Distinctions dans gastriques signatures d'expression génique du cancer provenant de microdissection laser versushistologic macrodissection

Distinctions dans gastriques signatures d'expression génique du cancer provenant de l'arrière-plan de microdissection laser contre
histologiques macrodissection
Résumé
échantillons de cancer gastrique obtenus par macrodissection histologiques contiennent une teneur relativement élevée du stroma qui peuvent influencer de manière significative les profils d'expression génique. Les différences entre la signature de l'expression des gènes dérivés d'échantillons de cancer gastrique macrodissected et la signature obtenue à partir de cellules épithéliales cancéreuses gastriques isolées à partir des mêmes biopsies utilisant laser capture microdissection (LCM) ont été évalués pour leurs biais expérimentaux potentiels.
Méthodes
ARN a été isolé à partir d'échantillons de tissus congelés de biopsies de cancer gastrique à partir de 20 patients en utilisant les deux techniques de macrodissection et LCM histologiques. ARN à partir de LCM a été soumis à une série supplémentaire de T7 RNA amplification. Expression profilage a été réalisée en utilisant Affymetrix HG-U133A. Les gènes identifiés dans les signatures d'expression de chaque procédé de traitement de tissus ont été comparés à l'ensemble des gènes contenus dans les régions chromosomiques trouve au port du nombre de copies des aberrations dans les échantillons de tumeurs par CGH et aux protéines préalablement identifiés comme étant surexprimé dans le cancer gastrique.
Résultats de gènes indiqués pour avoir augmenté le nombre de copies dans le cancer gastrique ont également été trouvés pour être surexprimé dans les échantillons obtenus par macrodissection (LS P
valeur < 10 -5), mais pas dans les données de tableau généré en utilisant microdissection . Un ensemble de 58 gènes identifiés précédemment surexprimé dans le cancer gastrique a été également enrichi dans la signature de gène identifié par macrodissection (LS P
< 10 -5), mais pas dans la signature identifiée par microdissection (LS P
= 0,013). En revanche, les 66 gènes précédemment rapportés pour être sous-exprimée dans le cancer de l'estomac ont été enrichies par la signature du gène identifié par microdissection (LS P
< 10 -5), mais pas dans la signature identifiée par macrodissection (LS P = 0,89).
La technique d'échantillonnage de la tumeur biaise les résultats microarray. LCM peut être une collecte et le traitement méthode plus sensible pour l'identification des gènes candidats suppresseur de tumeur potentiels dans le cancer gastrique en utilisant le profil d'expression.
Contexte
Un objectif majeur de l'analyse des microréseaux est l'identification des gènes exprimés de manière différentielle dans des sous-ensembles de clinique les échantillons correspondent à des thérapies spécifiques à des sous-types de tumeurs. Cependant, l'analyse quantitative de la matrice d'expression d'échantillons cliniques de cancer ayant une teneur élevée stromal est difficile, car le rapport des cellules tumorales épithéliales de cellules stromales peuvent varier considérablement. stroma contaminantes peut confondre l'expression à base de microréseaux et de copier des analyses nombre. microdissection laser (LCM) est une technique précieuse qui permet d'isoler les cellules épithéliales à partir de cellules stromales, enrichissant ainsi pour le contenu épithéliale. La quantité d'échantillon et de l'ARN obtenu par GCV est souvent très limitée, cependant, et nécessite une étape d'amplification afin de générer suffisamment de matériel pour les analyses de puces à ADN. Ce processus d'amplification peut biaiser les résultats et conduire à un ensemble asymétrique des gènes exprimés de manière différentielle [1]. macrodissection histologique (échantillons prélevés dans des coupes de tissu guidées par analyse microscopique d'une coupe colorée en série) fournit une plus grande quantité de matériau d'échantillon par rapport à la GCV qui peut éviter la nécessité d'une série supplémentaire de l'amplification d'ARN. Cependant, les échantillons macrodissected contiennent beaucoup plus de contenu de cellules stromales que les échantillons obtenus par microdissection.
Des études antérieures ont comparé ces deux méthodes de traitement des tissus pour les échantillons cliniques sur le cancer. Basé sur des données provenant de 14 échantillons d'adénocarcinome du rectum, Bruin et al
. favorisée macrodissection sur microdissection en raison de la contribution relativement faible des constituants du stroma dans des échantillons macrodissected à partir de ce type de tumeur et les résultats partiaux d'expression génique provenant d'échantillons microdisséqués due à l'amplification de l'ARN nécessaire pour ces échantillons [2]. D'autre part, Klee et al
. a suggéré que le profilage microdissection identifier de manière unique un grand nombre de gènes exprimés de manière différentielle ne se trouvent pas en utilisant autrement les prélèvements de tissus en vrac, sur la base de données de 10 adénocarcinomes pulmonaires et 6 échantillons normaux adjacents [3]. Ces études ont été limitées par la taille de l'échantillon, et, par conséquent, nécessite une validation supplémentaire. Il est également difficile de savoir si les gènes identifiés en utilisant uniquement des échantillons microdissection représentent des biomarqueurs utiles. Bias résultant de l'amplification d'ARN doit être équilibrée par rapport au bénéfice de l'enrichissement des échantillons pour le contenu épithéliale en examinant si microdissection est avantageux pour le profilage d'expression des tumeurs avec un contenu stromal élevé, tels que les adénocarcinomes gastriques ou pancréatiques.
Microdissection est particulièrement utile pour enrichir gastrique les cellules tumorales cancéreuses obtenues à partir d'échantillons de biopsie endoscopique, en particulier d'un cancer gastrique de type diffus, qui est composé de cellules tumorales disséminées mélangées avec des cellules inflammatoires et une fibrose. La baisse de l'incidence globale du cancer gastrique dans US au cours de ce siècle semble être en grande partie attribuable à une diminution des lésions de type intestinal, tandis que l'apparition de type diffus est pensé pour être resté le même [4]. En utilisant des échantillons obtenus par LCM, Wu et al
. ont rapporté que malignes par rapport aux cellules épithéliales gastriques bénignes peuvent être distinguées avec une précision de 99% sur la base d'un facteur prédictif du gène 504 [5]. Ce prédicteur inclus gènes bien connus exprimées dans l'épithélium gastrique y compris Trefoil facteurs 1, 2 et 3 [5]. Utilisation de LCM, Jinawath et al
. identifié 46 gènes qui peuvent représenter des signatures moléculaires distinctes pour les deux types histologiques de cancer gastrique - diffus type et les cancers gastriques de type intestinal [6]. Cependant, aucune étude n'a été réalisée à ce jour comparant directement le macrodissection vs
. méthodes LCM utilisant le même ensemble d'échantillons de cancer de l'estomac.
Dans cette étude, nous avons cherché à évaluer les distinctions entre les profils d'expression issus des mêmes tumeurs qui ont été traitées à la fois par macrodissection et LCM pour les analyses microarray. Compte tenu de la difficulté à valider l'ensemble des gènes exprimés de manière différentielle identifiés en utilisant chaque type de prélèvement d'échantillons, nous avons comparé les gènes identifiés grâce à notre microarray analyses avec des protéines connues pour être surexprimé dans le cancer gastrique. En outre, nous avons déterminé si l'expression de gènes identifiés dans chaque signature en corrélation avec les altérations du nombre de copies de gènes qui ont été identifiés par hybridation génomique comparative (CGH) à partir des mêmes tumeurs. Des études antérieures de cancer gastrique ont montré une forte corrélation entre CGH array et les données du tableau d'expression [7]. les modifications du nombre de copies ont été évaluées en utilisant l'ADN de la tumeur macrodissected afin d'éviter le biais de l'amplification du génome entier. Nous avons en outre déterminé si les signatures de gènes que nous avons obtenus à partir de chaque méthode de collecte et de traitement des échantillons ont été enrichies en protéines qui ont déjà été signalés à être dérégulée gènes dans le cancer gastrique. Nos résultats indiquent que le procédé LCM est plus sensible pour l'identification des gènes qui sont sous-exprimés dans le cancer par rapport aux tissus normaux (les gènes suppresseurs de tumeur potentiels), tandis que macrodissection identifie plusieurs gènes qui sont surexprimés dans le cancer. Par conséquent, macrodissection et LCM microdissection semblent utiles pour étudier les différents aspects de la biologie du cancer.
Méthodes
Vingt patients des patients qui ont été analysés dans cette étude est une partie de 96 patients qui ont participé à une étude prospective et dont les échantillons ont été utilisés comme un ensemble de formation d'expression pour développer un prédicteur chimio-réponse [8]. Une partie de l'expression et les données de CGH de leurs échantillons macrodissected a été précédemment rapporté [8, 9]. prélèvement des échantillons, le traitement et le suivi ont été réalisés selon un protocole approuvé par le Conseil d'examen institutionnel (IRB) de l'Hôpital National Cancer Center à Goyang, en Corée (NCCNHS01-003). Tous les patients ont signé un formulaire de consentement éclairé IRB approuvé. L'admissibilité à l'enrôlement dans l'étude comprenait les paramètres suivants: 1) l'âge ≥ 18 ans; 2) histologiquement confirmés adénocarcinome gastrique; 3) cliniquement documenté métastases à distance; 4) pas malignes antérieurs ou concomitants autres que le cancer de l'estomac; 5) sans antécédents de chimiothérapie, soit adjuvant ou palliatif; et 6) une fonction adéquate de tous les organes principaux. Les patients ont reçu le cisplatine 60 mg /m 2 IV le jour 1 et fluorouracile 1000 mg /m 2 IV les jours 1-5 d'un programme de 3 semaines.
Le traitement des tissus
Avant macrodissection, tumeur échantillons avaient des noyaux de tumeur médiane de 50% (intervalle interquartile, 30-60%). Macrodissection a été réalisée comme décrit précédemment [10]. Macrodissection conduire à la moyenne de 60% des noyaux de tumeur au chariot supérieur (intervalle interquartile, 60 à 72,5%). Pour microdissection, tumeur et cryosections d'échantillons de tissus normaux ont été coupés à 10 um, et conservé congelé à -80 ° C. Les lames ont été déshydratées en utilisant HistoGene sans nucléase (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) réactifs selon les recommandations du fabricant. Microdissection a été réalisée en utilisant PixCell II (Arcturus Bioscience, Mountain View, CA). Déshydratation et LCM a été limitée à 15 minutes ou moins pour chaque échantillon prélevé. Un total de 10.000 tirs laser (taille de spot de 15 um de diamètre) ont été recueillies à l'aide CaPSURE LCM Macro Caps pour chaque échantillon. L'ARN a été isolé en utilisant PicoPure Kit d'isolation d'ARN (Molecular Devices). En bref, les cellules épithéliales ont été incubées avec 50 ul de tampon d'extraction dans un tube de 0,5 ml de microcentrifugation à 42 ° C pendant 30 min. DNase (Qiagen, Valencia, CA) le traitement a été effectué directement dans la colonne de purification, et l'ARN a été isolé en utilisant le volume d'élution de 8 ul (Molecular Devices). Cinq ul d'ARN à partir de populations de cellules microdisséquées a été converti en biotinylé, la cible d'ARNc anti-sens, en utilisant la Affymetrix deux cycles procédé de marquage (Santa Clara, CA). Toutes les cibles biotinylés étaient fragmentées et 15μ
g de chacun a été hybridées à HG-U133A microarrays GeneChip suivant le protocole du fabricant. les images du tableau scannées ont été examinés et convertis en signaux de données en utilisant l'algorithme de 5,0 Affymetrix MAS.
matrice l'ADN génomique de CGH a été extrait des échantillons en utilisant le réactif TRI (Invitrogen, Carlsbad, CA) selon le protocole du fabricant, et en outre purifié en utilisant le kit QIAamp DNA Micro (QIAGEN). Pour un tableau des expériences CGH, Agilent 4x44k Microarrays HD-CGH contenant 44.000 fonctionnalités (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ont été utilisés. 0,5 à 1 pg de tumeur génomique échantillons d'ADN et la même quantité d'ADN génomique humain provenant de plusieurs donneurs anonymes femelles (Promega, Madison, WI) ont été digérés avec AluI (50 unités) et Rsal (50 unités) pendant 2 h à 37 ° C, . 5 pl d'amorce aléatoire a été mélangé à la matrice d'ADN digéré. La référence et l'échantillon d'ADN ont été marqués à l'aide d'étiquetage Kit PLUS d'Agilent, qui comprend un tampon 5x, 10x dNTP, Cy-5/3 dUTP (1,0 mM) et Exo-Klenow Fragment. Le mélange de sonde selon la Cy3 ADN marqué de l'échantillon, Cy5 ADN marqué de référence (39 pl), 5 pi d'ADN Cot-1 humain (Invitrogen), 11 ul d'Agilent 10 × agent de blocage et 50 ul d'Agilent 2 tampon × hybridation a été dénaturé à 95 ° C pendant 3 min et on a incubé à 37 ° C pendant 30 min. La sonde a été appliquée sur la matrice en utilisant une puce à ADN chambre d'hybridation Agilent et hybridées pendant 21 heures à 65 ° C dans un four tournant à 20 tours par minute. Les tableaux ont été lavés selon les recommandations du fabricant, trempées dans Agilent de stabilisation et d'une solution de séchage, et numérisés à l'aide d'un scanner de puces à ADN Agilent DNA 2565AA. Programme de contrôle du programme d'analyse de l'Agilent 7.0 et programme logiciel d'extraction 9.5.1 Agilent Feature ont été utilisés pour le traitement des données. données CGH Array ont été analysées en utilisant le logiciel CGH Analytics Agilent (version 3.5.14). ADM-2 algorithme de seuil 6, zéro logique floue et la centralisation sur, a été utilisé pour identifier les aberrations. Les critères de filtrage d'aberration étaient sondes minimum 5, log absolue moyenne minimale 2 rapport de 0,5, et les aberrations maximales de 1.000.000. Aberrations identifiés pour chaque échantillon ont été répertoriés et affichés graphiquement.
Gènes du cancer gastrique dans la littérature
Pour générer un gène ensemble défini par l'utilisateur pour analyse notre comparaison des gènes, nous avons cherché base de données PubMed de gènes avec la protéine spécifique des cellules de cancer gastrique expression, en utilisant des mots-clés de "cancer de l'estomac", "immunohistochimie" et "perte de l'expression" "surexprimé" ou. Pour les analyses de notre comparaison ensemble de gènes, symboles de gènes de gènes spécifiques du cancer gastrique ont été cartographiés pour sonder les ID fixés sur la matrice HG-U133A (http:.. //Www NetAffx com). Il y avait 178 ( «surexprimé») et 327 ( «perte d'expression") des articles dans le Pubmed au moment de l'écriture. L'analyse statistique
sur les données du tableau d'expression
données de biopuces d'expression génique Affymetrix HG-U133A ont été analysés avec ensemble des gènes des algorithmes d'analyse de comparaison de ArrayTools BRB (version 3.8, l'Institut national du cancer, http:.... //linus nci nih gov /BRB-ArrayTools html) [11]. L'outil de comparaison des gènes mis en analyse des ensembles de gènes définis par l'utilisateur pour l'expression différentielle entre les classes pré-définies (à savoir
., Cancer vs
. Normal) d'un ensemble de données source. ensembles de gènes définis par l'utilisateur utilisés dans cette étude comprennent U133A ensembles de sondes correspondant aux gènes avec le changement du nombre de copies et correspondant à des gènes de cancer gastrique dans la littérature. Les gènes dont la tumeur /normal journal 2 rapport est supérieur à 0,5 dans au moins un des 20 échantillons de patients ont été inclus dans la liste des gènes avec un gain de nombre de copies. De même, les gènes avec une perte de nombre de copies (log 2 rapport < -0,5) ont été répertoriés. Ces ensembles de gènes définis par l'utilisateur ont été analysés pour l'expression différentielle entre les 20 échantillons de cancer et de 6 échantillons normaux (par exemple
., 3 macrodissected et 3 échantillons microdisséqués).
Pour chaque jeu de données de source, une
P est -valeur calculée pour chaque gène de corréler le niveau d'expression pour l'expression différentielle entre les classes pré-définies, la génération d'une liste de gènes classés d'un projet BRB-ArrayTools donné. Pour un ensemble de gènes N de la carrés (LS) statistique moins est définie comme étant le logarithme naturel négatif moyenne des P
-values ​​du gène unique tests univariés appropriés [12]. Une statistique sommaire est calculée qui résume ces valeurs P
sur le gène ensemble défini par l'utilisateur; la statistique récapitulative est log moyenne (P
) pour le résumé de LS de la façon dont les valeurs de la P diffèrent d'une distribution uniforme pour LS [12]. La statistique sommaire est liée à la distribution des statistiques sommaires pour les échantillons aléatoires des gènes N, de l'échantillon à partir de ceux qui sont représentés sur le tableau. Ici N
est le nombre de gènes dans le gène ensemble défini par l'utilisateur. 100.000 ensembles de gènes aléatoires ont été échantillonnées pour calculer cette distribution. La
valeur LS P est la proportion des ensembles aléatoires de N de gènes avec des statistiques sommaires moyennes plus petites que les LS résumés calculés pour les données réelles.
BRB-ArrayTools estimés valeurs LS P
pour l'enrichissement de les 4 ensembles de gènes dans notre signature du transcriptome du cancer gastrique identifiés par chaque méthode de traitement des tissus de la manière suivante. Tout d'abord, afin de comparer les 2.324 gènes associés à un gain de nombre de copies avec notre signature transcriptomique de cancer gastrique identifié par la microdissection, la statistique de LS de 2.324 gènes amplifiés a été estimée en calculant un logarithme naturel négatif moyenne des valeurs P
du monogéniques tests univariés pour l'expression différentielle de chacun des 2.324 gènes entre 20 échantillons de cancer gastrique microdissection et 6 échantillons normaux. Puis BRB-ArrayTools calculé la proportion des ensembles aléatoires de 2.324 gènes avec des statistiques sommaires moyennes plus petites que les LS résumés calculés pour les données réelles (LS P
valeur). La signature du transcriptome de cancer gastrique identifié par la microdissection a également été comparé avec 677 gènes associés à la perte de nombre de copies, 58 protéines rapportées surexprimé dans le cancer gastrique, et 66 protéines signalées comme sous-exprimés dans le cancer gastrique, avec LS respective P
valeurs. La valeur de LS P inférieure à 0,01 a été considérée comme significative. Les mêmes analyses ont été répétées pour gastrique signature du transcriptome du cancer identifié par la méthode macrodissection.
Immunohistochimie
TFF1 immunohistochimie a été effectuée en utilisant des échantillons de tissus de biopsie chirurgicale ou endoscopique à partir de 16 patients atteints d'un cancer de l'estomac (16 cancer et 2 échantillons normaux adjacents de tissu), et 4 volontaires en bonne santé, qui ne sont pas inclus dans cette étude de puces à ADN. des échantillons de tissus muqueuse gastrique Grossièrement-normales ont été recueillies auprès de l'antre gastrique des volontaires en bonne santé en utilisant une technique de biopsie aveugle, avec le consentement éclairé [9]. les lames de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (4 um d'épaisseur) ont été colorées avec 13734-1-AP (ProteinTech Group, Chicago, IL) à 1h50 pendant 60 min à température ambiante et Envision anti-lapin peroxydase de raifort (K4003, DAKO , Carpinteria, CA) pendant 30 min à température ambiante. La réaction a été visualisé en utilisant diaminobenzidine (K3468, DAKO) et de contraste avec l'hématoxyline. l'expression a été évaluée TFF1 semi-quantitative à un grossissement de 200x
, en fonction du pourcentage de cellules colorées positivement ( "-" = immunocoloration ≤ 10% des cellules; "+" = 11-50%; "++" = 51- 75%; «+++» = 76-100%) [13, 14]. Immunocoloration sans anticorps primaire et de l'épithélium gastrique normale d'un tissu microarray de contrôle a servi en tant que témoins négatifs et positifs, respectivement [15]. Détermination des résultats de taches cytoplasmique qui était sans équivoque plus profond que de fond a été considéré comme positif. des signatures mondiales d'expression génique à partir d'échantillons macrodissected et LCM
Tableau 1 définit les caractéristiques clinico-pathologiques des patients et des volontaires inclus dans cette étude de microréseau. les données de puces à ADN ont été obtenus pour les deux échantillons LCM et macrodissected à partir des mêmes 20 biopsies (figure 1A). Bien que d'une qualité acceptable, les données de puces à ADN à partir d'échantillons LCM avaient généralement plus bas "présent appel" que les échantillons macrodissected (données non présentées
). Analyse en composantes principales des profils d'expression des gènes globaux issus de la micro- et les cancers gastriques macro-disséqués, et les échantillons normaux a démontré une nette séparation de chaque groupe d'échantillons (figure 1B). La corrélation de Pearson médiane entre les deux méthodes de traitement était de 0,75 (intervalle interquartile, 0,71 à 0,81) .Table 1 caractéristiques clinico-pathologiques des patients et des volontaires inclus dans l'analyse des microréseaux

les patients (n = 20)
volontaires (n = 6)
Baseline caractéristiques clinico-pathologiques

médian
Age ans
59
52 gamme
interquartile
54-69
43-61
Sex - no. (%)
16 (80%) de Male
3 (50%)
Femme
4 (20%)
3 (50%) Statut
Performance (PS ) - non. (%)
ECOG1 PS 0 ou 1
20 (100%)
Le type histologique - no. (%)
Intestinale
6 (30%) de Lauren
14 (70%) de la diffuse de Lauren
Localisation de la lésion primaire - no. (%)
Upper 1/3
4 (20%)
Moyen 1/3
6 (30%)
Lower 1/3
10 (50%)
Les métastases à distance - pas. (%)
20 (100%)
Traitement et résultats
chimiothérapie - no. (%)
Cisplatine /fluorouracile
20 (100%)
survie globale -. Mois
gamme médian
8,0
Interquartile

5,6 à 14,7 de temps jusqu'à progression -. Le mois
médian
3.5
interquartile
Figure 1 (A) schéma d'étude de 02.03 au 06.02
1Eastern Oncology Group coopérative de collecte d'échantillons et de traitement des puces à ADN (B) composantes principales analyse des profils d'expression génique des micro- et des échantillons de tumeur macro-disséqués à partir de 20 patients atteints de cancer gastrique et 6 échantillons normaux de volontaires sains.
tableaux 2 et 3 montrent des gènes surexprimés dans des échantillons de cancer gastrique micro et macro-disséqués à la sélection des fonctionnalités P
< 10 -6. La morphologie cellulaire
(AIF1, E2F1, E2F3, KIR2DL1, KIRREL, NPR1, RUNX2, TRIO
) est la catégorie la plus enrichie fonctionnelle des 42 gènes surexprimés dans les échantillons microdissection par rapport aux échantillons normaux (sélection de fonction P
< 10 -6) identifiés par Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (tableau 2). Tumeur morphologie
(APOE, BIRC5, CD14, COL1A1, COL1A2, CYR61, FKBP1A, IL8, MCAM, MIF, RHOB
) était la catégorie fonctionnelle la plus enrichie parmi les 73 gènes surexprimés dans les échantillons macrodissected (sélection de fonction P
< 10 -6) par l'IPA (tableau 3). les gènes de la matrice extracellulaire, tels que COL6A2, COL1A1, COL1A2
et
COL5A2, occupent une place importante dans les échantillons macrodissected et probablement apporté par les cellules stromales. Le tableau 4 montre les gènes sous-exprimés dans des échantillons de micro et macro-disséqués cancer gastrique à la sélection des fonctionnalités P
< 10 -6.Table 2 gènes surexprimés dans le cancer gastrique microdissection à la sélection des fonctionnalités P
< 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

BMP3
38.52
HIST1H4C
6.3
BGN
30.3
LEPRE1
5.9
TRIO
18.5
ETNK2
5.6
GADD45GIP1
17.2
TRIP6
5.3
MIER2
16.7
FAM125B
5.3
KIFC3
16.4
NPR1
5.3
217318_x_at
13.7
DSCC1
5.3
217219_at
13.2
CLUL1
5.0
RUNX2
12.5
HMGB3
4.5
SMARCD1
12.0
E2F3
4.3
KIRREL
12.0
AIMP2
4.2
215621_s_at
12.0
ATAD5
4.0
GRM2
10.0
E2F1
3.8
FJX1
10.0
FKSG49
3.7
AIF1
10.0
DVL2
3.7
THY1
9.1
TIPRL
2.9
CARD10
9.1
EIF2C3
2.9
SIM2
9.1
NAT10
2.8
AIF1
9.1
MED27
2.7
APOBEC3G
8.3
PIN4
2.7
RHAG
8.3
CTPS
2.6
changement 1fold, défini par le rapport d'expression d'un cancer à la normale (= cancer /normal)
2Toutes ces gènes avaient le taux de fausse découverte < 0,001
Tableau 3 gènes surexprimés dans le cancer gastrique macrodissected à fonction de sélection P
. < 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

LY6E
24.42
SRM
6.7
IL8
22.7
NGLY1
6.7
CA12
20.0
RHOB
6.3
SBNO2
19.2
ACTN1
5.9
UBE2S
17.2
LOXL2
5.9
CYR61
17.2
COL5A2
5.9
ANGPT2
15.9
TRIM28
5.6
COL6A2
14.3
218982_s_at
5.6
BOP1
13.2
C7orf44
5.3
COL1A1
13.2
UBE2C
5.3
LPL
13.0
CEP76
5.3
MFGE8
12.8
BIRC5
5.3
APOE
12.2
PNO1
5.0
G6PC3
10.9
FSTL1
5.0
215900_at
10.3
GRINA
4.8
NUP62
10.0
MRTO4
4.8
MRPL4
10.0
STC1
4.8
GNL3L
10.0
MRPL12
4.5
MCAM
9.1
FKBP1A
4.5
PDLIM7
9.1
IFI30
4.5
216472_at
9.1
KPNA6
4.3
ACTN1
9.1
216532_x_at
4.3
BYSL
9.1
CENPI
4.2
GNAI2
8.3
PPM1G
4.2
NCAPH2
8.3
ICT1
3.7
CD14
8.3
SFRS14
3.6
EXOSC4
8.3
CTPS
3.6
OBFC2B
8.3
IMP4
3.3
PPP1R15A
7.7
UBE2G2
3.2
COL1A2
7.7
ISG20L2
3.2
GPX1
7.7
EIF4A1
3.1
MIF
7.7
HDGF
2.6
NME1
7.1
PSMD14 2.6
PPIL2
7.1
220856_x_at
2.4
CCDC85B
7.1
CNOT3
2.4
SPARC
6.7
GLT25D1
2.0
C8orf55
6.7
changement 1fold, défini par le rapport d'expression d'un cancer à la normale (= cancer /normal)
2Toutes ces gènes avait taux de faux de découverte. < 0,001
Tableau 4 gènes sous-exprimés dans les micro- et macro-disséqués cancer gastrique à fonction sélection P
< 10-6
microdissection

Macrodissected

Gene

FC1

Gene

FC

HPGD
-25.02
208498_s_at
-11.1
HRASLS2
-20.0
SIDT2
-7.7
ABCC3
-20.0
MUC5AC
-5.9
SLC25A37
-16.7
CTAGE5
-5.0
ABHD2
-14.3
GNA11
-3.8
VIPR1
-10.0
ARFIP1
-3.4
CYTIP
-9.1
214316_x_at
-3.3
GALNT6
-9.1
222149_x_at
-3.3
SULT1A2
-9.1
OAS1
-8.3
PDCD4
-7.1
NR3C2
-7.1
DOCK6
-6.3
SULT1A1
-5.9
ZFYVE26
- 5.9
213212_x_at
-5.6
DSCR3
-5.3
TMEM131
-5.3
ECHDC2
-5.0
DENND1B
-5.0
KIAA0141
-4.8
RNF103
-4.8
PDCD4
-4.5
CABIN1
-4.5
222371_at
-4.3
RRBP1
-4.0
CC2D1A
-3.8
216438_s_at
-3.8
SGSM3
-3.8
ARPC2
-3.7
TRAK1
-3.6
GNA11
-3.6
PAFAH1B1
-3.4
CNDP2
-3.2
SPOP
-3.1
parp4
-3.1
ERLIN1
-2.9
1fold changer, défini par la négative du rapport d'expression de la normale au cancer (= - (normal /cancer))
2Toutes ces gènes avaient le taux de fausses découvertes < Comparaison entre expression et tableau des données CGH 0.001 de.
tableau analyse CGH a été réalisée en utilisant l'ADN génomique extrait à partir d'échantillons contenant macrodissected > les cellules tumorales 50% (critères utilisés par des études précédentes [16, 17]), étant donné que suffisamment d'ADN peut être obtenue sans la nécessité d'une amplification du génome entier tel que requis pour les échantillons microdisséqués. Toute l'amplification de l'ADN du génome peut potentiellement introduire un biais dans artifactual tableau des résultats CGH [18]. Représentée sur la figure 2 est la fréquence du nombre de copies d'ADN aberrations parmi l'ensemble des 20 échantillons. Nos données d'aberration du nombre de copies était généralement conforme aux données présentées antérieurement [7, 16, 17, 19-23]. Quatre des 20 patients ont présenté une amplification de CHR8-q24.13 q24.21 (126.357.475-128822596), qui contient l'oncogène MYC
. Le second locus d'amplification la plus courante était q21.2 chr17 (36109939-36230163) qui a été amplifié chez 3 patients. Sept patients ne présentaient pas d'aberrations chromosomiques détectables. Ces 7 échantillons contenaient une médiane de cellules tumorales 70%, tandis que les 13 autres patients avaient une médiane des cellules tumorales 60% (P = 0,1
valeur). Par conséquent, l'absence d'aberrations chromosomiques détectables au cours des 7 échantillons n'a pas été dû à un plus faible pourcentage de cellules tumorales dans ces échantillons. Figure 2 Image graphique illustrant la fréquence pour cent des sondes (aberrations) détectés parmi tous les 20 échantillons.
Il y avait 2.324 gènes uniques qui ont été associés à un gain de nombre de copies dans au moins un des 20 patients, et 677 gènes associés à nombre de copies perte. En utilisant la comparaison ensemble des gènes analyses, nous avons comparé ces ensembles de gènes avec nos signatures transcriptomiques identifiées par les différentes méthodes d'isolement de l'échantillon. Nous avons supposé que les gènes dérégulés associés à nombre de copies aberrations sont plus susceptibles d'être impliqués en tant que contributeurs à oncogenèse plutôt que simplement comme «spectateurs». Par conséquent, les 2.324 gènes contenus dans les régions du nombre de copies des gains ont été analysés quant à leur expression à partir des données du tableau obtenus en utilisant la méthode de macrodissection (sélection de fonction P
< 0,05). Le chevauchement entre la liste des gènes dans les régions d'amplification et d'enrichissement pour leur expression dans des échantillons qui ont été macrodissected était statistiquement significative (LS P
valeur = 10 -5, voir Méthodes de description statistique). Cependant, cette association n'a pas été observée lorsque les données d'expression a été analysée à partir d'échantillons microdissection (sélection de caractéristiques P
< 0,05; la valeur de LS P = 0,41) (figure 3A). Ainsi, il y avait une association plus forte entre le modèle de gain de nombre de copies et l'expression des gènes que dans des échantillons qui ont été macrodissected. Par exemple, MYC
, le gène le plus fréquemment amplifiée dans les échantillons de patients, a été déterminée pour être surexprimé dans les échantillons significativement macrodissected, mais pas chez ceux qui ont été microdissection, bien que ce résultat peut être dû à la taille relativement petite de l'échantillon ou de l'hétérogénéité au sein la tumeur. Figure 3 Nombre de gènes qui se chevauchent entre LCM et de matrices d'expression macrodissected ensembles de données et les données CGH array de la même série de 20 patients.
Une liste de 677 gènes a été identifié dans les régions où la perte de nombre de copies d'ADN a été trouvé dans au moins l'un des 20 patients de l'étude. L'expression de ces gènes a été analysée dans les ensembles de données de réseau macro- et micro-disséqués. Une association significative a été trouvée entre les gènes avec une perte du nombre de copies et leur expression dans les deux échantillons macro- et micro-disséqués. (P valeurs
LS, 0.009 et 0.006 pour LCM et des échantillons macrodissected, respectivement) (figure 3B).
Concordance des signatures de gènes avec des gènes précédemment rapportés à être associée à un cancer gastrique
Une recherche bibliographique PubMed a été réalisée d'identifier précédemment gènes et des protéines sur- et sous-exprimé pour le cancer gastrique (mots-clés: immunohistochimie, cancer de l'estomac, et surexprimée et ou de la perte d'expression). 58 protéines surexprimés dans le cancer gastrique ont été identifiées de cette manière. L'expression des gènes pour ces 58 protéines ont été trouvés pour être enrichi en données d'expression à partir d'échantillons recueillis par macrodissection (LS P
< 10 -5), mais pas d'enrichissement dans l'expression des 58 gènes a été trouvé pour les échantillons recueillis par microdissection (LS P
= 0,013). En revanche, les 66 protéines signalées comme sous-exprimés dans le cancer gastrique ont été enrichies dans les données du tableau d'expression à partir d'échantillons recueillis par microdissection (LS P
< 10 -5), mais pas à partir d'échantillons recueillis par macrodissection (LS P
= 0,89) (tableau 5) .Table 5 gènes du cancer gastrique dans la littérature qui ont été exprimés de manière différentielle entre 20 cancer et 6 échantillons normaux à la sélection des fonctionnalités P
< 0,05 selon les données de puces à ADN généré en utilisant chaque méthode de traitement des tissus
gènes surexprimés dans le cancer
gènes sous-exprimés dans cancer

LCM&Macro1

LCM

Macro

LCM&Macro

LCM2

Macro

APOE
EGFR
AKT1
ANXA10
ANXA7
CDKN2B
AURKA
HGF
ANXA2
CASP6
BAD
FHIT
CCNE1
MET
CALR
CASP7
HLA-B
Le CCNB1 de CDC20 de RHOA
CDH1
HLA-E
CDC25B
TNS4
EEF2
CTNNA1
HLA-G
CXCR4 de ESM1
GSN
PRSS8
E2F1
HIF1A
HLA-F
PTEN
EGR1
MINA
IQGAP2
SDHB
GRB2
PHB
KCNE2
SH3GLB1
HK2
KLF4
TFF1
ICAM1
MUC6
INHBA
RARB
LOXL2
SMAD4
MCM3
SPARC
1Previously de APTM rapporté protéines surexprimés pour le cancer gastrique qui ont également été surexprimé dans notre microdissection (LCM) et des échantillons de cancer macrodissected par rapport aux échantillons normaux
2Previoulsy rapporté des protéines pour le cancer gastrique sous-exprimés qui ont également été sous-exprimés dans notre microdissection (LCM) échantillons de cancer, mais pas dans les échantillons de cancer macrodissected
validation des données microarray
afin de valider nos données de puces à ADN, nous avons réalisé des analyses immunohistochimiques sur un gène identifié comme sous-exprimés dans des échantillons de cancer microdissection de 16 patients et 4 bénévoles qui ne sont pas inclus dans l'étude des puces à ADN. TFF1
a été choisi pour cette étude de validation de l'immunohistochimie, car il est nettement sous-exprimée dans les échantillons de LCM (P = 0,0036
) mais pas dans les échantillons macrodissected (P = 0,09)
, par rapport à la muqueuse gastrique normale. TFF1 immunoréactivité dans le cancer a été évaluée comme étant -, +, ++ et +++ à 7 (43,8%) 3 (18,7%) 4 (25,0%) et 2 (12,5%), respectivement. En revanche, tous les échantillons normaux 6 gastriques de la muqueuse (4 volontaires sains et les 2 échantillons de tissus adjacents normaux) conservés TFF1 immunoréactivité (+++) (figure 4). Ainsi, des échantillons de cancer gastrique était significativement plus faible immunoréactivité TFF1 que la muqueuse gastrique normale, compatible avec les rapports précédents [13, 14] (P
pour chi-carré = 0,007). La figure 4 représentant TFF1 résultats de la coloration immunohistochimique de (A) un adénocarcinome gastrique démontrant la perte de l'expression de TFF1, et (B) de la muqueuse gastrique normale à partir d'un volontaire sain exprimant TFF1 dans les cellules épithéliales gastriques. (Grossissement = 200x)
Ces résultats démontrent que l'expression des gènes à base macrodissection-analyses d'expression génique ont surperformé les analyses d'échantillons de LCM pour identifier les gènes surexprimés dans le cancer gastrique.

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