Een nieuwe methode, digitaal genoom scannen detecteert KRAS genamplificatie bij maagkanker: betrokkenheid van overexpressie wild-type KRAS in downstream signalering en kankercel growth

Een nieuwe methode, digitaal genoom scannen detecteert KRAS
genamplificatie bij maagkanker: betrokkenheid van overexpressie wild-type KRAS in downstream signalering en kanker celgroei
Abstracte achtergrond
Maagkanker is de derde meest voorkomende kwaadaardige tumor die de algemene bevolking wereldwijd. Afwijkende activering van KRAS is een belangrijke factor in de ontwikkeling van vele tumorsoorten echter oncogene mutaties van KRAS Wat zijn zeldzaam bij maagkanker. We hebben een nieuwe kwantitatieve analysemethode voor DNA-kopieaantal ontwikkeld, genaamd digitale genoom scanning (DGS), die is gebaseerd op de telling van korte restrictiefragmenten en PCR of hybridisatie heeft geen betrekking. In de huidige studie, gebruikten we DGS te copy-aantal veranderingen in maagkanker cellen overzien.
Methoden
DGS van maagkanker cellijnen werd uitgevoerd met behulp van de sequenties van 5.000-15.000 restrictiefragmenten. We gescreend 20 maagkanker cellijnen en 86 primaire maag tumoren KRAS
amplificatie door kwantitatieve PCR en onderzocht KRAS
amplificatie van het DNA, mRNA en eiwitniveaus door mutatieanalyse, real-time PCR, immunoblotanalyse, GTP -RAS pull-down test en immunohistochemische analyse. Het effect van het KRAS
knock-down op de activering van p44 /42 MAP kinase en AKT en op celgroei werden onderzocht door immunoblot en colorimetrische test, respectievelijk.
Resultaten
DGS analyse van de HSC45 maagkanker cel lijn bleek de amplificatie van een 500 kb gebied op chromosoom 12p12.1, waarin het KRAS
gen locus bevat. Amplificatie van het KRAS
locus werd gedetecteerd in 15% (3/20) van maagkanker cellijnen (8-18-voudige amplificatie) en 4,7% (4/86) van primaire maagtumoren (8-50-voudige amplificatie ). KRAS
mutaties werden geïdentificeerd in twee van de drie cellijnen waarin kras
geamplificeerd, maar werden niet gedetecteerd in de primaire tumoren. Overexpressie van KRAS eiwit gecorreleerd rechtstreeks met verhoogde KRAS
aantal kopieën. Het niveau van GTP-gebonden KRAS werd verheven volgende serum stimulatie in cellen met versterkte wild-type KRAS
, maar niet in cellen met versterkte mutant KRAS
. Knock-down van KRAS
bij maagkanker cellen die uitgevoerde versterkt wild-type KRAS
resulteerde in de remming van de celgroei en de onderdrukking van de p44 /42 MAP kinase en AKT activiteit.
Conclusie
Onze studie wijst op het nut van DGS voor de identificatie van de kopie-aantal veranderingen. Met behulp van DGS, identificeerden we KRAS
als een gen dat is versterkt in menselijke maagkanker. We hebben aangetoond dat genamplificatie waarschijnlijk vormt de moleculaire basis van overactivering van KRAS bij maagkanker. Bijkomende studies met behulp van een grotere cohort van maagkanker monsters worden verlangd om de diagnostische en therapeutische implicaties van KRAS
amplificatie en overexpressie te bepalen. Achtergrond
Maagkanker is de derde meest voorkomende kwaadaardige tumor die de algemene bevolking in de wereld [1 ]. Specifieke genetische veranderingen zijn gemeld bij maagkanker, met inbegrip van de amplificaties van KSAM
, BMO
ERBB2
en mutaties in p53
, APC
en CDH1
[2] . Terwijl gain-of-function mutaties van KRAS Wat zijn enkele van de meest waargenomen genetische veranderingen in verschillende tumoren, waaronder pancreas (60%), galwegen (33%) en colon (32%) [3], deze mutaties zijn zeldzaam bij maagkanker (2-7%) [4-7]. In het algemeen RAS
mutaties geassocieerd met het ontstaan ​​van tumoren "lock" RAS in een actieve GTP-gebonden toestand. GTP-RAS bindt aan een aantal effector eiwitten stroomafwaartse signaleringsroutes, waaronder de RAF-MAP kinase cascade en fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt routes van celgroei en oncogenese zijn de beste kenmerk stimuleren [3]. Langdurige activering van RAS kan ook optreden door middel van mechanismen die niet mutaties betrekken bij RAS. Zo verminderde expressie van let-7 microRNA, die RAS onderdrukt door je op de 3 'onvertaalde regio RAS
mRNA wordt vaak geassocieerd met een hoger eiwitgehalte RAS in tumoren [8]. Tot op heden, de moleculaire mechanismen van oncogene activering van RAS bij maagkanker nog niet volledig opgehelderd.
Amplificatie van genomische sequenties met genen die essentieel zijn voor celgroei is een van de belangrijkste mechanismen van activatie van oncogenen in kanker en is vaak geassocieerd met tumorprogressie, slechte prognose en /of geneesmiddelresistentie [9]. Van de vele methoden die momenteel beschikbaar zijn voor het opsporen van copy number veranderingen genoom-brede, de huidige gouden standaard is de array CGH methode (aCGH). In de afgelopen jaren, heeft de resolutie van aCGH snel verbeterd door het gebruik van oligonucleotide probes, en heeft overtrof dat van aCGH behulp van standaard BAC probes [10]. Echter aCGH is ook gevoelig voor de inherente ruis van hybridisatie gebaseerde intensiteitsmetingen, de signaalkwaliteit wordt beïnvloed door repeterende sequenties en is afhankelijk van de sonde kwaliteit [11]. In feite is optimalisatie probe ontwerp een grote uitdaging voor de ontwikkeling van tiling arrays [12, 13].
Digitale karyotypering (DK) werd ontwikkeld door Wang et al geweest. [14] en wordt niet beperkt door de inherente problemen van arraytechnieken. DK heeft betrekking op de digitale opsomming van korte fragmenten van genoom DNA (genaamd-tags), die een kwantitatieve meting van DNA copy number door de tag dichtheid analyse langs elk chromosoom. DK is met succes toegepast op een verscheidenheid van de tumor types te copy-nummer veranderingen op te sporen, met inbegrip van de versterking van tyms
, RSF1
OTX2
, en verwijdering van MKK4 Kopen en dystrofine
[ ,,,0],15-19]. Ondanks de efficiëntie van DK, is het technisch uitdagend voor brede toepassingen, omdat het gaat om PCR amplificatie en het genereren van tags van 21-baseparen (bp) lang precies het chromosoom locatie van interesse vertegenwoordigt.
Wij rapporteren hier de ontwikkeling van een nieuwe werkwijze, genaamd DGS, voor de kwantitatieve analyse van kopieaantal variant, die is gebaseerd op de tag tellen begrip DK, maar een vereenvoudigde werkwijze tag bereiding. DGS van maagkanker cellijnen gedetecteerd de versterking van het KRAS
locus op chromosoom 12p12.1. Onze resultaten geven een moleculaire basis voor de overactivering van KRAS, en suggereren dat de activering van KRAS stroomafwaartse signaleringsgebeurtenissen maag kankercelproliferatie kunnen bevorderen.
Werkwijzen
Cellijnen en weefsels Ondernemingen De cellijnen van de huidige geanalyseerd studie zijn opgenomen in de aanvullende file 1. De HSC en SH101P4 cellijnen werden vastgesteld door Kazuyoshi Yanagihara [20]; alle anderen werden verkregen van American Type Culture Collection of Japan Collection of Research Bioresources (Tokyo, Japan). Alle cellijnen werden gekweekt in de specificatie. Voor serum stimulatie werden cellen geïncubeerd in medium dat serum ontbrak gedurende 24 uur (u), en vervolgens ongestimuleerde of gestimuleerd gedurende 1 uur met medium dat 10% foetaal kalfsserum (FCS). Primaire maagkanker monsters werden verkregen van de afdeling Heelkunde, Keiyukai Sapporo Ziekenhuis, met informed consent van elke patiënt. Genomisch DNA werd geëxtraheerd met behulp van het fenol-chloroform methode, gevolgd door RNase behandeling. Totaal RNA werd geëxtraheerd met behulp van Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Genomisch DNA van normale perifere bloed leukocyten (BIOCHAIN, Hayward, CA, USA) en totaal RNA uit normale maagslijmvlies van gezonde individuen (BIOCHAIN ​​en Invitrogen) werden aangekocht. Primaire maagkanker werden ingedeeld aan de hand clinicopathologische functies, zoals getoond in Extra file 2, volgens de pTNM classificatieschema (5e editie, 1997) [21] en Lauren's classificatiesysteem [22]. KRAS
-amplification-status naar leeftijd werd vergeleken met behulp van de Student t-test; volgens rang, PT-status, pN status en ziektestadium met behulp van de Mann-Whitney U-test; en naar geslacht, histologie en PM-status met behulp van de Fisher exact test. Alle tests werden 2 staart, en een P
waarde van < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Digitale genoom scanning
kort werd 40 ug genomisch DNA werd onderworpen aan restrictie-enzymdigestie met behulp
Mbo I (Takara, Tokyo, Japan) en vervolgens gescheiden door elektroforese op een 3% NuSieve GTG agarose gel. Korte fragmenten (30-60 bp, genaamd real-tags) werden geëlektro, aaneengeschakelde en gesubkloneerd in Bam HI
gedigereerde pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) onder toepassing Mighty Mix DNA ligatie-oplossing (Takara). Escherichia coli DH10B
werden getransformeerd met de recombinante plasmiden, werden de transformanten verzameld en het plasmide DNA werd gezuiverd uit de 1e bibliotheek genereren. Concatemeren onroerend tags uitgesneden door
Spe I /PstI
digestie van 1 bibliotheek en fragmenten in het bereik van 140-800 bp werd aan elektro, aaneengeschakelde en gesubkloneerd in pBluescript II KS + om de 2e bibliotheek genereren. Tweede bibliotheek van plasmiden die concatemeren
Spe I /PstI
I fragmenten werden gesequentieerd met behulp van een ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) volgens instructies van de fabrikant. Unieke real tags afgebeeld op menselijk chromosoom sequenties en tag dichtheid, gedefinieerd als de verhouding van echte labels virtuele markeringen op glijdende werd berekend afwijkingen in DNA gehalte met behulp drempelwaarden gedefinieerd DGS simulaties detecteren. Tag posities en tag dichtheid verhoudingen werden gevisualiseerd met behulp van Custom Tracks en Genome grafieken van de University of California, Santa Cruz (UCSC) genoom browser (maart 2006 te bevriezen, hg18) [23-25]. De gedetailleerde protocollen voor DGS, virtuele tag karakterisering en in silico
simulaties zijn beschikbaar in Extra file 3.
Kwantitatieve real-time PCR
Relatief DNA copy number werd bepaald door kwantitatieve real-time PCR met behulp van een SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) en de ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). DNA-gehalte per haploïde genoom werd genormaliseerd tot die van een zich herhalend element, Line-1, en berekend door de vergelijkende CT (ΔΔCT) relatieve kwantificatie methode met de formule 2 (Nt Catawiki - Nline
) - ( xt
- Xline
), waarbij N
t
wordt de drempel cyclus aantal waargenomen voor een experimentele primer in normale leukocyten DNA, N
lijn
is de drempel cyclus nummer waargenomen voor de Line-1 primer in normale leukocyten DNA, Xt
is de gemiddelde drempelwaarde cyclus nummer waargenomen voor de experimentele primer in kankercel DNA, en X
lijn
is de gemiddeld drempel cyclus nummer waargenomen voor de Line-1 primer in kankercel DNA [14]. Genoomamplificatie werd gedefinieerd als meer dan 4-voudige toename in DNA-gehalte. De primer sequenties voor elke locus in aanvullende bestandsinformatie 4. allelische percentage mutant KRAS
(G12V, GGT GTT →) werd vastgesteld met behulp van een gemodificeerde real-time PCR Procedure volgens Itabashi et al
[26 ]. De gedetailleerde protocol is in aanvullende bestandsinformatie 3. cDNA werd bereid met SuperScript III reverse transcriptase (RT, Invitrogen) en het mRNA van elk gen werd bepaald door real-time RT-PCR met de TaqMan genexpressie Assay (Applied Biosystems) . Relatieve mRNA-niveaus werden berekend door de vergelijkende CT methode met GAPDH
als endogene controle. De primer /probe sets gebruikt worden getoond in Extra file 5.
Fluorescentie in situ
hybridisatie (FISH)
BAC dat de KRAS
locus (RP11-636P12) en chromosoom 12q24.2 bevatten (RP11 -91M21) werden gemerkt met Cy3 en Cy5, respectievelijk, en vervolgens geïncubeerd met glijbanen bereid met interfase en metafase chromosomen. Kernen werden tegen gekleurd met 4 ', 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) en dia's werden geanalyseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Leica CW-4000).
Mutatie-analyse van KRAS Kopen en PIK3CA

Amplified genomische fragmenten werden rechtstreeks gesequenced en gesubkloneerd met behulp van de TOPO TA kloneersamenstel (Invitrogen) en gesequenced. Ten minste tien klonen van twee onafhankelijke PCR-tests per locus werd de sequentie bepaald met behulp voorwaartse en achterwaartse M13-primers (Invitrogen). De sequenties van de primers die voor amplificatie van KRAS
(exons 1 en 2) en PIK3CA
(exons 9 en 20) getoond in aanvullende bestand 6.
Immunoblotanalyse
Cellen werden gelyseerd in Lysis buffer die 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) buffer, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 10% glycerol, 10 mM NaF, 1 mM natriumvanadaat, 50 mM β-glycerofosfaat, 1 mM fluoride phenylmethansulfonyl , 1 mM dithiothreitol, en een cocktail van proteaseremmers (Roche, Mannheim, Duitsland). Eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE en elektroblotting op een Immobilon-P membraan (Millipore, Billerica, MA, USA). De membranen werden geanalyseerd door immunoblot met de volgende antilichamen, zoals vermeld: muizen monoklonaal anti-KRAS, -NRAS en -HRAS antilichamen (SC-30, SC-31 en SC-29, respectievelijk, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-actine antilichaam (Millipore); konijn polyklonaal anti-p44 /42 MAP kinase, -phosho-p44 /42 MAP kinase (Thr202 /Tyr204), -Akt en -fosfo-Akt (Ser 473) antisera (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA).
GTP-RAS pull-down assay
activering van RAS werd gedetecteerd onder toepassing van een EZ-Detect Ras activering Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). In het kort cellysaat (500 ug) werd geïncubeerd met geïmmobiliseerde Raf1 Ras-bindend domein gefuseerd aan glutathion S-transferase (GST-Raf1-RBD). Precipitaten werden 3 keer gewassen, en gebonden eiwitten werden geëlueerd door koken gedurende 5 minuten (min). Eiwitten werden gescheiden op een 12% polyacrylamidegel, overgebracht naar een Immobilon-P membraan en onderworpen aan immunoblot analyse met anti-KRAS, -NRAS of -HRAS antilichamen.
RNA interferentie
Een op maat ontworpen KRAS
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), gericht op een gebied van KRAS
die niet geassocieerd met bekende oncogene mutaties, werd gesynthetiseerd door Dharmacon (Lafayette, CO, USA). siRNA gericht LRMP
, LYRM5 Kopen en CASC1
werden gekocht van Ambion (No.144181, 284.911 en 147.715). Een universele non-targeting siRNA (niet beheersing VII, Dharmacon) werd gebruikt als een negatieve controle. In elk experiment werden 5 x 10 6 cellen werden getransfecteerd met 7,5 ul 20 uM siRNA door elektroporatie (Amaxa, Keulen, Duitsland) onder toepassing Nucleofector kit V of T, volgens de instructies van de fabrikant.
Celproliferatie assay
Na transfectie met siRNA, de maagkanker cellijnen HSC45, MKN1, AGS en NUGC4 werden in 96-well platen geënt bij een dichtheid van 8000 cellen /100 pl in standaard medium dat 10% FCS. Aantal cellen op 48, 72 en 96 uur na transfectie werd indirect bepaald door colorimetrische test met gebruik Cell Counting Kit-8-oplossing (DOJINDO, Kumamoto, Japan). De test is gebaseerd op de reductie van een tetrazolium zout ([2- (2-methoxy-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfofenyl) -2-tetrazolium, mononatriumzout] WST -8) en wordt gebruikt als maat voor levende cellen. De absorptie van elk putje bij 450 nm werd gemeten met een microplaat reader (Model 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Flowcytometrie
Flowcytometrie werd uitgevoerd zoals eerder [27] beschreven. In het kort werden hechtende en losgemaakte cellen geoogst, in 90% koude ethanol, behandeld met RNase A vast (500 eenheden /ml) en vervolgens gekleurd met propidium iodide (50 ug /ml). Voor elk monster werden 30.000 gebeurtenissen geanalyseerd met de celcyclus analyse platform FlowJo programma (Tree Star, Ashland, OR, USA).
Immunohistochemie
formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde coupes van maag tumoren werden ontdaan van paraffine, gehydrateerd en vervolgens behandeld met peroxidase blokkeeroplossing (3% H 2O 2 in methanol). Secties werden geautoclaveerd bij 105 ° C gedurende 10 min in target retrieval oplossing (Dako, Glostrup, Denemarken). Secties werden geïncubeerd met een muis anti-KRAS antilichaam. (1: 100 verdunning; Santa Cruz Biotechnology) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en immunoreactiviteit werd gedetecteerd met ENVISION-Plus reagens (Dako)
Resultaten
Digitale genoom scanning en karakterisering van virtuele markeringen in silico
Digital genoom scanning (DGS) is een werkwijze voor het kwantificeren genkopienummer door korte opsomming genomische DNA-fragmenten (genaamd real-tags) die experimenteel worden gegenereerd door
Mbo I endonuclease digestie (Figuur 1a). De ingewikkelde stappen voor het bereiden tag elimineren we computationeel kenmerk korte DNA-fragmenten die worden geproduceerd door één restrictie-enzym digestie met Mbo I
, waarbij de 4-bp sequentie GATC herkent. In silico
digestie van het menselijke genoom van
Mbo I produceerde ongeveer 1.600.000 restrictiefragmenten (zogenaamde virtuele markeringen) in het gebied van 20-130 bp (aanvullende bestandsinformatie 7a). Nucleotide sequentie analyse toonde dat ongeveer 65% van het virtuele markeringen bevat repetitieve sequenties in de zin van de openbare database van herhaalde elementen (Extra bestand 7a). Belangrijker sequentie overeenkomende met de menselijke genoom database bleek dat ongeveer 85% van het virtuele labels toegewezen uniek nauwkeurige chromosomale lokatie (aanvullende bestandsinformatie 7b, c). Zelfs als de virtuele-tags repetitieve sequenties gedeeltelijk ongeveer 80% van de herhalende markeringen bleken uniek te zijn. De gemiddelde afstand tussen twee unieke virtuele tags van 30 tot 60 bp lang was 7,6 kb, de mediane afstand was 4,5 kb en 97,8% intervallen korter waren dan 30 kb (aanvullende bestandsinformatie 7d). Vertaald tag interval eigenschappen werden waargenomen voor virtuele labels het bereik van 70 tot 100 bp (gemiddelde afstand, 7,9 kb, mediane afstand 4,8 kb; 97,4% korter waren dan 30 kb) en 100-130 bp (gemiddelde afstand, 7,9 kb; mediane afstand, 4,9 kb,.. 97,4% korter waren dan 30 kb (aanvullende bestandsinformatie 7e, f) Bovendien is de dichtheid van unieke virtuele markeringen was bijna gelijk in elk chromosoom (aanvullende bestandsinformatie 7g) Deze in silico
bevindingen suggereerden dat het merendeel van de korte Mbo
ik labels informatief voor DGS zou zijn. Figuur 1 DGS en voorbereiding van real-tags. (a) Schematisch overzicht van DGS. Verfdozen vertegenwoordigen genomische Mbo
ik echt labels. Zie tekst voor details. (b en c) Bereiding (b) en karakterisatie (c) reële markeringen. Representatieve resultaten gebruikmaking van genomisch DNA van MKN1 maagkanker cellen worden getoond. (b) korte fragmenten van
Mbo I-gedigereerd genomisch DNA (30 tot 60 bp) werden geëlektro uit een agarosegel (i), aaneengeschakelde en gesubkloneerd. Resulterende recombinante plasmiden werden samengevoegd aan de 1e bibliotheek genereren (ii). Lange concatemeren (140-800 bp) werden uit 1 bibliotheek vectoren, elektro (iii), aaneengeschakelde en gesubkloneerd. De resulterende recombinante plasmiden vertegenwoordigen 2e bankklonen (iv). Het aantal labels in elke kloon wordt getoond bovenaan elke baan. Inserts werden door Xho I
/SacI digestie
in panelen (ii) en (iv). *, Vectorfragmenten; **, Spe
I /Pst
I vertering van de multiple-kloneringsplaats zonder inzet. (C) Aantal daadwerkelijk echte tags uit de 2e bibliotheek wordt weergegeven in het histogram (links), en hun kenmerken zijn samengevat (rechts).
DGS simulatie in silico
Het vermogen van DGS naar genoom te detecteren -brede veranderingen gebaseerd op genoom kenmerken, zoals het aantal kopieën en de grootte van de wijziging en het aantal echte labels verkregen sequentieanalyse. Om de grootte van wijziging die betrouwbaar kan worden gedetecteerd, aangezien een vast aantal bemonsterde markeringen computationeel voorspellen, gebruikten we Monte Carlo simulatie een positieve predictieve waarde (PPV), hetgeen de kans dat een gedetecteerde verandering vertegenwoordigt een echte verandering berekenen. Zo vonden we dat een analyse van 5000 labels betrouwbaar kan detecteren een 10-voudige amplificatie van 500 kb, een homozygote deletie van 7,5 Mb, of een enkele kopie verlies van een 30 Mb regio, maar kon niet detecteren een subchromosomaal krijgen kleiner is dan 30 Mb (Extra file 8). Zowel de gevoeligheid en specificiteit van het detecteren van deze soorten veranderingen waren > 99% in geval van hoge PPV (> 90%)., Waaruit bleek dat noch een beperkende factor analyse (gegevens niet getoond)
Bereiding van real tags uit humaan genomisch DNA
Voor DGS van maagkanker cellijnen HSC45 en MKN1, bereid we bibliotheken onroerend tags uit genomisch DNA, zie figuur 1a. De Mbo
gedigereerde genoom-DNA werd op grootte gefractioneerd (30-60 bp) en onderworpen aan concatemerization, gevolgd door constructie van een 2e bibliotheek, die ongeveer 10 echte labels per kloon bevatte (Figuur 1b). Nucleotide sequentie analyse van de echte labels bleek dat 85,8% toegewezen aan unieke posities, die in overeenstemming zijn met onze karakterisering van virtuele-tags (figuur 1c) was.
Amplificaties op chromosoom 12p in HSC45 maagkanker cellen Ondernemingen De genoom-brede tag dichtheid profiel van HSC45 cellen werd bepaald met een totaal van 5462 unieke real-tags. Hoge resolutie en gevoeligheid met de experimentele gegevens plaatsvindt, gebruikten we venstergrootte van 1000 en 2100 virtuele labels (ongeveer 2300 kb en 4700 kb) voor de analyse van amplificaties en deleties, respectievelijk. De verhouding tag dichtheid werd berekend als de som van echte labels gedeeld door het gemiddelde aantal echte labels in even grote ramen in het genoom, waarbij de normale verhouding tag dichtheid werd gedefinieerd als 1,0. We identificeerden verschillende subchromosomaal gebieden van verhoogde tag dichtheid bij 8q24.21, 12p12.1 en 12p13.33 en verminderde tag dichtheid bij 9p21.3 en de lange arm van chromosoom 18 (figuur 2, aanvullende bestandsinformatie 9a-d). De regio's steeg tag dichtheid (12p12.1, 12p13.33 en 8q24.21) bevatte KRAS
, CACNA1C
(calciumantagonisten, voltage-afhankelijke, L-type, alpha-subunit 1c) en MYC
loci respectievelijk. Southern blot analyse bevestigde dat KRAS Kopen en MYC
werden versterkt in HSC45 cellen (Extra file 9e). Elke gekwantificeerd kopie-aantal veranderingen zoals vastgesteld door kwantitatieve real-time PCR (qPCR) van genomisch DNA opmerkelijk vergelijkbaar met die geschat door DGS wanneer de venstergrootte voor tag dichtheidanalyse kwam overeen met de grootte van elke verandering (aanvullende bestandsinformatie 9a-d ). Deze resultaten suggereren dat tag dichtheidanalyse door DGS kunnen worden gebruikt om kopieaantal analyses uit te voeren gehele menselijke genoom. Figuur 2 Detectie van verhoogde aantal kopieën op de chromosomen 8q en 12p door DGS in HSC45 maagkanker cellen. (A) Een hele genoom weergave van het label dichtheidsverhouding (via een venster van 1000 virtuele markeringen) in HSC45 cellen zoals bepaald door DGS. Waarden op de y-as geven veelvoudveranderingen tag dichtheid ten opzichte van het gemiddelde tag dichtheid van het gehele genoom en vertegenwoordigt DNA-gehalte per haploïde genoom in vensters. De x-as geeft het aantal chromosomen. (B en c) Een uitgebreide weergave van tag density ratio op chromosomen 8 (b) en 12 (c). In elk paneel, de bovenste grafiek toont geheel chromosoom weergave van het label dichtheidsverhouding (gebaseerd op een venster van 1000 virtuele markeringen). De onderste grafiek toont een uitgebreide weergave van 8q24.21 en 12p12.1, waarin verhoogde tag dichtheid werd gedetecteerd met behulp van Windows 1000 en 500 virtuele labels. Unieke echte tags worden aangeduid als zwarte verticale balken, en de unieke virtuele tags worden aangegeven in blauw (60 bp of korter) of lichtblauw (langer dan 60 bp) bars in dichte stand. De posities van RefSeq genen, enkele splicing isovormen weggelaten worden getoond aan de onderzijde van de onderste panelen.
Amplificatie van KRAS
bij maagkanker cellijnen
Analyse van 26 loci binnen onmiddellijk flankerende chromosoom 12p12. 1 in HSC45 cellen door qPCR aangetoond dat een gebied van ongeveer 500 kb, die de KRAS
locus opgenomen, werd geamplificeerd (8-voudige amplificatie, figuur 3a). Genomische qPCR screening gedetecteerd KRAS
amplificatie in twee extra maagkanker cellijnen SH101P4 (18-voudig) en MKN1 (13-voudig) (Figuur 3a), terwijl er geen amplificatie van meer dan 4-voudig 17 andere detecteerde maagkanker cellijnen, of 10 darmkanker en 11 pancreatische kankercellijnen (in aanvullende bestand 1 vermelde gegevens niet getoond). DGS ook ontdekt amplificatie van het KRAS
locus in MKN1 cellen (Extra file 10). De naburige genen van KRAS
in de minimale amplicon waren LRMP
(-lymfoïde beperkte membraaneiwit), CASC1
(kanker vatbaarheid kandidaat-1) en LYRM5
(LYR motief met 5). BCAT1
(vertakte aminotransferase 1, cytosolische) werd geamplificeerd in SH101P4 en MKN1 cellen, maar niet in HSC45 cellen. We bevestigd dat CACNA1C
geamplificeerd in HSC45 cellen, maar niet in de andere maag-, colon- of pancreaskanker cellijnen via genoom qPCR analyse (9b Aanvullende bestandsinformatie, gegevens niet getoond). Noch NRAS
, HRAS
noch BRAF
amplificaties werden in bovenstaande kankercellijnen door genomische qPCR analyse gedetecteerd (gegevens niet getoond). De amplificatie van KRAS
werd geverifieerd door tweekleurige FISH analyse, waarbij de KRAS
amplicon was duidelijk een homogeen gekleurd gebied HSC45, SH101P4 en MKN1 cellen (Figuur 3b). Figuur 3 Genamplificatie van KRAS bij maagkanker cellen. (A) Kwantitatieve genomische PCR-analyse van het KRAS
locus op 12p12.1 in HSC45 cellen. Discrete amplificaties op 12p12.1 in twee maagkanker cellijnen werden gedetecteerd (SH101P4 en MKN1). DNA kopieaantal ten opzichte van normaal diploïde leukocyt DNA werd uitgezet tegen chromosomale nucleotidepositie (in megabasen). De posities van RefSeq genen in de overeenkomstige gebieden worden in de onderste kaart. De minimale amplificatie regio voor alle 3 maagkanker cellijnen wordt weergegeven door de oranje bar. (B) de metafase (links) - en interfase (rechts) -Vis analyse van het PCR KRAS
locus bij maagkanker cellijnen. De KRAS
-specifieke probe in geel en de controle probe, specifiek voor de lange arm van chromosoom 12, in rood. Tetraploidy in HSC45 en triploïdie in SH101P4 en MKN1 cellen waargenomen. (C) Kwantitatieve real-time RT-PCR analyse van mRNA expressie KRAS-
bij maagkanker cellen met 12p12.1 amplificatie. Expressie analyse van genen (KRAS, LRMP, CASC1 Kopen en LYRM5
) gelegen binnen de minimale amplicon en BCAT1
, waarbij de minimale amplicon flankeert, werd uitgevoerd met real-time RT-PCR. Expressieniveaus werden genormaliseerd op GAPDH-mRNA
en afgebeeld als een kleurverloop, ten opzichte van normaal maag. Het gen amplificatie en mutatie (codon 12 of 13) status KRAS
voor elk monster is samengevat in de juiste twee kolommen. Gevulde cirkels wijzen op de aanwezigheid van de amplificatie of mutatie van KRAS
en open cirkels geven geen versterking of geen mutatie van KRAS
.
Sequentieanalyse van KRAS
(Extra file 11a) is gebleken dat zowel HSC45 en SH101P4 cellen koesterde een mutatie in codon 12 die resulteerde in een enkele aminozuursubstitutie in KRAS (GGT → GTT, G12V), terwijl MKN1 cellen ontbrak KRAS
mutaties. De aanwezigheid van KRAS
mutaties in AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) en HCT116 (G13D) cellen is eerder [28, 29] gemeld. Van de tien PCR-klonen KRAS
van HSC45 en SH101P4 cellen die werden onderworpen aan mutatieanalyse, acht en drie respectievelijk geherbergd mutaties in codon 12. Verder genomische real-time PCR-analyse met behulp probes die specifiek waren wild type en mutante allelen KRAS
(aanvullende bestandsinformatie 11b) onthulde dat HSC45 en SH101P4 cellen bevatten verschillende verhoudingen van het mutante allel (80% en 50%, respectievelijk). Kortom, deze resultaten aan dat amplificatie van een gemuteerde KRAS
allel voorkomt ook HSC45 en SH101P4 cellen.
Vervolgens onderzochten we de niveaus van mRNA in
KRAS KRAS
-amplified maagkanker cellen door kwantitatieve real -tijd RT-PCR (qRT-PCR) (figuur 3c). De niveaus van KRAS
mRNA significant gecorreleerd met KRAS
aantal kopieën. De naburige genen LYRM5 Kopen en CASC1
die gelokaliseerd de minimale amplicon, werden ook tot expressie op hogere niveaus in cellen met amplificatie ten opzichte van cellen zonder amplificatie (Figuur 3c). Interessant LRMP
werd down-gereguleerd in kankercellen in vergelijking met normale maagcellen. Immunoblotanalyse van RAS eiwitten (Figuur 4a) bleek dat de expressie van Kras verhoogd KRAS
-amplified maagkanker cellen (HSC45, SH101P4 en MKN1), terwijl noch NRAS noch HRAS sterk tot expressie werden gebracht (figuur 4a; gegevens niet getoond ). Hoewel de expressie van let-7c en laat-7g microRNAs is gemeld RAS expressie [8], vonden we weinig correlatie van expressie van deze microRNAs KRAS eiwitniveaus (aanvullende bestandsinformatie 12), regelt die suggereerde dat KRAS overexpressie bij maagkanker cellijnen is vooral te danken aan genomische amplificatie van KRAS
. Figuur 4 Overexpressie van KRAS, en differentiële activering van KRAS, p44 /42 MAP kinase en AKT in KRAS -amplified maagkanker cellen. (A) Immunoblotanalyse van de expressieniveaus van KRAS en NRAS in kankercellen. Actine expressie werd geanalyseerd als ladingscontrole. (B) De basale niveau van GTP-KRAS was opvallend hoog in maagkanker cellen met versterkte mutant KRAS
(HSC45 en SH101P4). Totale lysaat (500 ug) werd aan een GTP-RAS pull-down assay en GTP-KRAS en GTP-NRAS werden gedetecteerd door immunoblot met behulp van anti-KRAS en anti-NRAS antilichamen, respectievelijk. Totale cellysaat (50 ug) werd geanalyseerd parallel aan het expressieniveau van KRAS en NRAS in cellen te bepalen. (C) GTP-KRAS werd verhoogd na serum stimulatie in MKN1 cellen. Cellen werden gekweekt in medium dat regelmatig 10% FCS (N), serum-verhongerd gedurende 24 uur (-) of serum onthouden vervolgens gestimuleerd met 10% FCS gedurende 1 h (+). Totale cellysaat werd onderworpen aan een GTP-KRAS pull-down test. (D) Activatie van p44 /42 MAP kinase en AKT in serum uitgehongerd of gestimuleerde maagkanker cellen.

• Genoom-brede gen aantal kopieën en expressie analyse van de primaire maag tumoren en maagkanker cellijnen
• Mechanismen van gastroprotection methanol extract van Melastoma malabathricum leaves