Naujų metodas, skaitmeninis genomo nuskaitymo aptinka KRAS geno amplifikacija skrandžio vėžio: dalyvavimą ekspresija laukinio tipo KRAS į vartotojų signalizacijos ir vėžio ląstelių augimą

Naujų metodas, skaitmeninis genomo nuskaitymo aptinka kras
genų amplifikacija skrandžio vėžio: dalyvavimas ekspresija laukinio tipo KRAS į vartotojų signalizacijos ir vėžio ląstelių augimą
tezės
Background pervežimas Skrandžio vėžys yra trečias labiausiai paplitęs piktybinis navikas įtakos plačiajai visuomenei visame pasaulyje. Netipinė aktyvavimo KRAS yra pagrindinis veiksnys, daugelio tipų auglių vystymuisi, tačiau onkogeninėmis mutacijos KRAS
yra retas skrandžio vėžio. Mes sukūrėme naujovišką kiekybinė analizės metodą DNR kopijų skaičiaus, vadinama skaitmeninio genomo skenavimą (GD), kuri, remiantis trumpų restrikcijos fragmentų skaičiavimas, ir nėra įtraukti PGR ar hibridizacija. Atsižvelgiant į dabartinę studijų, mes panaudojome IGS apžvelgti kopija numeris pakeitimus skrandžio vėžio ląsteles.
Metodai
IGS skrandžio vėžio ląstelių linijų buvo atliktas naudojant 5000 sekas 15000 restrikcijos fragmentų. Mes tikrinami 20 skrandžio vėžio ląstelių linijas ir 86 pirminės skrandžio navikai dėl kras
stiprinimas kiekybine PGR, ir ištirti kras
amplifikacija ne DNR, iRNR ir baltymų kiekis pagal mutacijos analizė, realaus laiko PGR, Imunoblotingas, GTF -RAS išskleidžiamasis tyrimas ir imunohistocheminis analizė. Iš KRAS poveikis
besisiejančiais žemyn ant P44 /42 MAP kinazės ir AKT ir ląstelių augimui aktyvavimo išnagrinėjo immunoblot bei spalvinėmis testą, atitinkamai.
Rezultatai
IGS analizės HSC45 skrandžio vėžio ląstelių linija atskleidė 500 kb regione stiprinimo chromosomos 12p12.1, kuriame yra kras
genų lokusas. Amplifikacija iš Kras
lokuso buvo aptikta 15% (3/20) skrandžio vėžio ląstelių linijų (8-18 kartų stiprinimo) ir 4,7% (4/86) pirminių skrandžio navikų (8-50 kartų stiprinimas ). Kras
mutacijos buvo nustatyta dviejų iš trijų ląstelių linijų, kuriomis kras
buvo išplėsta, tačiau nebuvo aptikta iš pirminių navikų. Padidėjusi KRAS baltymų koreliuoja tiesiogiai su padidėjusia kras
kopijų skaičiaus. Iš GTP jungiasi KRAS lygis buvo pakilęs po serumo stimuliacija ląstelių su papildyta laukinio tipo KRAS
, bet ne ląstelėse amplifikuotiems mutantas KRAS
. Knock-žemyn KRAS
skrandžio vėžio ląstelių pervežė sustiprina laukinio tipo KRAS
atlikus į ląstelių augimo ir slopinimo P44 /42 MAP kinazės ir AKT aktyvumo slopinimui.
Išvada
Mūsų tyrimas pabrėžia, kad IGS naudingumas siekiant identifikuoti kopija numeris pakitimų. Naudojant IGS, mes nustatyti kras
kaip genų ir kuri yra stiprinama žmogaus skrandžio vėžio. Mes parodė, kad genų amplifikacija greičiausiai sudaro molekulinę pagrindą overactivation iš KRAS skrandžio vėžio. Papildomi tyrimai naudojant didesnį kohortos skrandžio vėžio egzempliorių privalo nustatyti diagnostikos ir gydymo pasekmes kras
stiprinimas ir raiškos.
Faktai
Skrandžio vėžys yra trečias labiausiai paplitęs piktybinis navikas įtakos plačiajai visuomenei visame pasaulyje [1 ]. Specifiniai genetiniai pokyčiai buvo pranešta apie skrandžio vėžio, įskaitant KSAM
papildymą, susitiko parsisiųsti ir erbb2
ir mutacijų p53
, APC
ir CDH1
[2] , Nors pelnas-of-funkcija mutacijos KRAS
keletas iš dažniausiai pastebėtas genetinių pakitimų į navikų, įskaitant kasos (60%), tulžies takų (33%) ir storosios žarnos (32%) įvairovė [3], Šios mutacijos yra retas skrandžio vėžiu (2-7%) [4-7]. Apskritai, anksčiau
mutacijų, susijusių su Tumorigenesis "užrakinti" RAS į aktyvaus GTP-privalo valstybei. GTF-RAS jungiasi prie efektorinE baltymų skaičių skatinti tolesnius signalo perdavimo kelių, tarp kurių RAF-MAP kinazės kaskada ir fosfatidil 3-kinazės (PI3K) -AKT keliai ląstelių augimą ir onkogenezėje yra geriausias būdingas [3]. Ilgai aktyvavimo anksčiau taip pat gali atsirasti per mechanizmus, kurie neapima mutacijas anksčiau. Pavyzdžiui, sumažino išraišką tegul-7 mikro RNR, kurios slopina RAS nukreipiant 3'untranslated regioną Ras
mRNR, dažnai susijęs su didesne anksčiau baltymų lygio navikų [8]. Iki šiol, molekulinius mechanizmus, onkogeninių aktyvavimo anksčiau skrandžio vėžio nebuvo visiškai ištirtas.
Amplifikaoija genomo sekų, kurių sudėtyje yra genų, kurie yra ypač svarbios ląstelių augimas yra vienas iš pirminių mechanizmų aktyvavimo onkogenų į vėžio, ir yra dažnai susijęs su naviko progresavimo, blogos prognozės ir /arba atsparumo vaistams [9]. Iš daugelio metodų, šiuo metu turimų aptikti pločio genomo kopijų skaičiaus pakitimai, dabartinė aukso standartas yra masyvas CGH metodas (aCGH). Per pastaruosius kelerius metus, iš aCGH rezoliucija sparčiai pagerėjo per oligonukleotidų zondų naudojimo ir pranoko, kad aCGH naudojant standartines AKK zondai [10]. Tačiau, aCGH taip pat yra jautrus būdingo triukšmo hibridizacijos pagrindu intensyvumo matavimų, kaip signalo kokybė yra paveikta pasikartojančių sekų ir yra priklausoma nuo zondo kokybės [11]. Iš tiesų, optimizavimas zondo dizainas buvo didelis iššūkis į plytelės masyvai [12, 13].
Skaitmeninis kariotipavimas (DK) buvo sukurtas Wang et al plėtrai. [14], ir neapsiriboja būdingų problemų masyvo metodus. DK apima skaitmeninį sunumeriuoja trumpų fragmentų genomo DNR (vadinami žymių), teikia kiekybinę matavimą DNR kopijų skaičiaus per žyma tankio analizę išilgai kiekvienos chromosomos. DK buvo sėkmingai taikomas įvairiems navikams gydyti, aptikti kopija numeris pakeitimus, įskaitant TYMS
, RSF1
ir OTX2 pervežimas amplifikacijos įvairovę, ir ištrynimas MKK4
ir distrofino
[ ,,,0],15-19]. Nepaisant to, kad DK efektyvumo, tai yra techniškai sudėtinga plačias programas, nes ji apima PGR amplifikacija ir žymeles 21-bazių porų (bp) ilgio tiksliai atstovauti chromosomų vietą interesų kartos.
Mes pranešti čia plėtra naują metodą, vadinamą IGS, kiekybinės analizės kopijavimo skaičius variacijos, kuri yra grindžiama žyma skaičiuojamas sąvokos DK, bet naudoja supaprastintą procesą žyma paruošimo. IGS skrandžio vėžio ląstelių linijų aptikta iš Kras
lokuso chromosomos 12p12.1 stiprinimas. Mūsų rezultatai suteikia molekulinį pagrindą KRAS overactivation ir rodo, kad KRAS pasroviui signalizacijos renginių aktyvavimo gali skatinti skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją.
Metodai
Mobilaus ryšio linijų ir audiniai Viesbutis The ląstelių linijas analizuojamos srovės tyrimas yra išvardyti papildomame faile 1. SSK ir SH101P4 ląstelių linijos buvo įsteigta Kazuyoshi Yanagihara [20]; visi kiti buvo gauti iš Amerikos tipas Kultūros surinkimo ar Japonijos rinkimas tyrimų Bioresources (Tokijas, Japonija). Visi ląstelių linijos buvo auginamos rekomenduojamų žiniasklaida. Stimuliavimui serumo, ląstelės buvo inkubuojamos terpėje, kad trūko serumo už 24 valandas (H), ir po to arba Nestimuliuotų, arba stimuliuojama už 1 h su žiniasklaida, kurių sudėtyje yra 10% serumas iš veršiuko embriono (FCS). Pirminis navikas egzemplioriai buvo gauti iš Chirurgijos departamento Keiyukai Saporo ligoninė, informuoto sutikimo kiekvienam pacientui. Genominės DNR buvo ekstrahuojamas naudojant fenolio-chloroformo metodą, po to RNaze gydymui. Iš viso RNR išskirta naudojant Trizol (INVITROGEN, Carlsbad, CA, JAV), pagal gamintojo instrukcijas. pirko genomo DNR normalių periferinio kraujo leukocitų (Biochain, Hayward, CA, JAV), o bendras RNR nuo normalaus skrandžio gleivinės nuo sveikų asmenų (Biochain ir INVITROGEN). Pirminiai skrandžio vėžio buvo klasifikuojami taikant klinikos ypatybes, kaip parodyta Papildoma failą 2, pasak pTNM klasifikavimo schemą (5-asis leidimas, 1997) [21] ir Lauren anketa klasifikavimo sistemą [22]. Kras
-amplification statusas pagal amžių buvo palyginti naudojant Stjudento t kriterijų; pagal laipsnio, PT statusą, Pn būklę ir ligos stadijos, naudojant Mann-Whitney U testą; ir pagal lytį, histologiją ir Būklė naudojant Fisher tikslų testą. Visi bandymai buvo 2-tailed, ir P
vertė < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.
Skaitmeninės genomo nuskaitymo
Trumpai tariant, 40 mikrogramų genominės DNR buvo atliktas restrikcinė virškinimo naudojant Mbo
I (Takara, Tokijas, Japonija) ir tada atskirti elektroforezės 3% Nusieve GTG agarozės gelio. Trumpi fragmentai (30-60 bp, vadinami realių žymių) buvo electroeluted, sudurtinius ir subklonuotas į Bam pervežimas HI-suardomas pBluescript II KS + (Stratageno, La Jolla, Kalifornija), naudojant Galingasis Sumaišykite DNR perrišimas tirpalo (TAKARA). Escherichia coli
DH10B buvo transformuotos rekombinantinių plazmidžių, transformantai sumaišomos ir plazmidės DNR buvo gryninamas generuoti 1-oji biblioteka. Konkatemerus realių žymeles buvo akcizais apmokestinamos pagal Spe
i /PST
Aš virškinimą nuo 1 biblioteką ir fragmentai iš 140 iki 800 bp diapazone buvo electroeluted, sudurtinius ir subklonuotas į pBluescript II KS + generuoti 2nd biblioteką. Antra biblioteka plazmidės sudėtyje yra konkatemerus SPE
i /pst
i fragmentai buvo sekos naudojant ABI3130 Genetinis analizatorius (taikoma BIOSYSTEMS Foster City, CA, JAV), pagal gamintojo instrukcijas. Unikalūs Nekilnojamasis žymės buvo susietas su žmogaus chromosomų sekas, o žymė tankis, apibrėžiamas kaip realių žymeles virtualaus žymeles santykis per stumiamųlangųturinį buvo apskaičiuojamas aptikti anomalijas DNR turinį, naudojant apibrėžtus IGS modeliavimas ribines vertes. Tag pozicijas ir tegus tankio santykis buvo ryškinamos naudojant pasirinktinius takelius ir genomo Grafikai iš Kalifornijos universiteto Santa Cruz (UCSC) genomas naršyklę (Mar. 2006 užšaldyti, hg18) [23-25]. Išsamios protokolai IGS, virtualus reikšminiais žodžiais apibūdinti ir in silico
modeliavimas yra prieinami Papildoma failą 3.
PGR
Santykinis DNR kopijų skaičiaus nulėmė kiekybinė realaus laiko PGR naudojant SYBR Green Kiekybinis realiu laiku PGR pagrindinio mišinio (Applied Biosystems) ir ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). DNR kiekis už haploidinio genomo buvo normalizuotas, kad pasikartojančio elemento, "Line-1, ir apskaičiuojamas lyginamosios KT (ΔΔCT) santykinis kiekybinis metodas, naudojant formulę 2 (NT UAB - nline
) - ( xt UAB - Xline
), kur N
T
yra slenkstinis ciklas skaičius stebėti eksperimentinį gruntas normaliai leukocitų DNR, n
linija
yra slenkstinis ciklas skaičius pastebėta Line-1 gruntas normaliai leukocitų DNR, XT
yra vidutinė riba ciklas skaičius pastebėta eksperimentinės gruntuotos vėžio ląstelių DNR ir X
linija
yra vidutinis riba ciklas skaičius pastebėta Line-1 gruntuotos vėžio ląstelių DNR [14]. Genominės amplifikacija buvo apibrėžtas kaip didesnis nei 4 kartus didesnis už DNR kiekį. Grunto sekų Kiekvienas lokusas yra prieinami Papildoma failą 4. Alelių proporcingai mutanto kras
(G12V, GGT → GTT) nulėmė dirba keistas realaus laiko PGR procedūrą pagal Itabašis kt
[26 ]. Išsamus protokolas yra prieinama papildomų failų 3. kDNR buvo pagamintas naudojant Superscript III atvirkštinės transkriptazės (AT, Invitrogen), ir lygis mRNR kiekvieno geno buvo nustatomas pagal realaus laiko RT-PGR naudojant TaqMan genų ekspresijos, Analizės (Applied Biosystems) , Santykiniai iRNR kiekis buvo apskaičiuojamas lyginamosios KT metodu, naudojant GAPDH
kaip endogeninio kontrolę. Grunto /zondas aibes rodomi papildomų failų 5.
fluorescencijos in situ hibridizacijos (FISH
) pervežimas AKK, kuriuose rasta kras
lokusas (RP11-636P12) ir chromosomų 12q24.2 (RP11 -91M21) buvo paženklinti Cy3 ir Cy5, atitinkamai, ir inkubuojami su paruoštų skaidrių su interfazės ir metafazėje chromosomų. Branduoliai buvo Skaitliukas tamsintas su 4 ", 6-diamino-2-fenilindolo (DAPI) ir skaidres buvo analizuojami naudojant fluorescencijos mikroskopijos (" Leica CW-4000).
Mutacijos analizė KRAS parsisiųsti ir PIK3CA

amplifikuoti genomikos fragmentai buvo arba sekos tiesiogiai, arba subklonuotas naudojant TOPO TA-klonavimo rinkinį (Invitrogen) ir tada sekos. Bent dešimt klonų iš dviejų nepriklausomų PGR per lokuso sekos buvo naudojant M13 pirmyn ir atgal pradmenis (INVITROGEN). Pradmenų sekas naudojamas amplifikacija kras
(egzonų 1 ir 2) ir PIK3CA
(9 ir 20 egzonų) rodomi papildomų failų 6.
Imunoblotingas
Ląstelės buvo lizuoti į lizės buferis, kuriame yra 20 mM Tris-HCl (pH7.5) buferio, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X, 10% glicerolio, 10 mM, NBS, 1 mM natrio vanadato, 50 mM β-glicerofosfato, 1 mM phenylmethansulfonyl fluoridas , 1 mM ditiotreitolo, ir proteazės inhibitorius kokteilis (Roche, Mannheim, Vokietija). Baltymai buvo atskirtos SDS-PAGE ir electroblotted jį į Immobilon-P membranos (Millipore ", BILLERICA, MA, JAV). Membranos buvo analizuojami immunoblot naudojant šiuos antikūnus, kaip nurodyta: pele monokloninis anti-Kras -NRAS ir -HRAS antikūnų (SC-30, SC-31, SC-29, atitinkamai, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); Anti-aktino antikūnas (Millipore); triušis polikloninis Anti-P44 /42 ŽEMĖLAPIS kinazės, -phosho-P44 /42 ŽEMĖLAPIS kinazės (Thr202 /Tyr204), -Akt ir -phospho-Akt (Ser473) imuniniai serumai (Mobilusis Signalizacijos įranga, Danvers, MA, JAV).
GTF-RAS išskleidžiamasis tyrimas
Ras aktyvavimo buvo aptiktas naudojant EZ-Detect Ras aktyvinimo rinkinį (Pierce, Rockford, IL, JAV). Trumpai tariant, ląstelių lizato (500 mikrogramų) buvo inkubuojama su Sustabdyto Raf1 Ras surišančio domeno kondensuoto glutationo S-transferazės (PVM-Raf1-RBD). Nuosėdos plaunamos 3 kartus, ir sąlygotos baltymai buvo išplaunami virinant 5 minutes (min). Baltymai buvo išspręsta 12% poliakrilamido gelyje, perkeliamas į Immobilon-P membranos ir taikomos Imunoblotingas naudojant anti-Kras -NRAS, ar -HRAS antikūnai.
RNR interferencija
pasirinktinį suprojektuoti KRAS
siRNR (5'-AGAGUGCCUUGACGAUACAdTdT-3 "), skiriant nuo KRAS regionas
, kad nėra susijęs su žinomais onkogeniniam mutacijų, buvo susintetintas Dharmacon (Lafayette, Co, JAV). siRNAs skirtos LRMP
, LYRM5 parsisiųsti ir CASC1
buvo perkamos iš Ambion (No.144181, 284911 ir 147715). Universalus ne orientacija siRNA (nespecifinis kontrolė VII Dharmacon) buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Kiekvieno eksperimento metu, 5 × 10 6 ląstelės buvo pernešta su 7,5 įxL 20 mkm siRNA elektroporacijos (Amaxa, Kelnas, Vokietija), naudojant Nucleofector komplektas V arba T, pagal gamintojo instrukcijas.
Ląstelių proliferacija tyrimas
po transfekciją su siRNAs, skrandžio vėžio ląstelių linijų HSC45, MKN1, AGS ir NUGC4 buvo sėklomis 96 duobučių lėkštelėse esant 8000 ląstelių /100 iL į standartinę terpę, turinčią 10% FCS tankis. Mobilusis skaičių 48, 72 ir 96 h po transfekciją buvo nustatomas netiesiogiai, taikant kolorimetrinę tyrimą naudojant Mobilusis Skaičiavimo Kit 8 tirpalas (Dojindo, Kumamoto, Japonija). Analizė yra pagrįsta dėl tetrazolio druskos ([2- (2-metoksi-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfofenil) -2-tetrazolio, mononatrio druska], wst mažinimo -8) ir yra naudojamas kaip gyvų ląstelių priemonės. Kiekvieno pat esant 450 nm absorbcijos buvo matuojamas naudojant microplate skaitytojui (modelis 680, Bio-Rad, Hercules, CA, JAV).
Tėkmės citometrijos
tėkmės citometrijos buvo atliktas taip, kaip aprašyta anksčiau [27]. Trumpai, adhezinės ir atskirti Ląstelės buvo surinktos, nustatyta iš 90% šaltame etanolyje, veikiama RNaze A (500 vienetų /ml), ir vėliau yra nudažomi su propidiumo jodido (50 mikrogramų /ml). Kiekvienam mėginiui 30000 įvykiai buvo analizuojami naudojant ląstelių ciklo analizė platformą FlowJo programos (medis žvaigždė, Ashland, OR, JAV).
Imunohistocheminis
formalinu fiksuoto, parafino-embedded skyriai skrandžio navikų deparaffinized, hidratuotas , ir po to yra veikiamas peroksidazės blokuoja tirpalo (3% o 2O 2 metanolyje). Dalys buvo autoklavinio esant 105 ° C temperatūroje 10 min, į kurią pakartotinio tirpalo (Dako, Glostrup, Danija). Skyriai buvo inkubuojamos su pelės anti-KRAS antikūnų. (1: 100 skiedimo; Santa Cruz Biotechnology) 1 val kambario temperatūroje, ir reaktyvumas buvo aptiktas naudojant ENVISION plius REAGENTAI (DaKo)
rezultatai
Digital genomo nuskaitymo ir charakterizavimas virtualių žymeles silico pervežimas pervežimas Skaitmeninis genomo nuskaitymo (GD) yra kiekybiniam genų kopijos numeris išvardijant trumpus genomo DNR fragmentus metodas (vadinama realios žymes), kurie generuoja eksperimentiškai MBO
i endonukleazės virškinimui (1a pav.) Norėdami pašalinti sudėtingus etapus žyma rengimo, mes skaičiavimais būdingas trumpas DNR fragmentus, kurie gaminami vienu restrikcijos fermentų virškinimui su MBO
I, kurioje pripažįstama, kad 4-BP seka GASK. Be silikochromatas pervežimas virškinimui žmogaus genomo pagal MBO
Aš pagamintos maždaug 1,6 mln restrikcijos fragmentų (vadinamas virtualus žymes) Atsižvelgiant į 20-130 bp (Papildoma failą 7a) diapazone. Nukleotidų sekos analizė parodė, kad maždaug 65% virtualių žymeles esančius pasikartojančių sekų, kaip apibrėžta viešosios duomenų bazės pakartoti elementų (Papildoma failą 7a). Svarbu tai, kad seka atitikimo žmogaus genomo duomenų bazėje parodė, kad maždaug 85% virtualių žymeles unikaliai susietas su tiksliais chromosomų vietose (Papildoma failą 7b, C). Net jei virtualūs žymės yra pasikartojančių sekų iš dalies, maždaug 80% iš pasikartojančių žymių pasirodė esąs unikalus. Vidutinis atstumas tarp dviejų unikalių virtualių žymeles 30 iki 60 bp ilgio buvo 7,6 KB, vidutinis atstumas buvo 4,5 KB ir 97,8% intervalų buvo trumpesnis nei 30 kb (Papildoma failą 7d). buvo pastebėtas Panašūs žymė intervalas charakteristikos virtualių žymeles svyruoja nuo 70 iki 100 bp (vidutinis atstumas, 7.9 KB; vidutinis atstumas, 4.8 KB; 97,4% buvo trumpesnis kaip 30 KB), ir 100 MHz iki 130 bp (vidutinis atstumas, 7.9 KB; vidutinis atstumas, 4.9 KB;.. 97,4% buvo trumpesnis nei 30 kb (Papildoma failą 7e f) Be to, unikalių virtualių žymeles tankis buvo apylygis kiekvienoje chromosomoje (Papildoma failą 7g) Šios in silico pervežimas išvadų teigiama, kad trumpųjų MBO dauguma
i žymės būtų informatyvus IGS. 1 pav IGS ir rengti nekilnojamojo žymes. (A) plANAS IGS. Spalvotas dėžės atstovauti genomo MBO
i Nekilnojamasis žymes. Žr tekstą detales. (b ir c) paruošimas (b) ir charakteristikos (c) iš realiame žymės. atstovas rezultatus, gautus naudojant genomo DNR nuo MKN1 skrandžio vėžio ląstelės parodyta. (b) nustatomi trumpi fragmentai Mbo
i-suardomas genominės DNR (30-60 bp) buvo electroeluted iš agarozės gelyje (i), sudurtinius ir subklonuotas. Gaunami rekombinantinės plazmidės buvo imami mėginiai generuoti 1-oji biblioteka (ii). Ilgos konkatemerus (140 į nei 800 bp,) buvo pašalintų nuo 1 bibliotekų vektorių, electroeluted (III), sudurtinius ir subklonuotas. Susidarę rekombinantinės plazmidės atstovauja 2nd bibliotekos klonai (iv). Iš žymės esančias kiekviename klonas skaičius yra atvaizduojamas kiekvieno juostos viršuje. Intarpai išnagrinėjo Xho
i /Sac
i virškinimą plokštės (II) ir (iv). *, vektorines fragmentai; **, Spe
Aš /pst
i virškinimą iš kelių klonavimo svetainėje be įdėklo. (C) Tikrasis skaičius realių žymeles iš 2-ojo bibliotekoje rodomas histogramos (kairėje) ir jų savybės yra sutraukta (dešinėje).
IGS modeliavimas silicinio
IGS gebėjimą aptikti genomą masto: pokyčiai yra pagrįstas genomo charakteristikas, pavyzdžiui, kopijų skaičiaus ir apie pakeitimo dydžio, ir realiame žymės, gautų iš sekos analizės numeris. Prognozuoti pakeitimo dydį, patikimai galima nustatyti žinant nustatytą skaičių skaičiavimais atrinktų žymeles, mes panaudojome Monte Karlo modeliavimo apskaičiuoti teigiamą prognostinė vertė (PPV), kuri yra tikimybė, kad aptiktas pakeitimas atspindi tikrą pakeitimą. Pavyzdžiui, mes nustatėme, kad 5000 žymeles analizė gali patikimai aptikti 10 kartų amplifikacija 500 KiB, homozigotinę naikinimui 7,5 Mb, arba vienu egzemplioriumi praradimo 30 Mb regione, bet negalėjo aptikti subchromosomal įgyti mažesnis nei 30 MB (Papildoma failų 8). Tiek jautrumas ir specifiškumas nustatant šias pakeitimo rūšys buvo > 99% tais atvejais, su aukštais PPVs (> 90%)., Kuris nurodė, kad nei buvo ribojantis veiksnys šioje analizėje (nerodomas duomenys)
paruošimas Nekilnojamasis žodžius iš žmogaus genomo DNR
IGS skrandžio vėžio ląstelių linijas HSC45 ir MKN1, mes pasirengę bibliotekų realių žymeles iš genomo DNR, kaip parodyta 1a pav. (1b paveikslas) MBO
i-suardomas genomo DNR buvo dydis-frakcionuotas (30-60 bp) ir veikiamas concatemerization, po statybai 2nd biblioteka, į kurią buvo įtrauktas maždaug 10 realių žymes klonus. Nukleotidų sekos analizė realių žymeles parodė, kad 85,8% priskiriama unikalių pozicijas, kuri buvo suderinta su mūsų apibūdinimo virtualių žymės (1c pav.)
Papildymą chromosomoje 12p į HSC45 skrandžio vėžio ląstelių
genomo tag tankis profilis HSC45 ląstelių buvo nustatomos naudojant keletą 5,462 unikalių realių žymeles iš viso. Norėdami pasiekti aukštą raišką ir jautrumą su eksperimentiniais duomenimis, mes naudojamas langų dydžių 1000 ir 2100 virtualių žymės (apie 2300 kb ir 4700 KB) į papildymą ir trynimų analizę, atitinkamai. Žyma tankis santykis apskaičiuojamas kaip realių žymeles, padalytas iš vidutinio skaičiaus nekilnojamojo žymeles pačių dydžio langus visoje genomo, kurioje normalus žymė tankis santykis apibrėžiamas kaip 1,0 suma. Mes nustatyti skirtingas subchromosomal regionus išaugo žyma tankumas 8q24.21, 12p12.1 ir 12p13.33 ir sumažėjo tag tankį 9p21.3 ir ilgojo peties chromosomos 18 (2 pav Papildoma failą 9a-D). Padidėjusios žyma tankį (12p12.1, 12p13.33 ir 8q24.21) regionai esančius kras
, CACNA1C
(kalcio kanalų, įtampos priklausomas, L tipo, alfa-1c subvieneto) ir Myc
lokusų, atitinkamai. Pietų dėmė analizė patvirtino, kad KRAS parsisiųsti ir MYC
buvo sustiprina HSC45 ląstelių (Papildoma failą 9e). Kiekvienas kiekybiškai kopija numeris pokytis nustatomas pagal kiekybinius realaus laiko PGR (qPCR) genomo DNR buvo stebėtinai panašus į apskaičiuota IGS kai langas dydis Tag tankio analizę buvo priderinta prie kiekvieno pakeitimo dydis (Papildoma failą 9a-D ). Šie rezultatai rodo, kad žyma tankis analizė IGS gali būti naudojamas po visą žmogaus genomo atlikti kopijos numerį, analizę. 2 pav aptikimas padidėjo kopijavimo numeriu chromosomos 8q ir 12p pagal IGS HSC45 skrandžio vėžio ląsteles. (A) viso genomo vaizdas žyma tankio santykis (naudojant 1000 virtualių žymeles lange) į HSC45 ląstelių, kaip nustatyta IGS. Vertybes Y ašis rodo sulankstomomis pakeitimus Žymų tankio, palyginti su vidutiniu žyma tankio visą genomą ir atstovauja DNR kiekį, tenkantį haploidinio genomo langai. X ašis yra chromosomų skaičių. (B ir c) Išplėstas vaizdas iš žyma tankio santykis dėl chromosomų 8 (b) ir 12 (c). Kiekvienoje skydelyje, viršutinis grafikas rodo viso chromosomų vaizdas žyma tankio santykis (remiantis 1000 virtualių žymeles lange). Apatinė grafikas rodo išplėstą vaizdą 8q24.21 ir 12p12.1, kurioje išaugo žymė tankis buvo aptiktas naudojant "Windows 1000 ir 500 virtualių žymes. Unikalūs Nekilnojamasis žodžius, kurie nurodyti kaip juodos vertikalios juostos ir unikalių virtualių žodžius, kurie nurodė, mėlyna (60 bp ar trumpesnį) arba šviesiai mėlyna (ilgiau nei 60 BP) barų tankus režimu. Į refseq genų padėtys, su kai sandūrų izoformų praleistas, yra rodomas iš apatinių panelių jungties apačioje.
Stiprinimas iš KRAS
skrandžio vėžio ląstelių linijų
analizė 26 lokusų viduje ir iš karto gretutines chromosomą 12p12. 1 HSC45 ląstelėse qPCR parodė, kad maždaug 500 kb regionas, kuris apėmė kras
genų lokusas buvo papildyta (8 kartus stiprinimas, 3a pav.) Genomo qPCR atrankos aptikta kras
amplifikacija dviem papildomais skrandžio vėžio ląstelių linijų, SH101P4 (18 kartų) ir MKN1 (13 kartų) (3a paveikslas), o mes neaptiko stiprinimas yra didesnis nei 4 kartus per 17 kitų skrandžio vėžio ląstelių linijas, arba 10 gaubtinės žarnos vėžio ir 11 kasos vėžio ląstelių linijas (išvardyti papildomame faile 1, duomenys nebus rodomas). IGS taip pat aptikta stiprinimas iš Kras
lokuso ir MKN1 ląstelių (Papildoma failų 10). Kaimyninės genai KRAS
minimalaus amplikono buvo LRMP
(limfoidinio ribojamas membranos baltymo), CASC1
(vėžio jautrumą kandidatas 1) LYRM5
(LYR motyvas, kuriame yra 5). BCAT1
(šakotos grandinės aminotransferazės 1, citozolinių) taip pat buvo amplifikuotos SH101P4 ir MKN1 ląstelių, bet ne HSC45 ląstelių. Mes patvirtino, kad CACNA1C
buvo sustiprina HSC45 ląsteles, bet ne kitų skrandžio, storosios žarnos ar kasos vėžio ląstelių linijas, naudodamos genomo qPCR analizę (papildomų failų 9b; duomenys nebus rodomas). Nei NRI
, HRAS
nei BRAF
amplifikacijos buvo aptikta pirmiau vėžio ląstelių linijų genomo qPCR analizės (duomenys neparodyti). Iš KRAS
amplifikacija Taip pat buvo patikrinta dvigubos spalva FISH analizę, kurioje kras
amplikono buvo akivaizdu, kaip vienodai tamsintas regione HSC45, SH101P4 ir MKN1 ląstelių (3b pav). 3 pav Genų stiprinimas KRAS skrandžio vėžio ląsteles. (A) kiekybinių genomo PGR analizė kras
lokuso ne 12p12.1 į HSC45 ląsteles. Diskretieji amplifikacijos ne 12p12.1 dviem kitais skrandžio vėžio ląstelių linijų, taip pat buvo aptiktas (SH101P4 ir MKN1). DNR kopijų skaičiaus, palyginti su normalaus diploidas leukocitų DNR buvo brėžiamas prieš chromosomų nukleotidų pozicijos (iš megabases). Iš refseq genų atitinkamų regionų pozicijas rodomi apatiniame žemėlapyje. Bendras visų 3 skrandžio vėžio ląstelių linijų minimalus stiprinimo regione atstovauja oranžinės spalvos juosta. (B) metafazės (kairėje) - ir interfazinės (dešinėje) -žuvis analizė amlifikuoti kras
lokuso skrandžio vėžio ląstelių linijas. KRAS
specifinę zondas yra geltonos spalvos, o kontrolės zondas, specifinis ilgojo peties chromosomos 12, yra raudonos spalvos. buvo pastebėtas Tetraploidy į HSC45 ir triploidy į SH101P4 ir MKN1 ląsteles. (C) kiekybiniai realaus laiko PGR analizė kras
iRNR išraiškos skrandžio vėžio ląstelių su 12p12.1 stiprinimas. Išraiška analizė genų (Kras LRMP, CASC1 parsisiųsti ir LYRM5
) esančių minimaliu amplikono ir BCAT1
, kuris šonai minimalų amplikono, buvo atliktas naudojant realaus laiko RT-PGR. Ekspresijos lygis buvo standartizuoti GAPDH
mRNR, ir yra vaizduojamas kaip spalvų gradiento, lyginant su normaliu skrandį. Genas stiprinimas ir mutacijos (kodono 12 arba 13) statuso KRAS
kiekvieno mėginio apibendrinta dešinę dviejose skiltyse. Įdaryti apskritimai rodo sustiprinimu arba mutacijos KRAS
buvimą, ir atviros apskritimai nerodo jokio stiprinimo ar neturi KRAS
.
Seka analizė kras
(papildomų failų 11a) parodė, mutacija, kad tiek HSC45 ir SH101P4 ląstelės priglaudė mutaciją kodono 12, kad gauta nė vieno aminorūgščių keitimą į KRAS (GGT → GTT, G12V), o MKN1 ląstelės trūko kras
mutacijas. Iš kras
mutacijų buvimas AGS (G12D), SNU1 (G12D), DLD1 (G13D) ir HCT116 (G13D) ląstelių buvo pranešta anksčiau [28, 29]. Iš dešimties PCR-klonų KRAS
iš HSC45 ir SH101P4 ląstelių, kurios buvo atliktas mutacijos analizė, aštuonių ir trijų, atitinkamai, priglaudė mutacijų kodono 12. Be to, genomo realaus laiko PGR analizė, naudojant zondus, kurie buvo būdingi laukinių -type ir MUTANT kras
aleliai (Papildoma failą 11b), taip pat atskleidė, kad HSC45 ir SH101P4 ląstelės yra skirtingas proporcijas mutantas alelio (80% ir 50% atitinkamai). Apskritai, šie rezultatai rodo, kad mutantas kras
alelio stiprinimas taip pat pasitaiko HSC45 ir SH101P4 ląsteles.
Mes šalia ištyrė kras
mRNR lygį kras
-amplified skrandžio vėžio ląstelių kiekybinę Real Game AT-PGR (KRL-PGR) (3c pav.) Į kras
mRNR kiekis labai koreliuoja su kras
kopijų skaičiaus. Kaimyninės genai LYRM5 parsisiųsti ir CASC1
, kuris lokalizuotas minimaliai amplikono, taip pat buvo išreikštas ne aukštesnio lygio ląstelėse su amplifikacijos, palyginti su ląstelėmis be amplifikacijos (3c pav.) Įdomu tai, kad LRMP
buvo žemyn reguliuojama vėžinių ląstelių, palyginti su normaliomis skrandžio ląstelėse. Imunoblotingas RAS baltymų (4a paveikslas) parodė, kad KRAS išraiška buvo padidintas kras
-amplified skrandžio vėžio ląstelių (HSC45, SH101P4 ir MKN1), o nei NRI, nei HRAS buvo labai išreikštas (4a pav, duomenų nėra rodomi ). Nors išraiška tegul-7c ir tegul-7g mikro RNR buvo pranešta reguliuoti RAS išraišką [8], mes nustatėme, mažai koreliaciją išraiškos šių mikro RNR su KRAS baltymų koncentracijos (Papildoma failų 12), kuri teigė, kad KRAS raiška skrandžio vėžio Mobilaus ryšio linijos yra pirmiausia dėl to genomo amplifikacija KRAS
. 4 pav Padidėjusi KRAS ir skirtumas aktyvavimo, Kras P44 /42 MAP kinazės ir AKT į KRAS -amplified skrandžio vėžio ląsteles. (A) Imunoblotingas iš ekspresijos lygio KRAS ir NRI vėžinių ląstelių. Aktino išraiška buvo analizuojamas kaip pakrovimo kontrolę. (B) bazinio lygio GTP-KRAS buvo gerokai didelis skrandžio vėžio ląstelių su Amplified Mutant kras
(HSC45 ir SH101P4). Iš viso lizato (500 mikrogramų) buvo atliktas GTP-RAS išskleidžiamajame tyrimo ir GTF-KRAS ir GTF-NRI buvo aptikta immunoblot naudojant anti-KRAS ir anti-NRI antikūnus, atitinkamai. Bendras ląstelių lizatas (50 mikrogramų) buvo analizuojami lygiagrečiai nustatyti išraiškos KRAS ir NRI ląstelių lygį. (C) GTP-KRAS buvo padidėjusi po serumo stimuliacija MKN1 ląsteles. Ląstelės buvo auginamos reguliariai terpėje, turinčioje 10% FCS (N), serumo-alksta 24 h (-) arba serumo alkanas vėliau sužadinamas su 10% FCS 1 valandą, o (+). Bendras ląstelių lizatas buvo atliktas GTF-KRAS išskleidžiama tyrimu. (D) aktyvavimas P44 /42 MAP kinazės ir AKT serumo alksta ar -stimulated skrandžio vėžio ląsteles. Bendras ląstelių lizatas buvo analizuojami taip, kaip aprašyta pav c.

• Genomo genų kopijų skaičiaus ir išraiška analizė Pirminių skrandžio navikų ir skrandžio vėžio ląstelių lines
• Mechanizmai gastroprotection metanolio ekstrakto Melastoma malabathricum leaves