Um novo método, a varredura do genoma digital de detectar a amplificação do gene KRAS no câncer gástrico: envolvimento de overexpressed KRAS tipo selvagem na sinalização a jusante e crescimento de células de câncer

Um novo método, a digitalização genoma digitais detecta KRAS
amplificação do gene no câncer gástrico: envolvimento de overexpressed KRAS tipo selvagem no crescimento de sinalização e de células cancerosas a jusante da arte abstracta
Fundo
O câncer gástrico é o terceiro mais comum malignidade afetando a população em geral em todo o mundo. activação aberrante de KRAS é um fator chave no desenvolvimento de muitos tipos de tumor, no entanto, mutações oncogênicas do KRAS Quais são pouco frequentes no câncer gástrico. Desenvolvemos um novo método quantitativo de análise de número de cópias de ADN, denominado varrimento genoma digitais (DGS), que se baseia na enumeração dos fragmentos de restrição curtas, e não envolve PCR ou de hibridização. No presente estudo, foi utilizado DGS para examinar alterações no número de cópias em células cancerosas gástricas.
Métodos
DGS de linhas celulares de cancro gástrico foi realizada usando as sequências de 5000 a 15000 fragmentos de restrição. Foram triados 20 linhas celulares de cancro gástrico e 86 tumores gástricos primários para KRAS
amplificação por PCR quantitativo, e investigado KRAS
amplificação no ADN, ARNm e proteínas níveis de análise mutacional, PCR em tempo real, análise de imunotransf erência, GTP Ras ensaio de pull-down e análise imunohistoquímica. O efeito de KRAS
knock-down na activação de p44 /42 MAP cinase AKT e e no crescimento celular foram analisados ​​por imunotransferência e ensaio colorimétrico, respectivamente.

Resultados da análise DGS da célula cancerosa gástrica HSC45 a linha revelou a amplificação de uma região de 500 kb no cromossoma 12p12.1, que contém o KRAS
locus do gene. A amplificação do locus de KRAS
foi detectada em 15% (3/20) de linhas celulares de cancro gástrico (amplificação 8-18 vezes) e 4,7% (4/86) de tumores gástricos primários (amplificação 8-50 vezes ). KRAS
mutações foram identificadas em duas das três linhas de células em que
Kras foi amplificado, mas não foram detectados em nenhum dos tumores primários. Superexpressão da proteína KRAS correlacionada diretamente com o aumento KRAS
número de cópias. O nível de KRAS-GTP ligado foi elevada após estimulação sérica de células com amplificados do tipo selvagem KRAS
, mas não em células com amplificado mutante KRAS
. Knock-down de KRAS
em células cancerosas gástricas que levou amplificado KRAS do tipo selvagem
resultaram na inibição do crescimento celular e supressão de p44 /42 MAP quinase e atividade de AKT.
Conclusão
Nosso estudo destaca a utilidade da DGS para a identificação de alterações no número de cópias. Usando DGS, identificamos KRAS
como um gene que é amplificado em cancro gástrico humano. Nós demonstramos que a amplificação do gene provavelmente constitui a base molecular de overactivation de KRAS no câncer gástrico. Estudos adicionais utilizando uma coorte maior de amostras de cancro gástrico são necessários para determinar as implicações de diagnóstico e terapêutica de KRAS
amplificação e superexpressão.
Fundo
O câncer gástrico é a terceira neoplasia maligna mais comum que afeta a população em geral em todo o mundo [1 ]. alterações genéticas específicas foram relatados no câncer gástrico, incluindo as amplificações de KSAM
, MET Comprar e ERBB2
, e mutações em p53
, APC
e CDH1
[2] . Embora as mutações de ganho-de-função de KRAS
são algumas das alterações genéticas mais vulgarmente observadas em uma variedade de tumores, incluindo pancreático (60%), do tracto biliar (33%) e do cólon (32%) [3], estas mutações são pouco frequentes no câncer gástrico (2-7%) [4-7]. Em geral, RAS
mutações associadas à tumorigênese "lock" RAS em um estado ligado a GTP activa. GTP-RAS liga-se a uma série de proteínas efectoras para estimular as vias de sinalização a jusante, entre os quais a cascata da cinase RAF-MAP e o fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) -Akt vias de crescimento celular e oncogénese são a melhor caracterizada [3]. activação prolongada do RAS pode também ocorrer através de mecanismos que não envolvem mutações no RAS. Por exemplo, a expressão de let-7 microRNAs, que suprime RAS, visando a região 3'untranslated de RAS
mRNAs reduzida, é frequentemente associada com um nível de proteína RAS mais elevada em tumores [8]. Até à data, os mecanismos moleculares de activação oncogénica da EAR, o cancro gástrico não foram completamente elucidados.
A amplificação de sequências genómicas contendo genes que são fundamentais para o crescimento celular é um dos principais mecanismos de activação de oncogenes em cancro, e é frequentemente associada com a progressão do tumor, mau prognóstico e /ou resistência à droga [9]. Dos numerosos métodos actualmente disponíveis para a detecção de alterações no número de cópias do genoma-wide, o padrão ouro atual é a matriz método CGH (aCGH). Ao longo dos últimos anos, a resolução de aCGH melhorou rapidamente pela utilização de sondas de oligonucleótidos, e superou o de aCGH utilizando sondas BAC normais [10]. No entanto, aCGH também é susceptível ao ruído inerente de medições de intensidade baseado em hibridação, tal como a qualidade do sinal é afectada por sequências repetitivas e depende da qualidade da sonda [11]. Na verdade, a otimização do design sonda tem sido um grande desafio para o desenvolvimento de matrizes de lado a lado [12, 13].
Cariotipagem Digital (DK) foi desenvolvido por Wang et al. [14], e não é limitado pelos problemas inerentes às técnicas de matriz. DK envolve a enumeração digitais de fragmentos curtos de ADN genómico (marcas denominadas), proporcionando uma medição quantitativa do número de cópias de DNA por meio de análise de densidade tag ao longo de cada cromossomo. DK tem sido aplicado com sucesso em uma variedade de tipos de tumor para detectar alterações no número de cópias, incluindo a ampliação da Tyms
, RSF1 Comprar e OTX2
e exclusão de MKK4 Comprar e distrofina
[ ,,,0],15-19]. Apesar da eficácia da DK, é tecnicamente desafiador para aplicações gerais, porque envolve a amplificação por PCR ea geração de etiquetas de pares de 21 bases (pb) de comprimento para representar precisamente a localização cromossômica de interesse.
Relatamos aqui a o desenvolvimento de um novo método, denominado DGS, para a análise quantitativa de cópia variação do número, o qual é baseado no conceito de marcação de contagem de DK, mas utiliza um processo simplificado de preparação tag. DGS de linhas celulares de cancro gástrico detectada a amplificação dos KRAS
locus no cromossoma 12p12.1. Os nossos resultados fornecem uma base molecular para a sobreactivação de KRAS, e sugerem que a activação de eventos de sinalização a jusante KRAS pode promover a proliferação de células de cancro gástrico.
Métodos
linhas de células e tecidos in the linhas celulares analisados ​​no actual estudo estão listados no arquivo adicionais 1. As linhas de células HSC e SH101P4 foram estabelecidas por Kazuyoshi Yanagihara [20]; todos os outros foram obtidas da American Type Culture Collection ou o colecção japonesa de Bioresources investigação (Tóquio, Japão). Todas as linhas celulares foram cultivadas nos meios recomendados. Para estimulação sérica, as células foram incubadas em meios que careciam de soro durante 24 horas (h), e, em seguida, quer não estimuladas, ou estimuladas durante 1 h com meio contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS). espécimes câncer gástrico primários foram obtidos do Departamento de Cirurgia, Keiyukai Sapporo Hospital, com o consentimento informado de cada paciente. O ADN genómico foi extraído utilizando o método de fenol-clorofórmio, seguido de tratamento com RNase. O ARN total foi extraído utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. O ADN genómico de leucócitos normais de sangue periférico (Biochain, Hayward, CA, EUA) e ARN total a partir de mucosa gástrica normal a partir de indivíduos saudáveis ​​(Biochain e Invitrogen) foram adquiridos. cancros gástricos primários foram classificados utilizando características clínico-patológicas, como mostrado no arquivo adicionais 2, de acordo com o esquema de classificação pTNM (5ª edição, 1997) [21] e sistema de classificação do Lauren [22]. KRAS
estatuto -amplification acordo com a idade foi comparada usando o teste t de Student; segundo grau, estado pT, pN estatuto e estágio da doença através do teste de Mann-Whitney; e de acordo com o sexo, histologia e estatuto pM utilizando o teste exato de Fisher. Todos os testes foram 2 de cauda, ​​e um valor
P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Digitalização genoma digitais
Resumidamente, 40 ug de ADN genómico foram submetidos a digestão com enzimas de restrição usando
Mbo I (Takara, Tóquio, Japão) e em seguida, separados por electroforese num 3% Nusieve GTG gel de agarose. fragmentos curtos (30-60 pb, denominadas etiquetas reais) foram electroeluidas, concatenado e subclonado Bam HI-
digeridos de pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando uma solução de ligação poderoso mistura de ADN (Takara). Escherichia coli DH10B
foram transformadas com os plasmídeos recombinantes, os transformantes foram reunidas e o DNA de plasmídeo foi purificado para gerar a primeira biblioteca. Concatemeros de etiquetas reais foram excisadas por SPE
I /Pst I
digestão da primeira biblioteca, e fragmentos no intervalo de 140 a 800 pb foram electroeluidas, concatenado e subclonados em pBluescript II KS + para gerar a segunda biblioteca. plasmídeos segunda biblioteca contendo concatemeros de Spe
I /Pst
fragmentos I foram sequenciados utilizando um Analisador Genético ABI3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Tag reais originais foram mapeados para sequências de cromossomo humano, e densidade tag, definido como a relação de marcas reais para etiquetas virtuais sobre as janelas em movimento, foi calculado para detectar anormalidades no conteúdo de DNA usando valores limiares definidos pelo simulações DGS. posições de tags e razões de densidade tag foram visualizados usando faixas personalizadas e Genome Gráficos da Universidade da Califórnia, Santa Cruz (UCSC) navegador genoma (março 2006 congelamento, hg18) [23-25]. Os protocolos detalhados para DGS, caracterização tag virtual e in silico
simulações estão disponíveis no arquivo adicionais 3.
Quantitative PCR em tempo real
número de cópias do DNA relativa foi determinada por quantitativa PCR em tempo real usando um verde SYBR PCR master Mix (Applied Biosystems) e o ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). teor de ADN por genoma haplóide foi normalizada para a de um elemento repetitivo, Linha-1, e calculada pela CT comparativa (ΔΔCT) método de quantificação relativa por meio da fórmula 2 (Nt
- nLine
) - ( xt viajantes - XLine
), onde N
t
é o número de ciclo limite observado para um primer experimental no DNA dos leucócitos normal, N
linha
é o número do ciclo limiar observada para a linha 1-iniciador no ADN de leucócitos normais, Xt
é o número médio de ciclo limiar observado para o iniciador experimental em ADN de células de cancro, e X
é a linha
número médio do ciclo limiar observada para a linha 1-iniciador no ADN da célula cancerosa [14]. amplificação genómica foi definida como um aumento maior do que quatro vezes no teor de ADN. As sequências dos iniciadores para cada locus são disponíveis em ficheiros adicionais 4. A proporção de alelos mutantes de KRAS
(G12V, GGT → GTT) foi determinada empregando um procedimento de PCR em tempo real modificado de acordo com Itabashi et ai
[26 ]. O protocolo detalhado está disponível em ficheiros adicionais 3. ADNc foi preparado utilizando SuperScript III da transcriptase reversa (RT, Invitrogen), e o nível de ARNm de cada gene foi determinada por em tempo real de RT-PCR utilizando o Gene Expression Assay TaqMan (Applied Biosystems) . Os níveis de ARNm relativos foram calculados pelo método CT comparativo utilizando GAPDH como um controlo
endógena. Os conjuntos iniciador /sonda utilizados são apresentados na arquivo adicionais 5.
fluorescência in situ
fluorescente (FISH)
BACs que continham a KRAS
loco (RP11-636P12) e 12q24.2 cromossomo (RP11 -91M21) foram marcadas com Cy3 e Cy5, respectivamente, e, em seguida, incubadas com lâminas preparadas com interfase e cromossomas em metafase. Os núcleos foram contra-coradas com 4 ', 6-diamino-2-fenilindole (DAPI), e as lâminas foram analisadas utilizando um microscópio de fluorescência (Leica CW-4000). A análise mutacional de KRAS

e PIK3CA

fragmentos genómicos amplificados foram sequenciados, quer directamente, ou subclonados utilizando o estojo TOPO TA-cloning (Invitrogen) e, em seguida, sequenciada. Pelo menos dez clones de dois ensaios de PCR independentes por loco foram sequenciados utilizando M13 forward e reverse primers (Invitrogen). As sequências dos iniciadores utilizados para a amplificação de KRAS
(exões 1 e 2) e PIK3CA
exões (9 e 20) são mostrados no arquivo adicional 6. A análise de imunotransferência

As células foram lisadas na lise tampão contendo Tris-HCl 20 (pH 7,5) tampão NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X, 10% de glicerol, NaF 10 mM, vanadato de sódio 1 mM, 50 mM β-glicerofosfato, 1 mM de fluoreto de phenylmethansulfonyl , 1 mM de ditiotreitol e um cocktail de inibidor de protease (Roche, Mannheim, Alemanha). As proteínas foram separadas por SDS-PAGE e electrotransferidas para uma membrana Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA, EUA). As membranas foram analisadas por imunotransf erência utilizando os seguintes anticorpos, tal como indicado: monoclonal de ratinho anti-KRAS, -NRAS, e -HRAS anticorpos (SC-30, SC-31, e SC-29, respectivamente, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA); anticorpo anti-actina (Millipore); policlonal de coelho anti-p44 /42 MAP cinase, -phosho-p44 /42 MAP cinase (Thr202 /Tyr204), -Akt e fosfo-Akt (Ser473) anti-soros (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA).
ensaio de pull-down GTP-RAS
A ativação da RAS foi detectada usando um Ras Activation Kit EZ-Detect (Pierce, Rockford, IL, EUA). Resumidamente, lisado de células (500 ug) foi incubada com imobilizada RAF1 Ras de ligação ao domínio fundido com glutationa S-transferase (GST-RAF1-RBD). Os precipitados foram lavados 3 vezes, e as proteínas ligadas foram eluídas por ebulição, durante 5 minutos (min). As proteínas foram resolvidas num gel de poliacrilamida a 12%, transferidas para uma membrana Immobilon-P, e submetido a análise de imunotransf erência utilizando anticorpos anti-KRAS, -NRAS, ou -HRAS anticorpos. Interferência de ARN
Um KRAS customizado
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), tendo como alvo uma região de KRAS
que não está associada a mutações oncogénicas conhecidos, foi sintetizado por Dharmacon (Lafayette, CO, EUA). siRNAs segmentação LRMP
, LYRM5 Comprar e CASC1
foram adquiridos da Ambion (No.144181, 284911 e 147715). Um não-siRNA alvejando (controlo não específico VII, Dharmacon) universal foi utilizado como um controlo negativo. Em cada experimento, 5 × 10 6 células foram transfectadas com 7,5 ul de 20 uM ARNsi por electroporação (Amaxa, Colónia, Alemanha) usando o kit de Nucleofector V ou T, de acordo com as instruções do fabricante. Ensaio de proliferação celular

Após a transfecção com siRNAs, as linhas celulares de cancro gástrico HSC45, MKN1, AGS e NUGC4 foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 8000 células /100 uL em meio padrão contendo 10% de FCS. número de células em 48, 72 e 96 h pós-transfecção foi determinada indiretamente pelo ensaio colorimétrico usando celular Counting Kit-8 solução (Dojindo, Kumamoto, Japão). O ensaio baseia-se na redução de um sal de tetrazólio ([2- (2-metoxi-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-dissulfofenil) -2-tetrazólio, sal monossódico], WST -8) e é usado como uma medida de células vivas. A absorvância de cada poço a 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas (modelo 680, Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).
Citometria de fluxo A citometria de fluxo
foi realizada tal como descrito previamente [27]. Resumidamente, as células aderentes e destacadas foram colhidas, fixadas em etanol frio a 90%, tratou-se com RNase A (500 unidades /ml), e depois coradas com iodeto de propídio (50 ug /ml). Para cada amostra, 30000 eventos foram analisados ​​utilizando a plataforma de análise do ciclo celular de programa FlowJo (árvore da estrela, Ashland, OR, EUA).
Imunohistoquímica
formalina-fixo, secções embebidas em parafina de tumores gástricos foram desparafinados, hidratado , e, em seguida, tratada com uma solução de peroxidase de bloqueio (3% H 2O 2 em metanol). As secções foram autoclavadas a 105 ° C durante 10 min em solução de recuperação de alvo (Dako, Glostrup, Dinamarca). As secções foram incubadas com um anticorpo de ratinho anti-KRAS. (Diluição 1: 100; Santa Cruz Biotechnology) durante 1 h à temperatura ambiente, e a imunorreactividade foi detectada utilizando reagentes ENVISION-Plus (Dako)
Resultados
digitalização genoma digital e caracterização de etiquetas virtuais in silico
genoma de varrimento digital (DG) é um método de quantificação de número de cópias do gene através da enumeração fragmentos de DNA genómico curtas (denominados etiquetas reais) que são gerados experimentalmente por Mbo
endonuclease digestão (Figura 1a). Para eliminar os passos envolvidos na preparação complicados tag, caracterizado computacionalmente os fragmentos de ADN curtas que são produzidos através de digestão com enzimas de restrição único com Mbo
I, que reconhece a sequência de 4 pb GATC. In silico
digestão do genoma humano por Mbo
eu produzi aproximadamente 1,6 milhões de fragmentos de restrição (denominada etiquetas virtuais) no intervalo de 20-130 pb (arquivo 7a adicionais). A análise da sequência de nucleótidos revelou que aproximadamente 65% das etiquetas virtuais continham sequências repetitivas, como definido na base de dados pública de elementos de repetição (7a arquivo adicional). Importante, sequência correspondentes à base de dados do genoma humano revelou que aproximadamente 85% das etiquetas virtuais mapeados exclusivamente para localizações cromossómicas precisos (7b arquivo adicional, c). Mesmo que as etiquetas virtuais incluem sequências repetitivas em parte, cerca de 80% das marcas repetitivas acabou por ser único. A distância média entre duas etiquetas virtuais únicas de 30 a 60 pb de comprimento foi de 7,6 kb, a distância média foi de 4,5 kb e 97,8% dos intervalos eram mais curtos do que 30 kb (7d arquivo adicionais). Similar características intervalo tag foram observadas para as etiquetas virtuais na gama de 70 a 100 pb (distância média, de 7,9 kb, a distância média, de 4,8 kb; 97,4% eram mais curtos do que 30 kb), e 100 a 130 pb (distância média, 7,9 kb; distância média, 4,9 kb;.. 97,4% eram menores de 30 kb (7e arquivo adicionais, f) Além disso, a densidade de etiquetas virtuais exclusivos era quase igual em cada cromossomo (7 g de arquivo adicionais) Estes in silico
achados sugerem que a maioria dos curta Mbo
I etiquetas seria informativo para DGS. Figura 1 DGS e preparação de etiquetas de reais. (a) contorno esquemático de caixas coloridas DGS. representam genômica Mbo
Eu reais tags. Veja o texto para mais detalhes. (b e c) Preparação (b), e caracterização (c) de etiquetas reais. Os resultados representativos, utilizando o ADN genómico a partir de células de cancro gástrico MKN1 são mostrados. (b) fragmentos curtos de Mbo
ADN genómico digerido com (30 a 60 pb) foram electroeluídos a partir de um gel de agarose (I), concatenado e subclonados. plasmídeos recombinantes resultantes foram reunidas para gerar a primeira biblioteca (II). concatemeros longas (140 a 800 pb) foram excisados ​​a partir dos vectores de biblioteca 1st, (iii) a electroeluição, concatenado e subclonados. Os plasmídeos recombinantes resultantes representam clones de biblioteca 2a (IV). O número de marcadores contidos em cada clone é mostrada no topo de cada pista. Inserções foram examinadas por Xho
I /Sac I
digestão em painéis (II) e (IV). *, fragmentos de vector; **, Spe
I /Pst
I digestão do site de múltipla clonagem sem inserção. (C) O número real de etiquetas reais do 2º biblioteca é mostrada no histograma (à esquerda), e as suas características são resumidas (direita).
DGS simulação in silico
A capacidade da DGS para detectar genoma alterações -WIDE se baseia nas características do genoma, tais como o número de cópias e o tamanho da alteração, e o número de etiquetas de reais obtidos por análise de sequência. Para prever o tamanho da alteração de forma fiável que podia ser detectado, dado um número fixo de etiquetas computacionalmente da amostra, utilizou-se simulação de Monte Carlo para calcular um valor preditivo positivo (PPV), que é a probabilidade de que uma alteração detectada representa uma verdadeira alteração. Por exemplo, descobrimos que uma análise de 5000 tags de poder detectar com precisão uma amplificação de 10 vezes de 500 kb, a deleção homozigótica de 7,5 Mb, ou uma única perda cópia de uma região de 30 Mb, mas não conseguiu detectar uma sub-cromossómica ganhar menor do que 30 Mb (arquivo adicional 8). Tanto a sensibilidade e a especificidade de detecção destes tipos de alteração eram > 99% nos casos com elevados VPP (> 90%)., Que indicou que nem foi um factor limitante nesta análise (dados não mostrados)
Preparação de etiquetas reais a partir de ADN genómico humano
Para DGS das linhas celulares de cancro gástrico HSC45 e MKN1, preparamos bibliotecas de etiquetas reais a partir de ADN genómico, tal como mostrado na Figura 1A. O Mbo
ADN genómico digerido foi (30-60 pb) e submetido a concatemerization fraccionados por tamanho, seguido pela construção de uma segunda biblioteca, que continha aproximadamente 10 etiquetas reais por clone (Figura 1b). análise de sequência de nucleotídeos das marcas reais revelou que 85,8% mapeados para as posições originais, que era consistente com nossa caracterização de etiquetas virtuais (Figura 1c).
amplificações em 12p cromossomo em células de câncer gástrico HSC45
O tag de todo o genoma perfil de densidade de células HSC45 foi determinada utilizando um total de 5.462 marcações únicas reais. Para alcançar uma elevada resolução e sensibilidade, com os dados experimentais, utilizou-se tamanhos de janela de 1000 e 2100 etiquetas virtuais (cerca de 2300 kb e 4700 kb) para a análise de amplificações e deleções, respectivamente. A taxa de densidade de marcação foi calculado como a soma de etiquetas reais dividido pelo número médio de etiquetas reais em janelas do mesmo tamanho ao longo do genoma, em que a relação de densidade normal tag foi definida como 1,0. Foram identificadas regiões sub-cromossómicas distintas de aumento da densidade tag em 8q24.21, 12p12.1 e 12p13.33, e diminuição da densidade tag em 9p21.3 e no braço longo do cromossomo 18 (Figura 2, adicionais de arquivo 9a-d). As regiões de maior densidade tag (12p12.1, 12p13.33 e 8q24.21) continha KRAS
, CACNA1C
(canal de cálcio, dependente da tensão, l tipo, subunidade alfa-1-C) e MYC
loci, respectivamente. análise de Southern blot confirmou que KRAS Comprar e MYC
foram amplificados em células HSC45 (9e arquivo adicionais). Cada alteração no número de cópias quantificada como determinado a partir quantitativa PCR em tempo real (qPCR) de ADN genómico foi notavelmente semelhante ao estimado pelos SGD quando o tamanho da janela para a análise da densidade marcação foi comparado com o tamanho de cada alteração (adicionais arquivo 9a-d ). Estes resultados sugerem que a análise de densidade de marcação por DGS poderia ser usado para realizar a análise de número de cópias por todo o genoma humano. Figura 2 Detecção do aumento do número de cópias nos cromossomos 8q e 12p por DGS em células de câncer gástrico HSC45. (A) Uma vista de todo o genoma da taxa de densidade de marcação (utilizando uma janela de 1000 etiquetas virtuais) em células HSC45, tal como determinado por DGS. Os valores no eixo Y indicam dobra-mudanças na densidade tag em relação à densidade média tag de todo o genoma, e representam conteúdo de DNA por genoma haplóide, nas janelas. O eixo x representa o número de cromossomos. (B e c) Ampliação da Visão razões de densidade tag nos cromossomos 8 (b) e 12 (c). Em cada painel, o gráfico superior mostra uma vista de todo o cromossoma da taxa de densidade de marcação (com base em uma janela de 1000 etiquetas virtuais). O gráfico inferior mostra uma visão expandida da 8q24.21 e 12p12.1, em que o aumento da densidade tag foi detectada usando janelas de 1000 e 500 etiquetas virtuais. Tag reais únicas são indicados como barras verticais pretas e marcas virtuais exclusivos são indicados em azul (60 bp ou mais curto) ou azul claro (mais de 60 bp) bares em modo denso. As posições dos genes RefSeq, com algumas isoformas de splicing omitidos, são mostradas na parte inferior dos painéis inferiores.
Amplificação de KRAS
em linhas celulares de cancro gástrico
Análise de 26 loci no interior e flanqueando imediatamente cromossoma 12p12. 1 em células HSC45 por qPCR demonstrado que uma região de aproximadamente 500 kb, o que incluiu os KRAS
locus do gene, foi amplificada (amplificação de 8 vezes, Figura 3a). Genomic qPCR rastreio detectado KRAS
amplificação em duas linhas celulares de cancro gástrico adicionais, SH101P4 (18 vezes) e MKN1 (13 vezes) (Figura 3a), enquanto que não se detectou amplificação maior do que quatro vezes em 17 outros linhas celulares de cancro gástrico, ou em 10 do cancro do cólon e 11 linhas de células do cancro do pâncreas (listados no ficheiro adicional 1, dados não mostrados). DGS também detectou amplificação do KRAS
locus MKN1 células (arquivo adicional 10). Os genes vizinhos do KRAS
no amplicon mínima foram LRMP
(proteína da membrana de restrição linfóide), CASC1
(câncer susceptibilidade candidato 1) e LYRM5
(motivo LYR contendo 5). BCAT1
(ramificado aminotransferase cadeia 1, citosólica) também foi amplificado em células SH101P4 e MKN1, mas não em células HSC45. Confirmámos que CACNA1C
foi amplificado em células HSC45, mas não nos outros gástrico, cólon ou linhas celulares de cancro pancreático utilizando análise qPCR genómico (9b arquivo adicional; dados não mostrados). Nem NRAS
, HRAS
nem BRAF
amplificações foram detectados em linhas celulares de cancro acima por análise de qPCR genómico (dados não mostrados). A amplificação de KRAS
também foi verificada por análise de cor dupla de FISH, em que o KRAS
amplicon era evidente como uma região homogeneamente-coradas em HSC45, células SH101P4 e MKN1 (Figura 3b). Figura 3 A amplificação do gene de KRAS em células cancerosas gástricas. (A) Análise de PCR genómico quantitativa dos KRAS
lócus em 12p12.1 em células HSC45. amplificações discretos em 12p12.1 em duas outras linhas celulares de cancro gástrico também foram detectados (SH101P4 e MKN1). ADN número de cópias do ADN em relação ao normal de leucócitos diplóide foi traçada contra a posição cromossómica de nucleótidos (em megabases). As posições dos genes RefSeq nas regiões correspondentes são mostrados no mapa do fundo. A região mínima de amplificação comum a todas as 3 linhas de células de cancro gástrico é representado pela barra de cor-de-laranja. (B) Metáfase (esquerda) - e interfase (à direita) análise -peixes dos KRAS amplificados
lugar em linhas celulares de cancro gástrico. O KRAS
sonda espec�ico está no amarelo, e a sonda de controle, específico para o braço longo do cromossomo 12, está no vermelho. foram observados em tetraploidia HSC45 e triploidia em células SH101P4 e MKN1. (C) análise em tempo real de RT-PCR quantitativo de KRAS
expressão de mRNA em células de cancro gástrico com amplificação 12p12.1. Análise da expressão de genes (KRAS, LRMP, CASC1
e LYRM5
) situado dentro do fragmento amplificado mínima, e BCAT1
, que flanqueia o fragmento amplificado mínima, foi realizada utilizando em tempo real de RT-PCR. Os níveis de expressão foram normalizadas para GAPDH mRNA
, e são representadas como um gradiente de cor, em relação ao estômago normal. A amplificação do gene e mutação (códon 12 ou 13) o status de KRAS Compra de cada amostra é resumido nas direitas duas colunas. círculos preenchidos indicam a presença de amplificação ou mutação do KRAS
e círculos abertos indicam nenhuma amplificação ou nenhuma mutação do KRAS
.
A análise da sequência de KRAS
(11a arquivo adicionais) mostraram que tanto HSC45 e células SH101P4 nutria uma mutação no codão 12 que resulta em uma única substituição de aminoácido na KRAS (GGT GTT →, G12V), ao passo que as células faltava MKN1 KRAS
mutações. A presença de mutações em KRAS
AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) e as células HCT 116 (G13D) foi reportado anteriormente [28, 29]. Dos dez PCR de clones de células KRAS
HSC45 SH101P4 e que foram submetidas a análise mutacional, oito e três, respectivamente, as mutações no codão 12. Além disso nutria, a análise por PCR em tempo real genómico utilizando sondas que eram específicas para selvagem e do tipo KRAS mutantes
alelos (ficheiros adicionais 11b) também revelou que HSC45 e células SH101P4 conter diferentes proporções do alelo mutante (80% e 50%, respectivamente). No geral, estes resultados indicaram que a amplificação de um mutante KRAS
alelo também ocorre em células HSC45 e SH101P4.
A seguir investigou os níveis de ARNm
KRAS KRAS
em células de cancro gástrico -amplified por Real quantitativa -tempo de RT-PCR (qRT-PCR) (Figura 3c). Os níveis de KRAS
mRNA correlação significativa com KRAS
número de cópias. Os genes vizinhos LYRM5
e CASC1
, que se localizou o amplicão mínima, também foram expressos em níveis mais elevados em células com amplificação em comparação com as células sem amplificação (Figura 3c). Curiosamente, LRMP
foi regulada para baixo em células cancerosas, em comparação com células normais do estômago. A análise de imunotransferência de proteínas ras (Figura 4A) revelaram que a expressão de KRAS KRAS foi aumentada em células de cancro gástrico
-amplified (HSC45, SH101P4 e MKN1), enquanto nem NRAS nem HRAS foram altamente expressos (Figura 4a; dados não mostrados ). Embora a expressão de deixá-7c e deixe-7g microRNAs foi relatado para regular a expressão RAS [8], encontramos pouca correlação de expressão destes microRNAs com níveis de proteína KRAS (arquivo adicional 12), que sugeriu que KRAS superexpressão no câncer gástrico linhas celulares é devido principalmente a amplificação genómica de KRAS
. Figura 4 superexpressão do KRAS e ativação diferencial de KRAS, p44 /42 MAP quinase e AKT em KRAS -amplified células cancerosas gástricas. (A) A análise de imunotransferência dos níveis de expressão de KRAS e as ARN em células cancerosas. Actina expressão foi analisada como um controlo de carga. (B) O nível basal de GTP-KRAS foi marcadamente elevada nas células cancerosas gástricas com amplificados KRAS mutante
(HSC45 e SH101P4). lisado total (500 ug) foi submetido a um ensaio de pull-down GTP-RAS, e GTP-KRAS e GTP-NRAS foram detectados por imunotransf erência utilizando anticorpos anti-de ARN anti-KRAS e, respectivamente. lisado celular total (50 ug) foi analisada em paralelo para determinar o nível de expressão de KRAS e ARN nas células. (C) de GTP-KRAS foi elevada após a estimulação do soro nas células MKN1. As células foram cultivadas em meio normal contendo 10% de FCS (N),-privadas de soro durante 24 h (-) ou depois estimuladas com 10% de FCS, durante 1 h (+) privadas de soro. lisado de células total foi submetido a um ensaio de pull-down GTP-KRAS. (D) A ativação do p44 /42 MAP quinase e AKT em células cancerosas gástricas privadas de soro ou estimuladas. lisado celular total foi analisada como descrito para a figura c.

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