Forskjeller i mage kreft genekspresjonssignaturer avledet fra laser capture mikrodisseksjon versushistologic macrodissection

Forskjeller i mage kreft genekspresjonssignaturer avledet fra laser capture mikrodisseksjon versus
histologisk macrodissection
Sammendrag Bakgrunn
magekreft prøver tatt ved histologisk macrodissection inneholde en relativt høy stromal innhold som kan betydelig påvirke genuttrykk profiler. Forskjeller mellom genuttrykk signaturen stammer fra macrodissected magekreft prøver og signaturen hentet fra isolerte magekreft epitelceller fra samme biopsier ved hjelp av laser-fangst mikrodisseksjon (LCM) ble vurdert for deres potensielle eksperimentelle skjevheter.
Metoder
RNA ble isolert fra frosne vevsprøver av magekreft biopsier fra 20 pasienter som bruker både histologiske macrodissection og LCM teknikker. RNA fra LCM var gjenstand for en ekstra runde med T7 RNA forsterkning. Expression profilering ble utført med Affymetrix HG-U133A arrays. Gener som er identifisert i ekspresjons-signaturene fra hvert vev bearbeidingsmetode ble sammenlignet med et sett av gener som finnes i kromosomale regioner funnet å nære kopitall avvik i tumorprøver av matrisen CGH og til proteiner som tidligere er identifisert som å være overuttrykt i magekreft.
resultater
Gener vist seg å ha økt kopiantall i magekreft ble også funnet å være overuttrykt i prøver tatt av macrodissection (LS P
verdi < 10 -5), men ikke i array-data generert ved hjelp mikrodisseksjon . Et sett av 58 tidligere identifiserte gener overuttrykt i magekreft ble også anriket i genet signaturen identifiseres ved macrodissection (LS P
< 10 -5), men ikke i signaturen identifisert av mikrodisseksjon (LS P
= 0,013). I motsetning til dette, 66 gener som tidligere er rapportert å være underexpressed i magekreft ble anriket i genet signaturen identifiseres ved mikrodisseksjon (LS P
< 10 -5), men ikke i signaturen identifisert av macrodissection (LS P
= 0,89).
Konklusjoner
svulst sampling teknikk presser microarray resultater. LCM kan være mer følsomme innsamling og behandling metode for identifisering av potensielle tumor suppressor genet kandidater i magekreft ved hjelp av uttrykk profilering.
Bakgrunn
Et hovedmål for microarray analyse er identifisering av differensielt uttrykte gener i undergrupper av klinisk prøver å matche spesifikke behandlinger til kreft subtyper. Imidlertid er kvantitativt uttrykk rekke analyse av kliniske kreft prøver med høyt innhold stromal krevende ettersom forholdet av epitel-tumorceller til stromale celler kan variere sterkt. Forurensende stroma kan forvirre microarray-baserte uttrykk og kopiere antall analyser. Laser fangst mikrodisseksjon (LCM) er en verdifull teknikk som gjør det mulig å isolere epitelceller fra stromale celler, og dermed berikende for epitel innhold. Mengden av prøve og RNA erholdt ved LCM er ofte ganske begrenset, imidlertid, og krever et forsterkningstrinn for å generere tilstrekkelig materiale for mikromatriseanalyse. Denne amplifikasjonsprosessen kan påvirke resultatene, og føre til en skjev sett av differensielt uttrykte gener [1]. Histologisk macrodissection (prøver samlet fra vevssnitt guidet ved mikroskopisk analyse av en farget serie seksjon) gir en større mengde av prøvemateriale i forhold til LCM som kan eliminere behovet for en ytterligere runde med RNA-amplifikasjon. Men macrodissected prøvene inneholder betydelig mer stromal celleinnhold enn prøver tatt av mikrodisseksjon.
Tidligere studier har sammenlignet disse to vev bearbeidingsmetoder for klinisk kreftprøver. Basert på data fra 14 endetarms adenokarsinom prøver, Bruin et al
. begunstiget macrodissection enn mikrodisseksjon på grunn av den relativt lave bidrag av stromale komponenter i macrodissected prøver fra denne tumortype, og de forspente genekspresjon resultater fra microdissected prøver på grunn av amplifikasjon av RNA som er nødvendig for disse prøver [2]. På den annen side, Klee et al
. antydet at mikrodisseksjon profilering identifisere et stort antall differensielt uttrykte gener som ikke er funnet ved hjelp av bulk vev prøvetaking, basert på data fra 10 lunge adenokarsinomer og 6 tilstøtende normale prøver [3]. Disse studiene var begrenset av små utvalg, og derfor kreve ytterligere validering. Det er også uklart om genene identifisert unikt hjelp microdissected prøvene representerer nyttige biomarkører. Bias følge av RNA forsterkning må veies opp mot nytten av berikende prøver for epitel innhold i vurderingen av om mikrodisseksjon er en fordel for uttrykk profilering av svulster med høy stromal innhold, for eksempel mage eller bukspyttkjertelen adenokarsinomer.
Mikrodisseksjon er spesielt nyttig for berikende mage krefttumorceller oppnådd fra endoskopiske biopsiprøver, spesielt fra diffus-type magekreft som er sammensatt av spredte tumorceller blandet med inflammatoriske celler og fibrose. Nedgangen i total forekomst av magekreft i USA i løpet av dette århundret synes å være stor grad tilskrives en nedgang på tarm typen lesjoner, mens forekomsten av diffuse typen er antatt å ha vært den samme [4]. Ved hjelp av prøver tatt av LCM, Wu et al
. rapporterte at ondartet versus godartede gastriske epitel-celler kunne skjelnes med en nøyaktighet på 99% basert på et 504-genet prediktor [5]. Dette prediktor inkluderte kjente gener som uttrykkes i den gastriske epitel inkludert Trefoil faktorer 1, 2, 3 og [5]. Ved hjelp av LCM, Jinawath et al
. 46 identifiserte gener som kan utgjøre distinkte molekylære signaturer for de to histologiske typer av magekreft - diffus-type og intestinal-type gastriske cancere [6]. Imidlertid har ingen studier hittil utført direkte sammenligne macrodissection vs
. LCM metoder bruker samme sett av magekreft prøver.
I denne studien har vi søkt å evaluere forskjeller mellom uttrykk profiler som stammer fra de samme svulster som ble behandlet av både macrodissection og LCM for microarray analyse. På grunn av vanskeligheter med å validere alle de differensielt uttrykte gener som er identifisert ved hjelp av hver type prøveinnsamling, sammenlignet vi genene som er identifisert gjennom mikromatriseanalyse med proteiner som er kjent for å være overuttrykt i magekreft. I tillegg har vi fastslått hvorvidt ekspresjon av gener som er identifisert i hver signatur korrelert med forandringer i genkopitallet som ble identifisert ved sammenlignende matrise genomisk hybridisering (CGH) fra de samme tumorer. Tidligere studier av magekreft har vist en høy korrelasjon mellom matrise CGH og uttrykk array-data [7]. Kopitallet forandringer ble undersøkt ved hjelp av macrodissected tumor-DNA for å unngå forspenningen fra hele genomet forsterkning. Vi videre bestemt om genet underskrifter vi innhentet fra hver prøve innsamling og behandling metoden ble beriket for proteiner som tidligere har blitt rapportert å være dysregulerte gener i magekreft. Våre resultater tyder på at LCM-metoden er mer følsom for identifisering av gener som er underexpressed i kreft sammenlignet med normalt vev (potensielle tumor suppressorer), mens macrodissection identifiserer flere gener som blir overuttrykt i kreft. Derfor macrodissection og LCM mikrodisseksjon vises nyttige for å studere ulike aspekter av kreft biologi.
Metoder
Pasienter
Tjue pasienter som ble analysert i denne studien er en del av 96 pasienter som deltok i en prospektiv studie og hvis prøvene ble benyttet som et uttrykk treningssettet for å utvikle en chemo-respons prediktor [8]. En del av uttrykk og CGH array-data fra sine macrodissected prøvene ble tidligere rapportert [8, 9]. Prøvetaking, behandling og oppfølging ble utført i henhold en protokoll godkjent av Institutional Review Board (IRB) av National Cancer Center Hospital i Goyang, Korea (NCCNHS01-003). Alle pasienter signert en IRB-godkjent informert samtykke skjema. Valgbarhet for registrering i studien omfattet følgende parametre: 1) alder ≥ 18 år; 2) histologisk-bekreftet adenokarsinom i ventrikkel; 3) klinisk dokumentert fjernmetastaser; 4) andre enn magekreft ingen tidligere eller samtidig kreftformer; 5) ingen tidligere historie med kjemoterapi, enten adjuvant eller palliativ; og 6) tilfredsstillende funksjon av alle viktige organer. Pasientene fikk cisplatin 60 mg /m 2 IV på dag 1 og fluorouracil 1000 mg /m 2 IV på dag 1-5 av en tre-ukers timeplan.
Tissue behandling
Før macrodissection, tumor prøver hadde median tumor kjerner av 50% (interkvartilt rekkevidde, 30-60%). Macrodissection ble utført som tidligere beskrevet [10]. Macrodissection føre til gjennomsnittlig 60% av tumorkjerner på toppen lysbilde (interkvartilt område, 60 til 72,5%). For mikrodisseksjon, tumor og normalt vev prøvefrysesnitt ble kuttet ved 10 um, og lagret frosset ved -80 ° C. Skinnene var dehydrert ved hjelp nukleasefritt HistoGene (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) reagenser i henhold til produsentens anbefalinger. Mikrodisseksjon ble utført ved hjelp PixCell II (Arcturus Bioscience, Mountain View, California). Dehydrering og LCM ble begrenset til 15 minutter eller mindre for hver prøve oppsamlet. En total på 10.000 laserskudd (punktstørrelse på 15 pm i diameter) ble oppsamlet under anvendelse av Media CapSure Makro LCM Korker for hver prøve. RNA ble isolert ved hjelp PicoPure RNA Isolation Kit (Molecular Devices). I korthet, ble epitelceller inkubert med 50 ul av ekstraksjonsbuffer i et 0,5 ml mikrosentrifugerør ved 42 ° C i 30 minutter. DNase (QIAGEN, Valencia, CA) behandling ble utført direkte i rensekolonnen, og RNA ble isolert ved anvendelse av elueringsvolumet av 8 ul (Molecular Devices). Fem pl av RNA fra microdissected cellepopulasjoner ble omdannet til biotinylert, antisense cRNA mål, ved hjelp av Affymetrix to-syklus merking metode (Santa Clara, CA). Alle biotinylerte mål var fragmentert og 15μ
g av hver ble hybridisert til HG-U133A Genechip mikromatriser følge produsentens protokoll. Skannede array-bilder ble anmeldt og konvertert til signaldata med Affymetrix MAS 5.0 algoritme.
Array CGH
Genomisk DNA ble ekstrahert fra prøver ved hjelp TRI reagens (Invitrogen, Carlsbad, California), i henhold til produsentens protokoll, og i tillegg renset ved hjelp av QIAamp DNA Micro-sett (QIAGEN). For array-CGH eksperimenter ble Agilent 4x44k HD-CGH Mikromatriser inneholder 44.000 funksjoner (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) brukes. 0,5-1 ug av tumor genomiske DNA-prøver, og den samme mengde av humant genomisk DNA fra flere anonyme kvinnelige donorer (Promega, Madison, WI) ble spaltet med Alul (50 enheter) og Rsal (50 enheter) i 2 timer ved 37 ° C . 5 ul av Random Primer ble blandet med det fordøyde DNA-templat. Referanse og prøve-DNA ble merket ved bruk av Agilent Labeling Kit PLUS, som omfatter 5x buffer, 10x dNTP, Cy-3/5 dUTP (1,0 mM), og Exo-Klenow fragment. Sonden blanding av Cy3 merket prøve-DNA, Cy5 merket referanse DNA (39 mL), 5 mL av menneskelig Cot-1 DNA (Invitrogen), 11 mL av Agilent 10 × blokker og 50 ul av Agilent 2 × hybridisering buffer ble denaturert ved 95 ° C i 3 minutter og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Proben ble påført på matrisen ved hjelp av en Agilent microarray hybridisering kammeret, og hybridisert i 21 timer ved 65 ° C i en roterende ovn ved 20 rpm. Arrays ble vasket i henhold til produsentens anbefalinger, dyppet i Agilent stabiliserende og tørking løsning, og skannet med en Agilent 2565AA DNA microarray scanner. Agilent Scan Program Control Program 7.0 og Agilent Feature Extraction Programvaren 9.5.1 ble brukt for databehandling. Array CGH data ble analysert ved hjelp av Agilent CGH Analytics (versjon 3.5.14). ADM-2-algoritmen med terskel 6, med fuzzy null og sentralisering på, ble brukt til å identifisere aberrasjon. Kriterier for aberrasjon filtrering var minste sonder av 5, minimum gjennomsnittlig absolutt log 2-forhold på 0,5 og maksimum avvik av millioner. Avvik identifisert for hver prøve ble oppført og grafisk vises.
Gastric kreftgener i litteraturen
For å generere en brukerdefinert genet satt for vår genet sammenligning analyser, vi søkte PubMed database for gener med magekreft cellespesifikke proteinet uttrykk, ved hjelp av søkeord av "magekreft", "immunhistokjemi" og "overuttrykt" eller "tap av uttrykket". For vår genet sett sammenligning analyser, ble genet symboler av magekreft spesifikke gener kartlagt å sondere sett IDer på HG-U133A array (http: com //www NetAffx..). Det var 178 ( "uttrykt") og 327 ( "tap av uttrykket") artikler i Pubmed på i skrivende stund.
Statistisk analyse på uttrykk array-data
Affymetrix HG-U133A genuttrykk microarray data ble analysert med gen set sammenligning analyse algoritmer av BRB ArrayTools (versjon 3.8, National Cancer Institute, http:.... //Linus NCI nih gov /BRB-ArrayTools html) [11]. Genet satt sammenligning verktøyet analyserer brukerdefinerte gensettene for differensial uttrykk blant forhåndsdefinerte klasser (dvs.
., Kreft vs
. Normal) av en kilde datasett. Brukerdefinerte gensettene brukt i denne studien omfatter U133A-probe-sett som svarer til gener med kopitallet forandring og som svarer til magekreft gener i litteraturen. Gener hvis tumor /normal log 2-forhold er høyere enn 0,5 i minst ett av 20 pasientprøver ble inkludert i listen av gener med kopiantall gevinst. Tilsvarende gener med kopi nummer tap (log 2 ratio < -0,5) ble oppført. Disse brukerdefinerte gensettene analysert for differensial uttrykk mellom 20 kreftprøver og 6 normale prøver (dvs.
., 3 macrodissected og 3 microdissected prøver).
For hver kilde datasett, er en P
-verdi beregnet for hvert gen for å korrelere ekspresjonsnivået for den differensielle ekspresjonen mellom forhåndsdefinerte klasser, genererer en rangert liste gen av et gitt BRB-ArrayTools prosjekt. For et sett av N
gener, er minste kvadraters (LS) statistikk definert som den midlere negative naturlige logaritmen av P
-verdier av de egnede enkelt gen univariable tester [12]. Et sammendrag statistikk er beregnet som oppsummerer disse P
verdier over brukerdefinerte genet sett; sammendraget statistikken er gjennomsnittlig log (P
) for LS oppsummering av hvordan P
verdier avviker fra en jevn fordeling for LS [12]. Sammendraget statistikk er knyttet til fordelingen av sammendragsstatistikk for stikkprøver av N
gener, samplet fra de som er representert på tabellen. Her N
er antall gener i det brukerdefinerte gen sett. 100.000 tilfeldige gensettene samplet å beregne denne fordelingen. LS P
verdi er andelen av tilfeldige sett av N
gener med mindre gjennomsnittlig sammendrag statistikk enn LS sammendrag beregnet for de virkelige data.
BRB-ArrayTools estimerte LS P
verdier for anriking av 4 gensettene i vårt magekreft transkriptomet signatur identifiseres ved hvert vev prosesseringsmetode som følger. Først, for å sammenligne 2.324 gener assosiert med kopitall vinning med vår magekreft transkriptomet signatur identifisert ved mikrodisseksjon ble LS-statistikken fra 2.324 amplifiserte gener estimert ved å beregne en middelverdi negativ naturlig logaritme av P
verdiene av enkelt gen univariate tester for differensial uttrykk for hver av 2.324 gener mellom 20 microdissected magekreft prøver og 6 normale prøver. Deretter BRB-ArrayTools beregnet andelen av tilfeldige sett av 2.324 gener med mindre gjennomsnittlig sammendrag statistikk enn LS sammendrag beregnet for de virkelige data (LS P
verdi). Den magekreft transkriptomet signatur identifisert av mikrodisseksjon ble også sammenlignet med 677 gener assosiert med kopien antall tap, 58 proteiner rapportert å være overuttrykt i magekreft, og 66 proteiner rapportert å være underexpressed i magekreft, med respektive LS P
verdier. LS P
verdi mindre enn 0,01 ble betraktet som signifikant. De samme analysene ble gjentatt for magekreft transkriptomet signatur identifisert av macrodissection metoden.
Immunohistochemistry
TFF1 immunhistokjemi ble utført ved hjelp av kirurgisk eller endoskopisk biopsi vevsprøver fra 16 mage kreftpasienter (16 kreft og 2 tilstøtende prøver normale vev), og 4 friske frivillige, som ikke var inkludert i denne DNA mikromatrisestudie. Grovt-normal mageslimhinnen vevsprøver ble samlet inn fra mage antrum av friske frivillige ved hjelp av en blind biopsi teknikk, med informert samtykke [9]. Parafininnstøpte formalinfiksert vev lysbilder (4 mikrometer tykke) ble farget med 13734-1-AP (ProteinTech Group, Chicago, IL) på 1:50 i 60 minutter ved romtemperatur og Envision anti-kanin pepperrot peroksidase (K4003, DAKO , Carpinteria, CA) i 30 minutter ved RT. Reaksjonen ble visualisert ved hjelp av diaminobenzidin (K3468, DAKO) og kontra med hematoksylin. TFF1 uttrykk ble evaluert semi-kvantitativt ved 200x
forstørrelse, basert på prosentandelen av positivt fargede celler ( "-" = farging i ≤ 10% av cellene, "+" = 11-50%, "++" = 51- 75%, "+++" = 76-100%) [13, 14]. Immunfarging uten primære antistoff og normal gastrisk epitelium av en styre vev microarray tjente som negative og positive kontroller, henholdsvis [15]. Cytoplasmatiske beis som var utvetydig dypere enn bakgrunn ble regnet som positiv.
Resultater
Fastsettelse av globale genekspresjonssignaturer fra macrodissected og LCM prøver
Tabell 1 skisserer de klinisk-patologiske kjennetegn ved pasientene og frivillige inkludert i denne microarray studien. Microarray data ble innhentet for både LCM og macrodissected prøver fra de samme 20 biopsier (figur 1A). Selv av akseptabel kvalitet, microarray data fra LCM prøver hadde generelt lavere "tilstede call" enn macrodissected prøver (data ikke vist
). Prinsipal komponent analyse av de globale genuttrykksmønster avledet fra mikro- og makro dissekert mage kreft, og de vanlige prøvene viste et klart skille for hver prøve gruppe (figur 1B). Median Pearson korrelasjon mellom de to behandlingsmetodene var 0,75 (interkvartilt område, 0,71 til 0,81) .table 1 klinisk-patologisk karakteristikk av pasienter og frivillige med i microarray analyse

Pasienter (n = 20)
Volunteers (n = 6)
Baseline klinisk-patologiske egenskaper
Age år
Median
59
52
interkvartilt område
54-69
43-61
Sex - nei. (%)
Mann fra 16 (80%)
3 (50%)
Kvinne
fire (20%)
3 (50%)
performance status (PS ) - Nei. (%)
ECOG1 PS 0 eller 1
20 (100%)
Histologisk type - nei. (%)
Lauren intestinal
6 (30%)
Lauren diffuse
14 (70%)
Plassering av primær lesjon - nei. (%)
Øvre 1/3
fire (20%)
Middle 1/3
6 (30%)
Nedre 1/3
10 (50%)
Fjernmetastaser - nei. (%)
20 (100%)
behandling og utfall
kjemoterapi - nei. (%)
Cisplatin /Fluorouracil
20 (100%)
Total overlevelse -. Måned
Median
8,0
interkvartilt område
5,6 til 14,7
Tid til progresjon -. måned
Median
3,5
interkvartilt område
02.03 til 06.02
1Eastern Cooperative Oncology Group
Figur 1 (A) Study ordningen med prøvetaking og microarray behandling (B) Prinsipal komponent analyse av genekspresjonsprofiler av mikro- og makro-dissekert tumorprøver fra 20 magekreftpasienter og 6 normale prøver fra friske forsøkspersoner.
tabellene 2 og 3 viser gener overuttrykt i mikro- og makro-dissekert magekreft prøver ved funksjonsvalg P
< 10 -6. Cell morfologi plakater (AIF1, E2F1, E2F3, KIR2DL1, KIRREL, NPR1, RUNX2, TRIO
) var den mest beriket funksjonelle kategorien av de 42 genene overuttrykt i microdissected prøvene i forhold til de normale prøver (funksjonsvalg P
< 10 -6) som er identifisert av Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) (tabell 2). Tumor morfologi plakater (APOE, BIRC5, CD14, COL1A1, COL1A2, CYR61, FKBP1A, IL8, MCAM, MIF, RHOB
) var den mest beriket funksjonelle kategorien blant de 73 genene overuttrykt i macrodissected prøver (funksjonsvalg P
< 10 -6) med IPA (tabell 3). Ekstracellulære matrise gener som COL6A2, COL1A1, COL1A2
, og COL5A2
, var fremtredende i macrodissected prøvene og antagelig bidratt med de stromale celler. Tabell 4 viser gener underexpressed i mikro- og makro dissekert magekreftprøver på funksjonsvalg P
< 10 -6.Table 2 Gener overuttrykt i microdissected magekreft ved funksjonsvalg P
< 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

BMP3
38.52
HIST1H4C
6.3
BGN
30.3
LEPRE1
5.9
TRIO
18.5
ETNK2
5.6
GADD45GIP1
17.2
TRIP6
5.3
MIER2
16.7
FAM125B
5.3
KIFC3
16.4
NPR1
5.3
217318_x_at
13.7
DSCC1
5.3
217219_at
13.2
CLUL1
5.0
RUNX2
12.5
HMGB3
4.5
SMARCD1
12.0
E2F3
4.3
KIRREL
12.0
AIMP2
4.2
215621_s_at
12.0
ATAD5
4.0
GRM2
10.0
E2F1
3.8
FJX1
10.0
FKSG49
3.7
AIF1
10.0
DVL2
3.7
THY1
9.1
TIPRL
2.9
CARD10
9.1
EIF2C3
2.9
SIM2
9.1
NAT10
2.8
AIF1
9.1
MED27
2.7
APOBEC3G
8.3
PIN4
2.7
RHAG
8.3
CTPS
2.6
1fold endring, definert ved uttrykket forholdet mellom kreft til normal (= kreft /normal)
2All disse genene hadde falske funnraten < 0,001
Tabell 3 Gener overuttrykt i macrodissected magekreft ved funksjonsvalg P
. < 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

LY6E
24.42
SRM
6.7
IL8
22.7
NGLY1
6.7
CA12
20.0
RHOB
6.3
SBNO2
19.2
ACTN1
5.9
UBE2S
17.2
LOXL2
5.9
CYR61
17.2
COL5A2
5.9
ANGPT2
15.9
TRIM28
5.6
COL6A2
14.3
218982_s_at
5.6
BOP1
13.2
C7orf44
5.3
COL1A1
13.2
UBE2C
5.3
LPL
13.0
CEP76
5.3
MFGE8
12.8
BIRC5
5.3
APOE
12.2
PNO1
5.0
G6PC3
10.9
FSTL1
5.0
215900_at
10.3
GRINA
4.8
NUP62
10.0
MRTO4
4.8
MRPL4
10.0
STC1
4.8
GNL3L
10.0
MRPL12
4.5
MCAM
9.1
FKBP1A
4.5
PDLIM7
9.1
IFI30
4.5
216472_at
9.1
KPNA6
4.3
ACTN1
9.1
216532_x_at
4.3
BYSL
9.1
CENPI
4.2
GNAI2
8.3
PPM1G
4.2
NCAPH2
8.3
ICT1
3.7
CD14
8.3
SFRS14
3.6
EXOSC4
8.3
CTPS
3.6
OBFC2B
8.3
IMP4
3.3
PPP1R15A
7.7
UBE2G2
3.2
COL1A2
7.7
ISG20L2
3.2
GPX1
7.7
EIF4A1
3.1
MIF
7.7
HDGF
2.6
NME1
7.1
PSMD14 2.6
PPIL2
7.1
220856_x_at
2.4
CCDC85B
7.1
CNOT3
2.4
SPARC
6.7
GLT25D1
2.0
C8orf55
6.7
1fold endring, definert ved uttrykket forholdet mellom kreft til normal (= kreft /normal)
2All disse genene hadde falske funnrate. ≪ 0,001
Tabell 4 Gener underexpressed i mikro- og makro dissekert magekreft ved funksjonen utvalg P
< 10-6
microdissected

Macrodissected

Gene

FC1

Gene

FC

HPGD
-25.02
208498_s_at
-11.1
HRASLS2
-20.0
SIDT2
-7.7
ABCC3
-20.0
MUC5AC
-5.9
SLC25A37
-16.7
CTAGE5
-5.0
ABHD2
-14.3
GNA11
-3.8
VIPR1
-10.0
ARFIP1
-3.4
CYTIP
-9.1
214316_x_at
-3.3
GALNT6
-9.1
222149_x_at
-3.3
SULT1A2
-9.1
OAS1
-8,3
PDCD4
-7,1
NR3C2
-7,1
DOCK6
-6,3
SULT1A1
-5,9
ZFYVE26
- 5.9
213212_x_at
-5,6
DSCR3
-5,3
TMEM131
-5,3
ECHDC2
-5,0
DENND1B
-5,0
KIAA0141
-4,8
RNF103
-4,8
PDCD4
-4,5
Cabin1
-4,5
222371_at
-4,3
RRBP1
-4,0
CC2D1A
-3,8
216438_s_at
-3,8
SGSM3
-3,8
ARPC2
-3,7
TRAK1
-3,6
GNA11
-3,6
PAFAH1B1
-3,4
CNDP2
-3,2
spop
-3,1
PARP4
-3,1
ERLIN1
-2,9
1fold endres, definert ved den negative av uttrykket forholdet mellom normal til kreft (= - (normal /cancer))
2All disse genene hadde falsk funn hastighet < 0,001
Sammenligning mellom ekspresjon og matrise CGH data.
Array CGH analyse ble utført ved hjelp av genomisk DNA ekstrahert fra macrodissected prøver som inneholder > 50% tumorceller (kriterier som benyttes ved tidligere studier [16, 17]) siden tilstrekkelig DNA som kunne oppnås uten behov for hele genomet forsterkning som er nødvendig for microdissected prøver. Whole genome DNA forsterkning kan potensielt innføre kunstig skjevhet i matrise resultater CGH [18]. Vist i figur 2 er frekvensen av DNA-kopitall avvik blant alle de 20 prøver. Vår kopitallet aberrasjon data var generelt i overensstemmelse med tidligere rapporterte data [7, 16, 17, 19-23]. Fire av 20 pasienter hadde forsterkning av chr8 q24.13-q24.21 (126357475-128822596) som inneholder MYC
onkogen. Den nest vanligste forsterkning locus var chr17 q21.2 (36109939-36230163) som ble forsterket i 3 pasienter. Sju pasienter hadde ingen påvisbare kromosomavvik. Disse 7 prøvene inneholdt en median på 70% tumorceller, mens de øvrige 13 pasientene hadde en median 60% tumorceller (P
verdi = 0,1). Derfor er den manglende detekterbare kromosomforstyrrelser i de 7 prøvene var ikke på grunn av en lavere prosentandel av tumorceller i disse prøvene. Figur 2 grafisk bilde som viser den prosentvise frekvensen av prober detektert (brudd) blant alle 20 prøver.
Det var 2.324 unike gener som var knyttet til kopiantall forsterkning i det minste i en av de 20 pasienter, og 677 gener assosiert med kopiantall tap. Ved hjelp av genet sett sammenligning analyser, vi sammenlignet disse gensettene med våre transkriptom signaturer identifisert ved de ulike prøveisoleringsmetoder. Vi antok at feilregulert gener assosiert med kopi nummer avvik er mer sannsynlig å bli involvert som bidragsytere til onkogenese snarere enn bare som "tilskuere". Derfor ble de 2.324 gener som finnes i regioner av kopitall gevinster analysert med hensyn til sin ekspresjon fra matrise data oppnådd ved bruk av fremgangsmåten macrodissection (funksjonsvalg P
< 0,05). Overlappingen mellom listen over gener i områder av forsterkning og berikelse for sine uttrykk i prøver som ble macrodissected var statistisk signifikant (LS P
verdi = 10 -5, se metoder for statistisk beskrivelse). Men denne foreningen ble ikke observert når uttrykket data ble analysert fra microdissected prøver (funksjonsvalg P
< 0,05; LS P
verdi = 0,41) (figur 3A). Således er det var sterkere assosiasjon mellom mønsteret av kopiantallet vinning og genekspresjon bare i prøvene som ble macrodissected. For eksempel, MYC
, den hyppigst amplifiserte genet i våre pasientprøvene, ble bestemt til å være betydelig overuttrykt i macrodissected prøvene, men ikke i de som ble microdissected, selv om dette resultatet kan være forårsaket av forholdsvis liten prøvestørrelse eller heterogenitet innenfor svulsten. Figur 3 Antall gener overlappende mellom LCM og macrodissected uttrykk array-datasett og matrisen CGH data fra det samme sett av 20 pasienter., En liste av 677 gener ble identifisert i regioner hvor DNA-kopi antall tap ble funnet i minst ett av de 20 studiepasienter. Uttrykket av disse genene ble analysert i makro- og mikro dissekert array-datasett. En signifikant sammenheng ble funnet mellom gener med tap av kopiantall og deres uttrykk i både makro- og mikro dissekert prøver. (LS P
verdier, 0.009 og 0.006 for LCM og macrodissected prøver, henholdsvis) (figur 3B).
Concordance av gene signaturer med gener som tidligere er rapportert å være assosiert med magekreft, En PubMed litteratursøk ble utført å identifisere tidligere rapportert over- og under uttrykte gener og proteiner for magekreft (søkeord: immunhistokjemi, magekreft, og uttrykt og eller tap av uttrykk). 58 proteiner overuttrykt i magekreft ble identifisert på denne måte. Genekspresjon for disse 58 proteinene ble funnet å være anriket i ekspresjons-data fra prøver samlet etter macrodissection (LS P
< 10 -5), men ingen anrikning i ekspresjon av de 58 gener ble funnet for prøver samlet etter mikrodisseksjon (LS P
= 0,013). I kontrast, ble 66 proteiner rapportert å være underexpressed i magekreft anriket i uttrykk array-data fra prøver samlet inn av mikrodisseksjon (LS P
< 10 -5), men ikke fra prøver samlet inn av macrodissection (LS P
= 0,89) (Tabell 5) .table 5 magekreft gener i litteraturen som ble forskjellig uttrykt mellom 20 kreft og 6 normale prøver på funksjonsvalg P
< 0,05 i henhold til microarray data generert ved hjelp av hvert vev prosesseringsmetode
overexpressed gener i kreftBook Underexpressed gener i cancer

LCM&Macro1

LCM

Macro

LCM&Macro

LCM2

Macro

APOE
EGFR
AKT1
ANXA10
ANXA7
CDKN2B
AURKA
HGF
ANXA2
CASP6
BAD
FHIT
CCNE1
MET
CALR
CASP7
HLA-B
CDC20
RHOA
CCNB1
CDH1
HLA-E
CDC25B
TNS4
EEF2
CTNNA1
HLA-G
CXCR4
ESM1
GSN
PRSS8
E2F1
HIF1A
HLA-F
PTEN
EGR1
MINA
IQGAP2
SDHB
GRB2
PHB
KCNE2
SH3GLB1
HK2
KLF4
TFF1
ICAM1
MUC6
INHBA
R R
LOXL2
SMAD4
MCM3
PTMA
SPARC
1Previously rapporterte overuttrykte proteiner for magekreft som også ble overuttrykt i vår microdissected (LCM) og macrodissected kreftprøver sammenlignet med normale prøver
2Previoulsy rapportert underexpressed proteiner for magekreft som ble også underexpressed i vår microdissected (LCM) kreftprøver, men ikke i macrodissected kreftprøver
Validering av microarray data
for å validere våre microarray data, utførte vi immunhistokjemiske analyser på et gen identifisert som underexpressed i microdissected kreftprøver fra 16 pasienter og 4 frivillige som ikke var inkludert i DNA mikromatrisestudie. TFF1
ble valgt for dette studiet immunhistokjemi validerings, fordi det er betydelig underexpressed i LCM prøvene (P
= 0,0036), men ikke i macrodissected prøvene (P
= 0,09), sammenlignet med normal gastrisk mucosa. TFF1 immunreaktivitet i kreft ble evaluert som -, +, ++ og +++ i 7 (43,8%) 3 (18.7%) 4 (25,0%) og 2 (12,5%), henholdsvis. I motsetning til alle de 6 normale gastriske slimhinne prøver (4 friske frivillige og 2 normale prøver tilstøtende vev) konservert TFF1 immunoreaktivitet (+++) (figur 4). Dermed magekreft prøvene hadde signifikant lavere TFF1 immunoreaktivitets enn normal mageslimhinnen, i samsvar med tidligere rapporter [13, 14] (P
for chi-kvadrat = 0,007). Figur 4 Representative TFF1 immunhistokjemisk fargingsresultater for (A) en gastrisk adenokarsinom som viser tap av TFF1 uttrykk, og (b) normal gastrisk mucosa fra en frisk frivillig uttrykker TFF1 i mage-epitelceller. (Forstørrelse = 200x)
Disse resultatene viser at macrodissection baserte genekspresjon analyserer utkonkurrerte genekspresjon analyser fra LCM prøver for å identifisere gener overuttrykt i magekreft.

• BariSurg prøve: Sleeve gastrektomi versus Roux-en-Y gastrisk bypass hos overvektige pasienter med BMI 35-60 kg /m2 - en multisenter, randomisert pasient og observatør blind non-inferiority trial
• Expression profilen til slimstoffer (MUC2, MUC5AC og MUC6) i Helicobacter pylori infiserte pre-neoplastiske og neoplastiske menneskelige mage epithelium