Uutta menetelmää, digitaalinen genomin skannaus tunnistaa KRAS geenivahvistus mahasyövistä: osallistuminen yli-ilmentynyt villin tyypin KRAS loppupään signalointi ja syöpäsolujen growth

Uutta menetelmää, digitaalinen genomin skannaus tunnistaa KRAS
geenivahvistus mahasyövistä: osallistuminen yli-ilmentynyt villin tyypin KRAS loppupään signalointi ja syöpäsolujen kasvua
tiivistelmä
tausta
Mahasyöpä on kolmanneksi yleisin maligniteetti vaikuttavat väestön maailmanlaajuisesti. Poikkeava aktivaatio KRAS on avaintekijä kehitettäessä monenlaisia ​​kasvainten kuitenkin onkogeenisiä mutaatiot KRAS
ovat harvinaisia ​​mahasyövässä. Olemme kehittäneet uuden kvantitatiivinen analyysimenetelmä DNA kopioluvun, kutsutaan digitaalinen genomin skannausta (DGS), joka perustuu luettelointi lyhyt restriktiofragmenttien, eikä siihen liity PCR: llä tai hybridisaatioon. Nykyisessä tutkimuksessa käytimme DGS kartoittaa kopioluvun muutoksia mahalaukun syövän soluissa.
Menetelmät
DGS mahalaukun syövän solulinjojen suoritettiin käyttäen sekvenssien 5000-15000 restriktiofragmentit. Seuloimme 20 mahasyövän solulinjoja ja 86 ensisijaista mahalaukun kasvaimet KRAS
monistus kvantitatiivisella PCR: llä, ja tutkittiin KRAS
monistuksen DNA, mRNA: ta ja proteiinia tasoja mutaatioanalyysi, real-time PCR, immunoblot-analyysi, GTP -RAS avattavasta määritys ja immunohistokemiallinen analyysi. Vaikutus KRAS
knock-down aktivoinnista p44 /42 MAP-kinaasin ja AKT ja solujen kasvuun tutkittiin immunoblottauksella ja kolorimetrisellä määrityksellä, vastaavasti.
Tulokset
talletussuojajärjestelmiä analyysi HSC45 mahalaukun syöpäsolun line paljasti monistamisen 500 kb: n alueen kromosomissa 12p12.1, joka sisältää KRAS
geenilokuksesta. Monistaminen KRAS
lokuksen havaittiin 15% (3/20) mahasyövän solulinjojen (8-18-kertainen vahvistus) ja 4,7% (4/86) primaaristen mahalaukun kasvaimet (8-50-kertainen vahvistus ). KRAS
mutaatiot tunnistettiin kaksi kolmesta solulinjoja, jotka Kras
monistettiin, mutta ei havaittu mitään ensisijaisen kasvaimia. Yli-ilmentyminen KRAS proteiinin korreloi suoraan lisääntynyt KRAS
kopiomäärä. Taso GTP: hen sitoutuneen KRAS nostettiin seuraavat seerumin stimulaatiota solujen monistettiin villityypin KRAS
, mutta ei soluissa, vahvistetulla KRAS
. Knock-down of KRAS
mahalaukun syöpäsolut rahdin monistettu villin tyypin KRAS
johti solujen kasvun esto ja tukahduttaminen p44 /42 MAP-kinaasin ja AKT-vaikutusta.
Päätelmä
Tutkimuksemme korostaa hyödyllisyyttä DGS tunnistamiseksi kopioluvun muutoksia. Käyttämällä DGS tunnistimme KRAS
kuin geeni, jota vahvistetaan ihmisen mahasyövän. Olemme osoittaneet, että geenin monistus todennäköisesti muodostaa molekyylitasolla yliaktivoituminen KRAS mahasyövän. Lisätutkimukset käyttämällä suurempaa kohortin mahasyövän vaadita näytteitä määrittämiseksi diagnostiset ja terapeuttiset vaikutukset KRAS
vahvistusta ja yli-ilmentymisen.
Tausta
Mahasyöpä on kolmanneksi yleisin maligniteetti vaikuttavat väestön maailmanlaajuisesti [1 ]. Erityiset geneettisiä muutoksia on raportoitu mahasyövän, mukaan lukien siihen liitetyt ja KSAM
, MET
ja erbB2:
, ja mutaatioita p53
, APC
, ja CDH1
[2] . Vaikka voitto-of-function mutaatioiden KRAS
ovat eräitä kaikkein yleisimmin havaittu geneettisiä muutoksia eri kasvaimia, mukaan lukien haiman (60%), sappiteiden (33%) ja paksusuolen (32%) [3], nämä mutaatiot ovat harvinaisia ​​mahasyövässä (2-7%) [4-7]. Yleensä RAS
liittyviä mutaatioita tumorigeneesin "lukko" RAS aktiivisessa GTP sitoutuneena. GTP-RAS sitoutuu useita efektoriproteiinien edistää alavirtaan signalointireittien, joista RAF-MAP kinaasikaskadin ja fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) -AKT reittejä solujen kasvun ja kasvaimen synnyssä ovat parhaiten karakterisoitu [3]. Pitkäaikainen aktivointi RAS voi tapahtua myös mekanismeja, jotka eivät liity mutaatioita RAS. Esimerkiksi alennettu ilmentyminen let-7 MikroRNA, joka estää RAS kohdistamalla 3'untranslated alueen RAS
mRNA liittyy usein korkeampi RAS proteiinin tason kasvaimissa [8]. Tähän mennessä, molekyylitason mekanismeja onkogeenisiä aktivaation RAS mahasyövän ei ole täysin selvitetty.
Monistaminen genomisia sekvenssejä, jotka sisältävät geenejä, jotka ovat kriittisiä solujen kasvu on yksi tärkeimmistä mekanismeista aktivaation onkogeenien syövän, ja on usein liittyy syövän etenemiseen, huono ennuste ja /tai lääkeresistenssi [9]. Niistä lukuisia menetelmiä tällä hetkellä saatavilla havaitsemiseksi kopiomäärä muutoksia genomin laajuisia, nykyinen kultakanta on array CGH menetelmä (aCGH). Viime vuosina, resoluutiota aCGH on parantunut nopeasti käyttämällä oligonukleotidikoettimia, ja on ohittanut että aCGH tavallisilla BAC koettimia [10]. Kuitenkin aCGH on myös altis luontaista kohinaa hybridisaatio-pohjainen voimakkuuden mittaukset, kun signaalin laatu vaikuttavat toistuvat sekvenssit ja se on riippuvainen koettimen laadun [11]. Itse optimointi sondirakenne on ollut suuri haaste kehittämisessä laatoituksen paneelit [12, 13].
Digital karyotyping (DK) on kehittänyt Wang et al. [14], ja ei ole rajoitettu luontainen ongelmat array tekniikoita. DK liittyy digitaalisen luettelointi lyhyitä fragmentteja genomisen DNA (kutsutaan tunnisteet), joka tarjoaa kvantitatiivinen mittaus DNA kopioluvun kautta tag tiheys analyysi kummallakin kromosomi. DK on sovellettu onnistuneesti erilaisia ​​kasvaintyypeissä havaita kopioluvun muutoksia, mukaan lukien monistuminen TYMS
, RSF1
ja OTX2
, ja poistetaan MKK4
ja dystrofiinin
[ ,,,0],15-19]. Huolimatta tehokkuutta DK, se on teknisesti haastavaa laaja sovelluksissa, koska siihen liittyy PCR-monistus ja sukupolven tunnisteet 21-emäsparin (bp) pituisen tarkasti edustamaan kromosomi sijainti kiinnostava.
Raportoimme tässä kehittäminen uusi menetelmä, jota kutsutaan DGS, että kvantitatiivinen analyysi kopioluvun vaihtelu, joka perustuu tag-laskenta käsite DK, mutta käyttää yksinkertaistettua prosessia tag valmistelua. DGS mahalaukun syövän solulinjojen havaittiin monistamiseen KRAS
lokukseen kromosomissa 12p12.1. Tuloksemme antavat molekyylitason perustan yliaktivoituvan KRAS, ja viittaavat siihen, että aktivointi KRAS loppupään signalointi tapahtumat voivat edistää mahasyövässä soluproliferaatiota. Tool Menetelmät
Solulinjat ja kudoksissa
solulinjat analysoitu nykyisessä tutkimuksessa luetellaan Additional tiedostoon 1. HSC ja SH101P4 solulinjat perustettiin Kazuyoshi Yanagihara [20]; kaikki muut saatiin American Type Culture Collection tai Japani Collection of Research Bioresources (Tokio, Japani). Kaikkia solulinjoja viljeltiin suositellun median. Seerumin stimulointi, soluja inkuboitiin väliaineessa, joka ei ollut seerumia, 24 tunnin ajan (h), ja sitten joko stimuloimattomia tai stimuloitu 1 tunnin ajan väliaineessa, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia (FCS). Ensisijainen mahasyövän näytteet saatiin Department of Surgery, Keiyukai Sapporo sairaala, jossa tietoisen suostumuksen kustakin potilaasta. Genominen DNA uutettiin käyttäen fenoli-kloroformilla menetelmällä, jota seuraa RNaasi hoitoon. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Genomisen DNA: n normaalia ääreisveren leukosyyteissä (BioChain, Hayward, CA, USA), ja kokonais-RNA: ta normaalista mahalaukun limakalvon terveistä yksilöistä (BioChain ja Invitrogen) ostettiin. Ensisijainen mahasyövistä luokiteltiin käyttäen kliinis-, kuten on esitetty Additional tiedostoon 2 mukaan pTNM luokitusjärjestelmä (5. painos, 1997) [21] sekä Lauren n luokitusjärjestelmän [22]. KRAS
-amplification tila iän verrattiin käyttämällä Student t-testiä; mukaan grade, pT tila PN tila, ja taudin vaiheessa käyttäen U-testi; ja sukupuolen mukaan histologia ja pM tila käyttämällä Fisherin eksaktia testiä. Kaikki testit 2-tailed, ja P
arvo < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.
Digital genomin skannaus
Lyhyesti, 40 ug genomista DNA: ta altistettiin restriktioentsyymidigestiolla käyttäen Mbo
I (Takara, Tokio, Japani) ja sitten erotettiin elektroforeesilla 3% NuSieve GTG agaroosigeelillä. Lyhyt fragmentit (30-60 bp, kutsutaan todellinen tunnisteet) elektroeluoitiin, ketjutettu ja subkloonattiin Bam
HI-digestoituun pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) käyttäen Mighty Sekoita DNA ligation liuosta (Takara). Escherichia coli
DH10B transformoitiin rekombinanttiplasmideja, transformantit yhdistettiin ja plasmidi-DNA puhdistettiin, joka tuottaa 1-kirjaston. Concatemers todellinen tunnisteet irrotettiin Spe
I /Pst
I-digestiolla alkaen 1. kirjasto ja fragmentit välillä 140-800 bp elektroeluoitiin, ketjutettu ja subkloonattiin pBluescript II KS + tuottaa 2. kirjasto. Toinen kirjasto sisältävät plasmidit concatemers Spe
I /Pst
I-fragmentit sekvensoitiin käyttämällä ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ainutlaatuinen real tunnisteet kartoitettiin ihmisen kromosomiin sekvenssit, ja tag tiheys, määritellään suhde todellisen tunnisteita virtuaalisia tageja yli liikkuva ikkunat, laskettiin havaitsemiseksi poikkeavuuksien DNA sisältöä käyttämällä raja-arvojen määrittelemän DGS simulaatioita. Tag kantoja ja tag tiheys suhteet visualisoitiin käyttämällä Custom Kappaleet ja Genome Kuvaajat yliopistosta California, Santa Cruz (UCSC) genomin selain (maaliskuu 2006 jäätyä, hg18) [23-25]. Yksityiskohtaiset protokollat ​​DGS, virtuaalinen tag luonnehdinta ja in silico
simulaatiot ovat saatavilla Additional tiedostoon 3.
Quantitative real-time PCR
Suhteellinen DNA kopioluku määritettiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR käyttämällä SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ja ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). DNA: n määrä per haploidigenomista oli normalisoitu toistuvia elementti, Line-1, ja lasketaan vertaileva CT (ΔΔCT) suhteellinen kvantitointimenetelmä kaavalla 2 (Nt
- nline
) - ( xt
- xline
), missä N
t
on kynnyssykli numero havaittu kokeellisen pohjamaali normaalissa valkosolujen DNA, N
linja
on kynnyssykli numero havaittiin line-1 pohjamaali normaalissa valkosolujen DNA, Xt
on keskimääräinen kynnyssykli numero havaittiin kokeellisen pohjamaali syöpäsolujen DNA: ta ja X
linja
on keskimääräinen kynnyssyklistä numero havaittiin Line-1 pohjamaali syöpäsolun DNA [14]. Genomivahvistuksen määriteltiin suurempi kuin 4-kertainen lisäys DNA-pitoisuus. Alukesekvenssit kunkin lokuksen ovat saatavilla Muihin tiedoston 4. alleeliset osuus KRAS
(G12V, GGT → GTT) määritettiin käyttämällä modifioitua reaaliaikainen PCR-menettelyn mukaisesti Itabashi et ai
[26 ]. Yksityiskohtainen protokolla on saatavilla Additional tiedostoon 3. cDNA valmistettiin käyttämällä SuperScript III käänteistranskriptaasia (RT, Invitrogen), ja mRNA-tasolla kunkin geenin määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä käyttäen TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) . Suhteellinen mRNA-tasot laskettiin vertaileva CT-menetelmällä käyttäen GAPDH
kuin endogeeninen kontrolli. Aluke /koetin sarjat käytetyt esitetään Additional tiedostoon 5.
Fluoresenssi in situ
-hybridisaatio (FISH) B BAC: joka sisälsi KRAS
lokus (RP11-636P12) ja kromosomissa 12q24.2 (RP11 -91M21) leimattiin Cy3 ja Cy5, vastaavasti, ja sitten inkuboitiin dioja valmistettu interphase ja metafaasikromosomeissa. Tumat vasta-värjättiin 4 ', 6-diamino-2-fenyyli (DAPI), ja levyt analysoitiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Leica CW-4000).
Mutaatioanalyysi on KRAS
ja PIK3CA

Amplified genomiset fragmentit joko sekvensoitiin suoraan tai subkloonattiin käyttäen TOPO TA-kloonaus (Invitrogen) ja sitten sekvensoitiin. Ainakin kymmenen klooneja kahdesta itsenäisestä PCR-määrityksissä kohti lokuksen sekvensoitiin käyttämällä M13 eteen- ja taaksepäin-alukkeita (Invitrogen). Sekvenssit käytettyjen alukkeiden monistamiseen KRAS
(eksonit 1 ja 2) ja PIK3CA
(eksonit 9 ja 20) on esitetty Muihin tiedoston 6.
immunoblot-analyysi
Solut lyysattiin Lysis puskuria, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI (pH 7,5) puskuria, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 10% glyserolia, 10 mM NaF, 1 mM natriumvanadaattia, 50 mM β-glyserofosfaatti, 1 mM phenylmethansulfonyl fluoria , 1 mM ditiotreitolia, ja proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Mannheim, Saksa). Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja elektroblotattiin Immobilon-P-membraanille (Millipore, Bedford, MA, USA). Kalvot analysoitiin immunoblottauksella käyttäen seuraavia vasta-aineita, kuten: hiiren monoklonaalinen anti-KRAS, -NRAS, ja -HRAS aineita (sc-30, sc-31, ja sc-29, vastaavasti, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-aktiini-vasta-aine (Millipore); kanin polyklonaalista anti-p44 /42 MAP-kinaasin, -phosho-p44 /42 MAP-kinaasin (Thr202 /Tyr204), -Akt ja -phospho-Akt (Ser473) antiseerumit (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA).
GTP-RAS pull-down-määritys
aktivointi RAS havaittiin käyttäen EZ-tunnistus Ras Activation Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Lyhyesti, solu- lysaattia (500 ug) inkuboitiin immobilisoidun Raf1 Ras-sitova domeeni fuusioituna glutationi-S-transferaasin (GST-Raf1-RBD). Sakat pestiin 3 kertaa, ja sitoutuneet proteiinit eluoitiin keittämällä 5 minuuttia (min). Proteiinit erotettiin 12% polyakryyliamidigeelillä, siirretään Immobilon-P kalvo, ja alistettiin immunoblot-analyysi käyttäen anti-KRAS, -NRAS tai -HRAS vasta-aineita.
RNA-interferenssi
mittatilaustyönä KRAS
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), jonka tavoitteena on alue KRAS
, joka ei liity tunnettujen onkogeeniset mutaatiot, syntetisoitiin Dharmacon (Lafayette, Co, USA). siRNA kohdistaminen LRMP
, LYRM5
ja CASC1
ostettiin Ambion (No.144181, 284911 ja 147715). Universaali ei-suunnattu siRNA (epäspesifinen kontrolli VII, Dharmacon) käytettiin negatiivisena kontrollina. Jokaisessa kokeessa, 5 x 10 6-solut transfektoitiin 7,5 ui 20 uM siRNA elektroporaatiolla (Amaxa, Köln, Saksa) käyttäen Nucleofector sarja V tai T, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Soluproliferaatiomääritys
jälkeen transfektion siRNA: t, mahalaukun syövän solulinjat HSC45, MKN1, AGS ja NUGC4 ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 8000 solua /100 ui standardia, joka sisälsi 10% FCS: ää. Solujen määrä 48, 72 ja 96 h transfektion jälkeen määritettiin epäsuorasti kolorimetrisellä määrityksellä käyttäen Cell Counting Kit-8 ratkaisu (Dojindo, Kumamoto, Japani). Määritys perustuu vähentämiseen tetratsoliumsuolan ([2- (2-metoksi-nitrofenyyli) -3- (4-nitrofenyyli) -5- (2,4-disulfofenyyli) -2-tetratsolium, mononatriumsuola], WST -8) ja sitä käytetään mittana elävien solujen. Absorbanssi jokaisen kaivon 450 nm: ssä mitattiin mikrolevynlukijaa käyttäen (Model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Virtaussytometria
Virtaussytometria suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [27]. Lyhyesti, joka tarttuu ja irrottaa solut otettiin talteen, kiinnitettiin 90% kylmällä etanolilla, käsiteltiin RNaasi A: lla (500 yksikköä /ml), ja värjättiin sitten propidiumjodidilla (50 ug /ml). Jokaisesta näytteestä, 30000 tapahtumien analysoitiin käyttämällä solusyklin analyysi alustan FlowJo ohjelman (Tree Star, Ashland, OR, USA).
Immunohistokemia
Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotetut leikkeet mahalaukun kasvaimet poistettiin parafiini, hydratoitu , ja käsiteltiin sitten peroksidaasi blokkausliuoksella (3% H 2O 2 Metanoli). Osiot autoklavoitiin 105 ° C: ssa 10 minuutin ajan kohde haku liuokseen (Dako, Glostrup, Tanska). Leikkeitä inkuboitiin hiiren anti-KRAS-vasta-ainetta (1: 100 laimennos, Santa Cruz Biotechnology) 1 h huoneen lämpötilassa, ja immunoreaktiivisuus havaittiin käyttäen ENVISION-Plus reagenssit (Dako).
Tulokset
Digital genomin skannaus ja luonnehdinta virtuaalisten tagien silico
Digital genomin skannausta (DGS) on menetelmä kvantifioimiseksi geenikopiomäärä luettelemalla lyhyitä genomista DNA-fragmenttien (kutsutaan todellinen koodeja), jotka syntyvät kokeellisesti Mbo
I aasidigestiolla (kuva 1a). Poistamiseksi monimutkaisia ​​vaiheita, jotka liittyvät tunnisteen valmistamiseksi, me laskennallisesti tunnettu lyhyen DNA-fragmentit, jotka on tuotettu yhdessä restriktiopilkonnan Mbo
I, joka tunnistaa 4 emäsparin sekvenssin GATC. In silico
ruoansulatusta ihmisen genomiin Mbo
Olen tuottanut noin 1,6 miljoonaa restriktiofragmentit (kutsutaan virtuaalinen tunnisteet) on alueella 20-130 bp (Additional tiedosto 7a). Nukleotidisekvenssin analyysi paljasti, että noin 65% virtuaalisen tunnisteiden sisältämän toistuvat sekvenssit, kuten on määritelty julkisen tietokannan toista elementtien (Additional tiedosto 7a). Tärkeää on, sekvenssi vastaa ihmisen genomin tietokannasta paljasti, että noin 85% virtuaalisen tunnisteiden kartoitettu ainutlaatuisesti tarkat sijainnit kromosomissa (Additional tiedosto 7b, c). Vaikka virtuaalinen tunnisteet sisältävät toistuvat sekvenssit osittain noin 80% toistuvia tunnisteiden osoittautui ainutlaatuinen. Keskimääräinen etäisyys kahden ainutlaatuinen virtuaalinen tunnisteita 30-60 bp pitkiä oli 7,6 kb, mediaani etäisyys oli 4,5 kb ja 97,8% Intervallien olivat lyhyempiä kuin 30 kb (Additional tiedosto 7d). Samanlaisia ​​tag väli ominaisuudet havaittiin virtuaalisia tageja välillä ovat 70 100 emäsparin (keskimääräinen etäisyys, 7,9 kb; mediaani etäisyys, 4,8 kb; 97,4% oli alle 30 kb), ja 100-130 emäsparin (keskimääräinen etäisyys, 7,9 kb; mediaani etäisyys, 4,9 kb; 97,4% oli alle 30 kb (Additional tiedosto 7e, f). Lisäksi tiheys ainutlaatuisen virtuaalisen tunnisteiden oli lähes yhtä kussakin kromosomissa (Additional tiedosto 7 g). Nämä in silico
havainnot ehdotti, että suurin osa lyhyen Mbo
I tunnisteet olisi informatiivinen talletussuojajärjestelmille. Kuva 1 DGS ja valmistelu todellinen tunnisteita. (a) Kaavamainen ääriviivat DGS. Värilliset laatikot edustavat genomista Mbo
I todellinen tunnisteita. Katso teksti yksityiskohtia. (b ja c) valmistus (b) ja karakterisointi (c) todellinen tunnisteita. Edustavia tuloksia käyttämällä genomista DNA: ta MKN1 mahasyöpä solut on esitetty. (b) Lyhyet fragmentteja Mbo
I-digestoitu genomi-DNA: ta (30-60 bp) elektroeluoitiin agaroosigeelistä (i), ketjutettu ja subkloonattiin. Saatu yhdistelmä-DNA-plasmidit yhdistettiin tuottaa 1. kirjasto (ii). Long concatemers (140-800 bp) leikattiin 1 kirjastosta vektoreista, elektroeluoidaan (iii), ketjutettu ja subkloonattiin. Tuloksena rekombinanttiplasmidit edustavat toinen kirjasto klooneista (iv). Määrän tunnisteita, jotka sisältyvät kuhunkin kloonin on esitetty yläosassa kunkin kaistan. Insertit tutkittiin Xho
I /Sac
I digestiolla paneeleissa (ii) ja (iv). *, Vektorifragmentteja; **, Spe
I /Pst
I pilkkomalla usean kloonauskohdan ilman insertti. (C) todellinen määrä todellisia tageja 2. kirjastosta näkyy histogrammin (vasemmalla), ja niiden ominaisuudet on yhteenveto (oikealla).
DGS simulointi in silico
Kyky DGS havaita genomin laajuinen muutoksia perustuu genomin ominaisuuksia, kuten kopioluvun ja koon muuttaminen, ja määrä todellisia tunnisteita saatujen sekvenssianalyysillä. Ennustaa koko muutos, joka voi luotettavasti havaita, koska kiinteä määrä laskennallisesti näytteet tunnisteita, käytimme Monte Carlo simulaatiota laskea positiivinen ennustearvo (PPV), joka on todennäköisyys sille, että havaitaan muutos edustaa todellista muuttamista. Esimerkiksi, olemme havainneet, että analyysi 5000 tunnisteita voisi luotettavasti havaita 10-kertaista monistumista 500 kb, joka on homotsygoottinen deleetio 7,5 Mb, tai yhden kopion menetystä 30 Mb alueella, mutta sitä ei havaita subchromosomal saada pienempi kuin 30 Mb (Additional tiedosto 8). Sekä herkkyys ja havaita tämäntyyppisten muutos olivat > 99% tapauksissa korkea PPV (> 90%), joka ilmoitti, että kumpikaan oli rajoittava tekijä tässä analyysissä (tietoja ei esitetty).
Valmistaminen real tunnisteet ihmisen genomisesta DNA:
talletussuojajärjestelmille mahalaukun syövän solulinjat HSC45 ja MKN1, olemme valmiita kirjastoja todellista tunnisteet genomisesta DNA: sta, kuten on esitetty kuviossa 1a. MBO
I: llä pilkottu genominen DNA fraktioitiin koon mukaan (30-60 bp) ja alistettiin concatemerization, jonka jälkeen rakentaminen 2. kirjaston, joka sisälsi noin 10 todellinen tagit kloonin (kuvio 1 b). Nukleotidisekvenssi analyysinsä todellisista tunnisteita paljasti, että 85,8% kartoitettu ainutlaatuinen kilpailuasema, joka vastasi meidän luonnehdinta virtuaalisia tageja (kuva 1c).
Amplifikaatiot kromosomissa 12p in HSC45 mahasyövässä solujen
genominlaajuisten tag tiheys profiilia HSC45 solujen määritettiin käyttäen yhteensä 5462 ainutlaatuinen todellista tunnisteet. Saavuttaa korkea resoluutio ja herkkyys kanssa kokeelliset tiedot, käytimme ikkuna koot 1000 ja 2100 virtuaalisia tageja (noin 2300 kb ja 4700 kb) analysointiin monistukset ja poistot, vastaavasti. Tunniste tiheys laskettiin summana todellinen tunnisteiden jaettuna keskimääräinen todellinen tagien samansuuruisten ikkunat koko genomin, jossa normaali tag tiheyssuhde määritettiin 1,0. Havaitsimme erillisiä subchromosomal alueilla lisääntynyt tag tiheyden 8q24.21, 12p12.1 ja 12p13.33, ja laski tag tiheys 9p21.3 ja pitkän varren kromosomin 18 (kuvio 2, Additional tiedosto 9a-d). Alueet on lisääntynyt tag tiheys (12p12.1, 12p13.33 ja 8q24.21) sisälsi KRAS
, CACNA1C
(kalsiumkanavan, jännite-riippuvainen, l tyyppi, alfa-1 c alayksikkö) ja MYC
loci, vastaavasti. Southern blot-analyysi vahvisti, että KRAS
ja MYC
monistettiin HSC45 soluissa (Additional tiedosto 9e). Jokainen kvantitoidaan kopioluvun muutos määritetään kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) Genomisen DNA oli huomattavan samankaltainen kuin arvioima DGS kun ikkunan koko tag tiheys analyysiä sovitettu koko kunkin muutos (Additional tiedosto 9a-d ). Nämä tulokset viittaavat siihen, että tag tiheys analyysi DGS voitaisiin käyttää suorittamaan kopioluvun analyysi koko ihmisen genomin. Kuvio 2 havaitseminen lisääntyi kappalemäärinä kromosomien 8q ja 12p mukaan talletussuojajärjestelmää HSC45 mahalaukun syöpäsoluja. (A) Koko genomin näkymä tag tiheys -suhteen (käyttäen ikkuna 1000 virtuaalisen tunnisteet) in HSC45 soluissa määritettynä DGS. Arvot y-akseli osoittaa taitettava muutoksista tag tiheys verrattuna keskimääräiseen tag tiheys koko genomin, ja edustavat DNA-pitoisuus haploidia genomia kohti, ikkunoissa. X-akseli edustaa kromosomin numero. (B ja c) laajennettu näkymä tag tiheys tunnuslukuja kromosomeissa 8 (b) ja 12 (c). Kussakin paneelissa ylempi kaavio osoittaa koko-kromosomin näkymä tag tiheys suhde (perustuen ikkunan 1000 virtuaalisen tunnisteet). Alempi kuvaaja esittää suurennettua näkymä 8q24.21 ja 12p12.1, jossa lisääntynyt tag tiheys havaittiin käyttäen ikkunat 1000 ja 500 virtuaalisia tageja. Ainutlaatuinen real tunnisteet on merkitty mustina pystypalkki- ja ainutlaatuinen virtuaalinen tunnisteet on merkitty sinisellä (60 emäsparia tai lyhyempi) tai vaaleansininen (yli 60 bp) baareja tiheässä tilassa. Kannat refseq geenien, joidenkin liittämiseen isoformien pois, on esitetty alaosassa alemman paneelit.
Monistaminen KRAS
mahasyövän solulinjoissa
analyysi 26 loci sisällä ja välittömästi reunustavat kromosomiin 12p12. 1 HSC45 soluissa qPCR osoittaneet, että alue noin 500 kb, joka sisälsi KRAS
geenilokuksen, monistettiin (8-kertaista monistumista, kuva 3a). Genomista qPCR seulonta havaittu KRAS
amplifikaation kaksi mahasyövän solulinjoissa, SH101P4 (18-kertainen) ja MKN1 (13-kertainen) (kuvio 3a), kun taas emme monistumisen havaitsemiseksi on suurempi kuin 4-kertainen 17 muiden mahasyöpä solulinjoja, tai 10 paksusuolen syövän ja 11 haimasyövän solulinjoissa (lueteltu Muihin tiedosto 1, tuloksia ei ole esitetty). DGS myös havaittu monistamisen KRAS
lokukseen MKN1 soluissa (Additional tiedosto 10). Naapurimaiden geenit KRAS
on minimaalinen amplikoni oli LRMP
(lymfoidispesifiset rajoitettu kalvo proteiini), CASC1
(syöpäalttiutta ehdokas 1) ja LYRM5
(LYR motiivi sisältää 5). BCAT1
(haaraketjuinen aminotransferaasi 1, sytosolinen) oli myös monistettiin SH101P4 ja MKN1 soluja, mutta ei HSC45 soluissa. Olemme vahvisti, että CACNA1C
monistettiin HSC45 soluissa, mutta ei muissa mahan, paksusuolen, haiman tai syöpäsolulinjoissa käyttämällä genomista qPCR-analyysi (Additional tiedosto 9b; tuloksia ei ole esitetty). Kumpikaan sääntelyviranomaisten
, HRAS
eikä BRAF
monistukset havaittiin edellä syöpäsolulinjoissa genomisen qPCR-analyysi (tietoja ei esitetty). Monistamisen KRAS
varmistettiin myös kaksivärinen FISH-analyysillä, jossa KRAS
amplikonin havaittavasti homogeenisesti värjätty alue HSC45, SH101P4 ja MKN1 soluja (kuvio 3b). Kuvio 3 Geenin monistuminen on KRAS mahalaukun syöpäsoluja. (A) Kvantitatiivinen genomista PCR analyysi KRAS
lokusta 12p12.1 sisään HSC45 soluissa. Diskreetti monistukset at 12p12.1 kahdessa muussa mahasyövän solulinjoja havaittiin myös (SH101P4 ja MKN1). DNA kopiomäärä suhteessa normaaliin diploidinen leukosyyttien DNA piirrettiin kromosomaalinen nukleotidin asema (in megabases). Kantoja refseq geenien vastaavia alueita on esitetty alaosassa kartalla. Pienin vahvistus alue yhteisiä kaikille 3 mahalaukun syövän solulinjoissa edustaa oranssin värinen bar. (B) Metaphase (vasen) - ja interphase (oikealla) -Fish analyysi monistetun KRAS
locus mahasyövän solulinjoissa. KRAS
erityinen anturi on keltainen, ja kontrollikoettimen, spesifinen pitkän varren kromosomin 12, on punainen. Tetraploidy in HSC45 ja triploidy vuonna SH101P4 ja MKN1 soluja havaittiin. (C) Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR-analyysi KRAS
mRNA: n ilmentymisen mahasyövän solujen 12p12.1 vahvistusta. Expression analyysi geenien (KRAS, LRMP, CASC1
ja LYRM5
), joka sijaitsee minimaalinen amplikonin, ja BCAT1
, joka sivuaa minimaalinen amplikonin, suoritettiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR: llä. Ekspressiotasoja normalisoitiin GAPDH
mRNA, ja on kuvattu kuin väri kaltevuus, suhteessa normaaliin mahaan. Geeni monistamisen ja mutaation (kodonissa 12 tai 13) asema KRAS
kullekin näytteelle on esitetty oikeassa kaksi saraketta. Täytetyt ympyrät ilmaisemaan laajentaa tai mutaatio KRAS
, ja avoimet ympyrät ilmaisevat mitään monistusta tai ei mutaatio KRAS
.
Sekvenssianalyysi KRAS
(Additional tiedosto 11a) osoitti, että sekä HSC45 ja SH101P4 solut kanna mutaatiota kodonissa 12, joka johti yhden aminohapposubstituution KRAS (GGT → GTT, G12V), kun taas MKN1 solujen puuttui KRAS
mutaatioita. Läsnäolo KRAS
mutaatioiden AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) ja HCT116 (G13D) solut on raportoitu aiemmin [28, 29]. Kymmenestä PCR-klooneja KRAS myynnissä maassa HSC45 ja SH101P4 solut, jotka alistettiin mutaatioanalyysi, kahdeksan ja kolme, vastaavasti, kanna mutaatiot kodonissa 12. Lisäksi genominen reaaliaikainen PCR-analyysi käyttäen koettimia, jotka olivat spesifisiä villi tyyppinen ja KRAS
alleelien (Additional tiedosto 11b) osoitti myös, että HSC45 ja SH101P4 solut sisältävät eri suhteissa mutanttialleelin (80% ja 50%, vastaavasti). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että monistamisen KRAS
alleeli esiintyy myös HSC45 ja SH101P4 soluja.
Me tutkimme seuraavaksi tasot KRAS
mRNA: n KRAS
-amplified mahalaukun syövän solujen kvantitatiivisella -aika RT-PCR (qRT-PCR) (kuvio 3c). Tasot KRAS
mRNA korreloi merkitsevästi KRAS
kopioluku. Viereisen geenit LYRM5
ja CASC1
, jotka paikantuvat minimaalinen amplikonin, ilmaistiin myös korkeammilla tasoilla soluissa, joissa vahvistus verrattuna soluihin ilman vahvistusta (kuvio 3c). Mielenkiintoista, LRMP
oli alassäädetty syöpäsoluissa verrattuna normaaliin mahaan soluihin. Immunoblot-analyysi RAS-proteiinien (kuvio 4a), paljasti, että ilmentyminen KRAS lisääntyi KRAS
-amplified mahasyövän soluja (HSC45, SH101P4 ja MKN1), kun taas ei ole sääntelyviranomaisten eikä HRAS olivat erittäin ilmaistuna (kuvio 4a; tietoja ei esitetä ). Vaikka ilmaus anna-7c ja anna-7g MikroRNA on raportoitu säätelemään RAS ilmaisun [8], löysimme pienen korrelaation ilmaisun näiden MikroRNA kanssa KRAS-proteiinin tasot (Additional tiedosto 12), joka ehdotti, että KRAS yli-ilmentymisen mahasyövän solulinjoissa johtuu ennen kaikkea genomivahvistuksen of KRAS
. Kuva 4 yliekspressio KRAS, ja ero aktivointi KRAS, p44 /42 MAP-kinaasin ja AKT in KRAS -amplified mahalaukun syöpäsoluja. (A) immunoblot-analyysi ekspressiotasot KRAS ja sääntelyviranomaisten syöpäsoluissa. Aktiinin ekspressio analysoitiin latauskontrollina. (B) perustason GTP-KRAS oli selvästi suuri mahasyövän solujen monistaa KRAS
(HSC45 ja SH101P4). Yhteensä lysaattia (500 ug) saatettiin GTP-RAS pull-down-kokeessa, ja GTP-KRAS ja GTP-sääntelyviranomaiset havaittiin immunoblottauksella käyttäen anti-KRAS ja anti-sääntelyviranomaisten vasta-aineita, vastaavasti. Kokosolulysaattia (50 ug) analysoitiin rinnakkain tason määrittämiseksi ilmentymisen KRAS ja sääntelyviranomaisten soluissa. (C) GTP-KRAS nostettiin jälkeen seerumin stimulaation MKN1 soluissa. Soluja viljeltiin säännöllisesti, joka sisälsi 10% FCS: ää (N), seerumin puutteessa 24 tunnin ajan (-) tai ilman seerumia stimuloitiin sitten 10% FCS: ssa 1 h (+). Kokosolulysaattia saatettiin GTP-KRAS pull-down-määrityksessä. (D) aktivoiminen p44 /42 MAP-kinaasin ja AKT in seerumin puutteessa tai stimuloduista mahalaukun syöpäsoluja.

• Genominlaajuisten geenikopiomäärä ja ilmaisun analyysi ensisijainen mahalaukun kasvaimet ja mahasyövän solulinjoissa
• Mekanismit gastroprotection metanolia uutteen Melastoma malabathricum lehdet