Distinções em assinaturas de expressão do gene do cancro gástrico derivados de microdissecção de captura a laser versushistologic macrodissection

distinções em assinaturas de expressão do gene do cancro gástrico derivados de laser microdissecção de captura contra
histológico macrodissection da arte abstracta
Fundo
amostras de câncer gástrico obtidos por macrodissection histológico conter um teor relativamente elevado do estroma que pode influenciar significativamente os perfis de expressão de gene. As diferenças entre a assinatura a expressão do gene derivado de amostras de cancro gástrico macrodissected ea assinatura obtida a partir de células epiteliais de cancro gástrico isolados a partir dos mesmos biópsias usando laser de captura microdissection (LCM) foram avaliados por seus potenciais vieses experimentais.
Métodos
RNA foi isolado de amostras de tecidos congelados de biópsias de câncer gástrico de 20 pacientes em uso de ambas as técnicas macrodissection e LCM histológicas. RNA de LCM foi objecto de uma rodada adicional de amplificação de RNA T7. perfil de expressão foi realizada utilizando matrizes Affymetrix HG-U133A. Os genes identificados nas assinaturas de expressão de cada método de processamento de tecido foram comparados com o conjunto de genes contidos dentro de regiões cromossómicas encontradas para abrigar número de cópias aberrações nas amostras tumorais por arrayCGH e para proteínas previamente identificadas como sendo sobre-expresso em cancro gástrico.
resultados
genes encontra-se aumentado número de cópias no cancro gástrico, também foram encontrados para ser sobre-expresso em amostras obtidas por macrodissection (LS P
valor < 10 -5), mas não em dados de matriz gerada usando microdissecação . Um conjunto de 58 genes previamente identificados sobre-expresso em cancro gástrico também foi enriquecida na assinatura gene identificado por macrodissection (LS P
< 10 -5), mas não na assinatura identificado por microdissecação (LS P
= 0,013). Em contraste, 66 genes previamente relatado para ser underexpressed no cancro gástrico foram enriquecidos na assinatura gene identificado por microdissecação (LS P
< 10 -5), mas não na assinatura identificado por macrodissection (LS P
= 0,89).
Conclusões
A técnica de amostragem tumor influencia os resultados de microarray. LCM pode ser um método de recolha e tratamento mais sensível para a identificação de potenciais candidatos gene supressor de tumor em câncer gástrico utilizando perfil de expressão.
Fundo
Um dos principais objectivos da análise de microarray é a identificação de genes diferencialmente expressos em subconjuntos de clínica amostras para coincidir com terapias específicas para os subtipos de tumor. Contudo, a análise quantitativa da expressão matriz de amostras de cancro clínicos com elevado teor de estroma é um desafio uma vez que a proporção de células tumorais epiteliais para as células estromais podem variar muito. Contaminando estroma pode confundir expressão baseado em microarray e copiar analisa número. microdissecação de captura laser (LCM) é uma técnica que permite que uma valiosa para isolar células epiteliais a partir de células do estroma, enriquecendo assim para o teor epitelial. A quantidade de amostra e RNA obtidas por LCM é frequentemente muito limitado, no entanto, e requer um passo de amplificação para gerar material suficiente para análise de micro-arranjo. Este processo de amplificação podem falsear os resultados e levar a um conjunto inclinado dos genes diferencialmente expressos [1]. macrodissection histológico (amostras coletadas de cortes de tecido guiados por análise microscópica de uma secção de série manchado) fornece uma quantidade maior de material da amostra em comparação com LCM que pode evitar a necessidade de uma rodada adicional de amplificação de RNA. No entanto, as amostras macrodissected contêm significativamente mais conteúdo de células do estroma de amostras obtidas por microdissecção.
Estudos anteriores compararam estes dois métodos de processamento de tecidos para amostras de câncer clínicos. Com base em dados de 14 amostras de câncer de reto, Bruin et al
. favorecida macrodissection sobre microdissecação por causa da relativamente baixa contribuição dos componentes do estroma em amostras macrodissected a partir deste tipo de tumor e os resultados enviesados ​​de expressão de genes a partir de amostras microdissecadas devido à amplificação do ARN necessária para estas amostras de [2]. Por outro lado, Klee et al
. sugeriu que microdissection profiling identificar um grande número de genes diferencialmente expressos de outra forma não encontrados usando amostras de tecido grosso, com base em dados de 10 adenocarcinomas pulmonares e 6 amostras adjacentes normais [3]. Estes estudos foram limitados pelo pequeno tamanho das amostras, e, portanto, exigem uma validação adicional. Também não está claro se os genes identificados utilizando exclusivamente amostras microdissecadas representam biomarcadores úteis. Viés resultante da amplificação de RNA deve ser equilibrado com o benefício de enriquecer amostras para conteúdo epitelial ao considerar se microdissection é vantajoso para criação de perfis de tumores com alto teor de estroma, como adenocarcinomas gástricos ou pancreáticas expressão.
Microdissecção é particularmente útil para enriquecer gástrica células de tumor de cancro obtida a partir de amostras de biopsia endoscópicas, especialmente a partir de cancro gástrico do tipo difuso que é composto de células de tumor dispersos misturados com células inflamatórias e fibrose. O declínio na incidência global de carcinoma gástrico no EUA durante este século parece ser em grande parte atribuível a uma diminuição das lesões do tipo intestinal, enquanto que a ocorrência de tipo difuso é pensado para ter permanecido o mesmo [4]. Utilizando amostras obtidas por LCM, Wu et al
. relataram que maligna contra células epiteliais gástricas benignas podem ser distinguidos com uma precisão de 99% com base em um preditor 504 de genes [5]. Este preditor incluídos genes bem conhecidos expressos no epitélio gástrico incluindo Trefoil factores 1, 2, e 3 [5]. Usando LCM, Jinawath et al
. identificados 46 genes que podem representar assinaturas moleculares distintas para os dois tipos histológicos de câncer gástrico - difuso tipo e cancros gástricos do tipo intestinal [6]. No entanto, não há estudos têm sido realizados até à data comparando diretamente o macrodissection vs
. métodos LCM utilizando o mesmo conjunto de amostras de câncer gástrico.
Neste estudo, procuramos avaliar as diferenças entre os perfis de expressão derivados dos mesmos tumores que foram processados ​​por ambos macrodissection e LCM para análises microarray. Dada a dificuldade em validar todos os genes diferencialmente expressos identificados usando cada tipo de coleta de amostras, foram comparados os genes identificados através do nosso microarray análises com proteínas conhecidas a ser sobre-expressos em câncer gástrico. Além disso, determinou-se a expressão dos genes identificados em cada assinatura correlacionado com alterações no número de cópias do gene que foram identificados por hibridação genómica comparativa matriz (CGH) a partir dos mesmos tumores. Estudos prévios de câncer gástrico têm demonstrado uma alta correlação entre matriz CGH e dados de matriz expressão [7]. alterações no número de cópias foram avaliadas utilizando ADN do tumor macrodissected de modo a evitar a polarização de amplificação do genoma inteiro. Nós ainda determinado se as assinaturas genéticas que obtidos em cada método de coleta e processamento de amostras foram enriquecidas por proteínas que tenham sido previamente reportados a ser desregulada genes no cancro gástrico. Os nossos resultados indicam que o método de LCM é mais sensível para a identificação de genes que são underexpressed no cancro, em comparação com o tecido normal (potenciais supressores de tumores), ao passo que identifica macrodissection mais genes que são sobre-expressos em cancro. Portanto, macrodissection e microdissection LCM aparecem útil para estudar diferentes aspectos da biologia do câncer.
Métodos
Pacientes
Vinte pacientes que foram analisados ​​neste estudo é uma parte de 96 pacientes que participaram de um estudo prospectivo e cujas amostras foram utilizadas como um conjunto de treino de expressão para desenvolver um preditor quimio-resposta [8]. Parte de expressão e os dados de arrayCGH das suas amostras macrodissected foi anteriormente relatado [8, 9]. coleta de amostras, tratamento e seguimento foram realizadas de acordo com um protocolo aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) do Hospital National Cancer Center, em Goyang, Coreia (NCCNHS01-003). Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento IRB-aprovado. Elegibilidade para a inscrição no estudo incluiu os seguintes parâmetros: 1) ≥ 18 anos de idade; 2) histologicamente confirmada adenocarcinoma gástrico; 3) clinicamente documentados metástases à distância; 4) não ser o cancro gástrico doenças malignas prévias ou concomitantes; 5) sem histórico prévio de quimioterapia, ou adjuvante ou paliativa; e 6) a função adequada de todos os órgãos principais. Os pacientes receberam cisplatina 60 mg /m 2 IV no dia 1 e fluorouracil 1.000 mg /m 2 IV nos dias 1-5 de um cronograma de 3 semanas.
Processamento de tecidos
Antes macrodissection, tumor amostras tinham núcleos tumoral mediano de 50% (intervalo interquartil, 30-60%). Macrodissection foi realizada como previamente descrito [10]. Macrodissection levar a média de 60% de núcleos de tumor no carro superior (intervalo interquartil, 60-72,5%). Para microdissecação, tumor e tecidos normais criocortes de amostras foram cortadas em 10 mm, e armazenado congelado a -80 ° C. Os slides foram desidratados utilizando HistoGene livre de nuclease (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) Os reagentes de acordo com as recomendações do fabricante. Microdissecção foi realizada utilizando PixCell II (Arcturus Bioscience, Mountain View, CA). Desidratação e LCM foi limitado a 15 minutos ou menos para cada amostra coletada. Um total de 10.000 disparos de laser (tamanho de ponto de 15 m de diâmetro) foram coletados por meio CaPSURE Macro LCM Caps para cada amostra. O ARN foi isolado utilizando PicoPure Kit de Isolamento de RNA (Molecular Devices). Resumidamente, as células epiteliais foram incubadas com 50 uL de tampão de extracção num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml a 42 ° C durante 30 min. tratamento com DNase (Qiagen, Valencia, CA) foi realizada directamente no interior da coluna de purificação, e o ARN foi isolado utilizando o volume de eluição de 8 uL (Molecular Devices). Cinco ul de ARN a partir de populações de células microdissecadas foi convertido biotinilado, ARNc anti-sentido alvo, utilizando o Affymetrix de dois ciclos método de marcação (Santa Clara, CA). Todos os alvos biotinilados foram fragmentados e 15μ
g de cada um foi hibridizado para microarranjos de GeneChip HG-U133A seguindo o protocolo do fabricante. imagens digitalizadas de matriz foram revistos e convertido em sinal de dados utilizando o algoritmo de 5,0 Affymetrix MAS.
arrayCGH
O ADN genómico foi extraído de amostras utilizando reagente TRI (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acordo com o protocolo do fabricante, e, adicionalmente purificado utilizando o Kit de DNA QIAamp Micro (QIAGEN). Para matriz experimentos CGH, foram utilizados Agilent 4x44k HD-CGH microarrays contendo 44.000 recursos (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). 0,5-1 ^ g de amostras de ADN genómico de tumor e a mesma quantidade de ADN genómico humana a partir de vários dadores femininos anónimos (Promega, Madison, WI) foram digeridos com Alui (50 unidades) e Rsal (50 unidades) durante 2 h a 37 ° C . 5 ul de iniciador aleatório foi misturado com o molde de ADN digerido. A referência e amostra de ADN foram marcados utilizando Agilent Labeling Kit Plus, que inclui tampão de 5x, 10x dNTP, Cy-3/5 dUTP (1,0 mM), e Exo-Fragmento Klenow. A mistura de sonda de Cy3 ADN marcado da amostra, Cy5 marcado ADN de referência (39 ul), 5 ul de ADN Cot-1 humano (Invitrogen), 11 ul de Agilent 10 × agente bloqueador e 50 ul de Agilent 2 tampão × hibridação foi desnaturado a 95 ° C durante 3 minutos e incubadas a 37 ° C durante 30 min. A sonda foi aplicada à matriz usando uma câmara de hibridação microarray da Agilent, e hibridou-se durante 21 h a 65 ° C num forno rotativo a 20 rpm. Arrays foram lavados de acordo com as recomendações do fabricante, mergulhado em Agilent estabilização da solução e secagem, e digitalizados usando um scanner de microarray Agilent 2565AA DNA. Programa de Controle de Programa de Digitalização da Agilent 7.0 e Extração Programa de Software 9.5.1 Característica da Agilent foram utilizados para processamento de dados. dados CGH matriz foram analisados ​​utilizando software CGH Analytics da Agilent (versão 3.5.14). A ADM-2 algoritmo com limiar 6, com zero de difuso e centralização diante, foi utilizado para identificar a aberração. Critérios de filtragem aberração foram sondas mínimas de 5, log absoluta média mínima 2 proporção de 0,5, e aberrações máximos de 1.000.000. Aberrações identificadas para cada amostra foram listados e apresentados graficamente.
Genes câncer gástrico na literatura
Para gerar um conjunto de genes definido pelo usuário para análises nossa comparação gene, que procurou banco de dados PubMed para genes com proteína específica de células de câncer gástrico expressão, usando palavras-chave de "câncer gástrico", "imunohistoquímica" e "sobre-expresso" ou "perda de expressão". Para as análises nossa comparação conjunto de genes, símbolos de genes de genes específicos de câncer gástrico foram mapeados para sondar IDs definidos na matriz HG-U133A (http:.. //Www NetAffx com). Havia 178 ( "sobre-expressa") e 327 ( "perda de expressão") artigos na PubMed no momento da escrita. A análise estatística sobre os dados de matriz
expressão
dados de microarray Affymetrix U133A HG-expressão de genes foram analisados ​​com conjunto de genes algoritmos de análise de comparação de ArrayTools BRB (versão 3.8, o Instituto Nacional do Câncer, http:.... //Linus NCI nih gov /BRB-ArrayTools html) [11]. A ferramenta de comparação de gene definir analisa conjuntos de genes definidos pelo usuário para expressão diferencial entre as classes pré-definidas (isto
., Cancro vs
. Normal) de um conjunto de dados de origem. conjuntos de genes definidos pelo usuário utilizados neste estudo incluem U133A conjuntos de sondas correspondentes a genes com mudança do número de cópias e correspondentes a genes de câncer gástrico na literatura. Os genes cuja tumoral /normal de registo 2 rácio é superior a 0,5 em pelo menos uma das 20 amostras dos pacientes foram incluídos na lista de genes com o ganho de número de cópias. Da mesma forma, genes com perda do número de cópias (log 2 rácio < -0,5) foram listados. Estes conjuntos de genes definidos pelo usuário foram analisadas para expressão diferencial entre 20 amostras de câncer e 6 amostras normais (isto é
., 3 macrodissected e 3 amostras microdissecadas). Compra de cada conjunto de dados fonte, a P
-valor é calculado para cada gene para correlacionar o nível de expressão para a expressão diferencial entre classes pré-definido, gerando uma lista ordenada dos genes de um determinado projecto BRB-ArrayTools. Para um conjunto de N
genes, o quadrados (LS) estatística menos é definido como o logaritmo natural negativo média dos P
-Valores das único gene testes univariados adequadas [12]. Um resumo estatístico é calculado que resume esses valores P
sobre o conjunto de genes definido pelo usuário; a estatística de resumo é log médio (P
) para o resumo LS de como o P
valores diferem de uma distribuição uniforme para LS [12]. O resumo estatístico está relacionada com a distribuição das estatísticas resumidas para amostras aleatórias de N
genes, em amostras colhidas os representados na matriz. Aqui N
é o número de genes no conjunto gene definido pelo usuário. 100.000 conjuntos de genes aleatórios foram amostrados para calcular esta distribuição. O valor
LS P é a proporção de conjuntos aleatórios de N
genes com menor estatística de média de resumo do que os resumos LS computados para os dados reais.
BRB-ArrayTools valores LS P
estimados para o enriquecimento de os 4 conjuntos de genes em nossa assinatura transcriptoma câncer gástrico identificado por cada método de processamento de tecidos como segue. Em primeiro lugar, a fim de comparar os 2.324 genes associados com o ganho de número de cópias, com a assinatura transcriptoma cancro gástrico identificado por microdissecação, a estatística de LS de 2.324 genes amplificados foi estimada por cálculo de um logaritmo natural negativo significativo dos valores de P do
testes univariados único gene para expressão diferencial de cada um dos 2.324 genes entre 20 amostras com câncer gástrico microdissecadas e 6 amostras normais. Então BRB-ArrayTools calculada a proporção de conjuntos aleatórios de 2.324 genes com menor estatística de média de resumo do que os resumos LS computados para os dados reais (LS P
valor). A assinatura transcriptoma câncer gástrico identificado pelo microdissecção foi também comparado com 677 genes associados com a perda do número de cópias, 58 proteínas relatados a ser sobre-expressos em câncer gástrico, e 66 proteínas relatados a ser underexpressed no câncer gástrico, com a respectiva LS P
valores. LS P
valor inferior a 0,01 foi considerado significativo. As mesmas análises foram repetidas à assinatura transcriptoma câncer gástrico identificado pelo método macrodissection.
Imunohistoquímica
imunohistoquímica TFF1 foi realizada utilizando amostras de tecido biópsia cirúrgica ou endoscópicas de 16 doentes com cancro gástrico (16 câncer e 2 amostras de tecidos normais adjacentes), e 4 voluntários saudáveis, que não foram incluídos neste estudo microarray de DNA. amostras de tecido da mucosa gástrica grosseiramente-normais foram coletados do antro gástrico de voluntários saudáveis ​​utilizando uma técnica de biópsia cego, com o consentimento informado [9]. lâminas de tecido fixadas em formalina e embebidos em parafina (4 um de espessura) foram corados com 13734-1-AP (Grupo Proteintech, Chicago, IL) a 1:50 durante 60 minutos à temperatura ambiente e Envision peroxidase de rábano anti-coelho (K4003, Dako , Carpinteria, CA) durante 30 min à TA. A reacção foi visualizada utilizando diaminobenzidina (K3468, Dako) e contrastadas com hematoxilina. TFF1 expressão foi avaliada semi-quantitativamente em 200x
ampliação, com base na percentagem de células coradas positivamente ( "-" = imunocoloração em ≤ 10% das células; "+" = 11-50%; "++" = 51- 75%; "+++" = 76-100%) [13, 14]. Imunocoloração sem anticorpo primário e epitélio gástrico normal de um tissue microarray controle serviram como controle negativo e positivo, respectivamente [15]. mancha citoplasmática que foi inequivocamente mais profundo do que o fundo foi contado como positivo.

Resultados Determinação de assinaturas de expressão gênica global de amostras macrodissected e LCM
Tabela 1 delineia as características clínico-patológicas dos pacientes e voluntários incluídos neste estudo microarray. dados de microarray foram obtidos tanto para amostras de LCM e macrodissected dos mesmos 20 biópsias (Figura 1A). Apesar de qualidade aceitável, dados de microarranjos de amostras de LCM teve geralmente mais baixos "presente convite" do que as amostras macrodissected (dados não mostrados
). Análise de componentes principais dos padrões de expressão gênica global derivados do micro e cancros gástricos dissecados-macro, e as amostras normais demonstrou uma clara separação de cada grupo de amostras (Figura 1B). A correlação média Pearson entre os dois métodos de processamento foi de 0,75 (intervalo interquartil, 0,71-0,81) .table 1 características clínico-patológicas de pacientes e voluntários incluídos na análise microarray

Os pacientes (n = 20)
Voluntários (n = 6)
Base características clínico-patológicas
Idade anos
Median
59
52 gama
interquartil
54-69
43-61 Sexo seguro - não. (%)
Masculino
16 (80%) Sims 3 (50%)
Feminino página 4 (20%) Sims 3 (50%) de status
Desempenho (PS ) - não. (%)
ECOG1 PS 0 ou 1 | 20 (100%)
tipo histológico - não. (%)
De Lauren intestinal
6 (30%)
difusa
de Lauren 14 (70%)
Localização de lesão primária - não. (%)
Superior 1/3 página 4 (20%)
Oriente 1/3
6 (30%)
Lower 1/3
10 (50%)
As metástases à distância - não. (%)
20 (100%)
tratamento e evolução
regime de quimioterapia - não. (%)
Cisplatina /Fluorouracil
20 (100%)
sobrevida global -.
Mês Median
8,0
intervalo interquartil
5,6-14,7
tempo para progressão -.
mês Median
3,5
intervalo interquartil
2,3-6,2
1Eastern Cooperative Oncology Group
Figura 1 (A) esquema de Estudo da coleta de amostras e processamento microarray (B) de componentes principais análise de perfis de micro e amostras de tumores dissecados-macro a partir de 20 pacientes com câncer gástrico e 6 amostras normais de voluntários saudáveis ​​de expressão gênica.
quadros 2 e 3 genes mostram sobre-expressos em amostras de câncer gástrico micro e dissecou-macro na seleção de características P Art < 10 -6. A morfologia celular
(AIF1, E2F1, E2F3, KIR2DL1, KIRREL, NPR1, Runx2,
TRIO) foi a categoria mais enriquecida funcional dos 42 genes sobre-expressos nas amostras microdissecadas em comparação com as amostras normais (seleção de características P
< 10 -6) como identificado por Engenho Pathway Analysis (IPA) (Tabela 2). morfologia do tumor
(APOE, BIRC5, CD14, COL1A1, COL1A2, Cyr61, FKBP1A, IL8, MCAM, MIF, RHOB
) foi a categoria funcional mais enriquecido entre os 73 genes sobre-expressos nas amostras macrodissected (seleção de características P
< 10 -6) por IPA (Tabela 3). genes da matriz extracelular, tais como COL6A2, COL1A1, COL1A2
e COL5A2
, eram proeminentes nas amostras macrodissected e presumivelmente contribuiu pelas células estromais. A Tabela 4 mostra genes underexpressed em amostras de câncer gástrico micro e dissecou-macro na seleção de características P Art < 10 -6.Table 2 genes sobre-expressos em câncer gástrico microdissecção a seleção de características P Art < 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

BMP3
38.52
HIST1H4C
6.3
BGN
30.3
LEPRE1
5.9
TRIO
18.5
ETNK2
5.6
GADD45GIP1
17.2
TRIP6
5.3
MIER2
16.7
FAM125B
5.3
KIFC3
16.4
NPR1
5.3
217318_x_at
13.7
DSCC1
5.3
217219_at
13.2
CLUL1
5.0
RUNX2
12.5
HMGB3
4.5
SMARCD1
12.0
E2F3
4.3
KIRREL
12.0
AIMP2
4.2
215621_s_at
12.0
ATAD5
4.0
GRM2
10.0
E2F1
3.8
FJX1
10.0
FKSG49
3.7
AIF1
10.0
DVL2
3.7
THY1
9.1
TIPRL
2.9
CARD10
9.1
EIF2C3
2.9
SIM2
9.1
NAT10
2.8
AIF1
9.1
MED27
2.7
APOBEC3G
8.3
PIN4
2.7
RHAG
8.3
CTPS
2.6
mudança 1fold, definido pela razão de câncer de expressão ao normal (= cancer /normal)
2Todos estes genes tinha taxa de falsa descoberta < 0,001
Tabela 3 Genes sobre-expressos em câncer gástrico macrodissected pelo recurso de seleção de P
. < 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

LY6E
24.42
SRM
6.7
IL8
22.7
NGLY1
6.7
CA12
20.0
RHOB
6.3
SBNO2
19.2
ACTN1
5.9
UBE2S
17.2
LOXL2
5.9
CYR61
17.2
COL5A2
5.9
ANGPT2
15.9
TRIM28
5.6
COL6A2
14.3
218982_s_at
5.6
BOP1
13.2
C7orf44
5.3
COL1A1
13.2
UBE2C
5.3
LPL
13.0
CEP76
5.3
MFGE8
12.8
BIRC5
5.3
APOE
12.2
PNO1
5.0
G6PC3
10.9
FSTL1
5.0
215900_at
10.3
GRINA
4.8
NUP62
10.0
MRTO4
4.8
MRPL4
10.0
STC1
4.8
GNL3L
10.0
MRPL12
4.5
MCAM
9.1
FKBP1A
4.5
PDLIM7
9.1
IFI30
4.5
216472_at
9.1
KPNA6
4.3
ACTN1
9.1
216532_x_at
4.3
BYSL
9.1
CENPI
4.2
GNAI2
8.3
PPM1G
4.2
NCAPH2
8.3
ICT1
3.7
CD14
8.3
SFRS14
3.6
EXOSC4
8.3
CTPS
3.6
OBFC2B
8.3
IMP4
3.3
PPP1R15A
7.7
UBE2G2
3.2
COL1A2
7.7
ISG20L2
3.2
GPX1
7.7
EIF4A1
3.1
MIF
7.7
HDGF
2.6
NME1
7.1
PSMD14 2.6
PPIL2
7.1
220856_x_at
2.4
CCDC85B
7.1
CNOT3
2.4
SPARC
6.7
GLT25D1
2.0
C8orf55
6.7
mudança 1fold, definido pela razão de câncer de expressão ao normal (= cancer /normal)
2Todos estes genes tinham falsa taxa de detecção. < 0,001
Tabela 4 Genes underexpressed em micro e macro-dissecados câncer gástrico no recurso selecção P Art < 10-6
microdissectados

Macrodissected

Gene

FC1

Gene

FC

HPGD
-25.02
208498_s_at
-11.1
HRASLS2
-20.0
SIDT2
-7.7
ABCC3
-20.0
MUC5AC
-5.9
SLC25A37
-16.7
CTAGE5
-5.0
ABHD2
-14.3
GNA11
-3.8
VIPR1
-10.0
ARFIP1
-3.4
CYTIP
-9.1
214316_x_at
-3.3
GALNT6
-9.1
222149_x_at
-3.3
SULT1A2
-9.1
OAS1
-8,3
PDCD4
-7,1
NR3C2
-7,1
DOCK6
-6,3
SULT1A1
-5,9
ZFYVE26 viajantes - 5.9
213212_x_at
-5,6
DSCR3
-5,3
TMEM131
-5,3
ECHDC2
-5.0
DENND1B
-5.0
KIAA0141
-4,8
RNF103
-4,8
PDCD4
-4,5
CABIN1
-4,5
222371_at
-4,3
RRBP1
-4.0
CC2D1A
-3,8
216438_s_at
-3,8
SGSM3
-3,8
ARPC2
-3,7
TRAK1
-3,6
GNA11
-3,6
PAFAH1B1
-3,4
CNDP2
-3,2
POCA
-3.1
PARP4
-3.1
ERLIN1
-2,9
1fold mudar, definido pelo negativo da razão do normal expressão ao câncer (= - (normal /cancro))
2Todos estes genes tinha taxa de detecção falsa < 0,001
Comparação entre a expressão ea matriz de dados CGH. análise CGH
matriz foi realizada utilizando ADN genómico extraído a partir de amostras contendo macrodissected > As células de tumor de 50% (critérios utilizados por estudos anteriores [16, 17]) Uma vez que o DNA possa ser obtido sem a necessidade para a amplificação do genoma completo, conforme necessário para amostras microdissecadas. amplificação do DNA do genoma inteiro pode potencialmente introduzir viés artifactual na matriz resultados CGH [18]. Representado na Figura 2 é a frequência do número de cópias de ADN aberrações entre todas as 20 amostras. Nossos dados aberração número de cópias era geralmente consistente com os dados reportados anteriormente [7, 16, 17, 19-23]. Quatro dos 20 pacientes tiveram amplificação de CHR8 q24.13-q24.21 (126.357.475-128.822.596) que contém o oncogene MYC
. O segundo locus de amplificação mais comum foi q21.2 chr17 (36.109.939-36.230.163), que foi amplificado em 3 pacientes. Sete pacientes não tinham aberrações cromossómicas detectáveis. Estes 7 amostras continham uma mediana de células de tumor de 70%, enquanto os outros 13 pacientes tinham uma média de células de tumor de 60% (P
valor = 0,1). Assim, a falta de aberrações cromossómicas detectáveis ​​nas 7 amostras não foi devido a uma menor percentagem de células de tumor nas amostras. Figura 2 A imagem gráfica que ilustra a frequência por cento de sondas detectado (aberrações) entre todas as 20 amostras.
Havia 2.324 genes únicos que foram associados com o ganho de número de cópia em pelo menos uma das 20 pacientes e 677 genes associados com o número de cópia perda. Usando comparação conjunto de genes análises, comparamos esses conjuntos de genes com nossas assinaturas transcriptoma identificados pelos diferentes métodos de isolamento amostra. Nossa hipótese é que genes desregulados associados com aberrações no número de cópias são mais propensos a se envolverem como contribuintes para a oncogênese, em vez de simplesmente como "espectadores". Assim, os 2.324 genes contidos no interior das regiões de ganhos Número de cópia foram analisados ​​em relação à sua expressão a partir de dados de matriz obtidos usando o método macrodissection (selecção característica
P < 0,05). A sobreposição entre a lista de genes em regiões de amplificação e de enriquecimento para a sua expressão em amostras que foram macrodissected foi estatisticamente significativa (LS P
value = 10 -5; ver Métodos de descrição estatística). No entanto, essa associação não foi observada quando os dados de expressão foi analisada a partir de amostras microdissecadas (seleção de características P Restaurant < 0,05; LS P
value = 0,41) (Figura 3A). Assim, houve forte associação entre o padrão de ganho de número de cópias e a expressão do gene apenas em amostras que foram macrodissected. Por exemplo, MYC
, o gene mais frequentemente amplificada nas nossas amostras de doentes, foi determinada a ser significativamente sobre-expresso em amostras macrodissected, mas não nos que foram microdissecadas, embora este resultado pode ser devido ao pequeno tamanho da amostra relativamente ou heterogeneidade dentro o tumor. Figura 3 Número de genes sobrepostos entre LCM e expressão de matriz macrodissected conjuntos de dados e os dados de arrayCGH partir do mesmo conjunto de 20 doentes.
Uma lista de 677 genes foi identificada em regiões onde a perda do número de cópias de ADN foi encontrada em pelo menos um dos 20 pacientes do estudo. A expressão destes genes foi analisada nos conjuntos de dados de matriz macro e micro-dissecadas. Uma associação significativa foi encontrada entre os genes com perda de número de cópias e sua expressão em ambas as amostras macro e micro-dissecados. (LS P valores
, 0,009 e 0,006 para a LCM e amostras macrodissected, respectivamente) (Figura 3B).
Concordância de assinaturas de genes com genes previamente relatados para ser associado com câncer gástrico
A pesquisa bibliográfica foi realizada PubMed para identificar previamente relatado genes e proteínas sobre e sub-expressas para o câncer gástrico (palavras-chave: imunohistoquímica, câncer gástrico, e overexpressed e ou perda de expressão). 58 proteínas sobre-expresso em cancro gástrico foram identificados deste modo. A expressão dos genes para estas proteínas foram encontradas 58 para ser enriquecido em dados de expressão a partir de amostras recolhidas por macrodissection (LS P
< 10 -5), mas nenhum enriquecimento na expressão dos 58 genes foi encontrado para amostras recolhidas pela microdissection (LS P
= 0,013). Em contraste, 66 proteínas relatados a ser underexpressed no câncer gástrico foram enriquecidos em dados de matriz de expressão a partir de amostras coletadas por microdissection (LS P Art < 10 -5), mas não a partir de amostras coletadas por macrodissection (LS P
= 0,89) (Tabela 5) .table 5 genes câncer gástrico na literatura que foram diferencialmente expressos entre 20 cancro e 6 amostras normais de seleção de características P Art < 0,05 de acordo com dados de microarranjos gerada usando cada método de processamento de tecidos
genes sobre-expressos em câncer
underexpressed genes em cancer

LCM&Macro1

LCM

Macro

LCM&Macro

LCM2

Macro

APOE
EGFR
AKT1
ANXA10
ANXA7
CDKN2B
AURKA
HGF
ANXA2
CASP6
BAD
FHIT
CCNE1
MET
CALR
CASP7
HLA-B
CDC20
RHOA
CCNB1
CDH1
HLA-E
CDC25B
TNS4
EEF2
CTNNA1
CXCR4
ESM1 HLA-G

GSN
PRSS8
E2F1
HIF1A
HLA-F
PTEN
EGR1
MINA
IQGAP2
SDHB
GRB2
PHB
KCNE2
SH3GLB1
HK2
KLF4
TFF1
ICAM1
MUC6
INHBA
RARB
LOXL2
SMAD4
MCM3
PTMA
SPARC
1Previously relatou proteínas sobre-expresso para o câncer gástrico, que também foram sobre-expressos em nossa microdissecção (LCM) e amostras de câncer macrodissected em comparação com amostras normais
2Previoulsy relatados proteínas underexpressed para o câncer gástrico, que também foram underexpressed em nossa microdissecadas (LCM), as amostras cancerosas, mas não em amostras de cancro macrodissected
validação dos dados de microarray
a fim de validar os nossos dados de microarray, Foram realizadas análises imuno-histoquímica em um gene identificado como underexpressed em amostras de cancro microdissecadas a partir de 16 pacientes e 4 voluntários que não foram incluídos no estudo do DNA microarray. TFF1
foi escolhida para este estudo de validação imuno-histoquímica, porque é significativamente underexpressed nas amostras de LCM (P
= 0,0036), mas não em amostras macrodissected (P
= 0,09), em comparação com a mucosa gástrica normal. TFF1 de imunorreactividade no cancro foi avaliado como -, +, ++, +++ e em 7 (43,8%), 3 (18,7%), 4 (25,0%), e 2 (12,5%), respectivamente. Em contraste, todas as amostras 6 normais da mucosa gástrica (4 voluntários saudáveis ​​e 2 amostras de tecidos normais adjacentes) preservado imunorreactividade TFF1 (+++) (Figura 4). Assim, amostras de câncer gástrico tinha significativamente menor imunorreatividade TFF1 de mucosa gástrica normal, consistente com relatórios anteriores [13, 14] (P Compra de qui-quadrado = 0,007). Figura 4 representativas TFF1 resultados de coloração imuno-histoquímica para (A) um adenocarcinoma gástrico demonstrando a perda da expressão de TFF1, e (B) mucosa gástrica normal a partir de um voluntário saudável TFF1 expressar em células epiteliais gástricas. (Ampliação = 200x)
Estes resultados demonstram que a expressão de genes baseados em macrodissection analisa expressão gênica superou as análises de amostras de LCM para a identificação de genes sobre-expressos em câncer gástrico.

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