Различия в желудочном подписей экспрессии генов рака, полученных из лазерного захвата микродиссекции versushistologic macrodissection

различия в желудочном подписей экспрессии генов рака, полученных из лазерного захвата микродиссекции в сравнении
гистологического macrodissection
Аннотация
фона
образцов желудочного рака, полученных гистологических macrodissection содержат относительно высокое содержание стромы, которые могут существенно влиять на профили экспрессии генов. Различия между экспрессией гена сигнатуры, полученной из macrodissected образцов желудочного рака и сигнатуру, полученную от изолированных рака желудка эпителиальных клеток из тех же самых биопсий с использованием лазерного захвата микродиссекции (LCM) оценивали на их потенциальных экспериментальных пристрастий.
Методы
РНК был выделен из образцов замороженной ткани желудочных биопсий рака от 20 пациентов с использованием как гистологических методов macrodissection и LCM. РНК из LCM подвергалась дополнительному раунду РНК амплификации Т7. Выражение профилирование осуществляли с использованием Affymetrix HG-U133A массивов. Гены, идентифицированные в подписи выдавливанием из каждого метода обработки ткани сравнивали с набором генов, содержащихся в хромосомных регионах найдены укрывать число копий аберраций в образцах опухолей с помощью массива CGH и к белкам, ранее идентифицированы как избыточно экспрессируется при раке желудка.

Результаты Гены, представленные иметь увеличенное количество копий при раке желудка были также обнаружены сверхэкспрессируется в образцах, полученных с помощью macrodissection (LS P
значение < 10 -5), но не в массив данных генерируется с использованием микродиссекции , Набор из 58 ранее выявленных генов гиперэкспрессия при раке желудка также обогащены в гене подписи, идентифицированной macrodissection (LS P
&л; 10 -5), но не в подписи, идентифицированной микродиссекции (LS P
= 0,013). В отличие от этого, 66 генов, ранее сообщалось, underexpressed при раке желудка обогащались в гене подписи идентифицированного микродиссекции (LS P
≪ 10 -5), но не в подписи, идентифицированной macrodissection (LS P
= 0,89).
Выводы
методика отбора проб опухоли смещает результаты микрочипов. LCM может быть более чувствительным сбор и обработка методом для идентификации потенциальных кандидатов генов супрессоров опухолей при раке желудка с использованием выражения профилирование.
Предпосылки
Основной целью анализа микрочипов является идентификация дифференциально экспрессирующихся генов в подмножеств клинического образцы для соответствия конкретных методов лечения по отношению к опухолевым подтипов. Тем не менее, количественный анализ экспрессии массив клинических образцов рака с высоким содержанием стромы является сложной задачей, так как отношение эпителиальных опухолевых клеток к стромальные клетки могут сильно различаться. Заражение стромы может посрамить выражение микрочипов на основе и количество копий анализов. Лазерный захват микродиссекции (LCM) является ценным методом, который позволяет изолировать эпителиальные клетки из стромальных клеток, тем самым обогащая для эпителиального содержания. Количество образца и РНК, полученной LCM часто весьма ограничены, однако, и требует стадию амплификации для создания достаточного количества материала для микрочипов анализа. Этот процесс амплификации может исказить результаты и привести к перекосу множества дифференциально экспрессируемых генов [1]. Гистологическое macrodissection (образцы, собранные из срезов тканей, руководствуясь микроскопического анализа, окрашенном серийному секции) обеспечивает больший объем материала образца по сравнению с LCM, который может исключить необходимость в дополнительном раунде амплификации РНК. Однако macrodissected образцы содержат значительно большее содержание стромальных клеток, чем образцы, полученные микродиссекции.
Предыдущие исследования сравнили эти два метода обработки ткани для клинических образцов рака. На основании данных из 14 ректальных образцов аденокарциномы, косолапый и др
. благоприятствования macrodissection над микродиссекции из-за относительно низкого вклада компонентов стромы в macrodissected образцов из этого типа опухоли и смещенных результатов экспрессии генов из микродиссекции образцов за счет амплификации РНК, необходимой для этих [2] образцов. С другой стороны, Кли и др
. предположил, что микродиссекции профилирование однозначно идентифицировать большое количество дифференциально экспрессированных генов не найдено иное использование выборки объемной ткани, на основе данных из 10 аденокарциномы легких и 6 соседних нормальных образцах [3]. Эти исследования были ограничены малыми размерами выборки, и, следовательно, требуют дальнейшей проверки. Также неясно, гены, идентифицированные с помощью однозначно микродиссекции образцы представляют ли полезные биомаркеры. Уклон в результате амплификации РНК должна уравновешиваться в пользу обогащения образцов для эпителиального содержания при рассмотрении вопроса является предпочтительным для экспрессии профилирования опухолей с высоким содержанием стромы, такие как желудка или поджелудочной железы аденокарциномы микродиссекции.
Микродиссекция особенно полезен для обогащения желудка раковую опухоль клеток, полученных из образцов биопсии эндоскопических, особенно от рака диффузного типа желудка, которое состоит из разбросанными опухолевых клеток, смешанных с воспалительными клетками и фиброза. Снижение общей заболеваемости раком желудка в США в течение этого века, как представляется, в значительной степени связано с уменьшением поражений кишечника типа, в то время как появление диффузного типа, как полагают, осталась прежней [4]. Используя образцы, полученные LCM, Wu и др
. Сообщается, что злокачественные против доброкачественных эпителиальных клеток желудка можно было различить с точностью до 99% в расчете на 504 гена предсказателя [5]. Этот предсказатель включены хорошо известные гены, выраженные в желудочном эпителии, включая трилистника факторы 1, 2, и 3 [5]. Используя LCM, Jinawath и др
. определили 46 генов, которые могут представлять различные молекулярные подписи для двух гистологических типов рака желудка - диффузного типа и кишечного типа рака желудка [6]. Тем не менее, никаких исследований не проводилось до настоящего времени, непосредственно сравнивая macrodissection против
. Методы LCM, использующие один и тот же набор образцов желудочного рака.
В данном исследовании мы стремились оценить различия между профилями экспрессии, полученных из одних и тех же опухолей, которые были обработаны как macrodissection и LCM для микрочипов анализа. Учитывая трудности при проверке всех дифференциально выраженных генов, идентифицированных с использованием каждого типа сбора проб, мы сравнили гены, выявленных в ходе нашего анализа микрочипов с белками, как известно, гиперэкспрессия при раке желудка. Кроме того, мы определили, является ли экспрессия генов, идентифицированных в каждой подписи коррелировали с изменениями в количестве копий гена, которые были идентифицированы с помощью массива сравнительная геномная гибридизация (CGH) из одних и тех же опухолей. Предыдущие исследования рака желудка показали высокую корреляцию между массива CGH и данные выражения массива [7]. изменения количества копий были оценены с использованием ДНК macrodissected опухоли, чтобы избежать смещения от полного генома усиления. Кроме того, мы намерены были ли обогащенная подписи генов, которые мы получили от каждого метода сбора и обработки образцов для белков, которые ранее были зарегистрированы, чтобы быть дизрегуляции генов при раке желудка. Наши результаты указывают на то, что метод МДК является более чувствительным для идентификации генов, которые underexpressed в рак по сравнению с нормальной тканью (потенциальные супрессоров опухолей), в то время как macrodissection идентифицирует большее количество генов, которые избыточно экспрессируется при раке. Поэтому macrodissection и LCM микродиссекции оказаться полезными для изучения различных аспектов биологии рака.
Методы
Пациентов
Двадцать пациентов, которые были проанализированы в данном исследовании, является частью 96 пациентов, которые принимали участие в перспективном исследовании и чьи образцы использовались в качестве выражения обучающего набора для разработки предсказатель химио-ответ [8]. Часть выражения и массива данных CGH из своих macrodissected образцов сообщалось ранее [8, 9]. Пример сбора, обработки, и последующие меры были выполнены в соответствии с протоколом, утвержденный Институциональным наблюдательным советом (IRB) Национального онкологического центра больницы в Коян, Южная Корея (NCCNHS01-003). Все пациенты подписали IRB-утвержденную форму информированного согласия. Право на зачисление в исследование были включены следующие параметры: 1) возраст ≥ 18 лет; 2) гистологически подтвержденный аденокарциномы желудка; 3) клинически документированные отдаленные метастазы; 4) иные, чем рак желудка не предыдущие или сопутствующие злокачественные опухоли; 5) отсутствие в анамнезе химиотерапии, либо адъювант или паллиативная; и 6) адекватной функции всех основных органов. Пациенты получали цисплатин 60 мг /м 2 IV на 1 день и фторурацил 1000 мг /м 2 IV в дни 1-5 график 3 недели.
Обработка ткани
Перед macrodissection, опухоль образцы имели медианный ядра опухоли 50% (межквартильный диапазон 30-60%). Macrodissection проводили, как описано ранее [10]. Macrodissection приводят к среднему 60% ядер опухолевых на верхних салазок (межквартильный диапазон 60-72.5%). Для микродиссекции, опухолевых и нормальных тканей образцов криосрезах разрезали на 10 мкм, и хранили в замороженном состоянии при -80 ° С. Слайды были обезвожены использованием нуклеазы без HistoGene (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) реагенты в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Микродиссекция проводили с использованием PixCell II (Арктур ​​Bioscience, Mountain View, CA). Обезвоживание и LCM был ограничен до 15 мин или меньше, для каждого образца собранной. В общей сложности 10000 лазерных выстрелов (размер пятна 15 мкм в диаметре) были собраны с использованием CapSure Макро LCM Колпачки для каждого образца. РНК выделяли с помощью PicoPure Выделение РНК Kit (Molecular Devices). Вкратце, эпителиальные клетки инкубировали с 50 мкл буфера для экстракции в 0,5 мл трубки микроцентрифужных при 42 ° С в течение 30 мин. ДНКазы (Qiagen, Valencia, CA), проводили обработку непосредственно в колонне очистки, а РНК выделяли с использованием объем элюирования 8 мкл (Molecular Devices). Пять мкл РНК из популяции клеток микродиссекции превращали в биотинилированного, антисмысловой кРНК мишени, используя Affymetrix двухтактный методом мечени (Санта-Клара, Калифорния). Все биотинилированные цели были разрозненными и 15 мкм
г каждого гибридизовали HG-U133A GeneChip микрочипов в соответствии с протоколом производителя. Сканированные изображения массива были проанализированы и преобразованы в сигнал данных с помощью алгоритма 5.0 Affymetrix MAS.
Массив CGH
геномную ДНК экстрагировали из образцов с использованием TRI реагента (Invitrogen, Carlsbad, CA), в соответствии с протоколом производителя, и дополнительно очищали с использованием набора ДНК QIAamp Micro (QIAGEN). Для массивов экспериментов CGH были использованы Agilent 4x44k HD-CGH Microarrays, содержащие 44000 характеристики (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния). 0.5-1 мкг опухолевых геномных ДНК образцов и того же количества геномной ДНК человека из нескольких анонимных доноров женского пола (Promega, Madison, WI), переваривали AluI (50 единиц) и RsaI (50 единиц) в течение 2 ч при 37 ° C , 5 мкл случайных праймера была смешана с шаблоном расщепленной ДНК. Ссылка и образец ДНК метили с помощью компании Agilent Labeling Kit Plus, который включает в себя 5-кратный буфер, 10x дНТФ, Cy-3/5 дУТФ (1,0 мм) и Exo-фрагмент Кленова. Зонд смесь Су3 меченый ДНК-образец, Cy5 меченый ссылочный ДНК (39 мкл) 5 мкл человеческой Cot-1 ДНК (Invitrogen), 11 мкл Agilent 10 × блокирующего агента и 50 мкл Agilent 2 × гибридизационного буфера денатурировали при 95 ° С в течение 3 мин и инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин. Зонд был применен к массиву с использованием микрочипов Agilent камеру гибридизации и гибридизовали в течение 21 ч при 65 ° С во вращающейся печи при 20 оборотах в минуту. Массивы были промыты в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя, смоченным в компании Agilent стабилизирующие и сушки раствора, и сканируют с использованием микрочипов сканер Agilent 2565AA ДНК. Программа компании Agilent по программе Scan Control 7.0 и Feature Extraction компании Agilent Программа Software 9.5.1 были использованы для обработки данных. Массив данных CGH были проанализированы с помощью программного обеспечения ГКГ Analytics компании Agilent (версия 3.5.14). ADM-2 алгоритм с порогом 6, с нечетким нулем и централизации на, была использована для выявления аберрацию. Критерии фильтрации аберраций были минимальные зонды 5, минимальный средний абсолютный журнал <суб> 2 отношение 0,5, а максимальная аберраций 1000000. Аберрации, определенные для каждого образца были перечислены и в графическом виде.
Желудочной гены рака в литературе
Чтобы создать определенный пользователем набор генов для нашего сравнения генов анализа, мы искали базу данных PubMed для генов с желудочной клеточного специфического белка рака выражение, используя ключевые слова "рак желудка", "иммуногистохимии" и "суперэкспрессированный" или "потеря выражения". Для нашего набора генов сравнительных анализов, генные символы рака желудка специфических генов были нанесены на карту, чтобы исследовать набор идентификаторов на массиве HG-U133A (HTTP:.. //WWW NetAffx COM). Были 178 ( "суперэкспрессированный") и 327 ( "потеря экспрессии") статей в Pubmed на момент написания.
Статистический анализ данных экспрессии массивов данных
микрочипов экспрессии генов Affymetrix HG-U133A были проанализированы с помощью набор генов алгоритмы анализа Сравнение BRB ArrayTools (версия 3.8, Национальный институт рака, HTTP:.... //Линус NCI NIH гов /BRB-ArrayTools HTML) [11]. Набор генов инструмент сравнения анализирует определенные пользователем наборы генов для дифференциальной экспрессии среди заранее определенных классов (т.е.
., Рак против
. Нормальная) из исходного набора данных. Определяемые пользователем наборы генов, используемые в данном исследовании, включают U133A зонд наборы, соответствующие генам с изменением числа копий и соответствующая желудочных генов рака, описанных в литературе. Гены, опухоль /нормальный журнал отношение <суб> 2, выше, чем 0,5, по меньшей мере, один из 20 образцов пациентов были включены в список генов с усилением числа копий. Аналогичным образом, гены с потерей количества копий (журнал <суб> 2 соотношение &лт; -0.5) были перечислены. Эти пользовательские наборы генов были проанализированы для дифференциальной экспрессии между 20 образцов рака и 6 нормальных образцов (т.е.
., 3 macrodissected и 3 микродиссекции образцов).
Для каждого исходного набора данных, Р
-value является вычисляется для каждого гена соотносить уровень экспрессии для дифференциальной экспрессии между предопределенными классами, создавая ранжированный список генов данного проекта BRB-ArrayTools. Для набора N
генов, наименьших квадратов (LS) статистики определяется как среднее значение отрицательного натуральный логарифм P
-значения подходящих одного гена одномерные испытаний [12]. Сводная статистика вычисляется, который суммирует эти значения P
более определенного пользователем набора генов; суммарная статистика является средним P log (
) для резюме LS того, как P
значения отличаются от равномерного распределения для LS [12]. Сводная статистика связана с распределением статистики для случайных выборок N
генов, взятых из тех, которые представлены на массиве. Здесь N
это количество генов в определенный пользователем набор генов. 100000 случайных наборов генов были отобраны для вычисления этого распределения. Значение LS P
является доля случайных наборов N
генов с меньшими средними сводные статистические данные, чем LS резюме, вычисленных для реальных данных.
BRB-ArrayTools оценочные значения LS P
для обогащения на 4 комплекта генов в нашем желудочной транскриптома рака подписи идентифицированы каждым методом обработки ткани следующим образом. Во-первых, для того, чтобы сравнить 2,324 генов, связанных с увеличением количества копий с нашим желудочной транскриптома рак подписи идентифицированного микродиссекции, то LS статистика 2,324 амплифицированных генов оценивали путем вычисления среднего отрицательный натуральный логарифм значений P
единственный ген одномерные тесты для дифференциальной экспрессии каждого из генов 2,324 между 20 микродиссекции образцов желудочного рака и 6 нормальных образцов. Тогда BRB-ArrayTools рассчитывается доля случайных наборов 2,324 генов с меньшими средними сводные статистические данные, чем LS резюме, вычисленных для реальных данных (LS P
значение). Желудочный транскриптомный рак подписи идентифицируется микродиссекции также по сравнению с 677 генов, связанных с потерей количества копий, 58 белков, как сообщается, избыточно экспрессируется при раке желудка и 66 белков, как сообщается, underexpressed при раке желудка, с соответствующими LS P
значения. LS P
значение меньше 0,01 считается значительным. Одни и те же анализы были повторены для желудка транскриптома рака подпись была произведена по методу macrodissection.
Иммуногистохимия
TFF1 иммуногистохимии проводили с использованием хирургических или эндоскопических образцов ткани биопсии от 16 рака желудка у пациентов (16 рака и 2 смежных образцов нормальной ткани), и 4 здоровых добровольцев, которые не были включены в это исследование ДНК микрочипов. Макроскопически-нормальные образцы слизистой оболочки желудка ткани собирали из желудка антрального здоровых добровольцев с использованием методики слепой биопсии, с информированного согласия [9]. Парафиновые слайды ткани фиксированные формалином (4 мкм толщиной) были окрашены 13734-1-AP (Proteintech Group, Чикаго, Иллинойс) в 1:50 в течение 60 мин при комнатной температуре и Энвисион против кроличьего пероксидазой хрена (K4003, DAKO , Карпинтерия, CA) в течение 30 мин при комнатной температуре. Реакцию визуализируют с использованием диаминобензидина (K3468, DAKO) и контрастному окрашиванию гематоксилином. Выражение TFF1 оценивали полуколичественно при 200х увеличении
, основанный на процент положительно окрашенных клеток ( "-" = иммуноокрашивания в ≤ 10% клеток; "+" = 11-50%; "++" = 51- 75%; "+++" = 76-100%) [13, 14]. Иммунологическое без первичного антитела и нормального желудочного эпителия микрочипов контрольной ткани служили в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно [15]. Цитоплазматических пятно, которое недвусмысленно глубже, чем фон подсчитывали как положительные.

Результаты Определение глобальных подписей экспрессии генов из macrodissected и LCM образцов
Таблица 1 очерчивает Клинико-патологические характеристики пациентов и добровольцев, включенных в этот микрочипов исследование. Микрочипов данные были получены и для LCM и macrodissected образцов из тех же самых 20 биопсий (Фигура 1А). Несмотря на то, приемлемого качества, микрочипов данные из образцов LCM были в целом более низкий "настоящий вызов", чем macrodissected образцов (данные не показаны
). Анализ главных компонент глобальных паттернов экспрессии генов, полученных из микро- и макро-рассеченные рака желудка и нормальных образцов показали четкое разделение каждой группы образцов (рис 1B). Медиана корреляции Пирсона между этими двумя методами обработки составляла 0,75 (межквартильный диапазон 0.71-0.81) .table 1 Клинико-патологические характеристики пациентов и добровольцев, включенных в анализ микрочипов
<й> <бр> Пациенты (n = 20)

Добровольцы (п = 6)

Базовый клинико-патологическими характеристики

Возрастные год
Медиана
59 <бр> 52
межквартильный диапазон
54-69
43-61
Секс - нет. (%)
Мале
16 (80%)
3 (50%)
Женский
4 (20%)
3 (50%) Статус
Производительность (PS ) - нет. (%)
ECOG1 PS 0 или 1
20 (100%)
гистологического типа - нет. (%)
Лорен кишечная
6 (30%)
диффузного Лорен
14 (70%)
Местонахождение первичного очага - нет. (%)
Верхняя 1/3
4 (20%)
Средний 1/3
6 (30%)
Нижняя 1/3
10 (50%) <бр> Отдаленные метастазы - нет. (%) 20
(100%)
Лечение и исход
режима химиотерапии - нет. (%)
Цисплатин /Fluorouracil
20 (100%)
общей выживаемости -. Месяц
Медиана
8.0
межквартильный диапазон
5.6-14.7
Время до прогрессирования -. месяц
Медиана
3,5
межквартильный диапазон
2.3-6.2
1Eastern Cooperative Oncology Group
Рисунок 1 (а) Изучение схемы сбора проб и обработки микрочипов (B) основного компонента анализ экспрессии генов профилей микро- и макро-расчлененный образцов опухоли из 20 больных раком желудка и 6 нормальных образцов от здоровых добровольцев.
в таблицах 2 и 3 показаны гены избыточно экспрессируется в микро- и макроэлементов-рассеченные образцов желудочного рака при отборе признаков P
&л; 10 -6. Морфология клеток
(AIF1, E2F1, E2F3, KIR2DL1, KIRREL, NPR1, RUNX2, TRIO
) был наиболее обогащены функциональной категории из 42 генов суперэкспрессированный в микродиссекции образцах по сравнению с нормальными образцами (выбор функция P
&л; 10 -6), как это определено изобретательностью Pathway Analysis (IPA) (таблица 2). Опухоль морфология
(Апо, BIRC5, CD14, COL1A1, COL1A2, Cyr61, FKBP1A, IL8, MCAM, MIF, RHOB
) был наиболее обогащенная функциональной категории среди 73 генов суперэкспрессированный в macrodissected образцах (выбор функция P
&л; 10 -6) АПИ (Таблица 3). Внеклеточного матрикса гены, такие как COL6A2, COL1A1, COL1A2
и COL5A2
, были заметны в macrodissected образцах и, предположительно, вносимого стромальных клеток. В таблице 4 представлены гены underexpressed в микро- и макроэлементов-рассеченные образцах рака желудка при отборе функция P &
ЛТ; 10 -6.Table 2 Гены суперэкспрессированный в микродиссекции рака желудка при выборе функция P &
ЛТ; 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

BMP3
38.52
HIST1H4C
6.3
BGN
30.3
LEPRE1
5.9
TRIO
18.5
ETNK2
5.6
GADD45GIP1
17.2
TRIP6
5.3
MIER2
16.7
FAM125B
5.3
KIFC3
16.4
NPR1
5.3
217318_x_at
13.7
DSCC1
5.3
217219_at
13.2
CLUL1
5.0
RUNX2
12.5
HMGB3
4.5
SMARCD1
12.0
E2F3
4.3
KIRREL
12.0
AIMP2
4.2
215621_s_at
12.0
ATAD5
4.0
GRM2
10.0
E2F1
3.8
FJX1
10.0
FKSG49
3.7
AIF1
10.0
DVL2
3.7
THY1
9.1
TIPRL
2.9
CARD10
9.1
EIF2C3
2.9
SIM2
9.1
NAT10
2.8
AIF1
9.1
MED27
2.7
APOBEC3G
8.3
PIN4
2.7
RHAG
8.3
CTPS
2.6
1fold изменения, определяется отношением экспрессии рака к нормальной жизни (= рак /нормальный)
2All эти гены были ложных обнаружения &л; 0,001
Таблица 3 Гены суперэкспрессированный в macrodissected рака желудка на функцию выбора P
. &л; 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

LY6E
24.42
SRM
6.7
IL8
22.7
NGLY1
6.7
CA12
20.0
RHOB
6.3
SBNO2
19.2
ACTN1
5.9
UBE2S
17.2
LOXL2
5.9
CYR61
17.2
COL5A2
5.9
ANGPT2
15.9
TRIM28
5.6
COL6A2
14.3
218982_s_at
5.6
BOP1
13.2
C7orf44
5.3
COL1A1
13.2
UBE2C
5.3
LPL
13.0
CEP76
5.3
MFGE8
12.8
BIRC5
5.3
APOE
12.2
PNO1
5.0
G6PC3
10.9
FSTL1
5.0
215900_at
10.3
GRINA
4.8
NUP62
10.0
MRTO4
4.8
MRPL4
10.0
STC1
4.8
GNL3L
10.0
MRPL12
4.5
MCAM
9.1
FKBP1A
4.5
PDLIM7
9.1
IFI30
4.5
216472_at
9.1
KPNA6
4.3
ACTN1
9.1
216532_x_at
4.3
BYSL
9.1
CENPI
4.2
GNAI2
8.3
PPM1G
4.2
NCAPH2
8.3
ICT1
3.7
CD14
8.3
SFRS14
3.6
EXOSC4
8.3
CTPS
3.6
OBFC2B
8.3
IMP4
3.3
PPP1R15A
7.7
UBE2G2
3.2
COL1A2
7.7
ISG20L2
3.2
GPX1
7.7
EIF4A1
3.1
MIF
7.7
HDGF
2.6
NME1
7.1
PSMD14 2.6
PPIL2
7.1
220856_x_at
2.4
CCDC85B
7.1
CNOT3
2.4
SPARC
6.7
GLT25D1
2.0
C8orf55
6.7
1fold изменения, определяется отношением экспрессии рака к нормальной жизни (= рак /нормальный)
2All эти гены были ложных обнаружения &л;.
0,001 Таблица 4 Гены underexpressed в микро- и макро-рассеченные рак желудка в особенности выбор P
&л; 10-6
микродиссекции

<й>
Macrodissected

<й>
Gene

FC1

Gene

FC

HPGD
-25.02
208498_s_at
-11.1
HRASLS2
-20.0
SIDT2
-7.7
ABCC3
-20.0
MUC5AC
-5.9
SLC25A37
-16.7
CTAGE5
-5.0
ABHD2
-14.3
GNA11
-3.8
VIPR1
-10.0
ARFIP1
-3.4
CYTIP
-9.1
214316_x_at
-3.3
GALNT6
-9.1
222149_x_at
-3.3
SULT1A2
-9.1
OAS1
-8,3
Pdcd4
-7,1
NR3C2
-7,1
DOCK6
-6,3
SULT1A1
-5,9
ZFYVE26
- 5.9
213212_x_at
-5,6
DSCR3
-5,3
TMEM131
-5,3
ECHDC2
-5,0
DENND1B
-5,0
KIAA0141
-4,8
RNF103
-4,8
Pdcd4
-4,5
CABIN1
-4,5
222371_at
-4,3
RRBP1
-4,0
CC2D1A
-3,8
216438_s_at
-3,8
SGSM3
-3,8
ARPC2
-3,7
TRAK1
-3,6
GNA11
-3,6
pafah1b1
-3,4
CNDP2
-3,2
SPOP
-3,1
PARP4
-3,1
ERLIN1
-2,9
1fold изменить, определяется отрицательным отношения экспрессии нормального к раку (= - (нормальный /рак))
2All эти гены были ложных обнаружения &л; 0,001
Сравнение между выражением и массива данных CGH.
анализ массива CGH проводили с использованием геномной ДНК, выделенной из образцов, содержащих macrodissected > 50% опухолевых клеток (критерии, используемые в предыдущих исследованиях [16, 17]), так как достаточное количество ДНК может быть получена без необходимости полного генома амплификации в соответствии с требованиями для микродиссекции образцов. Всего амплификации ДНК генома потенциально может ввести смещение в об искусственной массива результатов CGH [18]. Изображенный на рисунке 2, частота комплементарной ДНК количество аберраций среди всех 20 образцов. Наши данные аберрация число копий в целом соответствует ранее сообщенным данным [7, 16, 17, 19-23]. Четыре из 20 пациентов имели усиление chr8 q24.13-q24.21 (126357475-128822596), который содержит MYC
онкоген. Вторым наиболее распространенным амплификация локуса был chr17 q21.2 (36109939-36230163), который был усилен в 3-х больных. Семь пациентов не имели обнаруживаемых хромосомных аберраций. Эти 7 образцы содержали медиана 70% опухолевых клеток, в то время как другие 13 пациентов имели средний 60% опухолевых клеток (P значение
= 0,1). Следовательно, отсутствие обнаруживаемых хромосомных аберраций в 7 образцах не было связано с более низким процентом опухолевых клеток в этих образцах. Рисунок 2 Графическое изображение, иллюстрирующий процентную частоту зондов обнаружено (аберраций) среди всех 20 проб.
Были 2,324 уникальных генов, которые были связаны с увеличением числа копий, по меньшей мере, одного из 20 пациентов, и 677 генов, связанных с числом копий потеря. Используя набор генов сравнения анализ, мы сравнили эти наборы генов с нашими подписями транскриптом, определенных различными методами выделения образца. Мы предположили, что дизрегуляции гены, связанные с числом копий аберраций, более вероятно, будут вовлечены в качестве вкладчиков онкогенеза, а не просто как "случайных прохожих". Следовательно, 2,324 гены, содержащиеся в регионах прироста количества копий были проанализированы с точки зрения их экспрессии из массива данных, полученных с помощью метода macrodissection (выбор функция P
&лт; 0,05). Перекрытие между списком генов в областях усиления и обогащения их экспрессии в образцах, которые были macrodissected было статистически значимым (P LS
значение = 10 -5, приведены в разделе Методы статистического описания). Тем не менее, эта ассоциация не наблюдалось, когда выражение данные были проанализированы с микродиссекции образцов (выбор функция P &
ЛТ; 0,05; P LS
значение = 0,41) (рис 3А). Таким образом, существует сильная ассоциация между характером прироста количества копий и экспрессии генов только в образцах, которые были macrodissected. Например, MYC
, наиболее часто амплифицированный ген в наших образцах пациентов, была определена значительно избыточно экспрессируется в macrodissected образцах, но не в тех, которые были микродиссекции, хотя этот результат может быть из-за относительно небольшого размера выборки или разнородность опухоль. Рисунок 3 Число генов перекрывающихся между LCM и массивов macrodissected выражение наборов данных и массива данных CGH из того же набора из 20 пациентов.
Список 677 генов, идентифицированных в тех регионах, где потери числа копий ДНК было обнаружено, по крайней мере, один из 20 пациентов в исследовании. Экспрессия этих генов была проанализирована в макро- и микро-рассеченные наборов данных массива. Статистически значимая связь была обнаружена между генами с потерей количества копий и их выражения в обоих макро- и микро-расчлененный образцов. (Значения
P LS, 0.009 и 0.006 для LCM и macrodissected образцов, соответственно) (рис 3B).
Concordance подписей генов с генами сообщалось ранее, связаны с раком желудка
PubMed поиск литературы был проведен для выявления ранее сообщалось, переедания и выражали гены и белки для рака желудка (ключевые слова: иммуногистохимии, рак желудка, и суперэкспрессированный и или потеря экспрессии). 58 белки избыточно экспрессируется при раке желудка были идентифицированы этим способом. были найдены экспрессии генов для этих 58 белков обогащены данные по экспрессии из образцов, собранных macrodissection (LS P
&л; 10 -5), но не обогащение в экспрессии генов 58 был найден в образцах, собранных микродиссекции (LS P
= 0,013). В отличие от этого, 66 белков, согласно сообщениям, underexpressed при раке желудка обогащались массива данных экспрессии из образцов, собранных микродиссекции (LS P
&л; 10 -5), но не из образцов, собранных macrodissection (LS P <бр> = 0,89) (таблица 5) .table 5 Желудочный генов рака в литературе, которые были дифференцированно выражены между 20 раком и 6 нормальных образцов при отборе функция P &
ЛТ; 0,05 по данным микрочипов генерируется с использованием каждого метода обработки ткани
суперэкспрессированный гены рака

Underexpressed гены cancer

LCM&Macro1

LCM

Macro

LCM&Macro

LCM2

Macro

APOE
EGFR
AKT1
ANXA10
ANXA7
CDKN2B
AURKA
HGF
ANXA2
CASP6
BAD
FHIT
CCNE1
MET
CALR
CASP7
HLA-B
CDC20
RHOA
CCNB1
CDH1
HLA-E
CDC25B
TNS4
EEF2
CTNNA1
HLA-G
CXCR4
ESM1
ПСГ
PRSS8
E2F1
HIF1A
HLA-F
PTEN
egr1
МИНА
IQGAP2
SDHB
Grb2
ПГБ
KCNE2
SH3GLB1
HK2
KLF4
TFF1
ICAM1
MUC6
INHBA
рарб
LOXL2
SMAD4
MCM3
PTMA
Sparc
1Previously сообщили суперэкспрессированный белки для рака желудка, которые также были сверхэкспрессируется в нашем микродиссекции (LCM) и macrodissected образцах рака по сравнению с нормальными образцами
2Previoulsy сообщили underexpressed белки для рака желудка, которые также были underexpressed в нашем микродиссекции (LCM) образцов рака, но не в macrodissected образцах рака
Валидация микрочипов
данных для того, чтобы проверить наши данные микрочипов, мы провели иммуногистохимический анализ на ген идентифицирован как underexpressed в микродиссекции образцах рака от 16 пациентов и 4 добровольцы, которые не были включены в ДНК микрочипов исследования. TFF1
был выбран для этого проверочного исследования иммуногистохимии, так как оно значительно underexpressed в образцах LCM (Р = 0,0036
), но не в macrodissected образцах (P
= 0,09), по сравнению с нормальной слизистой оболочки желудка. TFF1 иммунореактивности при раке была оценена как -, +, ++, +++ и в 7 (43,8%), 3 (18,7%), 4 (25,0%) и 2 (12,5%), соответственно. В противоположность этому, все 6 нормальных образцов желудочного слизистой оболочки (4 здоровых добровольцев и 2 нормальных образцов соседних тканей) сохраняется TFF1 иммунореактивности (+++) (рисунок 4). Таким образом, желудочные образцы рака имели значительно более низкую TFF1 иммунореактивности, чем нормальной слизистой оболочки желудка, в соответствии с предыдущими отчетами [13, 14] (P
для хи-квадрат = 0,007). Рисунок 4 Представитель TFF1 результаты иммуногистохимического окрашивания (А) аденокарциномы желудка демонстрирует потерю экспрессии TFF1, и (В) нормальной слизистой оболочке желудка у здорового добровольца, выражающей TFF1 в эпителиальных клеток желудка. (Увеличение = 200x)
Эти результаты показывают, что экспрессия гена macrodissection на основе анализа обогнали экспрессии генов анализа из образцов LCM для идентификации генов суперэкспрессированный при раке желудка.

• BariSurg испытание: Рукав гастрэктомии по сравнению с Ру-ан-Y желудочного шунтирования у пациентов с ожирением с И…
• Профиль экспрессии муцинов (MUC2, MUC5AC и MUC6) в инфицированных Helicobacter Pylori пренеопластическим и опухолевое человеч…