Skillnader i magcancer genuttryck signaturer som härrör från laser capture microdissection versushistologic macrodissection

skillnader i magcancer genuttryck signaturer som härrör från laser capture microdissection kontra
histologiska macrodissection Bild Sammanfattning
Bakgrund
magcancer prover som erhållits genom histologisk macrodissection innehålla en relativt hög stromal innehåll som väsentligt kan påverka genuttrycksprofilerna. Skillnader mellan genuttryck signatur härrör från macrodissected magcancer prover och signaturen som erhålls från isolerade magsäckscancer epitelceller från samma biopsier använder laser-capture microdissection (LCM) utvärderades för deras potentiella experimentella fördomar.
Metoder
RNA isolerades från frysta vävnadsprover för magcancer biopsier från 20 patienter som använder både histologiska macrodissection och LCM tekniker. RNA från LCM var föremål för en ytterligare runda av T7-RNA-förstärkning. Uttrycksprofilering genomfördes med hjälp av Affymetrix HG-U133A arrayer. Gener som identifierades i uttrycks underskrifter från varje vävnad behandlingsmetod jämfördes med genuppsättning som finns i kromosomregioner fann att hysa kopietal aberrationer i tumörprover från array CGH och till proteiner som tidigare identifierats som att överuttryckt i magcancer.
resultat
Gener visat sig ha ökat kopietal i magcancer befanns också vara överuttryckt i prover som erhållits genom macrodissection (LS P
värde < 10 -5), men inte i array data genereras med hjälp microdissection . En uppsättning av 58 tidigare identifierade gener överuttryckt i magcancer har också berikat i genen signatur identifieras genom macrodissection (LS P Hotel < 10 -5), men inte i signaturen identifieras genom microdissection (LS P
= 0,013). Däremot 66 gener som tidigare rapporterats vara underexpressed i magcancer anrikades i genen signatur identifieras genom microdissection (LS P Hotel < 10 -5), men inte i signaturen identifieras genom macrodissection (LS P = 0,89).
tumörprovtagningsteknik förspänner microarray resultat. LCM kan vara en känsligare insamling och bearbetning metod för identifiering av potentiella tumörsuppressorgen kandidater i magcancer använder uttrycksprofilering.
Bakgrund Review, en stor syftet med microarray analys är att identifiera differentiellt uttryckta gener i delmängder av klinisk prover för att passa specifika behandlingar mot tumörtyper. Emellertid är kvantitativt uttryck array analys av kliniska cancer prover med höga stromal halt utmanande eftersom förhållandet av epiteliala tumörceller att stromaceller kan variera kraftigt. Kontamine stroma kan förväxla microarray-baserad uttryck och antalet exemplar analyser. Laser capture microdissection (LCM) är en värdefull teknik som gör det möjligt att isolera epitelceller från stromaceller, vilket berikande för epitelial innehåll. Mängden prov och RNA som erhållits genom LCM är ofta ganska begränsad, dock, och kräver ett amplifieringssteg för att generera tillräckligt med material för microarray analyser. Denna amplifieringsprocess kan snedvrida resultatet och leda till en skev uppsättning differentiellt uttryckta gener [1]. Histologisk macrodissection (prover som tagits från vävnadssnitt guidade genom mikroskopisk analys av ett målat serie avsnitt) ger en större mängd av provmaterial jämfört med LCM som kan undanröja behovet av en ytterligare runda av RNA-förstärkning. Men macrodissected prov innehåller betydligt mer innehåll stromaceller än prover som erhållits genom microdissection.
Tidigare studier har jämfört dessa två vävnadsbearbetningsmetoder för kliniska cancerprover. Baserat på data från 14 rektala adenokarcinom prov, Bruin et al
. gynnad macrodissection över microdissection på grund av den relativt låga bidraget av stromala komponenter i macrodissected prover från denna tumörtypen och de förspända gen uttryck resulterar från microdissected prover på grund av amplifiering av RNA som krävs för dessa prover [2]. Å andra sidan, Klee et al
. föreslog att microdissection profilering identifiera ett stort antal differentiellt uttryckta gener inte annars hittas med hjälp bulk vävnadsprovtagning, baserat på data från 10 lung adenokarcinom och 6 intilliggande normala prover [3]. Dessa studier var begränsade av små provstorlekar, och därför kräver ytterligare validering. Det är också oklart om de gener som identifierats unikt använder microdissected prover representerar användbara biomarkörer. Bias följd av RNA förstärkning måste vägas mot nyttan av att berika prover för epitelial innehåll överväger huruvida microdissection är fördelaktig för uttryck profilering av tumörer med hög stromal innehåll, till exempel magsår eller bukspottkörteln adenokarcinom.
Microdissection är speciellt användbar för att berika gastric cancertumörceller som erhållits från endoskopiska biopsiprov, särskilt från magcancer diffus-typ som är sammansatt av spridda tumörceller blandade med inflammatoriska celler och fibros. Nedgången i den totala förekomsten av magsäckscancer i USA under detta århundrade tycks till stor del bero på en minskning av tarm typ lesioner medan förekomsten av diffusa typen tros ha förblivit densamma [4]. Använda prover som erhållits av LCM, Wu et al
. rapporterade att malign kontra benigna gastric epitelceller kan urskiljas med en noggrannhet på 99% baserat på en 504-gen prediktor [5]. Denna prediktor ingår välkända gener som uttrycks i det gastriska epitelet inklusive Trefoil Faktorer 1, 2, och 3 [5]. Med hjälp av LCM, Jinawath et al
. identifierade 46 gener som kan representera distinkta molekylära signaturer för de två histologiska typer av magcancer - diffus-typ och tarm-typ gastric cancer [6]. Emellertid har inga studier utförts hittills direkt jämföra macrodissection vs
. LCM metoder som använder samma uppsättning av magcancer prover. Sälja I denna studie har vi försökt att utvärdera skillnaderna mellan uttrycksprofiler som härrör från samma tumörer att bearbetades av både macrodissection och LCM för microarray analyser. Med tanke på svårigheten att validera alla differentiellt uttryckta gener som identifierades med hjälp av varje typ av provtagning, vi jämförde gener som identifierades genom vår microarray analyser med proteiner som är kända för att vara överuttryckt i magcancer. Dessutom bestämde vi huruvida uttryck av gener som identifierades i varje signatur korrelerade med förändringar i genkopietalet som identifierades genom array jämförande genomisk hybridisering (CGH) från samma tumörer. Tidigare studier av magcancer har visat en hög korrelation mellan array CGH och uttryck array uppgifter [7]. Kopietal förändringar utvärderades med användning macrodissected tumör-DNA i syfte att undvika förspänningen från hela genomet amplifiering. Vi ytterligare beslutsamma om genen underskrifter vi fått från varje insamling och bearbetning provmetod anrikades för proteiner som tidigare har rapporterats vara oreglerad gener i magcancer. Våra resultat tyder på att LCM metod är känsligare för att identifiera gener som är underexpressed i cancern jämfört med normal vävnad (potentiella tumörsuppressorer), medan macrodissection identifierar fler gener som är överuttryckta i cancer. Därför macrodissection och LCM microdissection verkar användbart för att studera olika aspekter av cancerbiologi.
Metoder
Patienter
Tjugo patienter som analyserades i denna studie är en del av 96 patienter som deltog i en prospektiv studie och vars prover användes som en expressionsövningsuppsättningen för att utveckla en kemo-respons prediktor [8]. En del av uttryck och CGH array data från sina macrodissected prover tidigare rapporterats [8, 9]. Provtagning, behandling och uppföljning genomfördes i enlighet ett protokoll som godkänts av Institutional Review Board (IRB) av National Cancer Center Hospital i Goyang, Korea (NCCNHS01-003). Alla patienter tecknat ett IRK-godkända informerat samtycke formulär. Behörighet för inskrivning i studien omfattade följande parametrar: 1) ålder ≥ 18 år; 2) histologiskt bekräftade magcancer; 3) kliniskt dokumenterad fjärrmetastaser; 4) inga andra än magcancer tidigare eller samtidig maligniteter; 5) ingen tidigare historia av kemoterapi, antingen adjuvans eller palliativ; och 6) lämplig funktion av alla större organ. Patienterna fick cisplatin 60 mg /m 2 IV dag 1 och fluorouracil 1000 mg /m 2 IV på dagarna 1-5 i en 3-veckors schema.
Tissue bearbetning
Innan macrodissection, tumör proven hade mediantumör kärnor av 50% (kvartilavståndet, 30-60%). Macrodissection utfördes såsom tidigare beskrivits [10]. Macrodissection leda till genomsnitt 60% av tumör kärnor på översta skivan (interkvartilt intervall, 60 till 72,5%). För mikrodissektion, tumör och normal vävnad prov kryosnitt skars vid 10 | j, m, och lagrades frysta vid -80 ° C. Diabilder dehydratiserades med användning av nukleasfritt HistoGene (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) reagenser i enlighet med tillverkarens rekommendationer. Microdissection utfördes med användning PixCell II (Arcturus Bioscience, Mountain View, CA). Uttorkning och LCM var begränsad till 15 minuter eller mindre för varje prov som tagits. Totalt 10.000 laserskott (fläckstorlek av 15 ^ m i diameter) uppsamlades med användning CapSure Macro LCM Lock för varje prov. RNA isolerades med hjälp av PicoPure RNA Isolation Kit (Molecular Devices). I korthet innebar detta epitelcellerna inkuberades med 50 | il extraktionsbuffert i ett 0,5 ml mikrocentrifugrör vid 42 ° C under 30 min. DNas (Qiagen, Valencia, CA) behandling genomfördes direkt i kolonnrening, och RNA isolerades med användning av elueringssystemet volym på 8 | il (Molecular Devices). Fem mikroliter av RNA från microdissected cellpopulationer omvandlades till biotinylerad, antisens-cRNA målet, med hjälp av Affymetrix tvåtaktsmärkningsmetod (Santa Clara, CA). Alla biotinylerade mål var splittrade och 15μ
g av varje hybridiserades till HG-U133A Genechip microarrays att följa tillverkarens protokoll. Skannade array bilder granskades och omvandlas till signaldata med hjälp av Affymetrix MAS 5,0 algoritm.
Array CGH
Iskt DNA extraherades från prover med TRI-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), enligt tillverkarens protokoll, och dessutom renades med hjälp av QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN). För array CGH experiment Agilent 4x44k HD-CGH Microarrays innehållande 44.000 funktioner (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) används. 0,5-1 ug av tumörgenomiskt DNA-prov och samma mängd av humant genom-DNA från flera anonyma kvinnliga donatorer (Promega, Madison, WI) digererades med Alul (50 enheter) och Rsal (50 enheter) under 2 h vid 37 ° C . 5 pl av Random Primer blandades med det digererade DNA-mallen. Referens och prov-DNA märktes med hjälp av Agilents Labeling Kit PLUS, som inkluderar 5x buffert, 10x dNTP, Cy-3/5 dUTP (1,0 mM), och Exo-Klenowfragment. Sonden blandning av Cy3 märkt prov-DNA, märkt Cy5 referens-DNA (39 | il), 5 pl humant Cot-1-DNA (Invitrogen), 11 pl Agilent 10 × blockerande medel och 50 pl Agilent 2 × hybridiseringsbuffert denaturerades vid 95 ° C under 3 min och inkuberades vid 37 ° C under 30 min. Sonden applicerades på arrayen med en Agilent microarray-hybridisering kammare, och hybridiserades under 21 timmar vid 65 ° C i en roterande ugn vid 20 rpm. Arrayer tvättades enligt tillverkarens rekommendationer, doppad i Agilents stabilisering och torkning lösning, och skannas med en Agilent 2565AA DNA microarray scanner. Agilent Scan Program Control Program 7,0 och Agilents Feature Extraction Programvaran 9.5.1 användes för databehandling. Array CGH data analyserades med hjälp av Agilents CGH Analytics programvara (version 3.5.14). ADM-2 algoritm med tröskel 6, med fuzzy noll och centralisering på, användes för att identifiera aberration. Kriterier för aberration filtrering var minimi prober av 5, minsta genomsnittlig absolut log 2 förhållandet mellan 0,5 och maximalt avvikelser av miljoner. Avvikelser som fastställts för varje prov noterades och visas grafiskt.
Gastric cancergener i litteraturen
att generera ett användardefinierat genuppsättning för vår gen jämförelse analyser, vi sökte PubMed databas för gener med magcancer cellspecifikt protein uttryck, med hjälp av sökord av "magcancer", "immunohistokemi" och "överuttryckt" eller "förlust av uttrycket". För vår genuppsättning jämförelse analyser gjordes gen symboler för magcancer specifika gener mappas till probuppsättning ID på HG-U133A array (http:.. //Www NetAffx com). Det fanns 178 ( "överuttryckt") och 327 ( "förlust av uttrycket") artiklar i Pubmed vid skrivande stund.
Statistisk analys av uttryck array data
Affymetrix HG-U133A genuttryck microarray data analyserades med genuppsättning jämförelseanalys algoritmer för BRB ArrayTools (version 3.8, National Cancer Institute, http:.... //linus NCI NIH gov /BRB-ArrayTools html) [11]. Genen set jämförelse Verktyget analyserar användardefinierade genuppsättningar för differentiellt uttryck bland fördefinierade klasser (dvs
., Cancer vs
. Normal) av en källa dataset. Användardefinierade genuppsättningar som används i denna studie inkluderar U133A probuppsättningar motsvarande gener med kopieantal förändringar och motsvarande magcancer gener i litteraturen. Gener vars tumör /normal log 2 förhållandet är högre än 0,5 i åtminstone en av 20 patientprover ingick i listan över gener med kopietal vinst. Likaså gener med antalet kopior förlust (log 2 förhållande < -0,5) noterades. Dessa användardefinierade genuppsättningar analyserades med avseende differentiellt uttryck mellan 20 cancerprov och 6 normala prover (dvs
., 3 macrodissected och 3 microdissected prover). Idéer för varje källa dataset, är en P
-värde beräknas för varje gen att korrelera uttrycksnivån för differentiellt uttryck mellan fördefinierade klasser, genererar en rankad gen lista över en viss BRB-ArrayTools projektet. För en uppsättning av N
gener, är minsta kvadrat (LS) statistik definieras som den genomsnittliga negativa naturliga logaritmen av P
-värden av lämpliga enda gen univariata test [12]. En sammanfattning statistik beräknas som sammanfattar dessa P
värden över den användardefinierade genuppsättning; sammanfattningen statistik är genomsnittlig log (P
) för LS sammanfattning av hur P
värden skiljer sig från en jämn fördelning för LS [12]. Sammanfattningen statistiken är relaterad till fördelningen av sammanfattande statistik för stickprov av N
gener, samplade från de representerade på matrisen. Här N
är antalet gener i den användardefinierade genuppsättning. 100.000 slump genuppsättningar samplades att beräkna denna fördelning. LS P
värde är andelen av slumpmässiga uppsättningar av N
gener med mindre genomsnittlig sammanfattande statistik än LS sammanfattningar beräknade för verkliga data.
BRB-ArrayTools uppskattade LS P
värden för anrikning av 4 genuppsättningar i vår magcancer transkriptom signatur identifieras av varje vävnad behandlingsmetod enligt följande. Först, för att jämföra de 2,324 gener associerade med kopietal förstärkningen med vår magcancer transkriptom signatur identifieras av microdissection, var LS statistik av 2,324 amplifierade gener uppskattas genom att beräkna en genomsnittlig negativ naturliga logaritmen av de P
värdena för enda gen univariata test för differentiellt uttryck av varje 2,324 gener mellan 20 microdissected magcancer prover och 6 normala prover. Då BRB-ArrayTools beräknade andelen av slumpmässiga uppsättningar av 2,324 gener med mindre genomsnittlig sammanfattande statistik än LS sammanfattningar beräknade för verkliga data (LS P
värde). Den magcancer transkriptom signatur identifieras av microdissection jämfördes också med 677 gener associerade med kopietalet förlust, 58 proteiner som rapporterats vara överuttryckt i gastrisk cancer och 66 proteiner som rapporterats som underexpressed i magcancer, med respektive LS P
värden. LS P
värde mindre än 0,01 ansågs signifikant. Samma analyser upprepades för magcancer transkriptom signatur identifieras genom macrodissection metoden.
Immunohistokemi
TFF1 immunohistokemi utfördes med hjälp av kirurgiska eller endoskopiska biopsivävnadsprover från 16 patienter med ventrikelcancer (16 cancer och 2 intilliggande normala vävnadsprover), och 4 friska försökspersoner, som inte ingick i detta DNA microarray studie. Grovt-normala magslemhinnan vävnadsprover samlades in från gastric antrum av friska försökspersoner med hjälp av en blind biopsi teknik, med informerat samtycke [9]. Paraffininbäddade formalinfixerade vävnadsobjektglas (4 | j, m tjock) färgades med 13734-1-AP (ProteinTech Group, Chicago, IL) vid 01:50 under 60 min vid rumstemperatur och Envision anti-kanin pepparrotsperoxidas (K4003, DAKO , Carpinteria, CA) under 30 min vid RT. Reaktionen visualiserades med användning av diaminobensidin (K3468, DAKO) och motfärgades med hematoxylin. TFF1 uttryck utvärderades halv kvantitativt vid 200x
förstoring, baserat på andelen positivt färgade celler ( "-" = immunfärgning i ≤ 10% av celler, "+" = 11-50%; "++" = 51- 75%; "+++" = 76-100%) [13, 14]. Immunfärgning utan primär antikropp och normal gastric epitel av en kontrollvävnad microarray tjänade som negativa och positiva kontroller, respektive [15]. Cytoplasmatisk fläck som var entydigt djupare än bakgrunden räknades som positiva.
Resultat
Fastställande av globala genuttryck signaturer från macrodissected och LCM prover
Tabell 1 skisserar de klinisk-patologiska egenskaperna hos patienter och frivilliga ingår i denna microarray studie. Microarray data erhölls för både LCM och macrodissected prover från samma 20 biopsier (Figur 1A). Även av godtagbar kvalitet, microarray data från LCM proven hade i allmänhet lägre "nuvarande samtal" än macrodissected prover (data ej visade
). Principalkomponentanalys av de globala genuttryck mönster som härrör från mikro- och makro dissekeras gastric cancer, och de normala proverna visade en tydlig åtskillnad mellan varje urvalsgrupp (Figur 1B). Median Pearson korrelation mellan de två bearbetningsmetoder var 0,75 (kvartilavståndet, 0,71-0,81) .table 1 klinisk-patologiska egenskaper hos patienter och frivilliga ingår i microarray analys

Patienter (n = 20)
Volunteers (n = 6)
Baseline klinisk-patologiska egenskaper
Ålders år
Median
59
52
kvartilavståndet
54-69
43-61
Sex - nej. (%) Review Male
16 (80%) Review 3 (50%) katalog Kvinna
4 (20%) Review 3 (50%) Prestation status (PS ) - Nej. (%) Review ECOG1 PS 0 eller 1
20 (100%) Review Histologisk typ - nej. (%) Review Lauren tarm
6 (30%) Review Laurens diffusa
14 (70%) Review Placering av primära lesionen - nej. (%) Review Övre 1/3
4 (20%) Review USA 1/3
6 (30%) katalog Lower 1/3
10 (50%)
fjärrmetastaser - nej. (%) Review 20 (100%) Review behandling och resultatet
kemoterapi regimen - nej. (%) Review Cisplatin /Fluorouracil
20 (100%) Review Överlevnad -. Månad
Median
8,0
kvartilavståndet
5,6-14,7
tid till progression -. månad
Median
3,5
kvartilavståndet
2,3-6,2
1Eastern Cooperative Oncology Group
Figur 1 (A) Studie ordning med provtagning och microarray bearbetning (B) Principal Component analys av genuttrycksprofilerna av mikro- och makro dissekeras tumörprover från 20 patienter med ventrikelcancer och 6 normala prover från friska frivilliga försökspersoner.
tabellerna 2 och 3 visar gener överuttryckta i mikro- och makro dissekeras magcancer prover vid funktionsval P Hotel < 10 -6. Cellmorfologi
(AIF1, E2F1, E2F3, KIR2DL1, KIRREL, NPR1, RUNX2, TRIO
) var den mest berikade funktionella kategori av de 42 generna överuttryckta i microdissected proven jämfört med de normala prover (feature val P
< 10 -6) som identifierats av påhittighet Pathway Analysis (IPA) (tabell 2). Tumör morfologi
(APOE, BIRC5, CD14, COL1A1, COL1A2, Cyr61 FKBP1A, IL8, MCAM, MIF, RHOB
) var den mest anrikade funktionell kategori bland de 73 generna överuttryckta i macrodissected prover (feature val P Hotel < 10 -6) av IPA (tabell 3). Extracellulära matris gener, såsom COL6A2, COL1A1, COL1A2
och COL5A2
, var framträdande i macrodissected prover och förmodligen skjutet från stromaceller. Tabell 4 visar gener underexpressed i mikro- och makro dissekeras magcancer prover på funktionsval P Hotel < 10 -6.Table 2 gener överuttryckta i microdissected magsäckscancer vid funktionsval P Hotel < 06/10
Gene

FC1

Gene

FC

BMP3
38.52
HIST1H4C
6.3
BGN
30.3
LEPRE1
5.9
TRIO
18.5
ETNK2
5.6
GADD45GIP1
17.2
TRIP6
5.3
MIER2
16.7
FAM125B
5.3
KIFC3
16.4
NPR1
5.3
217318_x_at
13.7
DSCC1
5.3
217219_at
13.2
CLUL1
5.0
RUNX2
12.5
HMGB3
4.5
SMARCD1
12.0
E2F3
4.3
KIRREL
12.0
AIMP2
4.2
215621_s_at
12.0
ATAD5
4.0
GRM2
10.0
E2F1
3.8
FJX1
10.0
FKSG49
3.7
AIF1
10.0
DVL2
3.7
THY1
9.1
TIPRL
2.9
CARD10
9.1
EIF2C3
2.9
SIM2
9.1
NAT10
2.8
AIF1
9.1
MED27
2.7
APOBEC3G
8.3
PIN4
2.7
RHAG
8.3
CTPS
2.6
1fold förändring, definieras genom förhållandet mellan cancer till normal (= cancer /normal) katalog 2AII dessa gener hade falska upptäckt kurs < 0,001
Tabell 3 Gener överuttryckta i macrodissected magsäckscancer vid funktionsval P
. < 06/10
Gene

FC1

Gene

FC

LY6E
24.42
SRM
6.7
IL8
22.7
NGLY1
6.7
CA12
20.0
RHOB
6.3
SBNO2
19.2
ACTN1
5.9
UBE2S
17.2
LOXL2
5.9
CYR61
17.2
COL5A2
5.9
ANGPT2
15.9
TRIM28
5.6
COL6A2
14.3
218982_s_at
5.6
BOP1
13.2
C7orf44
5.3
COL1A1
13.2
UBE2C
5.3
LPL
13.0
CEP76
5.3
MFGE8
12.8
BIRC5
5.3
APOE
12.2
PNO1
5.0
G6PC3
10.9
FSTL1
5.0
215900_at
10.3
GRINA
4.8
NUP62
10.0
MRTO4
4.8
MRPL4
10.0
STC1
4.8
GNL3L
10.0
MRPL12
4.5
MCAM
9.1
FKBP1A
4.5
PDLIM7
9.1
IFI30
4.5
216472_at
9.1
KPNA6
4.3
ACTN1
9.1
216532_x_at
4.3
BYSL
9.1
CENPI
4.2
GNAI2
8.3
PPM1G
4.2
NCAPH2
8.3
ICT1
3.7
CD14
8.3
SFRS14
3.6
EXOSC4
8.3
CTPS
3.6
OBFC2B
8.3
IMP4
3.3
PPP1R15A
7.7
UBE2G2
3.2
COL1A2
7.7
ISG20L2
3.2
GPX1
7.7
EIF4A1
3.1
MIF
7.7
HDGF
2.6
NME1
7.1
PSMD14 2.6
PPIL2
7.1
220856_x_at
2.4
CCDC85B
7.1
CNOT3
2.4
SPARC
6.7
GLT25D1
2.0
C8orf55
6.7
1fold förändring, definieras genom förhållandet mellan cancer till normal (= cancer /normal) katalog 2AII dessa gener hade falska upptäckten hastighet. ≪ 0,001
tabell 4 Gener underexpressed i mikro- och makro dissekeras magcancer på funktion urval P Hotel < 10-6
microdissected

Macrodissected

Gene

FC1

Gene

FC

HPGD
-25.02
208498_s_at
-11.1
HRASLS2
-20.0
SIDT2
-7.7
ABCC3
-20.0
MUC5AC
-5.9
SLC25A37
-16.7
CTAGE5
-5.0
ABHD2
-14.3
GNA11
-3.8
VIPR1
-10.0
ARFIP1
-3.4
CYTIP
-9.1
214316_x_at
-3.3
GALNT6
-9.1
222149_x_at
-3.3
SULT1A2
-9.1
OAS1
-8,3
PDCD4
-7,1
NR3C2
-7,1
DOCK6
-6,3
SULT1A1
-5,9
ZFYVE26
- 5,9
213212_x_at
-5,6
DSCR3
-5,3
TMEM131
-5,3
ECHDC2
-5,0
DENND1B
-5,0
KIAA0141
-4,8
RNF103
-4,8
PDCD4
-4,5
CABIN1
-4,5
222371_at
-4,3
RRBP1
-4,0
CC2D1A
-3,8
216438_s_at
-3,8
SGSM3
-3,8
ARPC2
-3,7
TRAK1
-3,6
GNA11
-3,6
PAFAH1B1
-3,4
CNDP2
-3,2
SPOP
-3,1
PARP4
-3,1
ERLIN1
-2,9
1fold förändras, definierad av den negativa för uttrycket förhållandet mellan normal till cancer (= - (normal /cancer)) katalog 2AII dessa gener hade falska upptäckt kurs < Jämförelse mellan uttryck och array CGH uppgifter 0,001
.
Array CGH analys utfördes med hjälp av genomiskt DNA extraherat från macrodissected prover som innehåller > 50% tumörceller (kriterier som används av tidigare studier [16, 17]), eftersom tillräckligt med DNA kunde erhållas utan behov av hela genomet förstärkning som krävs för microdissected prover. Hela genomet DNA-förstärkning kan potentiellt införa artefaktuella partiskhet i array CGH resultat [18]. Avbildas i figur 2 är frekvensen av DNA kopietal aberrationer bland alla av de 20 proverna. Vår kopietal aberration uppgifter var i allmänhet i linje med tidigare rapporterade uppgifter [7, 16, 17, 19-23]. Fyra av 20 patienter hade förstärkning av chr8 q24.13-q24.21 (126.357.475 till 128.822.596) som innehåller MYC
onkogen. Den näst vanligaste förstärkning locus var chr17 q21.2 (36.109.939 till 36.230.163) som förstärktes i 3 patienter. Sju patienter hade inga detekterbara kromosomavvikelser. Dessa 7 prover innehöll en median av 70% tumörceller, medan de övriga 13 patienter hade en median 60% tumörceller (P
-värde = 0,1). Därför var avsaknaden av detekterbara kromosomavvikelser i 7 proverna inte på grund av en lägre andel av tumörceller i dessa prover. Figur 2 Grafiskt avbilda som illustrerar den procentuella frekvensen av prober detekteras (aberrationer) bland alla 20 prover.
Det fanns 2,324 unika gener som var förknippade med kopietal förstärkning i åtminstone en av de 20 patienter och 677 gener associerade med kopietal förlust. Använda genuppsättning jämförelse analyser jämförde vi dessa genuppsättningar med våra transkriptom signaturer som identifierats av de olika provisoleringsmetoder. Vi antog att oreglerad gener associerade med kopietal avvikelser är mer sannolikt att vara inblandade som bidrar till onkogenes snarare än bara som "åskådare". Därför var de 2,324 gener som finns i regioner av kopietal vinster analyseras med avseende på deras uttryck från array data som erhållits med hjälp av macrodissection metoden (funktionsval P Hotel < 0,05). Överlappningen mellan listan av gener i regioner av förstärkning och berikande för deras uttryck i prover som macrodissected var statistiskt signifikant (LS P
värde = 10 -5, se Metoder för statistisk beskrivning). Emellertid var denna förening inte observeras när uttryck Data analyserades från microdissected prover (funktionsval P Hotel < 0,05; LS P
värde = 0,41) (Figur 3A). Det fanns således en starkare association mellan mönstret av antalet kopior vinst och genuttryck endast i prover som macrodissected. Till exempel, MYC
, den mest förstärkta genen i våra patientprover, var fast besluten att vara betydligt överuttryckt i macrodissected prover, men inte i de som microdissected, även om detta resultat kan bero på relativt små provmängder eller heterogenitet inom tumören. Figur 3 Antal gener överlappande mellan LCM och macrodissected uttryck array dataset och array CGH data från samma uppsättning av 20 patienter. Review, en lista över 677 gener identifierades i områden där DNA kopietal förlust hittades i åtminstone en av de 20 studiepatienter. Uttrycket av dessa gener analyserades i makro- och mikro dissekeras array datamängder. Ett signifikant samband konstaterades mellan generna med förlust av antal kopior och deras uttryck i både makro- och mikro dissekeras prover. (LS P
värden, 0,009 och 0,006 för LCM och macrodissected prover, respektive) (Figur 3B).
Concordance av genen signaturer med gener som tidigare rapporterats vara förknippade med magcancer Review, en PubMed litteratursökning utfördes tidigare identifiera rapporterade över- och under uttryckt gener och proteiner för magcancer (sökord: immunohistokemi, magcancer, och överuttryckt och eller förlust av uttryck). 58 proteiner överuttryckt i magcancer identifierades på detta sätt. Genuttryck för dessa 58 proteiner befanns vara anrikas i expressionsdata från prover som tagits av macrodissection (LS P Hotel < 10 -5), men ingen anrikning i uttryck av de 58 generna konstaterades för prover som samlats in av microdissection (LS P
= 0,013). Däremot var 66-proteiner rapporterades att underexpressed i magcancer anrikas i uttryck array data från prover som tagits av microdissection (LS P Hotel < 10 -5), men inte från prover som tagits av macrodissection (LS P
= 0,89) (Tabell 5) .table 5 magcancer gener i litteraturen som differentiellt uttryckta mellan 20 cancer och 6 normala prover på funktionsval P Hotel < 0,05 enligt microarray uppgifter genereras med hjälp av varje vävnad bearbetningsmetod
överuttryckta gener i cancer
Underexpressed gener i cancer

LCM&Macro1

LCM

Macro

LCM&Macro

LCM2

Macro

APOE
EGFR
AKT1
ANXA10
ANXA7
CDKN2B
AURKA
HGF
ANXA2
CASP6
BAD
FHIT
CCNE1
MET
CALR
CASP7
HLA-B
CDC20
RhoA
CCNB1
CDH1
HLA-E
CDC25B
TNS4
EEF2
CTNNA1
HLA-G
CXCR4
ESM1
GSN
PRSS8
E2F1
HIF1A
HLA-F
PTEN
EGR1
MINA
IQGAP2
SDHB
GRB2
PHB
KCNE2
SH3GLB1
HK2
Klf4
TFF1
ICAM1
MUC6
INHBA
R ^ R ^
LOXL2
Smad4
MCM3
PTMA
SPARC
1Previously rapporterade överuttryckta proteiner för magcancer som också överuttryckt i vår microdissected (LCM) och macrodissected cancerprov jämfört med normala prover
2Previoulsy rapporterade underexpressed proteiner för magcancer som också underexpressed i vår microdissected (LCM) cancerprov, men inte i macrodissected cancerprover
Validering av microarray uppgifter
för att validera våra microarray uppgifter, utförde vi immunohistokemiska analyser på en gen som identifierats som underexpressed i microdissected cancerprover från 16 patienter och fyra frivilliga som inte ingick i DNA microarray studie. TFF1
valdes för denna immunohistokemi valideringsstudie eftersom det avsevärt underexpressed i LCM proven (P
= 0,0036) men inte i macrodissected prov (P
= 0,09), jämfört med normal magslemhinna. TFF1 immunoreaktivitet i cancer utvärderades som -, +, ++ och +++ i 7 (43,8%), 3 (18,7%), 4 (25,0%), och 2 (12,5%), respektive. Däremot samtliga 6 normala magslemhinnan prover (4 friska frivilliga och 2 normala intilliggande vävnadsprover) bevarade TFF1 immunreaktivitet (+++) (Figur 4). Således, magsäckscancer proven hade signifikant lägre TFF1 immunreaktivitet än normalt magslemhinnan, i linje med tidigare rapporter [13, 14] (P Idéer för chi-kvadrat = 0,007). Figur 4 Representativa TFF1 immunhistokemisk färgningsresultat för (A) en magcancer visar förlusten av TFF1 uttryck, och (B) normal magslemhinna från en frisk frivillig uttrycker TFF1 i gastric epitelceller. (Förstoring = 200x)
Dessa resultat visar att macrodissection baserad analys av genuttryck överträffade genuttryck analyser från LCM prover för att identifiera gener överuttryckta i magcancer.

• BariSurg prov: Sleeve gastrektomi kontra Roux-en-Y gastric bypass hos överviktiga patienter med BMI 35-60 kg /m2 - en multicenter randomiserad patienten och observatören blinda non-inferiority trial
• Uttrycksprofilen för muciner (Muc2, MUC5AC och MUC6) i Helicobacter pylori infekterade preneoplastiska och neoplastiska mänsklig gastric epitel