Ein neuartiges Verfahren, digitale Genom-Scanning erkennt KRAS-Gen-Amplifikation in Magenkrebs: Beteiligung von überexprimiert KRAS-Wildtyp in nachgeschalteten Signal und das Krebszellwachstum

Ein neuartiges Verfahren, digitale Genom-Scanning erkennt KRAS
Gen-Amplifikation in Magenkrebs: Beteiligung von überexprimiert KRAS-Wildtyp in Downstream-Signalisierung und das Krebszellwachstum
Zusammenfassung
Hintergrund
Magenkrebs ist die dritthäufigste die allgemeine Bevölkerung weltweit zu beeinflussen Malignität. in der Entwicklung vieler Tumorarten jedoch onkogenen Mutationen von KRAS
sind selten bei Magenkrebs aberrante Aktivierung von KRAS ist ein Schlüsselfaktor. Wir haben eine neue quantitative Verfahren zur Analyse von DNA-Kopienzahl entwickelt, bezeichnet als digitale Genom-Scanning (DGS), die auf die Zählung von kurzen Restriktionsfragmenten basiert und keine PCR oder Hybridisierung beinhalten. In der aktuellen Studie verwendeten wir DGS Kopienzahl Veränderungen in der Magenkrebszellen zu untersuchen.
Methoden
DGS von Linien Magenkrebszellen wurde unter Verwendung der Sequenzen von 5.000 bis 15.000 Restriktionsfragmenten durchgeführt. Wir gescreent 20 Magenkrebszelllinien und 86 primären Magentumoren für KRAS
Amplifikation durch quantitative PCR und sucht KRAS
Amplifikation an der DNA, mRNA und Protein-Ebene durch Mutationsanalyse, Echtzeit-PCR, Immunblot-Analyse, GTP -RAS Pull-Down-Assay und immunhistochemischen Analyse. Die Wirkung von K-Ras
auf die Aktivierung von p44 /42 MAP-Kinase und AKT und auf das Zellwachstum knock-down wurden durch Immunblot und kolorimetrischen Test untersucht, respectively.
Ergebnisse
DGS Analyse des HSC45 Magenkrebszelle Linie ergab die Amplifikation eines 500-kb-Region auf Chromosom 12p12.1, das die KRAS
Genort enthält. Die Verstärkung des Locus
KRAS wurde in 15% (3/20) von Magenkrebs-Zelllinien (8-18-fache Verstärkung) und 4,7% (4/86) der primären Tumoren des Magens (8-50-fache Amplifikation nachgewiesen ). KRAS
Mutationen wurden in zwei der drei Zelllinien identifiziert, in denen Kras
amplifiziert wurde, wurden aber in einem der primären Tumoren nicht nachgewiesen. Die Überexpression von KRAS-Protein korreliert direkt mit einer erhöhten KRAS
Kopienzahl. Die Höhe der GTP-gebundenen KRAS wurde mit verstärkten Wildtyp-KRAS
folgende Serumstimulation in Zellen erhöht, aber nicht in Zellen mit amplifizierten mutierten KRAS
. Knock-down von KRAS
in Magenkrebszellen, die Wildtyp-KRAS verstärkt durch
in der Hemmung des Zellwachstums resultierte und die Unterdrückung von p44 /42 MAP-Kinase und AKT-Aktivität.
Fazit
Unsere Studie unterstreicht die Nützlichkeit der DGS für die Identifizierung von Kopienzahl Veränderungen. Mit DGS identifizierten wir KRAS
als ein Gen, das in der menschlichen Magenkrebs verstärkt wird. Wir haben gezeigt, dass Gen-Amplifikation wahrscheinlich die molekulare Grundlage der Überaktivierung von KRAS bei Magenkrebs bildet. Zusätzliche Studien eine größere Kohorte von Magenkrebs Proben unter Verwendung erforderlich, um die diagnostischen und therapeutischen Implikationen von KRAS
Amplifikation und Überexpression.
Hintergrund
Magenkrebs zu bestimmen, die dritthäufigste Krebserkrankung ist weltweit die Allgemeinbevölkerung betroffen [1 ]. Durch spezifische genetische Veränderungen wurden bei Magenkrebs berichtet, einschließlich der Amplifikationen von KSAM
, MET
und ErbB2
und Mutationen in p53
, APC
und CDH1
[2] . Während gain-of-function Mutationen KRAS
einige der am häufigsten beobachteten genetischen Veränderungen in einer Vielzahl von Tumoren, einschließlich Pankreas (60%), der Gallenwege (33%) und Dickdarm (32%) [3], diese Mutationen sind selten bei Magenkrebs (2-7%) [4-7]. Im Allgemeinen RAS
mit tumorigenesis assoziierte Mutationen "sperren" RAS in einem aktiven GTP-gebundenen Zustand. GTP-RAS bindet an eine Anzahl von Effektor-Proteine ​​nachgelagerten Signalwege zu stimulieren, unter denen die RAF-MAP-Kinase-Kaskade und die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) -AKT Wege von Zellwachstum und Onkogenese sind die am besten charakterisierte [3]. Längerer Aktivierung von RAS kann auch durch Mechanismen erfolgen, die keine Mutationen in RAS einzubeziehen. Beispielsweise erniedrigte Expression von let-7-mikroRNAs, die RAS unterdrückt, indem die 3'-untranslatierte Region von RAS
mRNAs Targeting, wird oft mit einem höheren RAS Proteinebene assoziierten Tumoren in [8]. Bis heute haben die molekularen Mechanismen der onkogenen Aktivierung von RAS in Magenkrebs nicht vollständig aufgeklärt worden.
Amplifikation von genomischen Sequenzen Gene enthält, die für das Zellwachstum kritisch sind eine der wichtigsten Mechanismen der Aktivierung von Onkogenen in Krebs ist, und oft mit Tumorprogression assoziiert, schlechte Prognose und /oder Arzneimittel-Resistenz [9]. Von den zahlreichen derzeit verfügbaren Methoden Kopienzahl Veränderungen genomweite zur Erfassung, ist der derzeitige Goldstandard der Array-CGH-Methode (aCGH). In den letzten Jahren hat sich die Auflösung verbessert aCGH schnell durch die Verwendung von Oligonukleotidsonden, und hat, dass der aCGH unter Verwendung von Standardsonden BAC übertroffen [10]. Allerdings aCGH ist auch anfällig für das Eigenrauschen der Hybridisierung basierende Intensitätsmessungen, da die Signalqualität durch repetitive Sequenzen betroffen ist, und ist abhängig von Sondenqualität [11]. In der Tat, die Optimierung der Sondendesign hat eine große Herausforderung bei der Entwicklung von Tiling Arrays [12, 13].
Digitale karyotyping (DK) von Wang et al entwickelt wurde. [14] und wird durch die inhärenten Probleme der Array-Techniken beschränkt. DK beinhaltet die digitale Zählung von kurzen Fragmenten von genomischer DNA (bezeichnet als Tags), entlang jedes Chromosoms eine quantitative Messung der DNA-Kopienzahl durch Tag-Dichteanalyse bereitstellt. DK wurde erfolgreich auf eine Vielzahl von Tumorarten angewendet Kopienzahl Veränderungen zu erkennen, einschließlich der Verstärkung von TYMS
, RSF1
und OTX2
und Löschen von MKK4
und Dystrophin
[ ,,,0],15-19]. Trotz der Effizienz von DK, ist es technisch anspruchsvoll für eine breite Anwendung, weil es PCR beinhaltet Verstärkung und die Erzeugung von Tags von 21-Basenpaare (bp) in der Länge genau das Chromosom Ort von Interesse dar.
Wir berichten hier über die Entwicklung eines neuen Verfahrens, bezeichnet als DGS, für die quantitative Analyse der Kopienzahländerung, die auf dem Tag-counting Konzept DK basiert, sondern verwendet ein vereinfachtes Verfahren der Herstellung Tag. DGS von Magenkrebs-Zelllinien detektiert, um die Verstärkung des Locus
KRAS auf Chromosom 12p12.1. Unsere Ergebnisse liefern eine molekulare Grundlage für die Überaktivierung von KRAS und deuten darauf hin, dass die Aktivierung von KRAS nachgeschalteten Signalereignisse Magenkrebszellproliferation fördern kann.
Methoden
Zelllinien und Gewebe, Die Zelllinien im aktuellen analysiert Studie sind in den weiteren Datei aufgelistet 1. Die HSC und SH101P4 Zelllinien von Kazuyoshi Yanagihara gegründet wurden [20]; alle anderen wurden von der American Type Culture Collection oder der japanischen Sammlung von Forschung Bioresources (Tokio, Japan) erhalten. Alle Zelllinien wurden in den empfohlenen Medien. Für Serum-Stimulation wurden die Zellen in Medium inkubiert, das Serum fehlte für 24 Stunden (h), und dann entweder unstimuliert oder für 1 h mit Medien stimuliert, das 10% fötales Kälberserum (FCS). Primäre Magenkrebs Proben wurden von jedem Patienten aus der Abteilung für Chirurgie, Keiyukai Sapporo Hospital, mit informierte Zustimmung erhalten. Genomische DNA wurde unter Verwendung des Phenol-Chloroform-Verfahren, gefolgt von RNase-Behandlung extrahiert. Gesamt-RNA wurde mit Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extrahiert, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Genomische DNA von normalen peripheren Blutleukozyten (Biochain, Hayward, CA, USA) und Gesamt-RNA aus normalen Magenschleimhaut von gesunden Individuen (Biochain und Invitrogen) wurden gekauft. Primäre Magenkrebs wurden mit klinisch-pathologischen Eigenschaften klassifiziert, wie es in den weiteren Datei 2 gezeigt, nach dem pTNM Klassifikationsschema (5. Auflage, 1997) [21] und dem Klassifizierungssystem des Lauren [22]. KRAS
-amplification Status nach Alter wurde verglichen, um den Student-t-Test; nach Klasse, pT-Status, pN-Status und dem Krankheitsstadium des Mann-Whitney-U-Test verwendet wird; und nach Geschlecht, Histologie und pM Status des Fisher-Exact-Test. Alle Tests wurden 2-tailed und ein P
Wert von < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.
Digitale Genom-Scanning Kurz
, 40 &mgr; g genomische DNA einer Restriktionsenzymverdauung unterworfen wurden Mbo Verwendung
I (Takara, Tokyo, Japan) und dann durch Elektrophorese auf einem 3% abgetrennt Nusieve GTG Agarose-Gel. Kurze Fragmente (30-60 bp, bezeichnet als echte Tags) wurden elektroeluiert, verkettete und subkloniert in Bam
HALLO-verdauten pBluescript II KS + (Stratagene, La Jolla, CA) unter Verwendung von Mighty Mix DNA Ligierungslösung (Takara). Escherichia coli DH10B
mit den rekombinanten Plasmiden transformiert wurden, wurden die Transformanten gesammelt und die Plasmid-DNA gereinigt, um die erste Bibliothek zu erzeugen. Konkatemeren realer Tags durch Spe exzidiert wurden
I /Pst I
aus der ersten Bibliothek Verdauung, und Fragmente im Bereich von 140 bis 800 bp wurden elektroeluiert, verkettete und subkloniert in pBluescript II KS + die zweite Bibliothek zu erzeugen. Zweite Bibliothek Plasmide Concatemeren von Spe
I /Pst enthält
I-Fragmente wurden ein ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sequenziert, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Einzigartige echte Tags wurden für die menschliche Chromosom-Sequenzen abgebildet, und Tag-Dichte, definiert als das Verhältnis von echten Tags zu virtuellen Tags über das Verschieben von Fenstern, wurde berechnet, Anomalien in den DNA-Gehalt unter Verwendung von Schwellenwerten definiert durch DGS-Simulationen zu erfassen. Tag Positionen und Tag-Dichteverhältnisse wurden unter Verwendung von benutzerdefinierten Tracks und Genome Graphs von der University of California, Santa Cruz (UCSC) Genom-Browser visualisiert (März 2006 einfrieren, hg18) [23-25]. Die detaillierten Protokolle für DGS, virtuelle Tag Charakterisierung und in silico
Simulationen sind in den weiteren Datei 3.
Quantitative real-time PCR
Relative DNA-Kopienzahl durch quantitative Echtzeit-PCR unter Verwendung eines SYBR Green bestimmt wurde PCR Master Mix (Applied Biosystems) und des ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). DNA-Gehalt pro haploidem Genom wurde normalisiert auf die eines sich wiederholenden Element, Line-1 sowie dem Vergleichs CT (ΔΔCT) relative Bestimmungsmethode unter Verwendung der Formel 2 (Nt
- Nline
) - berechnet ( xt
- Xline
), wobei N
t
die Schwellenzykluszahl wird für eine experimentelle Primer in normalen Leukozyten-DNA,
N beobachtet Linie
ist die Schwellenzykluszahl für die LINE-1-Primer in normalen Leukozyten-DNA beobachtet, ist Xt
die durchschnittliche Schwellenzykluszahl für die experimentelle Primer in der Krebszelle DNA beobachtet und X
line Was ist die mittleren Schwellenzykluszahl für die LINE-1-Primer in der Krebszelle DNA beobachtet [14]. Genomischer Amplifikation wurde als mehr als 4-fachen Anstieg der DNA-Gehalt definiert. Die Primer-Sequenzen für jeden Locus sind in den weiteren Datei 4. Die Allel-Anteil von mutierten KRAS
(G12V, GGT → GTT) wurde unter Verwendung eines modifizierten Echtzeit-PCR-Verfahren nach Itabashi et al
bestimmt [26 ]. Die ausführliche Protokoll ist in den weiteren Datei verfügbar 3. cDNA Superscript III Reverse-Transkriptase hergestellt wurde, (RT, Invitrogen) und die mRNA-Ebene jedes Gens wurde mittels real-time RT-PCR ermittelt unter Verwendung des TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) . Relative mRNA-Spiegel wurden durch die vergleichende CT-Methode berechnet unter Verwendung von GAPDH
als endogene Kontrolle. Die Primer /Sonde-Sets verwendet werden, in den weiteren Datei 5.
Fluoreszenz-in-situ
Hybridisierung (FISH)
BACs gezeigt, dass der KRAS
Locus (RP11-636P12) und Chromosom 12q24.2 enthielt (RP11 -91M21) wurden mit Cy3 und Cy5 markiert sind, und dann mit Folien hergestellt mit Interphase und Metaphasechromosomen inkubiert. Die Kerne wurden gegengefärbt mit 4 ', 6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) und Objektträger wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht (Leica CW-4000).
Mutationsanalyse von KRAS
und PIK3CA

amplifizierte genomische Fragmente wurden entweder direkt sequenziert oder subkloniert unter Verwendung des TOPO TA-Cloning Kit (Invitrogen) und dann sequenziert. Mindestens zehn Klone aus zwei unabhängigen PCR-Assays pro Locus wurden unter Verwendung von M13 Vorwärts sequenziert und Reverse-Primer (Invitrogen). Die Sequenzen der Primer für die Amplifikation von KRAS
(Exons 1 und 2) und PIK3CA
(Exons 9 und 20) gezeigt in Weitere Datei 6.
Immunoblot-Analyse verwendet
Cells in Lysis lysiert Puffer 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) Puffer, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 10% Glycerin, 10 mM NaF, 1 mM Natriumvanadat, 50 mM β-Glycerophosphat, 1 mM phenylmethansulfonyl fluoridhaltiger , 1 mM Dithiothreitol und einen Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche, Mannheim, Deutschland). Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch Elektroblotting auf eine Immobilon-P-Membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Die Membranen durch Immunoblot analysiert wurden die folgenden Antikörper verwendet werden, wie angegeben: monoklonaler Maus-anti-K-Ras, -NRAS und -HRAS Antikörper (sc-30, sc-31 und SC-29, jeweils, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-Aktin-Antikörper (Millipore); polyklonalen Kaninchen-anti-p44 /42 MAP-Kinase, -phosho-p44 /42 MAP-Kinase (Thr202 /Tyr204), -Akt und -phospho-Akt (Ser473) Antiseren (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA).
GTP-RAS-Pull-Down-Assay
Die Aktivierung von RAS wurde mit einem EZ-Detect Ras Aktivierung Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) nachgewiesen. Kurz gesagt, Zellysat (500 ug) wurde mit immobilisiertem Raf1 Ras-Bindungsdomäne an Glutathion S-Transferase (GST-Raf1-RBD) fusioniert inkubiert. Niederschläge wurden 3-mal gewaschen, und gebundene Proteine ​​wurden durch Kochen für 5 Minuten (min) eluiert. Proteine ​​wurden auf einem 12% Polyacrylamid-Gel aufgetrennt, transferiert auf eine Immobilon-P-Membran, und einer Immunoblot-Analyse unter Verwendung von anti-K-Ras, -NRAS oder -HRAS Antikörper.
RNA Interferenz
eine anwendungsspezifische KRAS
siRNA (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 '), Frankreich, dass eine Region von KRAS-Targeting ist nicht mit bekannten onkogenen Mutationen verbunden sind, von Dharmacon (Lafayette, Co, USA) synthetisiert. siRNAs Targeting LRMP
, LYRM5
und CASC1
von Ambion erworben wurden (No.144181, 284911 und 147715). Eine universelle Nicht-Targeting-siRNA (unspezifische Kontrolle VII, Dharmacon) wurde als Negativkontrolle verwendet. In jedem Versuch wurden 5 x 10 6 Zellen mit 7,5 ul 20 uM siRNA durch Elektroporation transfiziert wurden (Amaxa, Köln, Deutschland) unter Verwendung Nucleofector Kit V oder T, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Zellproliferationstest
Nach der Transfektion mit siRNAs, die Magenkrebszelllinien HSC45, MKN1, AGS und NUGC4 bei einer Dichte von 8000 Zellen /100 &mgr; l in Standardmedium in 96-Well-Platten ausgesät wurden 10% FCS enthielt. Die Zellzahl bei 48, 72 und 96 h nach der Transfektion wurde indirekt durch kolorimetrischen Assay unter Verwendung von Zellzählung Kit-8-Lösung (Dojindo, Kumamoto, Japan) bestimmt. Der Assay beruht auf der Reduktion eines Tetrazolium-Salzes ([2- (2-methoxy-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2-tetrazolium, Mononatriumsalz], WST -8) und wird als Maß der lebenden Zellen verwendet. Die Absorption jeder Vertiefung bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenleser (Modell 680, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gemessen.
Zytometrie Durchflusszytometrie
Strömung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [27]. Kurz zusammengefaßt wurden anhaftende und abgelösten Zellen geerntet, in 90% kaltem Ethanol fixiert, mit RNase A (500 Einheiten /ml) behandelt und dann mit Propidiumiodid (50 ug /ml) gefärbt. Für jede Probe wurden 30000 Ereignisse mit Hilfe der Zellzyklus-Analyse-Plattform von FlowJo Programm (Baum Star, Ashland, OR, USA) analysiert.
Immunhistochemie
Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Schnitte von Magentumoren wurden entparaffiniert, hydratisiert und dann mit Peroxidase-Blockierungslösung (3% H 2 O 2 in Methanol) behandelt. Die Schnitte wurden für 10 min in Demaskierungslösung (Dako, Glostrup, Dänemark) bei 105 ° C im Autoklaven behandelt. Die Schnitte wurden mit einem Maus-Antikörper, anti-K-Ras inkubiert. (1: 100 Verdünnung; Santa Cruz Biotechnology) für 1 h bei Raumtemperatur, und die Immunreaktivität wurde unter Verwendung ENVISION-Plus-Reagenzien (Dako) detektiert
Ergebnisse
Digitale Genom-Scanning und Charakterisierung von virtuellen Tags in silico
Digitale Genom-Scanning (DGS) ist eine Methode zur Quantifizierung der Anzahl der Genkopien durch kurze genomische DNA-Fragmente Aufzählen (bezeichnet als echte Tags), die experimentell durch Mbo
I Endonucleaseverdauung erzeugt werden (Abbildung 1a). Um die komplizierten Schritte beseitigen in Tag Vorbereitung beteiligt sind, befinden wir rechnerisch die kurze DNA-Fragmente, die durch einzelne Restriktionsenzymverdau mit Mbo
I erzeugt werden, die die 4-bp-Sequenz GATC erkennt. In silico
Verdauung des menschlichen Genoms von Mbo
I etwa 1,6 Millionen Restriktionsfragmente hergestellt (bezeichnet als virtuelle Tags) im Bereich von 20 bis 130 bp (Weitere Datei 7a). Nucleotid-Sequenz-Analyse zeigte, dass etwa 65% der virtuellen Tags repetitive Sequenzen enthalten, wie in der öffentlichen Datenbank von Wiederholungselemente (Zusatzdatei 7a) definiert ist. Wichtig ist, dass das menschliche Genom-Datenbank ergab, dass etwa 85% der virtuellen Tags zugewiesen eindeutig präzise chromosomale Stellen (Zusätzliche Datei 7b, c) passende Sequenz. Selbst wenn die virtuelle Tags repetitiven Sequenzen in Teil umfassen, etwa 80% der sich wiederholenden Tags erwies sich eindeutig sein. Der durchschnittliche Abstand zwischen zwei einzigartigen virtuellen Tags von 30 bis 60 bp in der Länge betrug 7,6 kb, die mittlere Abstand betrug 4,5 kb und 97,8% der Intervalle waren kürzer als 30 kb (Zusatzdatei 7d). Ähnliche Eigenschaften tag Intervall für virtuelle Tags den Bereich von 70 bis 100 bp wurden beobachtet (durchschnittliche Entfernung, 7,9 kb; mittlere Abstand, 4,8 kb; 97,4% als 30 kb kürzer waren), und 100 bis 130 bp (durchschnittliche Entfernung, 7,9 kb; mittlere Entfernung, 4,9 kb;.. 97,4% waren kürzer als 30 kb (Weitere Datei 7e, f) Ferner war die Dichte der einzigartigen virtuellen Tags nahezu gleich in jedem Chromosom (Weitere Datei 7 g) Diese in silico
Befunde legen nahe, dass die Mehrheit der kurzen Mbo
ich Tags informativ für DGS wäre. Abbildung 1 DGS und Vorbereitung der realen Tags. (a) Schematische Darstellung der DGS. Farbige Kästen stellen genomische Mbo
ich echte Tags. Details siehe Text. (b und c) Zubereitung (b) und Charakterisierung (c) des realen Tags. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von genomischer DNA aus MKN1 sind Magenkrebszellen gezeigt. (b) kurze Fragmente von Mbo
I-verdauter genomischer DNA (30 bis 60 bp) wurden aus einem Agarosegel (i), verkettete und subkloniert elektroeluiert. Resultierende wurden rekombinante Plasmide, die die erste Bibliothek (ii) zu erzeugen gepoolt. Lange Concatemeren (140 bis 800 bp) wurden aus der 1. Bibliothek Vektoren ausgeschnitten, elektroeluiert (iii), verkettete und subkloniert. Die resultierenden rekombinanten Plasmide stellen zweite Bibliothek Klone (iv). Die Anzahl der Tags in jedem Klon enthalten ist, an der Oberseite jeder Bahn angezeigt. Einsätze wurden geprüft durch Xho
I /Sac
ich in Platten Verdauung (ii) und (iv). *, Vektor-Fragmente; **, Spe
I /Pst
I Verdauung des Polylinker ohne Einsatz. (C) Die tatsächliche Anzahl der realen Tags aus der zweiten Bibliothek wird in dem Histogramm (links) gezeigt, und ihre Eigenschaften zusammengefasst werden (rechts).
DGS-Simulation in silico
Die Fähigkeit von DGS Genom nachzuweisen -weite Veränderungen beruht auf Genomeigenschaften, wie beispielsweise die Kopienzahl und der Größe der Änderung und der Anzahl von realen Variablen aus Sequenzanalyse erhalten. Um die Größe der Veränderung vorherzusagen, die zuverlässig detektiert werden kann, eine feste Anzahl von rechentechnisch abgetastete Tags gegeben verwendeten wir Monte-Carlo-Simulation eine positive prädiktive Wert (PPV) zu berechnen, die die Wahrscheinlichkeit ist, dass ein erkannter Veränderung eine echte Veränderung darstellt. Zum Beispiel fanden wir, dass eine Analyse von 5000 Tags zuverlässig eine 10-fache Verstärkung von 500 kb, eine homozygote Deletion von 7,5 Mb oder eine einzelne Kopie Verlust eines 30 Mb Region erkennen konnte, konnte aber eine subchromosomalen gewinnen kleinere nicht erkennen als 30 Mb (Weitere Datei 8). Sowohl die Sensitivität und Spezifität dieser Arten von Änderungserfassungs waren > 99% in Fällen mit hoher PPVs (> 90%)., Die ergab, dass weder ein begrenzender Faktor in dieser Analyse war (Daten nicht gezeigt)
Herstellung von echte Tags aus humanen genomischen DNA
Für DGS der Magenkrebszelllinien HSC45 und MKN1 stellten wir Bibliotheken von echten Tags aus genomischer DNA, wie in 1a gezeigt. Die Mbo
I-verdaute genomische DNA wurde Größe fraktioniert (30-60 bp) und Concatemerisierungsreaktion zogen, gefolgt von Bau einer zweiten Bibliothek, die ca. 10 echte Tags pro Klon enthalten (Abbildung 1b). Nucleotid-Sequenzanalyse der realen Tags ergab, dass 85,8% auf einzigartige Positionen abgebildet, die mit unserer Charakterisierung der virtuellen Tags (Abbildung 1c) übereinstimmte.
Vergrösserungen auf Chromosom 12p in HSC45 Magenkrebszellen
Die genomweite Tag Dichteprofil von HSC45 Zellen wurde mit insgesamt 5.462 einzigartigen realen Tags bestimmt. Um eine hohe Auflösung und Empfindlichkeit mit den experimentellen Daten erhalten, nutzten wir Fenstergrößen von 1000 bis 2100 virtuelle Tags (etwa 2300 kb und 4700 kb) für die Analyse von Amplifikationen und Deletionen, respectively. Die Tag-Dichteverhältnis wurde als die Summe der realen Tags berechnet durch die durchschnittliche Anzahl der realen Tags in gleich großen Fenster im gesamten Genom verteilt, in dem die normale Tag-Dichteverhältnis als 1,0 definiert wurde. Wir identifizierten verschiedene subchromosomalen Bereiche erhöhter Tag Dichte bei 8q24.21, 12p12.1 und 12p13.33 und verringert bei 9p21.3 Tag Dichte und dem langen Arm von Chromosom 18 (Abbildung 2, zusätzliche Datei 9a-d). Die Bereiche erhöhter tag Dichte (12p12.1, 12p13.33 und 8q24.21) enthalten KRAS
, CACNA1C
(Calciumkanal, spannungsabhängigen, L-Typ, alpha-Untereinheit 1c) und MYC
loci, respectively. Southern-Blot-Analyse bestätigte, dass KRAS
und MYC
HSC45 Zellen (Weitere Datei 9e) verstärkt wurden. Jede quantifiziert Kopienzahl als Wechsel von quantitativen real-time PCR (qPCR) der genomischen DNA bestimmt war bemerkenswert ähnlich, dass schätzungsweise DGS wenn die Fenstergröße für die Analyse Tag Dichte wurde auf die Größe jeder Änderung angepasst (Zusätzliche Datei 9a-d ). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Tag-Dichteanalyse von DGS verwendet werden könnten, Kopienzahl-Analyse im gesamten menschlichen Genom durchzuführen. Abbildung 2: Nachweis von erhöhten Kopienzahl auf den Chromosomen 8Q und 12p von DGS in HSC45 Magenkrebszellen. (A) Ein Gesamtgenom-Ansicht des Tags Dichteverhältnis in HSC45 Zellen (ein Fenster von 1000 virtuellen Tags verwenden), wie von DGS bestimmt. Die Werte auf der y-Achse zeigen fold changes in Tag-Dichte im Verhältnis zur durchschnittlichen Tag Dichte des gesamten Genoms, und repräsentieren den DNA-Gehalt pro haploiden Genom, in den Fenstern. Die x-Achse stellt die Chromosomenzahl. (B und c) vergrößerte Ansicht Tag Dichteverhältnisse auf den Chromosomen 8 (b) und 12 (c). In jeder Tafel zeigt die obere Kurve, die eine Ganz Chromosoms Ansicht des Tags Dichteverhältnis (basierend auf einem Fenster von 1000 virtuellen Tags). Der untere Graph zeigt eine erweiterte Ansicht 8q24.21 und 12p12.1, in denen Tag-Dichte erhöht wurde unter Verwendung von Fenstern von 1000 und 500 virtuelle Tags detektiert. Einzigartige echte Tags werden als schwarze vertikale Balken angezeigt werden, und einzigartige virtuelle Tags werden in blau (60 bp oder kürzer) oder hellblau (mehr als 60 bp) Bars in dichten Modus angezeigt. Die Positionen der RefSeq Gene, mit einigen Splicing-Isoformen weggelassen, sind am unteren Rand der unteren Platte.
Amplifikation von KRAS
bei Magenkrebs-Zelllinien
Analyse von 26 Loci innerhalb und unmittelbar flankierenden Chromosom 12p12 gezeigt. 1 in HSC45 Zellen durch qPCR demonstriert, dass eine Region von etwa 500 kb, das die K-Ras
Genlocus enthalten, amplifiziert (8-fache Verstärkung, Abbildung 3a). Genomic qPCR Screening entdeckt KRAS
Verstärkung in zwei zusätzliche Magenkrebszelllinien, SH101P4 (18-fach) und MKN1 (13-fach) (3a), während wir nicht Amplifikation von mehr als 4-fach erkannt wurde in 17 anderen Magenkrebs-Zelllinien, oder in 10 Darmkrebs und 11 Pankreaskrebszelllinien (aufgeführt in den weiteren Datei 1, Daten nicht gezeigt). DGS erfasst auch Verstärkung des Locus
KRAS in MKN1 Zellen (Weitere Datei 10). Die benachbarten Gene von KRAS
in der minimal-Amplikon waren LRMP
(lymphatischen-restricted Membranprotein), CASC1
(Krebsanfälligkeit Kandidat 1) und LYRM5
(LYR Motiv enthält 5). BCAT1
(verzweigtkettiger Aminotransferase 1, cytosolischen) wurde ebenfalls in SH101P4 und MKN1 Zellen amplifiziert, aber nicht in HSC45 Zellen. Wir haben bestätigt, dass CACNA1C
in HSC45 Zellen amplifiziert wurde, aber nicht in den anderen Magen-, Darm- oder Pankreaskrebszelllinien unter Verwendung von genomischer qPCR-Analyse (Weitere Datei 9b; Daten nicht gezeigt). Weder NRAS
, HRAS
noch BRAF
Amplifikationen wurden in den oben genannten Krebszelllinien durch genomische qPCR-Analyse nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Die Verstärkung von KRAS
wurde auch durch Zweifarben-FISH-Analyse überprüft, in denen die KRAS
Amplikon zeigte sich als homogen gefärbten Region in HSC45, SH101P4 und MKN1 Zellen (Abbildung 3b). Abbildung 3 Genamplifikation von KRAS in Magenkrebszellen. (A) Quantitative genomische PCR-Analyse des Locus
KRAS bei 12p12.1 in HSC45 Zellen. Diskrete Amplifikationen bei 12p12.1 in zwei anderen Magenkrebs-Zelllinien wurden ebenfalls nachgewiesen (SH101P4 und MKN1). DNA-Kopienzahl im Vergleich zu normalen DNA diploiden Leukozyten wurde gegen chromosomale Nukleotidposition aufgetragen (in Megabasen). Die Positionen der RefSeq Gene in den entsprechenden Regionen werden in der untersten Karte angezeigt. Die minimale Verstärkungsbereich, die für alle drei Magenkrebszelllinien wird durch die orangefarbene Balken dargestellt. (B) Metaphase (links) - und Interphase (rechts) -Fish Analyse des verstärkten KRAS
Locus bei Magenkrebs-Zelllinien. Die KRAS
-spezifischen Sonde ist in gelb, und die Kontrollsonde, die spezifisch für den langen Arm des Chromosoms 12, ist in rot. Tetraploidie in HSC45 und Triploidie in SH101P4 und MKN1 Zellen beobachtet. (C) Quantitative real-time RT-PCR-Analyse von KRAS
mRNA-Expression in Magenkrebszellen mit 12p12.1 Verstärkung. Expressionsanalyse von Genen (KRAS, LRMP, CASC1
und LYRM5
) innerhalb des minimalen Amplikon gelegen und BCAT1
, die die minimale Amplikon Flanken wurde real-time RT-PCR durchgeführt werden. Expressionsniveaus wurden auf GAPDH
mRNA normalisiert und sind als Farbverlauf, relativ zu normalen Magen dargestellt. Die Gen-Amplifikation und Mutation (Codon 12 bzw. 13) Status des KRAS
für jede Probe ist in den beiden rechten Spalten zusammengefasst. Gefüllte Kreise das Vorhandensein von Amplifikation oder Mutation von KRAS
zeigen, und offene Kreise zeigen keine Verstärkung oder keine Mutation des KRAS
.
Sequenzanalyse von KRAS
(Weitere Datei 11a) zeigten, dass sowohl HSC45 und SH101P4 Zellen beherbergten eine Mutation in Codon 12, die in K-Ras (GGT GTT →, G12V) in einer einzigen Aminosäuresubstitution resultiert, während MKN1 Zellen KRAS
Mutationen fehlten. Die Anwesenheit von KRAS-Mutationen
in AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) und HCT116 (G13D) Zellen wurde bereits berichtet [28, 29]. Von den zehn PCR-Klone von KRAS
HSC45 und SH101P4 Zellen, die Mutations-Analyse unterzogen wurden, acht und drei bzw. 12. Des weiteren Mutationen in Codon beherbergte, genomische real-time PCR-Analyse unter Verwendung von Sonden, die auf Wild spezifisch waren -Typs und mutierten KRAS
Allele (Weitere Datei 11b) zeigte auch, dass HSC45 und SH101P4 Zellen enthalten verschiedene Anteile des mutanten Allels (80% und 50% betragen). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Amplifikation eines mutierten KRAS
Allel tritt auch in HSC45 und SH101P4 Zellen.
Nächstes untersuchten wir das Niveau von KRAS
mRNA in KRAS
-amplified Magenkrebszellen durch quantitative real -Zeit RT-PCR (qRT-PCR) (Abbildung 3c). Die Pegel der KRAS
mRNA korrelierte signifikant mit KRAS
Kopienzahl. Die benachbarten Gene LYRM5
und CASC1
, die der minimal Amplikon lokalisiert wurden auch auf höheren Ebenen in Zellen mit Verstärkung ausgedrückt als auf Zellen, ohne Verstärker (Abbildung 3c) verglichen. Interessanterweise wurde LRMP
in Krebszellen-down reguliert, im Vergleich zum normalen Magenzellen. Immunoblot-Analyse von RAS-Proteine ​​(4a) zeigte, dass die Expression von KRAS erhöht wurde in KRAS
-amplified Magenkrebszellen (HSC45, SH101P4 und MKN1), während weder NRAS noch HRAS stark exprimiert wurden (Abbildung 4a; Daten nicht gezeigt ). Obwohl die Expression von-7c lassen und let-7 g microRNAs wurde gemeldet RAS Ausdruck zu regulieren [8], wir eine geringe Korrelation der Expression dieser microRNAs mit KRAS-Protein-Spiegel (Weitere Datei 12) gefunden, die vorgeschlagen, dass KRAS-Überexpression bei Magenkrebs Zelllinien ist vor allem auf genomische Amplifikation von KRAS
. Abbildung 4 Überexpression von KRAS und differentiellen Aktivierung von KRAS, p44 /42 MAP-Kinase und AKT in KRAS -amplified Magenkrebszellen. (A) Immunoblot Analyse der Expressionsniveaus von KRAS und die NRB in Krebszellen. Actin-Expression wurde als Ladekontrolle analysiert. (B) Die Grundniveau der GTP-KRAS war ausgesprochen hoch im Magenkrebszellen mit verstärkten mutierten KRAS
(HSC45 und SH101P4). Gesamt-Lysat (500 &mgr; g) wurde zu einer GTP-RAS-Pulldown-Assay unterzogen und GTP-K-Ras und GTP-NRAS wurden durch Immunoblot unter Verwendung von Anti-K-Ras und anti-NRAS Antikörper bzw. detektiert. Gesamt-Zelllysat (50 ug) wurde parallel zur Bestimmung der Höhe der Expression von KRAS und die NRB in Zellen analysiert. (C) GTP-KRAS wurde nach Serumstimulation in MKN1 Zellen erhöht. Zellen wurden in reguläre Medium mit 10% FCS (N), Serum-ausgehungert für 24 h (-) oder Serum-ausgehungert dann mit 10% FCS stimuliert für 1 h (+). Gesamt-Zell-Lysat wurde auf eine GTP-KRAS Pull-down-Assay unterzogen. (D) Die Aktivierung von p44 /42 MAP-Kinase und AKT in Serum-ausgehungert oder stimulierten Magenkrebszellen. Insgesamt Zelllysat wurde für Figur c wie beschrieben analysiert.

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