E Roman Method, digital Nepgen Scannen bieden KRAS Gentherapie amplification zu gastric Cancers: Abannung vun overexpressed Wildwest-Typ KRAS zu afgerappt sécher a Kriibs Zell growth

E Roman Method, digital Nepgen Scannen bieden KRAS VerfÜgung Gentherapie amplification zu gastric Cancers: Abannung vun overexpressed Wildwest-Typ KRAS zu afgerappt sécher a Kriibs Zell Wuesstem VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Gastric Kriibs ass déi drëtt meescht genannten malignancy weltwäit d'allgemeng Populatioun betrëfft. an der Entwécklung vun vill Zorte vun entholl, Ee, oncogenic Projet'en vun KRAS VerfÜgung sinn zouverlässeg an gastric Kriibs Aberrant Aktivatioun vun KRAS e Schlëssel Faktor ass. Mir hunn e Roman grouss Method vun Analyse vun DNA Kopie Zuel entwéckelt, als digital Nepgen Scannen (kéimen), deen op d'Configuratioun vun kuerz Restriktioun Fragmenter baséiert ass, an net Hinnen alleguer oder hybridization abannen. An der aktueller Etude, déi mir kéimen Copy-Nummer hire Restaurant zu gastric Kriibs Zellen ze Ëmfro. VerfÜgung Method VerfÜgung kéimen vun Linnen gastric Kriibs Zell war mat de Message vun 5000 bis 15000 Restriktioun Fragmenter gesuergt. Mir opgefouert 20 gastric Kriibs Zell Linnen an 86 Primärschoul gastric erhéijen fir KRAS VerfÜgung amplification déi grouss Hinnen alleguer, a propagéieren KRAS VerfÜgung amplification um DNA, mRNA an FAQ Niveau vun mutational Analyse, real-Zäit Hinnen alleguer, immunoblot Analyse, GTP -RAS banal-verwandelt assay an immunohistochemical Analyse. Den Effet vun KRAS VerfÜgung op den Aktivéierungscode vu p44 /42 MAP kinase an AKT an op Zell Wuesstem hummeren-verwandelt sech duerch immunoblot an colorimetric assay iwwerpréift, bzw.. VerfÜgung Resultater VerfÜgung kéimen Analyse vun der HSC45 gastric Kriibs Zell Linn réischt de amplification vun engem 500-kB Regioun op chromosome 12p12.1, déi de KRAS VerfÜgung Gentherapie nët enthält. Amplification vun der nët VerfÜgung KRAS war zu 15% (3/20) vun gastric Kriibs Zell Linnen (8-18-fantastesch amplification) an 4,7% (4/86) vun de Primärschoule gastric erhéijen (8-50-fantastesch amplification fonnt ). KRAS VerfÜgung kennen sech zu zwee vun den dräi Zell Linnen an déi identifizéiert KRAS VerfÜgung Implikatioune huet, mä sech zu enger vun de primären erhéijen net fonnt. Overexpression vun KRAS FAQ soll direkt mat fräi KRAS VerfÜgung Kopie Zuel. Den Niveau vun GTP-gebonnen KRAS war mat Kick Wildwest-Typ KRAS VerfÜgung folgenden serum Stimulatioun vun Zellen nik, mä net zu Zellen mat Kick Mann- KRAS VerfÜgung. Knock-Ugrëff vun KRAS VerfÜgung zu gastric Kriibs Zellen datt Wëllschwäin-Typ KRAS Implikatioune duerchgefouert VerfÜgung an der inhibition vun Zell Wuesstem duerchgesat an Ennerdréckung vun p44 /42 MAP kinase an AKT Aktivitéit. VerfÜgung Conclusioun VerfÜgung Eis studéieren Héichpunkter den Déngscht vun kéimen fir Identifikatioun vun Copy-Nummer hire Restaurant. Benotzt kéimen, mir identifizéiert KRAS VerfÜgung als Gentherapie, datt am mënschleche gastric Kriibs Kick ass. Mir bewisen datt Gentherapie amplification wahrscheinlech de molekulare Basis vun overactivation vun KRAS zu gastric Kriibs Formen. Zousätzlech Studien eng méi grouss Kohort vun gastric Kriibs uplanzen benotzt ginn néideg der diagnostic an therapeutesch Implikatioune vun KRAS VerfÜgung amplification an overexpression. VerfÜgung Background VerfÜgung Gastric Kriibs ze bestëmmen déi drëtt meescht genannten malignancy ass weltwäit déi allgemeng Bevëlkerung Auswierkungen [1 ]. Spezifësch genetesch Verännerungen goufen zu gastric Kriibs gemellt, dorënner de amplifications vun KSAM VerfÜgung, kennegeléiert VerfÜgung an ERBB2 VerfÜgung, a kennen an p53 VerfÜgung, APC VerfÜgung, an CDH1 VerfÜgung [2] . Iwwerdeems konnten-vun-Funktioun Projet'en vun KRAS VerfÜgung puer vun de meeschte Toast observéiert genetesch hire Restaurant zu enger Rei vun erhéijen sinn, dorënner pancreatic (60%), biliary TRACT (33%) an Colon (32%) [3], dës Projet'en sinn zouverlässeg an gastric Kriibs (2-7%) [4-7]. Am Allgemengen, RAS VerfÜgung mat tumorigenesis verbonne kennen "Schlass" RAS en aktiven GTP-gebonnen Staat. GTP-RAS Photo'en zu enger Rei vun effector Proteinen afgerappt sécher Weeër ze stimuléieren, ënnert deenen d'RAF-MAP kinase CASCADE an der phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) -AKT Curriculum vun Zell Wuesstem an oncogenesis sinn déi beschte charakteriséiert [3]. Länger Aktivatioun vun RAS kann och duerch Mechanismen geschéien, datt do net kennen RAS abannen. Zum Beispill, reduzéiert Ausdrock vun loosse-7 microRNAs, déi RAS Hien vun den 3'untranslated Regioun vun RAS VerfÜgung mRNAs gezielt, gëtt dacks mat engem héichen RAS FAQ verbonne zu erhéijen [8]. Fir Datum, hunn d'molekulare Mechanisme vun oncogenic Aktivatioun vun RAS zu gastric Kriibs net vollstänneg opgekläert ginn. VerfÜgung Amplification vu Frankräich Message Genen wouvun déi fir Zell Wuesstem kritesch sinn eent vun de primären Mechanisme vun Aktivéierung vun oncogenes zu Kriibs ass, an ass oft mat entholl Werdegang assoziéiert, aarm hätt an /oder Drogenofhängeger Resistenz [9]. Vun de ville Methoden Moment sinn Kopie Zuel hire Restaurant Nepgen-grouss fir z'entdecken, ass déi aktuell Gold Norm déi lackeleg CGH Method (aCGH). Dene leschte Joren huet de Resolutioun vun aCGH verbessert séier duerch d'Benotzung vun oligonucleotide Ämter, an huet déi vun aCGH benotzt Standard BAC Ämter klor [10]. Allerdéngs, aCGH ass och ufälleg fir d'Onfruchtbarkeet Kaméidi vun hybridization-baséiert Intensitéit Mesure, wéi d'Signal Qualitéit vun widderhuelen Message betraff ass an ass ofhängeg op Studiebäihëllefe Qualitéit [11]. An Tatsaach, Akeef vun Studiebäihëllefe Design ass eng grouss Erausfuerderung an der Entwécklung vun tiling flamenden Ofgrond ginn [12, 13]. VerfÜgung Digital karyotyping (wees net) vun Wang et al entwéckelt gouf. [14], an ass duerch d'Onfruchtbarkeet Problemer vun Partie Techniken net limitéiert. Wees net implizéiert déi digital Configuratioun vun kuerz Fragmenter vu Frankräich DNA (Limburg Tags), laanscht all chromosome eng grouss Miessung vun DNA Kopie Zuel duerch Markéierung Dicht Analyse ëmzesetzen. Wees gouf erfollegräich zu enger Rei vun entholl Zorte applizéiert Copy-Nummer hire Restaurant ze entdecken, dorënner de amplification vun TYMS VerfÜgung, RSF1 VerfÜgung an OTX2 VerfÜgung, a Läsche vun MKK4 VerfÜgung an dystrophin VerfÜgung [ ,,,0],15-19]. Trotz der Effizienz vun wees, ass et technesch Erausfuerderung fir breet Applikatiounen, well et Hinnen alleguer implizéiert amplification an d'Generatioun vun Tags vun 21-huel Puer (BP) an eng Längt bis eben d'chromosome Lag vun Interessi vertrieden. VerfÜgung Mir Rapport hei de Entwécklung vun engem Roman Method, Limburg kéimen, fir d'grouss Analyse vun Kopie Zuel Variant probéieren, déi op der Markéierung-Zielen Konzept vun wees baséiert ass, mä benotzt enger vereinfachter Prozess vun Markéierung Virbereedung. Kéimen vun gastric Kriibs Zell Linnen fonnt der amplification vun der nët VerfÜgung KRAS op chromosome 12p12.1. Eis Resultater vun enger molekulare Basis fir d'overactivation vun KRAS, a proposéiert, datt d'Aktivéierung vun KRAS afgerappt sécher Evenementer gastric Kriibs Zell Prolifératioun Promotioun kann. VerfÜgung Method VerfÜgung Zell Linnen an Stoffer VerfÜgung D'Zell Linnen an der aktueller analyséiert Etude sinn zu Weider Fichier opgezielt 1. D'HSC an SH101P4 Zell Verse Kazuyoshi Yanagihara etabléiert sech [20]; all déi aner sech aus American Type Kultur Collection oder der japanescher Collection vun Research Bioresources (Tokyo, Japan) kritt. All Zell Strecken cultured an der recommandéiert Medien. Fir serum Stimulatioun, goufen Zellen zu Medien incubated datt serum gefeelt fir 24 Stonnen (h), an dann entweder unstimulated, oder fir 1 h mat Medien stimuléiert wouvun 10% An et Kallef serum (FCS). Primärschoul gastric Kriibs uplanzen sech aus all Patient aus de Chiffer vun befënnt, Keiyukai Sapporo Spidol, mat Awëllegung kritt. Frankräich DNA huet mat der phenol-chloroform Method, gefollegt vun RNase Behandlung ofgebaut. Total RNS war mat Trizol (Invitrogen, Karlsbad CA, USA) ofgebaut, laut den Hiersteller d'Uweisungen. Frankräich DNA vun normal Randerscheinung Blutt leukocytes (Biochain, Hayward, CA, USA) a Ganzen RNS aus normal gastric mucosa aus gesond Persounen (Biochain an Invitrogen) waren kaaft. Primärschoul gastric Cancers benotzt clinicopathological Fonctiounen séiert, wéi zu Weider Fichier 2 gewisen, no der pTNM Klassifikatioun Schema (5. Editioun, 1997) [21] an der Systematik d'Lauren [22]. KRAS VerfÜgung -amplification Statut no Alter war Verglach der Student t Test benotzt; no mannerwäerteg, PT Status, pN Zoustand, an Krankheet Etapp de Mann-Whitney U Test benotzt; an no Geschlecht, Histologie a Auer Status der Fisher genau Test mat. All Tester goufen 2-tailed, an engem P VerfÜgung Wäert vu &Si besteet; 0,05 war statistesch relevant considéréiert. VerfÜgung Digital Nepgen Scannen Kuerz VerfÜgung, 40 μg vu Frankräich DNA zu Restriktioun Aktivitéit unzereegen ënnerworf waren Mbo benotzt VerfÜgung ech (Takara, Tokyo, Japan) an dann vun electrophoresis op engem 3% getrennt Nusieve GTG agarose gelies. Kuerz Fragmenter (30-60 BP, als real Tags) waren electroeluted, concatenated an subcloned an Bam VerfÜgung Salut-verdaut pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) benotzt Mighty Mix DNA ligation Léisung (Takara). Escherichia belaascht VerfÜgung DH10B mat der recombinant plasmids transforméiert waren, goufen d'transformants hinzeginn an der plasmid DNA sidd war den 1. Bibliothéik ze generéieren. Concatemers vun real Tags vun Spe excised sech VerfÜgung ech /Pompey VerfÜgung ech aus der 1. Bibliothéik Verdauung, a Fragmenter vun der Gamme vun 140 bis 800 BP sech electroeluted, concatenated an subcloned an pBluescript II KS + der 2. Bibliothéik ze generéieren. Zweete Bibliothéik plasmids concatemers vun Spe VerfÜgung ech /Pompey wouvun VerfÜgung sin Fragmenter sech eng ABI3130 genetesch Organer (Obwuel Biosystems, Foster City, CA, USA) Nepgen benotzt, laut Hiersteller d'Uweisungen. Eenzegaarteg real Tags sech ze Mënsch chromosome Message Ëmgéigend, an Markéierung Dicht, definéiert als d'Verhältnis vun real Tags ze virtuell Tags iwwer Fënsteren bewegt, war berechent abnormalities zu DNA Inhalt mat loung Wäerter definéiert duerch kéimen Simulatioune z'entdecken. Tag Positiounen an Markéierung Dicht nennen sech mat Benotzerdefinéiert seelen an Genom Grafiken vun der University of California, Santa Cruz (UCSC) Nepgen Browser visualized (Mar. 2006 afréieren, hg18) [23-25]. Déi detailléiert Ëmwelt- fir kéimen, virtuell Markéierung characterization an silico VerfÜgung Simulatioune ginn sinn an Weider Fichier 3. VerfÜgung Chemeschen real-Zäit Hinnen alleguer VerfÜgung rel DNA Kopie Zuel vun grouss real-Zäit Hinnen alleguer mat enger SYBR Green alles war Hinnen alleguer Master Mix (Obwuel Biosystems) an dem Abi PRISM 7000 (Obwuel Biosystems). DNA Inhalt pro haploid Nepgen war normalized fir datt vun engem widderhuelen Element, Linn-1, an duerch de Komparativ CT (ΔΔCT) famill quantification Method mat der Formel 2 (NG VerfÜgung - Nline VerfÜgung) - berechent ( Xt VerfÜgung - Xline VerfÜgung), woubäi N VerfÜgung t VerfÜgung der loung Zyklus Zuel ass fir en experimentéierte primer zu normal leukocyte DNA, VerfÜgung N observéiert Linn VerfÜgung ass der loung Zyklus Zuel fir d'Linn-1 primer zu normal leukocyte DNA observéiert, ass Xt VerfÜgung der Moyenne loung Zyklus Zuel fir déi experimentell primer zu Kriibs Zell DNA observéiert, an X VerfÜgung Linn VerfÜgung ass de Duerchschnëtt loung Zyklus Zuel fir d'Linn-1 primer zu Kriibs Zell DNA observéiert [14]. Frankräich amplification war als grouss wéi 4-fantastesch Erhéijung vun DNA Inhalt definéiert. D'primer Message fir all nët gi sinn an Weider Fichier 4. der allelic Undeel vun Mann- KRAS VerfÜgung (G12V, ggt → gTt) war duerch astellen en geännert real-Zäit Hinnen alleguer Prozedur no Itabashi et al VerfÜgung sech [26 ]. Déi detailléiert Protokoll ass zu Weider Fichier sinn 3. cDNA SuperScript III ëmgedréint transcriptase benotzt bereet war (RT, Invitrogen), an der mRNA Niveau vun all Gentherapie war vun real-Zäit RT-Hinnen alleguer alles mat der TaqMan Gene Expression Assay (Obwuel Biosystems) . Relativer mRNA Niveauen sech duerch d'Komparativ CT Method berechent benotzt GAPDH VerfÜgung als endogenous Kontroll. D'primer /Studiebäihëllefe baut benotzt ginn an Weider Fichier 5. VerfÜgung Fluorescence zu situ VerfÜgung hybridization (FISH) VerfÜgung BACs gewisen, datt d'KRAS VerfÜgung nët (RP11-636P12) an chromosome 12q24.2 Texter (RP11 -91M21) sech mat Cy3 an Cy5 gekennzeechent, respektiv, an dann mat drënner bereet mat interphase an metaphase chromosomes incubated. Kären waren Konter Kierchefënster mat 4 ", 6-diamino-2-phenylindole (DAPI), an drënner waren mat engem fluorescence microscope analyséiert (Leica Cw-4000). VerfÜgung Mutational Analyse vun KRAS VerfÜgung an PIK3CA VerfÜgung VerfÜgung Implikatioune Frankräich Fragmenter sech entweder direkt Nepgen, oder subcloned mat der anerer Sprooch TA-Klone Kit (Invitrogen) an dann Nepgen. Op d'mannst zéng clones aus zwee onofhängeg Hinnen alleguer assays pro nët benotzt M13 Stiermer Nepgen a Réckproduktioun primers (Invitrogen). De Message vun der primers fir amplification vun KRAS VerfÜgung (exons 1 an 2) an PIK3CA VerfÜgung (exons 9 an 20) sinn dës Distanz an Weider Fichier 6. VerfÜgung Immunoblot Analyse benotzt VerfÜgung BTS an Lysis lysed sech gefiermt 20 mm Tris-HCl (pH7.5) Prellbock, 150 mm NaCl, 1 mm héich, 1% Triton X, 10% glycerol, 10 mm NaF, 1 mm Natrium vanadate, 50 mm β-glycerophosphate, 1 mm phenylmethansulfonyl wouvun fluoride , 1 mm dithiothreitol, an engem protease inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Däitschland). Proteinen sech duerch SDS-PAGE getrennt an electroblotted op eng Immobilon-P Membran (Millipore, Billerica, MA, USA). D'Schläimhait vun immunoblot analyséiert goufen déi folgend antibodies benotzt, wéi uginn: Maus monoclonal anti-KRAS, -NRAS, an -HRAS antibodies (sc-30, sc-31, an sc-29, respektiv, Santa Cruz Déi, Santa Cruz, CA, USA); Anti-actin antibody (Millipore); Kanéngchen polyclonal anti-p44 /42 MAP kinase, -phosho-p44 /42 MAP kinase (Thr202 /Tyr204), -Akt an -phospho-Akt (Ser473) antisera (Zell sécher Technology, Danvers, MA, USA). VerfÜgung GTP-RAS banal-verwandelt assay VerfÜgung D'Aktivéierung vun RAS war mat engem EZ-Detektioun Ras Activatiounscode Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) fonnt. Kuerz, Zell lysate (500 μg) war mat Sommet Raf1 Ras-verbindlech Domain ze glutathione S-transferase (GST-Raf1-RBD) Äonen incubated. Precipitates waren 3 Mol gewäsch, a gebonnen Proteinen sech duerch kache fir 5 Minutten (min) eluted. Proteinen sech op eng 12% polyacrylamide gelies geléist, transferéiert un eng Immobilon-P Membran, an deen zu immunoblot Analyse mat anti-KRAS, -NRAS, oder -HRAS antibodies. VerfÜgung RNS Amëschen VerfÜgung E Brauch-entworf KRAS
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 "), VerfÜgung datt eng Regioun vun KRAS gezielt ass net mat bekannt oncogenic kennen assoziéiert, vun Dharmacon (Bailly, Co, USA) Wierderbuch war. siRNAs gezielt LRMP VerfÜgung, LYRM5 VerfÜgung an CASC1 VerfÜgung aus Ambion kaaft huet (No.144181, 284911 an 147715). Eng universell Net-gezielt siRNA (Net-spezifesch Kontroll VII, Dharmacon) war als negativ Kontroll benotzt. An all Experimenter, 5 × 10 6 Zellen mat 7.5 μl vun 20 μM siRNA vun electroporation transfected waren (Amaxa, Köln, Däitschland) mat Nucleofector Kit V oder T, laut der Uweisungen d'Hiersteller. VerfÜgung Zell Prolifératioun assay
Nom transfection mat siRNAs, déi gastric Kriibs Zell Linnen HSC45, MKN1, AGS an NUGC4 op eng Dicht vu 8.000 Zellen /100 μl zu Standard mëttel- a 96-gutt Placke rakommen waren 10% FCS mat. Zell Zuel op 48, 72 an 96 h Post-transfection war indirekt duerch colorimetric assay benotzt Zell Counting Kit-8 Léisung (Dojindo, Kumamoto, Japan) alles. D'assay baséiert op der Reduktioun vun engem tetrazolium Salz ([2- (2-methoxy-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2-tetrazolium, monosodium Salz], WST -8) an ass als eng Moossnam vum liewen Zellen benotzt. D'absorbance vun all gutt bei 450 nm huet mat enger microplate Lieser (Model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gemooss. VerfÜgung cytometry Flow cytometry VerfÜgung Flow virdrun ëmschriwwen duerchgefouert [27]. Kuerz, goufen Operstéiungszeen an ugebauten Zellen Feld, zu 90% kal Ethanol fix, mat RNase A (500 Unitéiten /ml) behandelt gëtt, an da mat propidium Kaliumiodid (50 μg /ml) geschriwwen. Fir all Prouf, goufen 30000 Evenementer mat der Zell Zyklus Analyse Plattform vun FlowJo Programm (Tree Star, Ashland, ODER, USA) analyséiert. VerfÜgung Immunohistochemistry VerfÜgung Formalin-fix, paraffin-Ënnerbewosstsinn Rubriken vun gastric erhéijen sech deparaffinized, denken , an dann mat peroxidase erauszesichen Léisung (3% H 2O 2 zu Methanol) traitéiert. Sektiounen sech fir 10 min an Zil- retrieval Léisung (Dako, Glostrup, Dänemark) op 105 ° C autoclaved. Sektiounen huet mat enger Maus antibody anti-KRAS incubated. (1: 100 dilution; Santa Cruz Déi) fir 1 h bei Raumtemperatur, an immunoreactivity war mat Stellt-Plus reagents (Dako) fonnt VerfÜgung Resultater VerfÜgung Digital Nepgen Scannen an characterization vun virtuell lëtzëbuerger silico
Digital Nepgen Scannen (kéimen) ass eng Method vun quantitating Gentherapie Kopie Zuel vun kuerz Frankräich DNA Fragmenter enumerating (Limburg real Tags) dass experimentally vun Mbo VerfÜgung ech endonuclease unzereegen generéiert ginn (Well 1a). Fir d'komplizéiert Schrëtt eliminéiert zu Markéierung Virbereedung Équipe, mir charakteriséiert computationally der kuerzer DNA Brochstécker, déi zur Single Restriktioun Aktivitéit unzereegen mat Mbo VerfÜgung ech produzéiert ginn, déi den 4-BP Haaptrei GATC erkennt. An silico VerfÜgung Verdauung vun de Mënscherechter Nepgen vun Mbo VerfÜgung ech ongeféier 1,6 Milliounen Restriktioun Fragmenter produzéiert (Limburg virtuell Tags) an der Gamme vun 20-130 BP (Zousätzleche Fichier 7A). Nukleotid Haaptrei Analyse verroden, dass ongeféier 65% vun de virtuelle Tags widderhuelen Message Texter, wéi am öffentleche Datebank vun widderhuelen Elementer (Zousätzleche Fichier 7A) definéiert. Wichteg, fir de Mënsch Nepgen Datebank verroden, dass ongeféier 85% vun de virtuelle Tags Ëmgéigend eendeiteg ze preziser chromosomal Plazen (Zousätzleche Fichier 7b, c) passende Haaptrei. Och wann de virtuelle Tags widderhuelen Message am Kader gehéiert, ongeféier 80% vun der widderhuelen Tags erausgestallt eenzegaarteg gin. Déi duerchschnëttlech Distanz tëscht zwee eenzegaarteg virtuell Tags vun 30 bis 60 BP laang war 7,6 KB, d'Steiren Distanz war 4.5 KB an 97,8% vun Intervalle sech kuerz wéi 30 KB (Zousätzleche Fichier 7d). Ähnlech Charakteristiken Markéierung nolauschterer fir virtuell Tags der Gamme vun 70 bis 100 BP observéiert goufen (duerchschnëttlech Distanz, 7,9 KB; Steiren Distanz, 4,8 KB; 97,4% wéi 30 kB kuerz waren), an 100 bis 130 BP (duerchschnëttlech Distanz, 7,9 KB; Steiren Distanz, 4,9 kB;.. 97,4% goufen kuerz wéi 30 kB (Zousätzleche Fichier 7, f) Ausserdeem, war d'Dicht vun eenzegaarteg virtuell Tags bal gläich an all chromosome (Zousätzleche Fichier 7g) Dës zu silico VerfÜgung Conclusiounen ugeholl, datt der Majoritéit vun kuerz Mbo VerfÜgung ech Tags praktesch fir kéimen wier. Dorënner 1 kéimen a Virbereedung vun real Tags. (en) Sënn Direktive vu kéimen. Gefierfte Këschte vertrieden Frankräich Mbo VerfÜgung ech richteg kennen. Kuck Text fir Detailer. (b an c) Virbereedunge (b) an characterization (c) vun real Tags. Vertriederin Resultater mat Frankräich DNA aus MKN1 sinn gastric Kriibs Zellen gewisen. (b) Short Fragmenter vun Mbo VerfÜgung ech-verdaut Frankräich DNA (30 bis 60 BP) huet vun enger agarose gelies (i), concatenated an subcloned electroeluted. Allerdéngs goufen recombinant plasmids der 1. Bibliothéik (II) ze generéieren hinzeginn. Laang concatemers (140 bis 800 BP) sech vum 1. Bibliothéik vectors excised, electroeluted (III), concatenated an subcloned. D'entstoent recombinant plasmids vertrieden 2. Bibliothéik clones (IV). D'Zuel vun lëtzëbuerger all Klon enthale ass op der Spëtzt vun all Geschäftswelt gewisen. Text goufen iwwerpréift vun Xho VerfÜgung ech /Referendum um nationale VerfÜgung ech zu Brieder unzereegen (II) a (IV). *, Vecteure Fragmenter; **, Spe VerfÜgung ech /Pompey VerfÜgung ech Verdauung vun de Multiple-Klone Site ouni opginn. (C) Richteg Zuel vun real Tags aus der 2. Bibliothéik ass an der ugëtt (lénks) gewisen, an hirem Beméien zesummegefaasst sinn (riets). VerfÜgung kéimen Simulatioun vun silico
D'Kapazitéit vun kéimen Nepgen z'entdecken -wide Ännerungen baséiert op Nepgen Charakteristiken, wéi d'Kopie Zuel an der Gréisst vun de Verfall, an d'Zuel vun real Tags aus Haaptrei Analyse kritt. Fir d'Gréisst vun den Aménagement viraus datt zouverlässeg nogewise ginn hätt, eng fix Zuel vun computationally anerer Tags entscheet, déi mir Monte Carlo Simulatioun engem positive predictive Wäert (PPV) ze berechnen, déi d'Probabilitéit ass, datt e fonnt Verfall engem richtege Verfall duerstellt. Zum Beispill, hunn mer dat eng Analyse vun 5000 Tags zouverlässeg engem 10-fantastesch amplification vun 500 kB, engem homozygous Läsche vun 7.5 MB oder enger eenzeger Kopie Verloscht vun engem 30 Mo Regioun erkennen konnt, mä kéint eng subchromosomal gewannen kleng net erkennen, wéi 30 Mo (Zousätzleche Fichier 8). Souwuel d'Sensibilitéit an Spezifizitéit vun dësen Zorte vun Verfall fonnt goufen > 99% vun Fäll mat héije PPVs (> 90%)., Déi uginn, datt weder eng limitéieren Faktor vun dëser Analyse huet (Donnéeën net gewisen) VerfÜgung Virbereedunge vun real Tags vum Mënsch Frankräich DNA VerfÜgung fir kéimen vun der gastric Kriibs Zell Linnen HSC45 an MKN1, bereet mer Bibliothéiken vun real Tags aus Frankräich DNA, wéi zu Dorënner 1a gewisen. D'Mbo VerfÜgung ech-verdaut Frankräich DNA war Gréisst-fractionated (30-60 BP) an zu concatemerization ënnerworf, gefollegt vum Bau vun enger 2. Bibliothéik, déi ronn 10 real Tags pro Klon Texter (Dorënner 1b). Nukleotid Haaptrei Analyse vun der real Tags verroden, datt 85,8% op eemolege Positiounen Ëmgéigend, déi mat eiser characterization vun virtuell Tags (Dorënner 1c) kohärent war. VerfÜgung Amplifications op chromosome 12P an HSC45 gastric Kriibs Zellen VerfÜgung Den Daniel Nepgen-grouss Markéierung Dicht Profil vun HSC45 Zellen war mat engem Total vun 5.462 eenzegaarteg real Tags alles. Ze héich Opléisung an Empfindlechkeet mat der experimentell Date erreechen, déi mir Fënster Gréisste vun 1000 an 2100 virtuell Tags (ongeféier 2300 KB an 4700 KB) fir d'Analyse vun amplifications a geläscht, bzw.. D'Markéierung Dicht Verhältnis war wéi d'Zomm vun real Tags berechent déi duerchschnëttlech Zuel vun real lëtzëbuerger selwecht-Stad Fënsteren ganze Nepgen ënnerdeelt, an deenen d'normal Markéierung Dicht Verhältnis den 1.0 definéiert war. Mir identifizéiert z'ënnerscheedde subchromosomal Regioune vun fräi Markéierung Dicht um 8q24.21, 12p12.1 an 12p13.33, a rofgaang um 9p21.3 Markéierung Dicht an de laangen Aarm vum chromosome 18 (Dorënner 2, Zousätzleche Fichier 9A-d). D'Regiounen vun fräi Markéierung Dicht (12p12.1, 12p13.33 an 8q24.21) enthale KRAS VerfÜgung, CACNA1C VerfÜgung (Kalzium Kanal, Volt-ofhängeg, l Typ, alpha-1c subunit) an MYC VerfÜgung loci, bzw.. Southern blot Analys confirméiert datt KRAS VerfÜgung an MYC VerfÜgung zu HSC45 Zellen (Zousätzleche Fichier 9e) Implikatioune goufen. All quantitated Copy-Nummer den Klimawandel aus grouss real-Zäit Hinnen alleguer (qPCR) vu Frankräich DNA alles war ganz ähnlech ze dass geschate vun kéimen, wann d'Fënster Gréisst fir Analyse Markéierung Dicht war zu der Gréisst vun all den Aménagement stemmt (Zousätzleche Fichier 9A-d ). Dës Resultater hindeit, datt Markéierung Dicht Analyse vun kéimen benotzt ginn hätt Kopie Zuel Analyse uechter d'mënschlech Nepgen zu Leeschtunge. Figur 2 Detektioun vum fräi Kopie Zuel op chromosomes 8q an den 12P vun kéimen zu HSC45 gastric Kriibs Zellen. (En) E ganzt-Nepgen Vue vun der Markéierung Dicht Verhältnis zu HSC45 Zellen (eng Fënster vun 1000 virtuell Tags benotzt) als déi kéimen bestëmmt. Wäerter op der y-Achs weg fantastesch-Ännerungen am Markéierung Dicht relativ zu der Moyenne Markéierung Dicht vun der ganzer Nepgen, a vertrieden DNA Inhalt pro haploid Nepgen, an Fënsteren. D'x-Achs duerstellt chromosome Zuel. (B an c) Lo Vue vun Markéierung Dicht nennen op chromosomes 8 (b) an 12 (c). An all erschéngt, weist den ieweschte Grafik e ganzt-chromosome Vue vun der Markéierung Dicht Verhältnis (baséiert op enger Fënster vun 1000 virtuell Tags). Déi ënnescht Grafik weist eng erweidert Vue vun 8q24.21 an 12p12.1, an déi Markéierung Dicht fräi war mat Fënsteren vun 1000 an 500 virtuelle Tags fonnt. Eenzegaarteg real Tags sinn als schwaarzen vertikalen Baren uginn, an eenzegaarteg virtuell Tags sinn am bloe (60 BP oder kuerz) oder hell blo (méi wéi 60 BP) Baren zu dichten Modus uginn. D'Positioune vun refseq Genen, mat e puer splicing isoforms ewech, sinn um ënneschten vun den ënneschte Brieder. VerfÜgung Amplification vun KRAS VerfÜgung zu gastric Kriibs Zell Linnen VerfÜgung Analys vun 26 loci bannen an direkt Reliefsailen chromosome 12p12 gewisen. 1 an HSC45 Zellen vun qPCR bewisen, dass eng Regioun vun ongeféier 500 kB, déi de KRAS VerfÜgung Gentherapie nët abegraff, war Kick (8-fantastesch amplification, dorënner 3A). Frankräich qPCR Kontroll fonnt KRAS VerfÜgung amplification an zwou zousätzlech gastric Kriibs Zell Linnen, SH101P4 (18-fantastesch) an MKN1 (13-fantastesch) (Dorënner 3A), wobäi mir net amplification vun grouss wéi 4-fantastesch entdecken gemaach an 17 aner gastric Kriibs Zell Linnen, oder an 10 Colon Kriibs an 11 pancreatic Kriibs Zell Linnen (opgezielt zu Weider Fichier 1, Donnéeën net gewisen). Kéimen nogewise och amplification vun der nët VerfÜgung KRAS zu MKN1 Zellen (Zousätzleche Fichier 10). D'Nopeschlänner Genen vun KRAS VerfÜgung am Minimum amplicon sech LRMP VerfÜgung (lymphoid-limitéiert Membran FAQ), CASC1 VerfÜgung (Kriibs waat Kandidat 1) an LYRM5 VerfÜgung (LYR Motiv mat 5). BCAT1 VerfÜgung (gemuert Kette aminotransferase 1, cytosolic) war och zu SH101P4 an MKN1 Zellen Implikatioune verstärkt, mee net an HSC45 Zellen. Mir confirméiert datt CACNA1C VerfÜgung zu HSC45 Zellen Implikatioune war, mä net an déi aner gastric, Colon, oder pancreatic Kriibs Zell Linnen mat Frankräich qPCR Analyse (Zousätzleche Fichier 9B; Donnéeën net gewisen). Weder NRAS VerfÜgung, HRAS VerfÜgung nach BRAF VerfÜgung amplifications waren an der uewen Kriibs Zell Linnen duerch Frankräich qPCR Analyse fonnt (Donnéeën net gewisen). D'amplification vun KRAS VerfÜgung war och déi duebel Faarf FISH Analyse ubelaangt, an deem d'KRAS VerfÜgung amplicon war evident als homogeneously-Kierchefënster Regioun an HSC45, SH101P4 an MKN1 Zellen (Dorënner 3B). Figur 3 Gene amplification vun KRAS zu gastric Kriibs Zellen. (En) Chemeschen Frankräich Hinnen alleguer Analyse vun de nët VerfÜgung KRAS um 12p12.1 zu HSC45 Zellen. Diskret amplifications um 12p12.1 zu zwee aner gastric Kriibs Zell Linnen goufen och nogewise (SH101P4 an MKN1). DNA Kopie Zuel jee normal DNA behënnerte leukocyte war géint chromosomal Nukleotid Positioun opgezeechent (an megabases). D'Positioune vun refseq Genen am entspriechende Regioune sinn an der leschter Kaart gewisen. De Minimum amplification Regioun gemeinsam un all 3 gastric Kriibs Zell Linnen ass déi orange-faarweg Bar vertrueden. (B) Metaphase (lénks) - an interphase (riets) -FISH Analyse vun den Kick KRAS VerfÜgung nët zu gastric Kriibs Zell Linnen. D'KRAS VerfÜgung -specific Studiebäihëllefe ass giel, an d'Kontroll Studiebäihëllefe, spezifesch fir de laangen Aarm vum chromosome 12, ass zu rout. Tetraploidy zu HSC45 an triploidy zu SH101P4 an MKN1 Zellen sech observéiert. (C) Chemeschen real-Zäit RT-Hinnen alleguer Analyse vun KRAS VerfÜgung mRNA Ausdrock vun gastric Kriibs Zellen mat 12p12.1 amplification. Ausdrock Analyse vun Genen (KRAS, LRMP, CASC1 VerfÜgung an LYRM5 VerfÜgung) bannent der minimal amplicon läit, an BCAT1 VerfÜgung, deen d'minimal amplicon Säiten, war real-Zäit RT-Hinnen alleguer standing benotzt. Ausdrock Niveau sech ze GAPDH VerfÜgung mRNA normalized, a si als eng Faarf packt, relativ zu normal Mo. duergestallt. Der Gentherapie amplification an stattfannen (codon 12 oder 13) Zoustand vun KRAS VerfÜgung fir all Prouf ass am Recht zwou Kolonnen zesummegefaasst. Gefëllt Kreeser der Präsenz vun amplification oder stattfannen vun KRAS VerfÜgung weg, an oppen Kreeser weg kee amplification oder net stattfannen vun KRAS VerfÜgung. VerfÜgung liichtkraaftarm Analyse vun KRAS VerfÜgung (Zousätzleche Fichier 11A) gewisen, datt béid HSC45 an SH101P4 Zellen harbored engem stattfannen an codon 12. datt zu KRAS (ggt → gTt, G12V) zu engem eenzege Aminosaier Wiessel schéinen hierkommen MKN1 Zellen KRAS VerfÜgung kennen gefeelt. D'Präsenz vun KRAS VerfÜgung kennen AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) an HCT116 (G13D) Zellen gouf schonn gemellt [28, 29]. Vun der ten Hinnen alleguer-clones vun KRAS VerfÜgung aus HSC45 an SH101P4 Zellen datt zu mutational Analyse ënnerworf waren, aacht an dräi, respektiv, 12. Ausserdeem kennen codon harbored, Frankräich real-Zäit Hinnen alleguer Analyse Ämter benotzt dass zu wëll spezifesch sech -type an Mann- KRAS VerfÜgung alleles (Zousätzleche Fichier 11b) verroden och dass HSC45 an SH101P4 Zellen enthalen verschidde Undeeler vun der Mann- allele (80% an 50%, respektiv). Am Allgemengen, uginn dës Resultater datt amplification vun engem Mann- KRAS VerfÜgung allele existeiert och zu HSC45 an SH101P4 Zellen. VerfÜgung Mir propagéieren nächste de Niveau vun KRAS VerfÜgung mRNA zu KRAS VerfÜgung -amplified gastric Kriibs Zellen duerch grouss ass real hut RT-Hinnen alleguer (qRT-Hinnen alleguer) (Dorënner 3C). Den Niveau vun KRAS VerfÜgung mRNA soll vill mat KRAS VerfÜgung Kopie Zuel. D'Nopeschlänner Genen LYRM5 VerfÜgung an CASC1 VerfÜgung, déi un d'minimal amplicon en der, waren och bei héichen Niveau vun Zellen mat amplification ausdrécke wéi zu Zellen ouni amplification (Dorënner 3C) am Verglach. Spannen, war LRMP VerfÜgung zu Kriibs Zellen-verwandelt reegelen als Verglach zu normal Mo. Zellen. Immunoblot Analyse vun RAS Proteinen (Dorënner 4A) bekannt, datt den Ausdrock vun KRAS fräi war zu KRAS VerfÜgung -amplified gastric Kriibs Zellen (HSC45, SH101P4 an MKN1), iwwerdeems weder NRAS nach HRAS héich ausgedréckt huet (Dorënner 4A; Donnéeën net dës ). Obwuel den Ausdrock vun-7c loossen a loosse-7g microRNAs gemellt gouf RAS Ausdrock ze regléieren [8], mir kleng Korrelatioun vun Ausdrock vun dësen microRNAs mat KRAS FAQ Niveauen (Zousätzleche Fichier 12) fonnt, deen ugeholl datt KRAS overexpression zu gastric Kriibs Zell Linnen ass wéinst allem un Frankräich amplification vun KRAS VerfÜgung. Figur 4 Overexpression vun KRAS, an Ënnerscheed Aktivatioun vun KRAS, p44 /42 MAP kinase an AKT zu KRAS -amplified gastric Kriibs Zellen. (En) Immunoblot Analyse vun den Ausdrock Niveau vun KRAS an NRAS zu Kriibs Zellen. Actin Ausdrock war als Luede Kontroll analyséiert. (B) D'basal Niveau vun GTP-KRAS Ofstand héich zu gastric Kriibs Zellen mat Kick Mann- KRAS VerfÜgung (HSC45 an SH101P4). Total lysate (500 μg) gouf zu engem GTP-RAS banal-verwandelt assay ënnerworf, an GTP-KRAS an GTP-NRAS sech duerch immunoblot mat anti-KRAS an Anti-NRAS antibodies, bzw. fonnt. Total Zell lysate (50 μg) war an parallel ze bestëmmen de Niveau vum Ausdrock vun KRAS an NRAS vun Zellen analyséiert. (C) GTP-KRAS war no serum Stimulatioun vun MKN1 Zellen erhuewen. Zellen sech cultured regelméisseg mëttel wouvun 10% FCS (N), serum-gehongert fir 24 h (-) oder serum-gehongert dann mat 10% FCS stimuléiert fir 1 h (+). Total Zell lysate gouf zu engem GTP-KRAS banal-verwandelt assay ënnerworf. (D) Activatiounscode vun p44 /42 MAP kinase an AKT zu serum-gehongert oder -stimulated gastric Kriibs Zellen.

• Nepgen-grouss Gentherapie Kopie Zuel an Ausdrock Analyse vun der Primärschoul gastric erhéijen an gastric Kriibs Zell Linnen
• Mechanisme vun gastroprotection vun methanol Extrait vun Melastoma malabathricum Blieder