione di TYMS
, relè RSF1
e OTX2
, e la cancellazione di MKK4
e distrofina
[ ,,,0],15-19]. Nonostante l'efficacia di DK, è tecnicamente difficile per applicazioni generali, perché comporta l'amplificazione PCR e la generazione di tag di coppie 21-basi (bp) di lunghezza per rappresentare con precisione la posizione cromosomica di interesse.
Riportiamo qui la sviluppo di un nuovo metodo, chiamato DGS, per l'analisi quantitativa di variazione del numero di copie, che si basa sul concetto tag conteggio di DK, ma utilizza un processo semplificato di preparazione tag. DGS di linee di cellule di cancro gastrico rilevato l'amplificazione dei KRAS
locus sul cromosoma 12p12.1. I nostri risultati forniscono una base molecolare per l'iperattivazione di KRAS, e suggeriscono che l'attivazione di KRAS eventi di segnalazione a valle può promuovere gastrica proliferazione delle cellule tumorali.
Metodi
linee cellulari e tessuti Aziende Il linee cellulari analizzate nella corrente studio sono elencati nel file di informazioni 1. Le linee di cellule HSC e SH101P4 sono stati stabiliti da Kazuyoshi Yanagihara [20]; tutti gli altri sono stati ottenuti da American Type Culture Collection o la collezione giapponese di risorse biologiche di ricerca (Tokyo, Giappone). Tutte le linee di cellule sono state coltivate nei supporti consigliati. Per la stimolazione siero, le cellule sono state incubate in mezzi che mancava siero per 24 ore (h), e poi o non stimolato, o stimolati per 1 h con supporto contenente 10% di siero fetale bovino (FCS). campioni di cancro gastrico primari sono stati ottenuti dal Dipartimento di Chirurgia, Keiyukai Sapporo Hospital, con il consenso informato da ciascun paziente. Il DNA genomico è stato estratto con il metodo del fenolo-cloroformio, seguita da trattamento RNasi. L'RNA totale è stato estratto utilizzando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), secondo le istruzioni del produttore. Il DNA genomico di normali leucociti del sangue periferico (BIOCHAIN, Hayward, CA, USA) e l'RNA totale da normale mucosa gastrica da individui sani (BIOCHAIN ​​e Invitrogen) sono stati acquistati. tumori gastrici primari sono stati classificati utilizzando caratteristiche clinico-patologici, come mostrato in file aggiuntive 2, secondo lo schema di classificazione pTNM (5a edizione, 1997) [21] e il sistema di classificazione del Lauren [22]. KRAS
stato -amplification secondo l'età è stata confrontata con il test t di Student; secondo il grado, lo stato del terminale, lo stato pN, e stadio della malattia utilizzando il test di Mann-Whitney U; e in base al sesso, l'istologia e lo stato pM utilizzando il test esatto di Fisher. Tutti i test sono stati 2 dalla coda, e un valore di P
di < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo
. Scansione del genoma digitale
In breve, 40 mg di DNA genomico sono stati sottoposti a digestione con enzimi di restrizione utilizzando Mbo
I (Takara, Tokyo, Giappone) e poi separati mediante elettroforesi su un 3% NuSieve GTG gel. frammenti brevi (30-60 bp, chiamati tag reali) sono stati electroeluted, concatenati e subclonato in Bam
HI-digerito pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) usando la soluzione legatura Mighty Mix DNA (Takara). Escherichia coli
DH10B stati trasformati con i plasmidi ricombinanti, i trasformanti sono stati riuniti ed il DNA plasmidico è stato purificato per generare la prima libreria. Concatemers di tag reali sono stati asportati dalla Spe
I /Pst
I digestione dal 1 biblioteca e frammenti nel range di 140-800 bp sono stati electroeluted, concatenati e subclonati in pBluescript II KS + per generare la seconda biblioteca. Secondo plasmidi libreria contenente concatemers di Spe
I /Pst
I frammenti sono stati sequenziati usando un ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), secondo le istruzioni del produttore. tag reali unici sono stati mappati sequenze cromosoma umano, e la densità di tag, definito come il rapporto tra i tag reali per tag virtuali sopra le finestre in movimento, è stato calcolato per rilevare anomalie nel contenuto di DNA utilizzando i valori di soglia definiti da simulazioni DGS. posizioni tag e rapporti di densità di tag sono stati visualizzati utilizzando tracce personalizzate e Genoma grafici presso la University of California, Santa Cruz (UCSC) del browser genoma (marzo 2006 freeze, hg18) [23-25]. I protocolli dettagliati per DGS, caratterizzazione tag virtuali e simulazioni in silico
sono disponibili in file aggiuntive 3.
quantitativa real-time PCR
numero di copie di DNA relativo è stato determinato quantitativo PCR in tempo reale utilizzando un verde SYBR PCR master Mix (Applied Biosystems) e l'ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). contenuto di DNA per genoma aploide era normalizzata a quella di un elemento ripetitivo, Line-1, e calcolato dal CT comparativo (ΔΔCT) relativo metodo di quantificazione utilizzando la formula 2 (Nt
- Nline
) - ( Xt
- Xline
), dove N
t
è il numero di ciclo soglia osservato per un primer sperimentale nel normale DNA dei leucociti, N
linea
è il numero di ciclo soglia osservato per la linea 1-primer normale DNA dei leucociti, Xt
è il numero medio ciclo soglia osservato per il primer sperimentale nel DNA delle cellule tumorali, e X
linea
è il numero medio ciclo soglia osservato per la linea 1-fondo nel DNA delle cellule tumorali [14]. amplificazione genomica è stata definita come un aumento superiore a 4 volte del contenuto di DNA. Le sequenze di primer per ogni locus sono disponibili in file aggiuntive 4. L'intervento allelica del gene KRAS mutante
(G12V, GGT → GTT) è stata determinata impiegando una procedura PCR modificata in tempo reale in base alle Itabashi et al
[26 ]. Il protocollo dettagliato è disponibile in file aggiuntive 3. cDNA è stato preparato utilizzando SuperScript III trascrittasi inversa (RT, Invitrogen), e il livello di mRNA di ogni gene è stata determinata mediante real-time RT-PCR utilizzando la TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) . I livelli di mRNA relativi sono stati calcolati con il metodo CT comparativo utilizzando GAPDH
come controllo endogeno. I set di primer /sonde utilizzate sono visualizzate in file aggiuntive 5.
fluorescenza in situ
ibridazione (FISH)
BAC che contenevano il KRAS
locus (RP11-636P12) e cromosoma 12q24.2 (RP11 -91M21) sono stati etichettati rispettivamente con Cy3 e Cy5, e poi incubato con vetrini preparati con interfase e metafase i cromosomi. I nuclei sono stati contro-colorati con 4 ', 6-diammino-2-phenylindole (DAPI), e le diapositive sono stati analizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza (Leica CW-4000).
Analisi mutazionale del KRAS
e PIK3CA

amplificate frammenti genomici sono stati sequenziati sia direttamente, o subclonati utilizzando il kit TOPO TA-cloning (Invitrogen) e poi sequenziato. Almeno dieci cloni provenienti da due PCR indipendenti per locus sono stati sequenziati usando M13 Forward e Reverse primer (Invitrogen). Le sequenze dei primer utilizzati per l'amplificazione del KRAS
(esoni 1 e 2) e PIK3CA
(esoni 9 e 20) sono mostrati in file aggiuntive 6.
analisi immunoblot
Le cellule sono state lisate in Lysis tampone contenente 20 mM Tris-HCl (pH7.5) tampone, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 10% glicerolo, 10 mM NaF, 1 mM di sodio vanadato, 50 mM β-glicerofosfato, 1 mM phenylmethansulfonyl fluoruro , 1 mM ditiotreitolo, e un cocktail inibitore della proteasi (Roche, Mannheim, Germania). Le proteine ​​sono state separate mediante SDS-PAGE e electroblotted su una membrana Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA, USA). Le membrane sono stati analizzati mediante immunoblot utilizzando i seguenti anticorpi, come indicato: topo monoclonale anti-KRAS, -NRAS, e -HRAS anticorpi (SC-30, SC-31 e SC-29, rispettivamente, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anticorpo anti-actina (Millipore); policlonale di coniglio anti-p44 /42 MAP chinasi, -phosho-p44 /42 MAP chinasi (Thr202 /Tyr204), -Akt e -phospho-Akt (ser473) antisieri (Cell Signaling Technology Danvers, MA, USA).
GTP-RAS pull-down test
L'attivazione di RAS è stato rilevato utilizzando un kit di attivazione EZ-Detect Ras (Pierce, Rockford, IL, USA). In breve, lisato cellulare (500 mg) è stato incubato con immobilizzata RAF1 Ras-dominio di legame fusa al glutatione S-transferasi (GST-Raf1-RBD). I precipitati sono stati lavati 3 volte, e proteine ​​legate sono state eluite mediante bollitura per 5 minuti (min). Le proteine ​​sono stati risolti su un gel di poliacrilammide al 12%, trasferito ad una membrana Immobilon-P, e sottoposti ad analisi immunoblot utilizzando anti-KRAS, -NRAS, o -HRAS anticorpi.
RNA interference
Un KRAS custom-designed
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), destinate a una regione di KRAS
che non è associata a mutazioni noti oncogeni, è stato sintetizzato da Dharmacon (Lafayette, Co, Stati Uniti d'America). siRNA di targeting LRMP
, LYRM5
e CASC1
sono stati acquistati da Ambion (No.144181, 284.911 e 147.715). Un universale non-targeting siRNA (controllo non specifico VII, Dharmacon) è stato utilizzato come controllo negativo. In ogni esperimento, 5 × 10 6 cellule sono state trasfettate con 7,5 ml di 20 micron siRNA di elettroporazione (Amaxa, Colonia, Germania) utilizzando Nucleofector kit V o T, secondo le istruzioni del produttore. Proliferazione test
cellulare
a seguito di trasfezione con siRNA, le linee di cellule di cancro gastrico HSC45, MKN1, AGS e NUGC4 sono state seminate in piastre da 96 pozzetti ad una densità di 8000 cellule /100 ml in terreno standard contenente 10% FCS. numero di cellulare a 48, 72 e 96 ore dopo la trasfezione è stata determinata indirettamente mediante saggio colorimetrico utilizzando cellulare conteggio Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Giappone). Il saggio è basato sulla riduzione di un sale di tetrazolio ([2- (2-metossi-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfophenyl) -2-tetrazolio, sale monosodico], WST -8) e viene utilizzato come misura di cellule vive. L'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm è stata misurata utilizzando un lettore per micropiastre (modello 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Citometria a flusso
citometria a flusso è stata effettuata come descritto in precedenza [27]. Brevemente, cellule aderenti e distaccate sono state raccolte, fissate in 90% etanolo freddo, trattato con RNasi A (500 unità /ml), e poi colorate con ioduro di propidio (50 ug /ml). Per ogni campione, 30000 eventi sono stati analizzati utilizzando la piattaforma di analisi del ciclo cellulare del programma FlowJo (Albero Stella, Ashland, OR, USA).
Immunoistochimica
formalina-fisso, sezioni incluse in paraffina di tumori gastrici sono stati deparaffinate, idratate , e poi trattata con soluzione di perossidasi di bloccaggio (3% H 2O 2 in metanolo). Le sezioni sono state in autoclave a 105 ° C per 10 min in soluzione di recupero di destinazione (Dako, Glostrup, Danimarca). Le sezioni sono state incubate con un mouse anticorpo anti-KRAS. (Diluizione 1: 100; Santa Cruz Biotechnology) per 1 ora a temperatura ambiente, e immunoreattività è stato rilevato utilizzando reagenti ENVISION-Plus (Dako)
Risultati
scansione del genoma digitale e caratterizzazione di tag virtuali in silico
scansione del genoma Digital (DGS) è un metodo di quantificazione del numero di copie del gene enumerando brevi frammenti di DNA genomico (chiamato tag reali) che vengono generate sperimentalmente da Mbo
I endonucleasi digestione (Figura 1a). Per eliminare i passaggi complicati coinvolte nella preparazione del tag, computazionalmente caratterizzato i brevi frammenti di DNA che sono prodotte da un'unica digestione con enzimi di restrizione con Mbo
io, che riconosce la sequenza di 4 bp GATC. In silico
digestione del genoma umano da Mbo
ho prodotto circa 1,6 milioni di frammenti di restrizione (chiamati tag virtuali) nel range di 20-130 bp (sui file 7a). analisi della sequenza nucleotidica ha rivelato che circa il 65% dei tag virtuali conteneva sequenze ripetitive, come definito nel database pubblico di elementi di ripetizione (sui file 7a). È importante sottolineare che la sequenza corrispondente al database genoma umano ha rivelato che circa l'85% dei tag virtuale mappata univocamente a posizioni precise cromosomiche (sui file 7b, c). Anche se i tag virtuali includono sequenze ripetitive in parte, circa l'80% dei tag ripetitivi si è rivelata unica. La distanza media tra due tag virtuali unici di 30 a 60 bp in lunghezza era di 7,6 kb, la distanza media è stata di 4,5 kb e 97,8% degli intervalli erano più corti di 30 kb (sui file 7d). sono stati osservati simili caratteristiche di intervallo tag per i tag virtuali la gamma di 70 a 100 bp (distanza media, 7,9 kb, distanza mediana, 4,8 kb; 97,4% era inferiore a 30 kb), e 100 e 130 punti base (distanza media, 7,9 kb; distanza mediana, 4,9 kb,.. 97,4% era inferiore a 30 kb (sui file 7e, f) Inoltre, la densità di tag virtuali unici era quasi uguale a ciascun cromosoma (sui file 7g) Questi in silico
risultati hanno suggerito che la maggior parte di breve Mbo
I tag sarebbero informativo per DGS. Figura 1 DGS e la preparazione di tag reali. (a) sagoma schematica della DG. caselle colorate rappresentano genomica Mbo
I veri tag. Vedi testo per i dettagli. (b, c) Preparazione (b) e caratterizzazione (c) del tag reali. risultati rappresentativi utilizzando DNA genomico da cellule di cancro gastrico MKN1 sono mostrati. (b) frammenti brevi di Mbo
DNA genomico digerito I (da 30 a 60 bp) sono stati electroeluted da un gel di agarosio (i), concatenati e subclonato. plasmidi ricombinanti risultanti sono stati raggruppati per generare la 1a libreria (ii). concatemers lunghi (140-800 bp) sono stati asportati dal 1 ° vettori biblioteca, electroeluted (iii), concatenati e subclonato. I plasmidi ricombinanti risultanti rappresentano 2 ° cloni biblioteca (iv). Il numero di variabili contenute in ciascun clone è mostrato nella parte superiore di ogni corsia. Inserti sono stati esaminati da Xho
I /Sac
I digestione in pannelli (ii) e (iv). *, frammenti del vettore; **, Spe
I /Pst
I digestione del sito a più di clonazione senza inserto. (C) Il numero effettivo di tag reali dal 2 biblioteca è mostrato nella istogramma (a sinistra), e le loro caratteristiche sono riassunte (a destra).
DGS simulazione in silico
La capacità di DGS per individuare il genoma modifiche -Wide è basato sulle caratteristiche del genoma, come il numero di copie e la dimensione della modifica, e il numero di tag reali ottenuti dall'analisi di sequenza. Per prevedere la dimensione di alterazione che potrebbe essere rilevato in modo affidabile, dato un numero fisso di tag computazionalmente campionati, abbiamo utilizzato la simulazione Monte Carlo per calcolare un valore predittivo positivo (PPV), che è la probabilità che una alterazione rilevato rappresenta un vero alterazione. Ad esempio, abbiamo scoperto che l'analisi di 5000 tag potrebbe affidabile rilevare una amplificazione di 10 volte di 500 kb, una delezione omozigote di 7,5 Mb, o una sola perdita copia di una regione 30 Mb, ma non è in grado di rilevare un subchromosomal guadagno minore di 30 Mb (file aggiuntivo 8). Sia la sensibilità e la specificità di rilevare questi tipi di alterazione erano > 99% nei casi con elevati PPVs (> 90%)., Che ha indicato che non era un fattore limitante in questa analisi (dati non mostrati)
Preparazione di veri e propri tag da umano genomica DNA
Per DGS delle linee cellulari del cancro gastrico HSC45 e MKN1, abbiamo preparato le librerie di tag reali da DNA genomico, come mostrato in Figura 1a. Il Mbo
DNA genomico I-digerito era di dimensioni frazionata (30-60 bp) e sottoposto a concatemerization, seguita da costruzione di una seconda biblioteca, che conteneva circa 10 tag reali per clone (figura 1b). analisi della sequenza nucleotidica del tag reali ha rivelato che il 85,8% mappato posizioni uniche, che era coerente con la nostra caratterizzazione dei tag virtuali (Figura 1c).
amplificazioni sul cromosoma 12p in cellule di cancro gastrico HSC45
Il tag genome-wide profilo di densità di cellule HSC45 è stato determinato utilizzando un totale di 5.462 etichette reali unici. Per raggiungere alta risoluzione e sensibilità con i dati sperimentali, abbiamo usato le dimensioni delle finestre del 1000 e 2100 etichette virtuali (circa 2300 kb e 4700 KB) per l'analisi delle amplificazioni e delezioni, rispettivamente. Il rapporto di densità variabile è stato calcolato come la somma dei tag diviso per il numero medio di tag reali stesse dimensioni finestre in tutto il genoma, in cui il rapporto di densità normale tag è stata definita come 1.0. Abbiamo identificato le regioni subchromosomal distinte di maggiore densità di tag nella 8q24.21, 12p12.1 e 12p13.33, e diminuzione della densità di tag nella 9p21.3 e il braccio lungo del cromosoma 18 (Figura 2, Ulteriori file di 9a-d). Le regioni di maggiore densità di tag (12p12.1, 12p13.33 e 8q24.21) contenevano KRAS
, CACNA1C
(canale del calcio, voltaggio-dipendente, l tipo, alfa-1c subunità) e MYC
loci, rispettivamente. analisi Southern blot ha confermato che KRAS
e MYC
sono stati amplificati in cellule HSC45 (sui file 9e). Ogni quantificato cambiamento copia-numero, come determinato dal quantitativa real-time PCR (qPCR) del DNA genomico è stato molto simile a quello stimato da DGS quando la dimensione della finestra per l'analisi della densità tag è stato abbinato alle dimensioni di ogni alterazione (Ulteriori file di 9a-d ). Questi risultati suggeriscono che l'analisi della densità di tag da DGS potrebbe essere utilizzato per eseguire la copia di analisi numero di tutto il genoma umano. Figura 2 riscontro di un aumento del numero di copie sui cromosomi 8q e 12p da DGS in cellule di cancro gastrico HSC45. (A) Una vista intero genoma del rapporto di densità variabile (utilizzando una finestra di 1000 tag virtuali) in cellule HSC45 come determinato da DGS. I valori sui y asse indicano pieghevole cambiamenti nella densità tag relativi alla densità media tag di tutto il genoma, e rappresentano il contenuto di DNA per genoma aploide, in finestre. L'asse x rappresenta il numero dei cromosomi. (B e C) vista espansa di rapporti di densità tag sui cromosomi 8 (b) e 12 (c). In ogni pannello, il grafico superiore mostra una vista intera cromosoma del rapporto di densità tag (basato su una finestra di 1000 tag virtuali). Il grafico in basso mostra una vista espansa di 8q24.21 e 12p12.1, in cui una maggiore densità di tag è stato rilevato utilizzando finestre di 1000 e 500 tag virtuali. tag reali unici sono indicati come barre verticali nere, e tag virtuali unici sono indicati in blu (60 bp o meno) o azzurro (più di 60 bp) bar in modalità densa. Le posizioni dei geni RefSeq, con alcune isoforme di splicing omessi, vengono visualizzati nella parte inferiore dei pannelli inferiori.
Amplificazione di KRAS
in linee cellulari di cancro gastrico
Analisi di 26 loci all'interno e subito di accompagnamento cromosoma 12p12. 1 nelle cellule HSC45 di qPCR dimostrato che una regione di circa 500 kb, che comprendeva le KRAS
locus genico, è stato amplificato (amplificazione di 8 volte, Figura 3a). Genomic qPCR lo screening rilevato KRAS
amplificazione in due linee di cellule di cancro gastrico supplementari, SH101P4 (18 volte) e MKN1 (13 volte) (Figura 3a), mentre non abbiamo rilevato l'amplificazione superiore a 4 volte in 17 altri linee di cellule di cancro gastrico, o in 10 cancro del colon e 11 linee di cellule di cancro del pancreas (elencati nel file aggiuntive 1, i dati non mostrati). DGS anche rilevato l'amplificazione del KRAS
locus in MKN1 cellule (file aggiuntivo 10). I geni vicini di Kras
nel amplicone minimo erano LRMP
(proteina di membrana linfoide-restricted), CASC1
(cancro suscettibilità candidato 1) e LYRM5
(motivo LYR contenente 5). BCAT1
(catena ramificata aminotransferasi 1, citosolico) è stato anche amplificato in cellule SH101P4 e MKN1, ma non nelle cellule HSC45. Abbiamo confermato che CACNA1C
è stato amplificato in cellule HSC45, ma non negli altri gastrici, del colon, o linee di cellule di cancro del pancreas utilizzando l'analisi genomica qPCR (sui file 9b, dati non riportati). Né NRAS
, HRAS
né BRAF
amplificazioni sono state rilevate nelle linee cellulari di cancro di cui sopra mediante analisi genomica qPCR (dati non riportati). L'amplificazione del KRAS
è stata verificata anche da doppia analisi del colore FISH, in cui il KRAS
amplicone era evidente come una regione omogenea macchiato in HSC45, cellule SH101P4 e MKN1 (Figura 3b). Figura 3 amplificazione genica di KRAS in cellule di cancro gastrico. (A) quantitativa analisi genomica PCR delle KRAS
locus a 12p12.1 nelle cellule HSC45. amplificazioni discreti a 12p12.1 in altre due linee di cellule di cancro gastrico sono stati anche rilevati (SH101P4 e MKN1). DNA numero di copie rispetto al normale DNA diploide dei leucociti è stata tracciata contro la posizione cromosomica nucleotide (in megabasi). Le posizioni dei geni RefSeq nelle regioni corrispondenti sono mostrate nella mappa inferiore. La regione minima amplificazione comune a tutte e 3 le linee di cellule di cancro gastrico è rappresentata dalla barra di colore arancione. (B) Metaphase (a sinistra) - e interfase (a destra) l'analisi -FISH delle KRAS amplificati
locus in linee cellulari di cancro gastrico. Il KRAS
sonda SPECIFICI è in giallo, e la sonda di controllo, specifica per il braccio lungo del cromosoma 12, è in rosso. sono stati osservati in tetraploidia HSC45 e triploidia nelle cellule SH101P4 e MKN1. (C) quantitativa in tempo reale, l'analisi RT-PCR di KRAS
espressione di mRNA in cellule di cancro gastrico con amplificazione 12p12.1. analisi di espressione dei geni (KRAS, LRMP, CASC1
e LYRM5
) situato all'interno del amplicone minimo, e BCAT1
, che fiancheggia l'amplicone minima, è stata effettuata utilizzando real-time RT-PCR. I livelli di espressione sono stati normalizzati per GAPDH
mRNA, e sono raffigurati come un gradiente di colore, rispetto al normale stomaco. L'amplificazione del gene e la mutazione (codone 12 o 13) lo stato di KRAS Compra di ogni campione è riassunto nella destra due colonne. cerchi pieni indicano la presenza dell'amplificazione o la mutazione di KRAS
, e cerchi aperti indicano nessuna amplificazione o nessuna mutazione del gene KRAS
.
analisi della sequenza del gene KRAS
(file 11a supplementare) ha dimostrato che sia HSC45 e cellule SH101P4 ospitavano una mutazione nel codone 12 che ha portato in una singola sostituzione aminoacidica in KRAS (GGT → GTT, G12V), mentre MKN1 cellule mancava KRAS
mutazioni. La presenza di KRAS
mutazioni in AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) e le cellule HCT116 (G13D) è stato riportato in precedenza [28, 29]. Dei dieci PCR-cloni di KRAS
dalle cellule HSC45 e SH101P4 che sono stati sottoposti ad analisi mutazionale, otto e tre, rispettivamente mutazioni nel codone 12. Inoltre nutrito, genomica analisi real-time PCR utilizzando sonde che erano specifici per selvatici tipo e KRAS mutato
alleli (sui file 11b) ha anche rivelato che HSC45 e le cellule SH101P4 contengono diverse proporzioni del allele mutante (80% e 50%, rispettivamente). Nel complesso, questi risultati hanno indicato che l'amplificazione di un mutante KRAS
allele si verifica anche nelle cellule HSC45 e SH101P4.
Abbiamo poi studiato i livelli di KRAS
mRNA in KRAS
-amplified cellule di cancro gastrico da vera quantitativa -time RT-PCR (qRT-PCR) (figura 3c). I livelli di mRNA KRAS
correlata in modo significativo con KRAS
numero di copie. I geni vicini LYRM5
e CASC1
, che localizzato alla amplicone minima, sono stati anche espressi a livelli più alti nelle cellule con amplificazione rispetto alle cellule senza amplificazione (Figura 3c). È interessante notare che, LRMP
è stato down-regolato nelle cellule tumorali rispetto alle normali cellule dello stomaco. analisi immunoblot delle proteine ​​RAS (figura 4a) ha rivelato che l'espressione del gene KRAS è stata aumentata in KRAS
cellule di cancro gastrico -amplified (HSC45, SH101P4 e MKN1), mentre né NRAS né HRAS erano altamente espresse (figura 4a; dati non mostrati ). Anche se l'espressione di let-7c e lasciare-7g microRNA è stato segnalato per regolare l'espressione RAS [8], abbiamo trovato scarsa correlazione di espressione di questi microRNA con livelli di proteina KRAS (file aggiuntivo 12), che ha suggerito che KRAS sovraespressione di cancro gastrico linee cellulari è dovuto principalmente alla amplificazione genomica di KRAS
. Figura 4 sovraespressione di KRAS, e l'attivazione differenziale di KRAS, p44 /42 MAP chinasi e AKT in KRAS -amplified cellule di cancro gastrico. (A) analisi immunoblot dei livelli di espressione di KRAS e le ANR nelle cellule tumorali. espressione actina è stato analizzato come controllo di caricamento. (B) Il livello basale di GTP-KRAS è stato marcatamente elevato in cellule di cancro gastrico con KRAS mutante amplificato
(HSC45 e SH101P4). lisato totale (500 mg) è stato sottoposto ad un test di pull-down GTP-RAS, e GTP-KRAS e GTP-NRAS sono stati rilevati da immunoblot utilizzando anti-KRAS e anticorpi anti-ANR, rispettivamente. lisato cellulare totale (50 ug) è stato analizzato in parallelo per determinare il livello di espressione di KRAS e NRAS nelle cellule. (C) GTP-KRAS è stato elevato dopo stimolazione del siero nelle cellule MKN1. Le cellule sono state coltivate in terreno normale contenente 10% FCS (N), siero a digiuno per 24 h (-) o siero-fame quindi stimolate con 10% FCS per 1 h (+). Totale lisato cellulare è stato sottoposto ad un test di pull-down GTP-KRAS. (D) L'attivazione di p44 /42 MAP chinasi e AKT in cellule di cancro gastrico siero-fame o -stimulated.

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