Spôsob román, digitálne skenovanie genómu detekuje KRAS amplifikáciu génu v žalúdočnej rakoviny: zapojenie nadmerne vystavený divokým typom KRAS vo signalizácie downstream a rastu rakovinových bunkových

Spôsob román, digitálne skenovanie genómu detekuje Kras
zosilnenie génu u karcinómov žalúdka: zapojenie nadmerne vystavený divokým typom KRAS v nadväzujúcom zabezpečovacieho systému a nádorových buniek rast
abstraktné
pozadia
žalúdočné rakovina je treťou najčastejšou malígne ochorenie postihujúce všeobecnú populáciu po celom svete. Aberantne aktivácia KRAS je kľúčovým faktorom v rozvoji mnohých typov nádorov, však, onkogénne mutácie KRAS
sú časté u karcinómu žalúdka. Vyvinuli sme novú metódu kvantitatívnej analýzy počtu kópií DNA, označované ako digitálny genómu skenovanie (DG), ktorý je založený na stanovenie počtu krátkych reštrikčných fragmentov, a nezahŕňa PCR alebo hybridizácie. V tejto štúdii sme použili DGS prieskumu copy-number zmeny v buniek karcinómu žalúdka.
Metódy
DGS žalúdočných nádorových bunkových línií bola vykonávaná s použitím sekvencie 5000 až 15000 reštrikčných fragmentov. premietané sme 20 rakovinou žalúdka bunkových línií a 86 primárnych nádorov žalúdka pre Kras
amplifikácie kvantitatívnej PCR, a vyšetroval Kras
zosilnenie na DNA, mRNA a proteínové úrovni tak mutačné analýzy, real-time PCR, analýza Imunoblot, GTP -RAS pull-down test a imunohistochemická analýza. Účinok KRAS
knock-down na aktiváciu P44 /42 a MAP kinázy AKT a na rast buniek boli skúmané metódou imunoblotu a kolorimetrickým testom, v danom poradí.
Výsledky
DGS analýzy HSC45 žalúdočné nádorové bunky linka odhalila amplifikácia 500 kb regiónu na chromozóme 12p12.1, ktorý obsahuje krasu
génového miesta. Bola zistená amplifikácie krasu
miesto, na 15% (3/20) žalúdočných nádorových bunkových línií (8 až 18-násobné zosilnenie) a 4,7% (4/86) primárnych nádorov žalúdka (8-50-násobné zosilnenie ). Kras
mutácie boli zistené v dvoch z troch bunkových línií, v ktorých kras
bol amplifikovaný, ale v žiadnom z primárnych nádorov neboli detekované. Nadmerná expresia proteínu KRAS korelovala priamo so zvýšeným Kras
počtu kópií. Hladina GTP-viazanej KRAS bola zvýšená po stimulácii v sére v bunkách s väčším divokého typu KRAS
, ale nie v bunkách s väčším mutovaný
. Knock-down Kras
v rakovinových bunkách žalúdka, ktoré niesli zosilnený divokého typu KRAS
viedli k inhibícii bunkového rastu a potlačenie P44 /42 MAP kinázy a AKT činnosti.
Záver
našej štúdie upozorňuje na užitočnosť ochrany vkladov pre identifikáciu copy-number zmien. Použitie systému ochrany vkladov, sme identifikovali KRAS
as génu, ktorý je zosilnený v ľudskej rakovine žalúdka. Preukázali sme, že amplifikácia génu pravdepodobne tvorí molekulárnej základ nadmernú aktiváciu krasu v karcinómu žalúdka. Doplnkové štúdie využívajúce väčšie kohortu vzoriek s karcinómom žalúdka potrebný na identifikáciu diagnostické a terapeutické dôsledky Kras
amplifikácie a nadmernej expresie.
Pozadie
rakovina žalúdka je treťou najčastejšou malígne ochorenie postihujúce všeobecnú populáciu po celom svete [1 ]. Špecifické genetické zmeny boli zaznamenané u rakoviny žalúdka, vrátane zosilnením KŠAM
, sa stretol stroje a ErbB2 stroje a mutácií v p53
APC stroje a CDH1
[2] , Kým gain-of-funkcie mutácie KRAS
sú jedny z najčastejšie pozorovaných genetickými zmenami v rôznych nádorov, vrátane pankreasu (60%), žlčových ciest (33%) a hrubého čreva (32%) [3], tieto mutácie sú časté u karcinómu žalúdka (2-7%) [4-7]. Všeobecne platí, že Ras
mutácie spojené s vzniku nádorov "lock" RAS v aktívnom GTP viazaného stavu. GTP-RAS sa viaže na niekoľko efektorových proteínov stimulovať následných signálnych dráh, z ktorých Raf-MAP kinázy kaskáda a fosfatidylinozitol 3-kinázy (PI3K) -Akt dráhy bunkového rastu a onkogenézy sú najlepšie charakterizované [3]. Predĺženým aktivácia RAS môže dôjsť aj prostredníctvom mechanizmov, ktoré nezahŕňajú mutácie v RAS. Napríklad, znižuje expresiu rokov-7 mikroRNA, ktorý potláča RAS zacielením 3'untranslated oblasť Ras
mRNA, je často spojené s vyššou úrovňou RAS proteínu v nádoroch [8]. K dnešnému dňu sa molekulárne mechanizmy onkogénne aktiváciu RAS u karcinómu žalúdka neboli úplne objasnené.
Amplifikácia genomickej sekvencie, ktoré obsahujú gény, ktoré sú rozhodujúce pre rast buniek je jedným z hlavných mechanizmov aktivácie onkogénov v rakoviny, a je často spojená s progresiou nádoru, zlú prognózu a /alebo liekovej rezistencie [9]. Z početných spôsobov v súčasnej dobe k dispozícii pre detekciu počet kópií zmeny celého genómu, je aktuálny zlatý štandard je array CGH metóda (aCGH). V posledných niekoľkých rokoch, je rozlíšenie aCGH rýchlo zlepšiť použitím oligonukleotidových sond, a predčil to aCGH za použitia štandardných BAC sondy [10]. Avšak, aCGH je tiež citlivé na vlastné šum merania intenzity hybridizácie na báze, ako je kvalita signálu je ovplyvnená repetitívnych sekvencií a je závislá na kvalite sondy [11]. V skutočnosti, optimalizácia návrhu sondy bolo veľkou výzvou vo vývoji obkladových polí [12, 13].
Digital karyotyping (DK) bol vyvinutý Wang et al. [14], a nie je obmedzený na základnom problémom s techniky poľa. DK zahŕňa digitálny výpočet krátkych fragmentov genómovej DNA (takzvané tagy), ktoré poskytujú kvantitatívne meranie počtu kópií DNA pomocou analýzy štítkom hustoty pozdĺž každého chromozómu. DK bol úspešne aplikovaný na rôzne typy nádorových pre detekciu copy-number zmeny, vrátane zosilnenie TYMS
RSF1 stroje a OTX2 stroje a vymazanie MKK4 stroje a dystrofín
[ ,,,0],15-19]. Napriek účinnosti DK, je technicky náročné pre široké použitie, pretože to zahŕňa PCR amplifikácie a vytváranie značiek v 21 párov báz (bp) na dĺžku, aby presne reprezentovať chromozómu oblasť záujmu.
Opisujeme tu vývoj nového spôsobu, nazývané DGS, pre kvantitatívnu analýzu variácií v počte kópií, ktorý je založený na tag pre počítanie konceptu DK, ale používa zjednodušený proces prípravy štítkom. DGS žalúdočných rakovinových bunkových líniách zistená amplifikácie krasu
lokuse na chromozóme 12p12.1. Naše výsledky poskytujú molekulárnej základ pre nadmernú aktiváciu kras, a naznačujú, že aktivácia KRAS po prúde signalizačných udalostí môže podporovať žalúdočné proliferáciu rakovinových buniek.
Metódy Bunkové línie a
tkaniva
bunkové línie analyzované v prúde štúdie sú uvedené v ďalšej súbor 1. bunkové línie HSC a SH101P4 boli stanovené Kazuyoshi Yanagihara [20]; všetky ostatné boli získané z American Type Culture Collection alebo japonskú Zbierke Research Bioresources (Tokyo, Japonsko). Všetky bunkové línie boli kultivované v odporúčaných médiách. Pre stimuláciu séra, bunky boli inkubované v médiu, ktoré chýbali sérum po dobu 24 hodín (h), a potom buď nestimulované alebo stimulované po dobu 1 hodiny s médiom obsahujúcim 10% plodové teľacie sérum (FCS). Primárne vzorky rakovina žalúdka boli získané z Ústavu chirurgie, Keiyukai Sapporo nemocnice, s informovaným súhlasom od každého pacienta. Genómovej DNA bola extrahovaná metódy fenol-chloroform, nasledované pôsobením RNázy. Celková RNA bola extrahovaná za použitia TRIzolu (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), podľa inštrukcií výrobcu. Genómovej DNA z normálnych leukocytov periférnej krvi (Biochain, Hayward, CA, USA) a celkové RNA z normálnej žalúdočnej sliznice od zdravých jedincov (Biochain a Invitrogen) boli zakúpené. Primárne karcinómov žalúdka boli rozdelené podľa klinicko-patologické rysy, ako je uvedené v ďalší súbor 2, podľa klasifikačného schémy pTNM (5. vydanie, 1997) [21] a Lauren klasifikačného systému [22]. Kras
stav -amplification v závislosti na veku bola porovnaná s použitím Student t testom; Podľa stupňa, stavu pT, PN stave a štádiu ochorenia pomocou testu Mann-Whitney U; a podľa pohlavia, histológie a stavu pM pomocou exaktného testu Fisher. Všetky testy boli 2-sledoval a P
hodnota < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.
Digital genómu skenovanie
V stručnosti, 40 ug genómovej DNA boli podrobené štiepenie štiepenia enzýmom pomocou Mbo
I (Takara, Tokyo, Japonsko) a potom oddelené elektroforézou na 3% NuSieve GTG agarózovom gélu. Krátke fragmenty (30-60 bp, nazývané skutočné tagy) boli Elektroelucí, zreťazené a subklonován do Bam HI
štiepeného pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) s použitím Mighty Mix DNA ligačního roztoku (TAKARA). Escherichia coli DH10B
boli transformované rekombinantnými plazmidy, transformanty boli spojené a plazmidmi DNA bola čistená pre generovanie 1. knižnice. Concatemers skutočných značiek boli vyrezané pomocou SPE
I /Pst I
trávenie z 1. knižnice, a fragmenty v rozmedzí 140 až 800 bp boli Elektroelucí, dlhých a subklonován do pBluescript II KS + za účelom generovania 2. knižnice. Druhá knižnica plazmidy obsahujúce concatemers SPE
I /Pst
fragmenty Aj boli sekvenované za použitia ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Unikátny skutočné značky boli mapované na ľudský chromozóm sekvencií a hustota tag, definovaný ako pomer skutočných značiek na virtuálnych značiek počas pohybu okna, bola vypočítaná na detekciu abnormalít v obsahu DNA pomocou prahových hodnôt definovaných DGS simulácií. Tag pozície a pomery hustoty tag boli vizualizované pomocou vlastných skladieb a Genome grafy z University of California, Santa Cruz (UCSC) genóm prehliadača (marec 2006 zmraziť, hg18) [23-25]. Podrobné protokoly pre poistenie vkladov, virtuálne charakterizáciu tag a in silico
simulácií sú k dispozícii v doplnkovej súboru 3.
kvantitatívnej real-time PCR
Relatívna počet kópií DNA bola stanovená kvantitatívne real-time PCR za použitia SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) a ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). Obsah DNA na haploidné genóm je normalizované na ktoré sa opakujú prvku, Line-1, a vypočíta porovnávacie CT (ΔΔCT) relatívna metóda kvantifikácie pomocou vzorca 2 (Nt
- nŘádek
) - ( xt
- XLINE
), kde N
t
je číslo prah cyklu pozorovaná na skúšobný náter v normálnom leukocytov DNA, n
linka
je počet prah cyklu pozorovaná u Line-1 náter v normálnom leukocytov DNA, Xt
je priemerný počet prah cyklu pozorovaná u experimentálne náter v rakovinových buniek DNA a X
čiara
je priemerný počet prah cyklu pozorovaná u Line-1 náter v rakovinových buniek DNA [14]. Genomická amplifikácia bola definovaná ako väčšia ako 4-násobné zvýšenie obsahu DNA. Tieto sekvencie primérov pre každý lokus sú k dispozícii v ďalšej oblasti 4. alelická podiel zmutovaný
(G12V, GGT GTT →) bola stanovená za použitia modifikovaného postupu real-time PCR podľa Itabashi et al
[26 ]. Podrobný protokol je k dispozícii v doplnkovej súboru 3. cDNA bola pripravená za použitia Superscript III reverznej transkriptázy (RT, Invitrogen), a úroveň mRNA z každého génu bola stanovená pomocou real-time RT-PCR s použitím TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) , Relatívna mRNA boli vypočítané porovnávacie metódou CT za použitia GAPDH
ako endogénne kontrola. Sady primer /sonda sú uvedené v ďalšej súbor 5.
fluorescenčnej in situ hybridizácia (FISH
)
BAC, ktoré obsahovali krasu
locus (RP11-636P12) a chromozómu 12q24.2 (RP11 -91M21) boli značené s Cy3 a Cy5, v danom poradí, a potom inkubované s diapozitívy pripravené s interfáze a metafázy chromozómov. Jadrá bola kontrastne prifarbená s 4 ', 6-diamino-2-fenylindolu (DAPI) a sklíčka sa analyzovala za použitia fluorescenčného mikroskopu (Leica CW-4000).
Mutačný analýza KRAS stroje a PIK3CA

Amplified genómovej fragmenty boli sekvenované a to buď priamo, alebo subklonovány pomocou TOPO TA-klonovacieho kitu (Invitrogen) a potom sekvencovania. Najmenej desať klonov z dvoch nezávislých PCR na lokus boli sekvenované s použitím M13 vpred a vzad primery (Invitrogen). Sekvencie primérov použitých k amplifikácii Kras
(exóny 1 a 2) a PIK3CA
(exóny 9 a 20), sú uvedené v ďalšej oblasti 6.
imunoblotovou analýzu
Bunky boli lyžovanie v Lysis pufor obsahujúci 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) pufra, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 10% glycerol, 10 mM NaF, 1 mM vanádu sodný, 50 mM β-glycerofosfát, 1 mM phenylmethansulfonyl fluorid , 1 mM dithiothreitol a koktejlom inhibítora proteázy (Roche, Mannheim, Nemecko). Proteíny boli oddelené pomocou SDS-PAGE a elektroblotovány na Immobilon-P membránu (Millipore, Billerica, MA, USA). Membrány boli analyzované metódou imunoblotu s použitím nasledujúcich protilátok, ako je uvedené: myšou monoklonálne anti-kras, -NR aS, a -HRAS protilátok (sc-30, SC-31 a SC-29, v danom poradí, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-aktínu protilátky (Millipore); králičie polyklonálne anti-P44 /42 MAP kinázy, -phosho-P44 /42 MAP kinázy (Thr202 /Tyr204), -Akt a -fosfo-Akt (Ser473) antiséra (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA).
GTP-RAS pull-down test
aktiváciu RAS bola detekovaná pomocou Ras aktivačný sadu EZ-Detect (Pierce, Rockford, IL, USA). Stručne povedané, fragmenty buniek (500 ug) bol inkubuje sa s ním s imobilizovaným Raf1 Ras-väzbové domény fúzovania s glutatión S-transferáza (GST-Raf1-RBD). Zrazeniny boli premyté 3 krát, a naviazané proteíny boli eluované varom po dobu 5 minút (min). Proteíny boli rozdelené na 12% polyakrylamidovom gélu, prenesená na membránu Immobilon-P, a podrobené analýze imunoblotovou s použitím anti-KRAS, -NR aS, alebo -HRAS protilátky.
RNA interferencie
zákazku navrhnutý KRAS
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), so zameraním na oblasť KRAS
, ktorá nie je spojená so známymi onkogénne mutácie, bol syntetizovaný Dharmacon (Lafayette, Co, USA). siRNA cielia LRMP
LYRM5 stroje a CASC1
boli zakúpené od firmy Ambion (No.144181, 284911 a 147715). Univerzálny non-zacielenie siRNA (nešpecifický kontrolné VII, Dharmacon) bola použitá ako negatívna kontrola. V každom experimente, 5 x 10 6 bunky boli transfekovány 7,5 ul 20 uM siRNA elektroporácie (Amax, Kolín, Nemecko) za použitia kitu Nucleofector V alebo T, v súlade s pokynmi výrobcu.
Cell Test proliferácie
po transfekciu s siRNA, žalúdočných bunkových línií karcinómu HSC45, MKN1, AGS a NUGC4 boli schovať v 96-jamkových doštičiek v hustote 8000 buniek /100 ul v štandardnom médiu s obsahom 10% FCS. počet buniek v 48, 72 a 96 hodín po transfekciu bola stanovená nepriamo kolorimetricky pomocou mobilného počítanie Kit-8 riešenia (Dojindo, Kumamoto, Japonsko). Test je založený na redukciu tetrazoliové soli ([2- (2-metoxy-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2-tetrazolium, monosodná soľ], WST -8) a je používaný ako meradlo živých buniek. Absorbancia každej jamky pri 450 nm bola meraná pomocou readeru (Model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Prietoková cytometria
Prietoková cytometria bola vykonaná tak, ako bolo opísané skôr [27]. Stručne, priľnavé a oddelené bunky boli zozbierané, fixované v 90% studenom etanole, pridá sa RNázy A (500 jednotiek /ml), a potom zafarbené propidium jodidom (50 ug /ml). Pre každú vzorku, 30000 udalosti boli analyzované pomocou analýzy bunkového cyklu platformy programu FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA). Imunohistochemické
formalínu fixované, boli zbavené parafínu zaliatych parafínu úseky nádorov žalúdka, hydratovaný , a potom sa spracuje s peroxidázou blokovacím roztoku (3% H 2O 2 v metanole). Rezy boli v autokláve pri 105 ° C počas 10 minút v cieľovej vyhľadávacom roztoku (Dako, Glostrup, Dánsko). Rezy boli inkubované s myšou anti-KRAS protilátky. (1: 100 riedenie; Santa Cruz Biotechnology) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti, a imunoreaktivita bola detekovaná za použitia činidiel ENVISION-Plus (Dako)
Výsledky
genómu skenovanie digitálne a charakterizácia virtuálnych značiek v silikochróm
digitálne genóm skenovanie (DG) je metóda kvantifikácia počtu kópií génu výpočtom krátkych fragmentov genómovej DNA (nazývané skutočné tagy), ktoré sú generované experimentálne Mbo
aj endonukleázou trávenie (obrázok 1a). Eliminovať zložité kroky pri príprave značky, sme výpočtovo vyznačuje krátkych fragmentov DNA, ktoré sú vyrábané podľa jedného reštrikčné štiepenie MBO
I, ktorý rozpoznáva 4-bp sekvenciu GATC. In silico
trávenie ľudského genómu Mbo
som vyrobila približne 1,6 milióna reštrikčných fragmentov (nazývané virtuálne tagov) v rozsahu 20-130 bp (Ďalší súbor 7a). Nukleotidová sekvenčná analýza ukázala, že približne 65% z virtuálnych značiek obsahovali repetitívne sekvencie, ako je definované vo verejnej databáze opakovaných prvkov (Ďalší súbor 7a). Dôležité je, že sekvencia zodpovedajúce databázy ľudského genómu sa zistilo, že približne 85% z virtuálnych značiek mapované jednoznačne presných miestach chromozomálnych (Ďalšie súbor 7b, c). Aj v prípade, že virtuálne značky zahŕňajú opakujúce sa sekvencie v časti, približne 80% opakujúcich sa značkami sa ukázalo, že je jedinečný. Priemerná vzdialenosť medzi dvoma jedinečnými virtuálnymi tagy 30-60 bp bol 7,6 kb, strednú vzdialenosť bola 4,5 kb a 97,8% intervalov boli kratšie ako 30 kb (Ďalší súbor 7d). Podobné vlastnosti tag intervale boli pozorované u virtuálnych značiek rozsahu 70 až 100 bp (priemerná vzdialenosť, 7,9 kb; stredné vzdialenosti, 4,8 kb; 97,4% boli kratšie ako 30 KB) a 100 až 130 bp (priemerná vzdialenosť, 7,9 KB; strednú vzdialenosť, 4,9 kB, .. 97,4% bolo kratšie ako 30 kb (Ďalšie súbor 7E, f) Okrem toho je hustota unikátnych virtuálnych značiek bol takmer rovnaký v každom chromozóme (Ďalší súbor 7g) Tieto in silico
zistenia naznačujú, že väčšina krátkych Mbo
by tagy, ktoré môžem byť informatívne pre poistenie vkladov. Obrázok 1 ochrany vkladov a príprava skutočných značiek. (a) Schéma náčrt DGS. farebných polí predstavujú genomické MBO
aj skutoční tagy. Viac informácií nájdete texte pre podrobnosti. (b a c) Príprava (b) a charakterizácia (c) skutočných značiek. Reprezentatívne výsledky za použitia genómovej DNA z MKN1 rakovina žalúdka bunky sú zobrazené. (b) Krátke fragmenty MBO
i-štiepené genómovej DNA (30 - 60 bp) boli elektrovymývány z agarosového gélu (i), zlúčia a subklonovány. Výsledné rekombinantné plazmidy boli spojené na vytvorenie knižnice 1. (ii). Dlhé concatemers (140 až 800 bp) boli vyrezané z 1st knižnice vektorov, elektrovymýván (iii), zlúčia a subklonovány. Výsledné rekombinantné plazmidy predstavujú 2nd knižnice klonov (iv). Počet tagov obsiahnutých v každom klonu je uvedené v hornej časti každej dráhy. Vložky boli skúmané pomocou Xho I /
Sac
Aj trávenia v paneloch (ii) a (iv). *, Vektorová fragmenty; ** Spe
I /Pst
trávenie Aj viacnásobným klonovacím mieste bez vložky. (C) Skutočný počet skutočných značiek z 2. knižnice je ukázaný na histogramu (vľavo), a ich vlastnosti sú zhrnuté (vpravo).
DGS simulácia in silico
Schopnosť DGS detekcie genómu -Široký zmeny je založený na genómu vlastnosti, ako je počet kópií a veľkosti zmeny, a počtu skutočných značiek získaných zo sekvenčnej analýzy. Predpovedať veľkosť zmeny, ktoré by mohli byť spoľahlivo detegovať, za predpokladu pevný počet značiek výpočtovo vzorky sme použili simulácie Monte Carlo pre výpočet pozitívnu prediktívnu hodnotu (PPV), čo je pravdepodobnosť, že detekovaná zmena predstavuje skutočnú zmenu. Napríklad sme zistili, že analýza 5000 značiek mohlo spoľahlivo rozpoznať 10-násobné zosilnenie 500 kb, homozygotná delécie 7,5 MB, alebo jediné straty kópií 30 Mb oblasti, ale nemohol detekovať subchromosomal získať menšie ako 30 Mb (ďalší súbor 8). Ako citlivosť a špecifickosť zistení týchto typov modifikácií bolo viac ako 99% v prípadoch s vysokými PPVS (viac ako 90%)., Čo ukazuje, že ani bola limitujúcim faktorom v tejto analýze (dáta nie sú uvedené)
Príprava skutočné značky z ľudskej genómovej DNA
pre DGS rakoviny žalúdka bunkové línie HSC45 a MKN1, pripravili sme knižnice skutočných značiek z genómovej DNA, ako je znázornené na obrázku 1a. Systému MBO
Aj štiepená genomická DNA bola veľkosti frakcionované (30 až 60 bp) a podrobí sa concatemerization, nasleduje výstavba 2. knižnice, ktorá obsahovala približne 10 skutočné značky na klon (obrázok 1b). Nukleotidová sekvencia analýza skutočných značiek bolo zistené, že 85,8% mapované do jedinečnej pozície, čo bolo v súlade s naším charakterizáciu virtuálnych značiek (Obrázok 1C).
Amplifikácia na chromozóme 12p v HSC45 buniek karcinómu žalúdka
celého genómu značku profil hustota HSC45 buniek bola stanovená za použitia celkom 5,462 jedinečných skutočných značiek. Pre dosiahnutie vysokého rozlíšenia a citlivosti s experimentálnymi dátami, sme použili veľkosť okna 1000 a 2100 virtuálnych značiek (približne 2300 kb a 4700 kb) pre analýzu amplifikáciu a delécií, resp. Pomer hmotnosť značka bola vypočítaná ako súčet skutočných značiek delené priemerným počtom skutočných značiek v rovnakej veľkosti okna v genóme, v ktorom bol pomer normálny hustotu tag definovaný ako 1,0. Zistili sme, že rôzne subchromosomal oblasti so zvýšenou hustotou štítkom na 8q24.21, 12p12.1 a 12p13.33, a znížila hustota značiek na 9p21.3 a dlhom ramene chromozómu 18 (obrázok 2, Ďalšie súbor 9a-d). Oblasti zvýšenou hustotou tag (12p12.1, 12p13.33 a 8q24.21) obsahoval KRAS
CACNA1C
(vápnik kanál, napätie závislé od typu l, alfa-1c podjednotku) a MYC
loci, resp. blot analýza Southern potvrdila, že KRAS stroje a MYC
boli zosilnené v HSC45 bunkách (Ďalší súbor 9e). Každý kvantifikuje zmena copy-number, ako je stanovené z kvantitatívnej real-time PCR (qPCR) genómovej DNA bola pozoruhodne podobná ako odhadujú DGS, keď je veľkosť okna pre analýzu hustoty šablóna bola prispôsobená veľkosti každej zmene (Ďalší súbor 9a-d ). Tieto výsledky naznačujú, že analýza hustoty tag podľa DGS by mohli byť použité na vykonanie analýzy počet kópií v ľudskom genóme. Obrázok 2 Detekcia zvýšeného počtu kópií na chromozómoch 8Q a 12p prostredníctvom systému ochrany vkladov v HSC45 s rakovinou žalúdka buniek. (A) Celý genóm pohľad na pomere k hmotnosti tag (s použitím okna 1000 virtuálnych značiek) v HSC45 buniek, ako bolo stanovené DGS. Hodnoty na osi y naznačujú, rozkladacie zmeny hustoty značka vo vzťahu k priemernej hustoty značky celého genómu, a predstavujú obsah DNA na haploidné genóm, v oknách. Os x predstavuje počet chromozómov. (B a c), rozšírený pohľad na pomerov hustoty záznamu na chromozómoch 8 (b) a 12 (c). V každom paneli, horný graf ukazuje pohľad na celé chromozómu v pomere k hmotnosti tag (založený na okne 1000 virtuálnych značiek). Spodná graf ukazuje rozšírený pohľad na 8q24.21 a 12p12.1, v ktorom zvýšená hustota bola zistená tag používate Windows 1000 a 500 virtuálnych značiek. Unikátny skutočné značky sú označené ako čierne zvislé pruhy a jedinečné virtuálne tagy sú uvedené v modrom (60 bp alebo kratšie) alebo svetlo modré (dlhšia ako 60 bp) pruhy v hustom režime. Polohy RefSeq génov, s niektorými spájanie izoforiem vynechať, sú uvedené v dolnej časti spodných panelov.
Amplifikácia KRAS
v žalúdočných bunkových línií karcinómu
Analýza 26 lokusov v rámci a ihneď sprievodných chromozóm 12p12. 1 v bunkách HSC45 qPCR preukázali, že oblasť asi 500 kb, ktorý zahŕňal krasu
génového miesta, bol zosilnený (8-násobné zosilnenie, obrázok 3a). Genomic qPCR screening zistená Kras
zosilnenie v dvoch ďalších žalúdočných rakovinových bunkových línií, SH101P4 (18-krát) a MKN1 (13-krát) (Obrázok 3a), zatiaľ čo my nezistil amplifikácie väčší ako 4-krát v 17 ďalší karcinómu žalúdka bunkové línie, alebo v 10 rakoviny hrubého čreva a pankreasu 11 rakovinové bunkové línie (uvedené v doplnkovej súboru 1, dáta nie sú ukázaná). DGS zistili aj amplifikácie krasu
miesto, na MKN1 bunkách (ďalší súbor 10). Susedné gény KRAS
v minimálnom amplikónu boli LRMP
(lymfatické obmedzenej membránový proteín), CASC1
(rakovina náchylnosť kandidát 1) a LYRM5
(LYR motív obsahujúce 5). BCAT1
(rozvetvený aminotransferázy 1, cytozolové) bol tiež amplifikovaný SH101P4 a MKN1 buniek, ale nie v HSC45 bunkách. Potvrdilo sa, že CACNA1C
bol amplifikovaný v bunkách HSC45, ale nie v iných žalúdočných, hrubého čreva, pankreasu alebo nádorových bunkových línií za použitia genómovej analýzy qPCR (ďalší súbor 9b; dáta nie sú uvedené). Ani národných regulačných orgánov
, Hraše
ani BRAF
amplifikácie boli detekované vo vyššie uvedených bunkových línií karcinómu genómovej analýzou qPCR (dáta nie sú uvedené). Zosilnenie KRAS
bola tiež overená duálny analýzou farebné ryby, v ktorom bolo zrejmé krasu
amplicon ako homogénne zafarbeného regiónu HSC45, SH101P4 a MKN1 buniek (obrázok 3b). Obrázok 3 amplifikácie génu Kras v rakovinových bunkách žalúdka. (A) kvantitatívne genomické PCR analýza krasu
lokuse na 12p12.1 v HSC45 bunkách. sa zistili aj v diskrétnej amplifikácie 12p12.1 v dvoch iných žalúdočných bunkových línií karcinómu (SH101P4 a MKN1). Počtu kópií DNA vo vzťahu k normálnej diploidný DNA leukocytov bola vynesená proti chromozómové nukleotidové polohy (v megabases). Polohy RefSeq génov v zodpovedajúcich oblastiach sú uvedené v dolnej časti mapy. Minimálna oblasť zosilnenie spoločné pre všetky 3 bunkových línií karcinómu žalúdka je reprezentovaný oranžovo sfarbené bar. (B) metafázu (vľavo) - a prechodné štádia (vpravo) -Ryby analýzy amplifikovanej Kras
lokuse v žalúdočnej nádorových bunkových línií. Krasu
-specifické sonda je v žltej farbe, a kontrolné sonda, špecifická pre dlhom ramene chromozómu 12, je v červenej farbe. boli pozorované tetraploid v HSC45 a triploidií v SH101P4 a MKN1 buniek. (C) kvantitatívne real-time RT-PCR analýza Kras
expresie mRNA v žalúdočnej nádorových bunkách s amplifikáciou 12p12.1. Analýzu expresie génov (KRAS, LRMP, CASC1 stroje a LYRM5
) sa nachádza v minimálnej amplikónu, a BCAT1
, ktorý lemuje minimálne amplikón, sa vykonáva za použitia real-time RT-PCR. Expresné hladiny boli normalizované k GAPDH mRNA
, a sú znázornené ako farebný gradientu, vztiahnuté na normálny žalúdok. Zosilnenie a mutácie génu (kodóne 12 alebo 13) stavu KRAS
pre každú vzorku sú zhrnuté v pravom dvoch stĺpcoch. Plná kolieska ukazujú na prítomnosť amplifikácie alebo mutácie KRAS stroje a prázdne krúžky neukazujú žiadne zosilnenie ani žiadnu mutáciu KRAS
.
Sekvenčná analýza KRAS
(ďalší súbor 11a) ukázala, že obaja HSC45 a SH101P4 bunky kryl mutáciu v kodóne 12, ktorá vyústila v substitúcii jedinej aminokyseliny v KRAS (GGT → GTT, G12V), zatiaľ čo MKN1 bunky chýbal Kras
mutácie. Prítomnosť Kras
mutácií v AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) a HCT116 (G13D) buniek bol už skôr [28, 29] hlásené. Z desiatich klonov PCR Kras
z HSC45 a SH101P4 buniek, ktoré boli podrobené mutačné analýzu, osem a tri, v tomto poradí, kryl mutácie v kodóne 12. Ďalej genómovej real-time PCR analýza s použitím sond, ktoré boli špecifické pre divoký -typ a zmutovaný
alely (Ďalší súbor 11b) tiež ukázal, že HSC45 a SH101P4 bunky obsahujú rôzne podiely mutantný alely (80% a 50%, v tomto poradí). Celkovo tieto výsledky ukazujú, že amplifikácia mutovaný
alely tiež sa vyskytuje v HSC45 a SH101P4 buniek.
Ďalej sme skúmali hladinu Kras
mRNA v Kras
-amplified buniek karcinómu žalúdka kvantitatívne real -time RT-PCR (QRT-PCR) (obrázok 3c). Hladiny Kras
mRNA významne koreluje s Kras
počtom kópií. Susedné gény LYRM5 stroje a CASC1
, ktoré lokalizované k minimálnej amplikónu, boli vyjadrené na vyšších úrovniach v bunkách sa zosilnením v porovnaní s bunkami bez zosilnenia (obrázok 3c). Je zaujímavé, že LRMP
bola down-regulovaná v nádorových bunkách v porovnaní s normálnymi bunkami žalúdka. Imunoblotová analýza proteínov RAS (Obrázok 4A), sa zistilo, že expresia génu KRAS bola zvýšená v Kras
-amplified buniek karcinómu žalúdka (HSC45, SH101P4 a MKN1), zatiaľ čo ani národné regulačné orgány, ani Hraše bol vysoko exprimovaný (Obrázok 4a; dáta nie sú uvedené ). Hoci expresia rokov-7c a necháme-7 g microRNA bola hlásená k regulácii RAS výraz [8], ktorý sme našli malú koreláciu expresie týchto mikroRNA s hladinou proteínov Kras (ďalší súbor 12), ktorý navrhol, že KRAS nadmerná expresia v karcinómu žalúdka bunkové línie je spôsobený predovšetkým genomické zosilnenie KRAS
. Obrázok 4 Nadprodukcie KRAS, a diferenciálnej aktivácia KRAS, P44 /42 MAP kinázy a AKT v KRAS -amplified rakovinové bunky žalúdočnej. (A) analýza imunoblotu expresných hladín KRAS a národné regulačné orgány v nádorových bunkách. Aktínu expresia bola analyzovaná ako kontrola nanášania. (B) Bazálna úroveň GTP-KRAS bol výrazne vysoký obsah žalúdka rakovinových bunkách s väčším zmutovaný
(HSC45 a SH101P4). Celková lyzáty (500 ug) bol podrobený rozbaľovací teste GTP-RAS, a GTP-KRAS a GTP-NRO boli detekované metódou imunoblotu za použitia anti-KRAS a anti-protilátky národných regulačných orgánov, resp. Celkový bunkový lyzát (50 ug) bola analyzovaná paralelne pre stanovenie hladiny expresie génu KRAS a národných regulačných orgánov v bunkách. (C) GTP-KRAS bol povýšený po séra stimulácii MKN1 bunkách. Bunky boli kultivované v normálnom médiu obsahujúcom 10% FCS (N), sérové ​​hladovanie po dobu 24 hodín (-) alebo v sére vyhladované potom stimulované 10% FCS po dobu 1 hodiny (+). Celkový bunkový lyzát bol podrobený testu pull-down GTP-KRAS. (D) Aktivácia P44 /42 a MAP kinázy AKT v rakovinových bunkách žalúdočnej séra hladovania alebo stimulovanej. Celkový bunkový lyzát bol analyzovaný, ako je popísané pre obrázok C.

• Genóm celé číslo kópií génu a expresie analýza primárnych nádorov žalúdka a žalúdočné karcinóm lines
• Mechanizmy žalúdočným metanolu extrakt z melastoma malabathricum listy