Onderscheidingen bij maagkanker gene expression handtekeningen afkomstig van laser capture microdissectie versushistologic macrodissection

Onderscheidingen bij maagkanker gene expression handtekeningen afkomstig van laser capture microdissectie versus
histologische macrodissection
Abstracte achtergrond
Maagkanker monsters verkregen door histologische macrodissection bevatten een relatief hoog stromale inhoud die aanzienlijk van invloed kunnen zijn genexpressie profielen. Verschillen tussen de ondertekening genexpressie afgeleid van macrodissected maagkanker monsters en de verkregen uit geïsoleerde maagkanker epitheelcellen van dezelfde biopten met behulp van laser-capture microdissectie (LCM) ondertekening werden geëvalueerd op hun potentiële experimentele vooroordelen.
Methods
RNA werd geïsoleerd uit bevroren weefselmonsters van maagkanker biopten van 20 patiënten die zowel histologische macrodissection en LCM technieken. RNA van LCM werd onderworpen aan een extra ronde van T7 RNA-amplificatie. Expressieprofiel werd uitgevoerd onder toepassing van Affymetrix HG-U133A matrices. Geïdentificeerde genen in de expressie handtekeningen van elk weefsel verwerkingsmethode vergeleken met het stel van genen die in chromosomale regio bleek kopieaantal afwijkingen haven in de tumormonsters van array CGH en eiwitten was aangegeven dat overexpressie gebracht bij maagkanker.
resultaten
Genen aangetoond dat toename van het aantal exemplaar in maagkanker hebben werden ook gevonden te zijn overexpressie in monsters verkregen door macrodissection (LS P
waarde < 10 -5), maar niet in de rij data gegenereerd met behulp van microdissectie . Een reeks 58 eerder geïdentificeerde genen tot overexpressie gebracht bij maagkanker werd verrijkt in het gen handtekening die door macrodissection (LS P
< 10 -5), maar niet in de signatuur die door microdissectie (LS P
= 0,013). Daarentegen 66 genen eerder gemeld worden underexpressed bij maagkanker werden verrijkt in het gen handtekening die door microdissectie (LS P
< 10 -5), maar niet in de signatuur die door macrodissection (LS P
= 0,89).
Conclusies Ondernemingen de tumor sampling techniek spant de microarray resultaten. LCM kan een gevoeliger inzameling en verwerking methode voor de identificatie van mogelijke tumor suppressor gen kandidaten bij maagkanker met behulp van expressie profilering. Achtergrond
Een belangrijk doel van microarray-analyse is de identificatie van differentieel tot expressie genen in subsets van klinische monsters specifieke therapieën tumor subtypes passen. Echter, kwantitatieve expressie array analyse van klinische monsters kanker met een hoog gehalte stromale uitdagend omdat de verhouding van epitheliale tumorcellen stromale cellen kunnen sterk variëren. Verontreinigende stroma kan microarray-gebaseerde expressie verwarren en kopienummer analyses. Laser capture microdissectie (LCM) is een belangrijke techniek die laat toe epitheelcellen isoleren uit stromale cellen, waardoor verrijken voor epitheliale inhoud. De hoeveelheid monster en RNA verkregen LCM vaak vrij beperkt echter en vereist een amplificatiestap om voldoende materiaal te genereren voor microarray analyses. Deze versterking proces kan vertekening van de resultaten en leiden tot een scheve set van differentieel tot expressie van genen [1]. Histologische macrodissection (monsters van weefselcoupes leiden door microscopische analyse van een gekleurde seriële sectie) een grotere hoeveelheid monstermateriaal opzichte LCM dat de behoefte aan een additionele ronde van RNA-amplificatie kunnen voorkomen. Echter, macrodissected samples bevatten significant meer stromale celinhoud dan monsters verkregen door microdissectie.
Eerdere studies hebben deze twee weefsel verwerkingsmethoden voor klinisch kankervrij monsters vergeleken. Op basis van gegevens van 14 rectaal adenocarcinoom monsters, Bruin et al
. macrodissection voorkeur via microdissectie vanwege de relatief lage bijdrage van stromale componenten in macrodissected monsters van dit soort tumor en voorgespannen genexpressie resultaten van gemicrodisseceerde monsters vanwege de amplificatie van het RNA die voor deze monsters [2]. Anderzijds, Klee et al
. suggereerde dat microdissectie profilering een groot aantal differentieel tot expressie van genen anders niet gevonden met behulp van bulk weefsel bemonstering uniek te identificeren, gebaseerd op gegevens van 10 longadenocarcinomen en 6 aangrenzende normale monsters [3]. Deze studies werden beperkt door kleine steekproeven, en daarom vereisen verdere validatie. Het is ook onduidelijk of de genen geïdentificeerd met behulp van een unieke gemicrodissecteerde monsters vertegenwoordigen bruikbare biomarkers. Bias gevolg van RNA amplificatie moeten worden afgewogen tegen de voordelen verrijken monsters voor epitheliale inhoud te kunnen beoordelen of microdissectie is voordelig voor profielen van tumoren met hoge stromale inhoud, zoals maag- of pancreatische adenocarcinomen.
Microdissection is bijzonder bruikbaar voor het verrijken maag kanker tumorcellen verkregen van endoscopische biopsie monsters, in het bijzonder diffuse type maagkanker dat uit verspreide tumorcellen gemengd met ontstekingscellen en fibrose. De daling van de totale incidentie van maagcarcinoom in U.S. deze eeuw lijkt grotendeels toe te schrijven aan een daling van de intestinale lesies van type zijn, terwijl het optreden van diffuse type wordt gedacht hetzelfde gebleven [4]. Met behulp van monsters verkregen door LCM, Wu et al
. gemeld dat maligne versus benigne maagepitheelcellen onderscheiden zou kunnen worden met een nauwkeurigheid van 99% gebaseerd op een 504-gen predictor [5]. Deze voorspeller inclusief bekende genen tot expressie gebracht in de maag epitheel inbegrip Trefoil factoren 1, 2 en 3 [5]. Met behulp van LCM, Jinawath et al
. 46 geïdentificeerde genen die verschillende moleculaire signaturen kunnen vormen voor de twee histologische types maagkanker - diffuse type en intestinale type maagkanker [6]. Er zijn echter geen studies zijn uitgevoerd tot op heden rechtstreeks vergelijken van de macrodissection vs
. . LCM methoden met behulp van dezelfde set van maagkanker monsters
In deze studie hebben we getracht de verschillen tussen expressie profielen afgeleid van dezelfde tumoren die door zowel macrodissection en LCM werden verwerkt voor microarray-analyses te evalueren. Gezien de moeilijkheden bij het valideren van alle differentieel tot expressie van genen geïdentificeerd met behulp van elk type monstername, vergeleken we de genen geïdentificeerd door middel van onze microarray analyses eiwitten waarvan bekend is dat overexpressie bij maagkanker. Daarnaast hebben we onderzocht of expressie van genen die in elke ondertekening gecorreleerd met veranderingen in het genkopieaantal die werden geïdentificeerd door matrix comparative genomic hybridisatie (CGH) vanaf dezelfde tumoren. Eerdere studies van maagkanker hebben een hoge correlatie tussen array CGH en expressie-array data toonden [7]. Duplicaties werden geëvalueerd middels macrodissected tumor DNA om de bias gehele genoom amplificatie voorkomen. We verder bepaald of het gen handtekeningen wij van elk monster verzameld en verwerkt werkwijze verrijkt voor eiwitten die eerder gemeld worden ontregeld genen in maagkanker. Onze resultaten geven aan dat de LCM methode is gevoeliger voor de identificatie van genen die in de underexpressed kanker vergeleken met normaal weefsel (potentiële tumor suppressors), terwijl macrodissection identificeert meer genen die tot overexpressie worden gebracht bij kanker. Daarom macrodissection en LCM microdissectie blijken bruikbaar voor het bestuderen van verschillende aspecten van de biologie van kanker.
Werkwijzen Patiënten

Twintig patiënten die werden geanalyseerd in deze studie is een onderdeel van 96 patiënten die deelnamen aan een prospectief onderzoek en waarvan monsters werden gebruikt als een training uitdrukking set een chemo-response voorspeller te ontwikkelen [8]. Een deel van meningsuiting en CGH array-gegevens van hun macrodissected monsters werd eerder gemeld [8, 9]. Monstername, behandeling en follow-up werd uitgevoerd volgens een protocol door de Institutional Review Board (IRB) van het National Cancer Center Hospital in Goyang, Korea (NCCNHS01-003) goedgekeurd. Alle patiënten ondertekende een IRB-goedgekeurde informed consent formulier. In aanmerking te komen voor de inschrijving in de studie omvatte de volgende parameters: 1) leeftijd ≥ 18 jaar; 2) histologisch bevestigde adenocarcinoom van de maag; 3) klinisch gedocumenteerde metastasen op afstand; 4) geen eerdere of gelijktijdige dan de maagkanker maligniteiten; 5) er geen voorgeschiedenis van chemotherapie, ofwel adjuvant of palliatief; en 6) voldoende functie van alle belangrijke organen. Patiënten kregen cisplatine 60 mg /m 2 IV op dag 1 en fluorouracil 1000 mg /m 2 IV op dagen 1-5 van een 3-week schema.
Tissue verwerking
Voordat macrodissection, tumor samples had mediane tumor kernen van 50% (interkwartielafstand, 30-60%). Macrodissection werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [10]. Macrodissection leiden tot gemiddeld 60% van de tumor kernen boven slide (interkwartielafstand, 60-72,5%). Voor microdissectie, tumor en normaal weefselmonster vriescoupes werden gesneden in 10 urn, en ingevroren bij -80 ° C. Objectglaasjes werden gedehydrateerd middels nuclease-vrij HistoGene (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) reagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Microdissection werd uitgevoerd met behulp van PixCell II (Arcturus Bioscience, Mountain View, CA). Uitdroging en LCM beperkt tot 15 minuten of minder voor elk monster verzameld. Een totaal van 10.000 laserschoten (puntgrootte van 15 urn in diameter) werden verzameld met behulp CaPSURE Macro LCM Caps voor elk monster. RNA werd geïsoleerd onder PicoPure RNA Isolation Kit (Molecular Devices). In het kort werden de epitheelcellen geïncubeerd met 50 pl extractiebuffer in een 0,5 ml microcentrifuge buis bij 42 ° C gedurende 30 minuten. DNase (QIAGEN, Valencia, CA) behandeling werd direct uitgevoerd in de zuiveringskolom, en het RNA werd geïsoleerd met het elutievolume van 8 pi (Molecular Devices). Vijf pi van RNA uit gemicrodissecteerd celpopulaties werd omgezet gebiotinyleerde antisense cRNA doel, met het Affymetrix twee cycli methode labeling (Santa Clara, CA). Alle gebiotinyleerde doelen waren gefragmenteerd en 15μ
g elk werd gehybridiseerd met HG-U133A GeneChip microarrays volgens het protocol van de fabrikant. Gescande reeks beelden werden beoordeeld en omgerekend naar gegevens met de Affymetrix MAS 5,0 algoritme signaal.
Array CGH
Genomisch DNA geëxtraheerd uit monsters met behulp TRI reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), volgens het protocol van de fabrikant, en bovendien gezuiverd met het QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN). Voor array CGH experimenten, Agilent 4x44k HD-CGH microarrays met 44.000 functies (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) werden gebruikt. 0,5-1 ug tumor genomische DNA monsters en dezelfde hoeveelheid humaan genomisch DNA uit verschillende anonieme vrouwelijke donoren (Promega, Madison, WI) werden geknipt met AluI (50 eenheden) en RsaI (50 eenheden) gedurende 2 uur bij 37 ° C . 5 ui statistische primer werd gemengd met het gedigereerde DNA-matrijs. De verwijzing en proeven van DNA werden gemerkt met behulp van Agilent Labeling Kit PLUS, die 5x buffer, 10x dNTP omvat, Cy-3/5 dUTP (1,0 mM) en Exo-Klenow Fragment. De sonde mengsel van Cy3 gemerkte monster-DNA, Cy5 gemerkte referentieverbinding DNA (39 pi), 5 pl menselijk Cot-1 DNA (Invitrogen), 11 gl Agilent 10 × blokkeermiddel en 50 pl Agilent 2 x hybridisatiebuffer werd gedenatureerd bij 95 ° C gedurende 3 minuten en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De probe werd op de array met een Agilent microarray hybridisatie kamer en gehybridiseerd gedurende 21 uur bij 65 ° C in een roterende oven bij 20 rpm. Arrays werden gewassen volgens de aanbevelingen van de fabrikant, gedoopt in Agilent stabiliseren en drogen oplossing en gescand met behulp van een Agilent 2565AA DNA microarray scanner. De Agilent Scan Program Control Program 7.0 en Agilent Feature Extraction Software Program 9.5.1 werden gebruikt voor de verwerking van gegevens. Array CGH gegevens werden geanalyseerd met behulp van Agilent CGH Analytics software (versie 3.5.14). ADM-2 algoritme drempel 6, met fuzzy nul en centralisatie werd gebruikt om aberratie te identificeren. Criteria voor aberratie filtering waren minimum probes van 5, minimale gemiddelde absolute log 2-verhouding van 0,5, en een maximale afwijkingen van 1.000.000. Afwijkingen die voor elk monster werden opgesomd en grafisch weergegeven.
Maagkanker genen in de literatuur Belgique Om een ​​door de gebruiker gedefinieerde gen set genereren voor onze genen vergelijking analyseert, zochten we PubMed database naar genen met maagkanker cel-specifieke eiwit expressie, met behulp van trefwoorden of "maagkanker", "immunohistochemie" en "overexpressie" of "verlies van meningsuiting". Voor onze genen set vergelijking analyseert, werden gen symbolen van maagkanker specifieke genen in kaart gebracht om set id's aan de HG-U133A serie sonde (http:.. //Www NetAffx com). Er waren 178 ( "overexpressie") en 327 ( "verlies van meningsuiting") artikelen in de Pubmed op het moment van schrijven.
Statistische analyse op de expressie-array data
Affymetrix HG-U133A genexpressie microarray gegevens werden geanalyseerd met gen set vergelijking algoritmes van BRB ArrayTools (versie 3.8, National Cancer Institute, http:.... //Linus NCI nih gov /BRB-ArrayTools html) [11]. Het gen set vergelijking tool analyseert de gebruiker gedefinieerde gen sets voor differentiële expressie tussen vooraf gedefinieerde klassen (dat wil zeggen
., Kanker vs
. Normaal) van een bron dataset. Gebruiker gedefinieerde groepen van genen die in deze studie ook U133A probe die overeenstemmen met genen met kopie-aantal veranderingen, overeenkomend met maagkanker genen in de literatuur. Genen waarvan tumor /normaal log 2 verhouding groter dan 0,5 in ten minste één van 20 patiëntenmonsters werden opgenomen in de lijst van genen met copy number gain. Op dezelfde genen met copy number verlies (log 2 verhouding < -0,5) werden genoteerd. Deze door de gebruiker gedefinieerde gen sets werden geanalyseerd op differentiële expressie tussen de 20 monsters van kanker en 6 normale monsters (dwz
., 3 macrodissected en 3 gemicrodissecteerde monsters).
Voor elke bron dataset, een P
-waarde is berekend voor elk gen om de expressie-niveau voor de differentiële expressie tussen vooraf gedefinieerde klassen, het genereren van een gerangschikt gen lijst van een bepaalde BRB-ArrayTools project te correleren. Voor een set van N
genen, is de kleinste kwadraten (LS) statistische gedefinieerd als de gemiddelde negatieve natuurlijke logaritme van de P
-waarden van de geschikte enkel gen univariate proeven [12]. Een samenvatting statistiek is berekend dat deze P
waarden over de door de gebruiker gedefinieerde gen set vat; de samenvatting statistiek is gemiddeld log (P
) voor de LS samenvatting van hoe de P
waarden afwijken van een gelijkmatige verdeling van LS [12]. De samenvatting statistiek is gerelateerd aan de verdeling van de samenvattende statistieken voor steekproeven van N
genen bemonsterd uit die voorgesteld op de array. Hier N
is het aantal genen in de door de gebruiker gedefinieerde gen set. 100.000 willekeurige gen sets werden bemonsterd om deze verdeling te berekenen. De LS P
waarde is het aandeel van de willekeurige sets van N
genen met kleinere gemiddelde samenvatting statistieken dan de LS samenvattingen berekend voor de echte data.
BRB-ArrayTools geschat LS P
waarden voor de verrijking van de 4 groepen van genen in ons gastrische kanker transcriptoom handtekening die door elk weefsel verwerkingsmethode als volgt. Eerst, om de 2324 genen geassocieerd met copy number gain ons gastrische kanker transcriptoom signatuur die door de microdissectie vergelijken de statistiek van LS 2324 geamplificeerde genen werd geschat door het berekenen van een gemiddelde negatieve natuurlijke logaritme van de P
waarden van de enkel gen univariate tests voor differentiële expressie van elk van 2324 genen tussen 20 gemicrodisseceerde maag kankermonsters en 6 normale monsters. Vervolgens berekend BRB-ArrayTools het aandeel van de willekeurige sets van 2324 genen met kleinere gemiddelde samenvatting statistieken dan de LS samenvattingen berekend voor de echte data (LS P
waarde). De gastrische kanker transcriptoom handtekening die door de microdissectie werd ook vergeleken met 677 genen geassocieerd met het kopieaantal verlies, 58 eiwitten gerapporteerd dat overexpressie bij maagkanker en 66 eiwitten naar verluidt underexpressed bij maagkanker, met respectievelijke LS P
waarden. LS P
waarde van minder dan 0,01 werd beschouwd als significant. Dezelfde analyses werden herhaald voor de maag handtekening kanker transcriptoom geïdentificeerd door de macrodissection methode.
Immunohistochemie
TFF1 immunohistochemie werd uitgevoerd met behulp van chirurgische of endoscopische biopsie weefselmonsters van 16 maagkanker patiënten (16 kanker en 2 aangrenzende normale weefselmonsters), en 4 gezonde vrijwilligers, die niet waren opgenomen in dit DNA microarray studie. Grove-normaal maagslijmvlies weefselmonsters werden verzameld uit de maag antrum van gezonde vrijwilligers die een blinde biopsie techniek met geïnformeerde toestemming [9]. In paraffine ingebedde formaline gefixeerd weefselobjectglaasjes (4 pm dik) werden gekleurd met 13.734-1-AP (Proteintech Group, Chicago, IL) en 1:50 gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur en Envision anti-konijn mierikswortel peroxidase (K4003, DAKO , Carpinteria, CA) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De reactie werd gevisualiseerd met behulp van diaminobenzidine (K3468, DAKO) en tegengekleurd met hematoxyline. TFF1 expressie werd geëvalueerd semi-kwantitatief bij 200x vergroting
, gebaseerd op percentage van positief gekleurde cellen ( "-" = immunokleuring in ≤ 10% van de cellen, "+" = 11-50%; "++" = 51- 75%; "+++" = 76-100%) [13, 14]. Immunokleuring zonder primair antilichaam en normale gastrische epitheel van controle weefsel microarray dienden als negatieve en positieve controles, respectievelijk [15]. Cytoplasma vlek die ondubbelzinnig dieper dan achtergrond werd geteld als positief was.
Resultaten
Bepaling van de wereldwijde genexpressie handtekeningen van macrodissected en LCM monsters
Tabel 1 schetst de clinico-pathologische kenmerken van de patiënten en vrijwilligers in deze microarray studie. Microarray gegevens werden verkregen voor zowel LCM en macrodissected monsters van dezelfde 20 biopsies (Figuur 1A). Hoewel van aanvaardbare kwaliteit, microarray gegevens van LCM monsters hadden over het algemeen lager "Deze oproep" dan macrodissected samples (gegevens niet
getoond). Principal component analyse van de wereldwijde genexpressie patronen afkomstig van de micro- en macro-ontleed maagkanker, en de normale monsters toonde een duidelijke scheiding van elk monster groep (Figuur 1B). De mediane Pearson correlatie tussen de twee verwerkingsmethoden was 0,75 (interkwartielafstand, 0,71-0,81) .table 1 Clinico-pathologische kenmerken van de patiënten en vrijwilligers in microarray analyse

De patiënten (n = 20)
Vrijwilligers (n = 6)
Baseline clinico-pathologische kenmerken
Age-bouwjaar Median
59
52
interkwartielbereik
54-69
43-61
Sex - geen. (%)
Man
16 (80%)
3 (50%)
Vrouw verhuur 4 (20%)
3 (50%)
performance status (PS ) - Nee. (%)
ECOG1 PS 0 of 1
20 (100%)
Histologisch soort - geen. (%)
Lauren's intestinale
6 (30%)
Lauren's diffuse
14 (70%)
Locatie van de primaire laesie - geen. (%)
Upper 1/3 verhuur 4 (20%)
Midden 1/3
6 (30%)
Lower 1/3
10 (50%)
Distant metastase - geen. (%)
20 (100%)
behandeling en resultaat
Chemotherapie - geen. (%)
Cisplatine /fluorouracil
20 (100%)
Overall survival -. Maand
Median
8,0
interkwartielbereik
5,6-14,7
tijd tot progressie -. maand
Median
3.5
interkwartielbereik
2,3-6,2
1Eastern Cooperative Oncology Group
Figuur 1 (A) Studie schema van monstername en microarray verwerking (B) Belangrijkste component analyse van genexpressie profielen van micro- en macro ontleed tumormonsters van 20 patiënten met maagkanker en 6 normale monsters van gezonde vrijwilligers.
tabellen 2 en 3 tonen genen overexpressie in micro- en macro-ontleed maagkanker monsters kenmerkselectietechnieken P Restaurant < 10 -6. Celmorfologie
(AIF1, E2F1, E2F3, KIR2DL1, KIRREL, NPR1, RUNX2, TRIO
) was de meest verrijkte functionele categorie van de 42 genen tot overexpressie gebracht in de gemicrodissecteerde monsters vergeleken met de normale monsters (feature selectie P
< 10 -6), zoals geïdentificeerd door Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (tabel 2). Tumor morfologie
(APOE, BIRC5, CD14, COL1A1, COL1A2, CYR61, FKBP1A, IL8, MCAM, MIF, RHOB
) was de meest verrijkte functionele categorie onder de 73 genen tot overexpressie gebracht in de macrodissected monsters (feature selectie P Restaurant < 10 -6) van IPA (tabel 3). Extracellulaire matrix genen, zoals COL6A2, COL1A1,
COL1A2 en COL5A2
waren prominent in de macrodissected monsters en vermoedelijk bijgedragen door de stromacellen. Tabel 4 toont genen underexpressed in micro- en macro-ontleed maagkanker monsters op optie-P Restaurant < 10 -6.Table 2 Genen overexpressie in gemicrodissecteerde maagkanker bij optie-P Restaurant < 06/10
Gene

FC1

Gene

FC

BMP3
38.52
HIST1H4C
6.3
BGN
30.3
LEPRE1
5.9
TRIO
18.5
ETNK2
5.6
GADD45GIP1
17.2
TRIP6
5.3
MIER2
16.7
FAM125B
5.3
KIFC3
16.4
NPR1
5.3
217318_x_at
13.7
DSCC1
5.3
217219_at
13.2
CLUL1
5.0
RUNX2
12.5
HMGB3
4.5
SMARCD1
12.0
E2F3
4.3
KIRREL
12.0
AIMP2
4.2
215621_s_at
12.0
ATAD5
4.0
GRM2
10.0
E2F1
3.8
FJX1
10.0
FKSG49
3.7
AIF1
10.0
DVL2
3.7
THY1
9.1
TIPRL
2.9
CARD10
9.1
EIF2C3
2.9
SIM2
9.1
NAT10
2.8
AIF1
9.1
MED27
2.7
APOBEC3G
8.3
PIN4
2.7
RHAG
8.3
CTPS
2.6
1fold verandering, gedefinieerd door de expressie verhouding van kanker naar de normale (= kanker /normaal)
2Alle deze genen had valse ontdekking rate < 0,001
Tabel 3 Genen overexpressie in macrodissected maagkanker bij optie-P
. < 06/10
Gene

FC1

Gene

FC

LY6E
24.42
SRM
6.7
IL8
22.7
NGLY1
6.7
CA12
20.0
RHOB
6.3
SBNO2
19.2
ACTN1
5.9
UBE2S
17.2
LOXL2
5.9
CYR61
17.2
COL5A2
5.9
ANGPT2
15.9
TRIM28
5.6
COL6A2
14.3
218982_s_at
5.6
BOP1
13.2
C7orf44
5.3
COL1A1
13.2
UBE2C
5.3
LPL
13.0
CEP76
5.3
MFGE8
12.8
BIRC5
5.3
APOE
12.2
PNO1
5.0
G6PC3
10.9
FSTL1
5.0
215900_at
10.3
GRINA
4.8
NUP62
10.0
MRTO4
4.8
MRPL4
10.0
STC1
4.8
GNL3L
10.0
MRPL12
4.5
MCAM
9.1
FKBP1A
4.5
PDLIM7
9.1
IFI30
4.5
216472_at
9.1
KPNA6
4.3
ACTN1
9.1
216532_x_at
4.3
BYSL
9.1
CENPI
4.2
GNAI2
8.3
PPM1G
4.2
NCAPH2
8.3
ICT1
3.7
CD14
8.3
SFRS14
3.6
EXOSC4
8.3
CTPS
3.6
OBFC2B
8.3
IMP4
3.3
PPP1R15A
7.7
UBE2G2
3.2
COL1A2
7.7
ISG20L2
3.2
GPX1
7.7
EIF4A1
3.1
MIF
7.7
HDGF
2.6
NME1
7.1
PSMD14 2.6
PPIL2
7.1
220856_x_at
2.4
CCDC85B
7.1
CNOT3
2.4
SPARC
6.7
GLT25D1
2.0
C8orf55
6.7
1fold verandering, gedefinieerd door de expressie verhouding van kanker naar de normale (= kanker /normaal)
2Alle deze genen had valse ontdekking tarief. ≪ 0,001
Tabel 4 Genen underexpressed in micro- en macro-ontleed maagkanker bij functie selectie P Restaurant < 06/10
gemicrodissecteerde

Macrodissected

Gene

FC1

Gene

FC

HPGD
-25.02
208498_s_at
-11.1
HRASLS2
-20.0
SIDT2
-7.7
ABCC3
-20.0
MUC5AC
-5.9
SLC25A37
-16.7
CTAGE5
-5.0
ABHD2
-14.3
GNA11
-3.8
VIPR1
-10.0
ARFIP1
-3.4
CYTIP
-9.1
214316_x_at
-3.3
GALNT6
-9.1
222149_x_at
-3.3
SULT1A2
-9.1
OAS1
-8,3
PDCD4
-7,1
NR3C2
-7,1
DOCK6
-6,3
SULT1A1
-5,9
ZFYVE26
- 5.9
213212_x_at
-5,6
DSCR3
-5,3
TMEM131
-5,3
ECHDC2
-5,0
DENND1B
-5,0
KIAA0141
-4,8
RNF103
-4,8
PDCD4
-4,5
CABIN1
-4,5
222371_at
-4,3
RRBP1
-4,0
CC2D1A
-3,8
216438_s_at
-3,8
SGSM3
-3,8
ARPC2
-3,7
TRAK1
-3,6
GNA11
-3,6
pafah1b1
-3,4
CNDP2
-3,2
SPOP
-3,1
PARP4
-3,1
ERLIN1
-2,9
1fold veranderen, bepaald door het negatieve van de uitdrukking verhouding van normaal tot kanker (= - (normaal /kanker))
2Alle deze genen had valse ontdekking rate < 0,001
Vergelijking tussen expressie en array CGH data.
Array CGH analyse werd uitgevoerd met behulp van genoom-DNA geëxtraheerd uit macrodissected monsters met > 50% tumorcellen (criteria die eerdere studies [16, 17]) omdat voldoende DNA kan worden verkregen zonder de noodzaak van hele genoom amplificatie zoals vereist voor gemicrodisseceerde monsters. Gehele genoom DNA-amplificatie kan mogelijk introduceren artifactual bias in array CGH resultaten [18]. In Figuur 2 is de frequentie van DNA kopieaantal afwijkingen tussen alle 20 monsters. Onze kopieaantal aberratie data over het algemeen consistent met eerder gerapporteerde gegevens [7, 16, 17, 19-23]. Vier van de 20 patiënten hadden versterking van chr8 q24.13-q24.21 (126.357.475-128.822.596), die de MYC
oncogen bevat. De tweede meest voorkomende versterking locus was chr17 q21.2 (36.109.939-36.230.163), die werd versterkt in 3 patiënten. Zeven patiënten hadden geen detecteerbare chromosoomafwijkingen. Deze 7 monsters bevatten een gemiddelde van 70% tumorcellen, terwijl de overige 13 patiënten hadden een mediane 60% tumorcellen (P
waarde = 0,1). Vandaar het gebrek aan detecteerbare chromosomale afwijkingen in de 7 monsters niet door een lager percentage van tumorcellen in die monsters. Figuur 2 grafisch beeld illustreert het percentage frequentie van probes gedetecteerd (aberraties) van alle 20 monsters.
Waren er 2324 unieke genen die zijn geassocieerd met kopieaantal winst in ten minste één van de 20 patiënten en 677 genen geassocieerd met kopienummer verlies. Met behulp van gen-set vergelijking analyseert, we vergeleken deze gen sets met onze transcriptoom- handtekeningen die door de verschillende monster isolatie methoden. Onze hypothese was dat ontregelde genen geassocieerd met copy number afwijkingen hebben meer kans om betrokken te zijn als contribuanten aan oncogenese in plaats van simpelweg als "omstanders." Vandaar dat de 2324 genen bevat binnen gebieden van kopieaantal winsten werden onderzocht op hun expressie van matrix verkregen met de werkwijze macrodissection (optie-P
< 0,05). De overlap tussen de lijst van genen in gebieden van amplificatie en verrijking van hun expressie in monsters die werden macrodissected was statistisch significant (p LS
value = 10 -5 zie Werkwijzen voor statistische beschrijving). Echter, was deze vereniging niet waargenomen wanneer de expressie gegevens werden geanalyseerd van gemicrodissecteerde monsters (optie-P Restaurant < 0,05; LS P
value = 0,41) (Figuur 3A). Er was dus sterker verband tussen de structuur van het kopieaantal gain en genexpressie alleen in monsters die zijn macrodissected. Bijvoorbeeld MYC
, de meest geamplificeerde gen bij onze patiënten monsters werd bepaald significant tot overexpressie gebracht in macrodissected monsters, maar niet aan die die werden gemicrodissecteerde, hoewel dit resultaat kan het gevolg zijn van relatief kleine steekproef of heterogeniteit binnen de tumor. Figuur 3 Aantal genen overlappen van LCM en macrodissected expressie matrix datasets en array CGH gegevens voor dezelfde set van 20 patiënten.
Een lijst van 677 genen werd geïdentificeerd in regio DNA kopieaantal verlies werd gevonden in ten minste één van de 20 studie patiënten. De expressie van deze genen werd geanalyseerd in de macro- en micro-ontleed matrix datasets. Een significant verband werd gevonden tussen de genen met een verlies van het aantal kopieën en hun expressie in zowel macro- en micro-ontleed monsters. (LS P
waarden 0,009 en 0,006 voor LCM en macrodissected monsters, respectievelijk) (Figuur 3B).
Concordantie van gen handtekeningen met genen eerder gemeld te worden geassocieerd met maagkanker Hotels A PubMed literatuuronderzoek werd uitgevoerd eerder gerapporteerd identificeren over- en expressie van genen en eiwitten voor maagkanker (trefwoorden: immunohistochemie, maagkanker en overexpressie en of verlies van expressie). 58 eiwitten overexpressie in maagkanker werden op deze wijze geïdentificeerd. Genexpressie van deze 58 eiwitten werd vastgesteld dat verrijkt in expressiegegevens uit monsters door macrodissection verzameld (LS P
< 10 -5), maar geen verrijking expressie van 58 genen werd gevonden voor monsters van verzamelde microdissectie (LS P
= 0,013). Daarentegen 66 eiwitten naar verluidt underexpressed bij maagkanker werden verrijkt in expressie matrix data van monsters door microdissectie verzameld (LS P
< 10 -5), maar niet uit monsters door macrodissection verzameld (LS P
= 0,89) (Tabel 5) .table 5 Maagkanker genen in de literatuur die differentieel tot expressie werden gebracht tussen de 20 kanker en 6 normale monsters op optie-P Restaurant < 0.05 op basis van microarray data gegenereerd met behulp van elk weefsel verwerkingsmethode
overexpressie genen in kanker
underexpressed genen in cancer

LCM&Macro1

LCM

Macro

LCM&Macro

LCM2

Macro

APOE
EGFR
AKT1
ANXA10
ANXA7
CDKN2B
AURKA
HGF
ANXA2
CASP6
BAD
FHIT
CCNE1
MET
CALR
CASP7
HLA-B
Cdc20
RhoA
CCNB1
CDH1
HLA-E
CDC25B
TNS4
EEF2
CTNNA1
HLA-G
CXCR4
ESM1
GSN
PRSS8
E2F1
HIF1a
HLA-F
PTEN
EGR1 expressie
MINA
IQGAP2
SDHB
GRB2
PHB
KCNE2
SH3GLB1
HK2
KLF4
TFF1
ICAM1
MUC6
INHBA
RARB
LOXL2
SMAD4
MCM3
PTMA
SPARC
1Previously gemeld overexpressie eiwitten voor maagkanker die ook werden tot overexpressie gebracht in onze gemicrodissecteerde (LCM) en macrodissected kanker monsters in vergelijking met een normale monsters
2Previoulsy gemeld underexpressed eiwitten voor maagkanker die ook werden underexpressed in onze gemicrodissecteerde (LCM) kankermonsters, maar niet in macrodissected kanker monsters
Validatie van microarray data
om onze microarray gegevens te valideren, voerden we immunohistochemische analyses een gen geïdentificeerd als underexpressed in gemicrodisseceerde kanker monsters van 16 patiënten en 4 vrijwilligers die niet waren opgenomen in DNA microarray studie. TFF1
is geselecteerd voor dit immunohistochemie valideringsonderzoek omdat het aanzienlijk underexpressed in de LCM monsters (P
= 0,0036), maar niet in monsters macrodissected (P
= 0,09), in vergelijking met een normale maagslijmvlies. TFF1 immunoreactiviteit in kanker werd beoordeeld als -, +, ++ en +++ in 7 (43,8%) 3 (18,7%) 4 (25,0%) en 2 (12,5%), respectievelijk. Daarentegen alle 6 normale maagslijmvlies monsters (4 gezonde vrijwilligers en 2 aangrenzende normale weefselmonsters) geconserveerd TFF1 immunoreactiviteit (+++) (figuur 4). Zo maagkanker monsters hadden significant lagere TFF1 immunologische dan normaal maagslijmvlies, in overeenstemming met eerdere rapporten [13, 14] (P
voor chi-kwadraat = 0,007). Figuur 4 Representatieve TFF1 immunohistochemische kleuringen voor (A) een maagdarmkanker tonen verlies van TFF1 expressie, en (B) normaal maagslijmvlies van een gezonde vrijwilliger expressie TFF1 in maagepitheelcellen. (Vergroting = 200x)
Deze resultaten demonstreren dat macrodissection-gebaseerde genexpressie analyses overtrof genexpressie analyses van LCM monsters voor identificatie van genen tot overexpressie gebracht bij maagkanker.

• BariSurg proef: Sleeve gastrectomie versus Roux-en-Y gastric bypass in obese patiënten met een BMI 35-60 kg /m2 - een multi-center gerandomiseerde patiënt en waarnemer blind non-inferioriteit studie
• Expressie profiel van mucinen (MUC2, MUC5AC en MUC6) in Helicobacter pylori geïnfecteerde pre-neoplastische en neoplastische menselijke maag epitheel