Udmærkelser i gastrisk cancer genekspression signaturer afledt af laser capture microdissection versushistologic macrodissection

Udmærkelser i gastrisk cancer genekspression signaturer afledt af laser capture mikrodissektion versus
histologiske macrodissection
Abstrakt
Baggrund
mavekræft prøver opnået ved histologisk macrodissection indeholder et relativt højt stromale indhold, der i væsentlig grad kan påvirke genekspression profiler. Forskelle mellem genekspression signatur stammer fra macrodissected mavekræft prøver og underskrift opnået fra isolerede mavekræft epitelceller fra samme biopsier bruger laser-capture mikrodissektion (LCM) blev evalueret for deres potentielle eksperimentelle fordomme.
Metoder
RNA blev isoleret fra frosne vævsprøver af mavekræft biopsier fra 20 patienter, der anvender både histologiske macrodissection og LCM teknikker. RNA fra LCM var genstand for en yderligere runde af T7 RNA forstærkning. Ekspressionsprofil blev udført under anvendelse Affymetrix HG-U133A arrays. Generne identificeret i udtrykket signaturer fra hvert væv forarbejdningsmetode blev sammenlignet med det sæt af gener indeholdt i kromosomale regioner fundet til harbour kopital aberrationer i tumoren prøver ved opstilling CGH og til proteiner tidligere identificeres som overudtrykkes i gastrisk cancer.
Resultater
Gener vist sig at have øget kopi nummer i mavekræft viste sig også at være overudtrykt i prøver opnået ved macrodissection (LS P
værdi < 10 -5), men ikke i array-data genereret ved hjælp mikrodissektion . Et sæt af 58 tidligere identificerede gener overudtrykt i mavekræft blev også beriget i genet signatur identificeret ved macrodissection (LS P
< 10 -5), men ikke i signaturen identificeret ved mikrodissektion (LS P
= 0,013). I modsætning hertil 66 gener som tidligere rapporteret at være underexpressed i gastrisk cancer blev beriget i genet signatur identificeret ved mikrodissektion (LS P
< 10 -5), men ikke i signaturen identificeret ved macrodissection (LS P
= 0,89).
konklusioner
tumor sampling teknik forspænder microarray resultater. LCM kan være en mere følsom indsamling og behandling metode til identifikation af potentielle tumorsuppressorgen kandidater i mavekræft bruger udtryk profilering.
Baggrund
En af hovedmålene for microarray analyse er identifikationen af ​​differentielt udtrykte gener i delmængder af klinisk prøver at matche specifikke terapier til tumor undertyper. Imidlertid kvantitativt udtryk array analyse af kliniske prøver cancerpatienter med højt stromal indhold er udfordrende, da forholdet mellem epiteliale tumorceller til stromaceller kan variere meget. Forurenende stroma kan forvirre microarray-baserede udtryk og eksemplarnummer analyser. Laser capture microdissection (LCM) er en værdifuld teknik, der gør det muligt at isolere epithelceller fra stromaceller, således berigende for epitelial indhold. Mængden af ​​prøve og RNA opnået ved LCM er ofte ret begrænset, dog, og kræver en forstærkning skridt til at generere tilstrækkeligt materiale til microarray-analyser. Denne amplifikation proces kan prioritere resultaterne og føre til en skæv sæt af differentielt udtrykte gener [1]. Histologisk macrodissection (prøver indsamlet fra vævssnit styret ved mikroskopisk analyse af en farvet seriel afsnit) giver en større prøvemængde end LCM, som kan fjerne behovet for en yderligere runde af RNA-amplifikation. Men macrodissected prøver indeholder betydeligt mere stromacelle- indhold end prøver fremstillet ved mikrodissektion.
Tidligere undersøgelser har sammenlignet disse to væv forarbejdningsmetoder til kliniske prøver kræft. Baseret på data fra 14 rektal adenocarcinom prøver, Bruin et al
. begunstiget macrodissection løbet mikrodissektion grund af den relativt lave bidrag stromale komponenter i macrodissected prøver fra denne tumortype og tendentiøse genekspression resultater fra Mikrodissekterede prøver på grund af amplifikation af RNA'et nødvendig for disse [2] prøver. På den anden side, Klee et al
. foreslog, at mikrodissektion profilering entydigt at identificere et stort antal differentielt udtrykte gener ellers ikke findes ved hjælp af bulk-væv prøveudtagning, baseret på data fra 10 lunge adenokarcinomer og 6 tilstødende normale prøver [3]. Disse undersøgelser blev begrænset af små stikprøvestørrelser, og derfor kræver yderligere validering. Det er også uklart, om generne identificeres entydigt ved hjælp Mikrodissekterede prøver repræsenterer nyttige biomarkører. Bias som følge af RNA forstærkning skal afvejes mod fordelen ved at berige prøver til epitelial indhold i vurderingen af, om mikrodissektion er fordelagtig for ekspression profilering af tumorer med høj stromale indhold, såsom mave- eller pancreas adenokarcinomer.
Mikrodissektion er især nyttig til berigelse gastrisk cancer tumorceller opnået fra endoskopiske biopsiprøver, især fra diffuse type gastrisk cancer, som er sammensat af spredte tumorceller blandet med inflammatoriske celler og fibrose. Faldet i den samlede forekomst af gastrisk karcinom i USA i løbet af dette århundrede synes at være stort set tilskrives et fald i tarmens typen læsioner, mens forekomsten af ​​diffuse form menes at have været den samme [4]. Brug prøver opnået ved LCM, Wu et al
. rapporterede, at maligne versus godartede gastriske epitelceller kunne skelnes med en nøjagtighed på 99% baseret på en 504-gen prædiktor [5]. Denne prædiktor inkluderet velkendte gener udtrykt i det gastriske epitel herunder Trefoil faktorer 1, 2, og 3 [5]. Ved hjælp af LCM, Jinawath et al
. identificeret 46 gener, som kan repræsentere distinkte molekylære signaturer for de to histologiske typer af mavekræft - diffus-type og tarm-gastriske cancere [6]. Imidlertid har ingen undersøgelser udført til dato direkte at sammenligne macrodissection vs
. LCM metoder under anvendelse af det samme sæt af mavekræft prøver.
I denne undersøgelse har vi forsøgt at evaluere forskellene mellem udtryk profiler afledt af de samme tumorer, der blev behandlet af både macrodissection og LCM for microarray analyser. I betragtning af vanskelighederne med at validere alle de differentielt udtrykte gener identificeret ved hjælp af hver enkelt type prøvetagning, vi sammenlignet generne identificeret gennem vores microarray analyser med proteiner vides at være overudtrykt i mavekræft. Desuden har vi fastslået, om ekspression af generne identificeret i hver signatur korreleret med ændringer i genkopitallet der blev identificeret ved opstilling komparativ genomisk hybridisering (CGH) fra de samme tumorer. Tidligere undersøgelser af mavekræft har vist en høj korrelation mellem vifte CGH og udtryk array-data [7]. Kopital ændringer blev vurderet ved anvendelse macrodissected tumor-DNA for at undgå bias fra hele genomet amplifikation. Vi yderligere besluttet, om de gen underskrifter vi opnået fra hver indsamling og behandling prøve metode blev beriget for proteiner, der tidligere er rapporteret til at blive dysreguleret gener i mavekræft. Vores resultater viser, at LCM metode er mere følsom for identifikation gener, der er underexpressed i canceren sammenlignet med normalt væv (potentielle tumorsuppressorer), hvorimod macrodissection identificerer flere gener, der er overudtrykt i cancer. Derfor macrodissection og LCM mikrodissektion være nyttigt for at studere forskellige aspekter af kræft biologi.
Metoder
Patienter
Tyve patienter, der blev analyseret i denne undersøgelse er en del af 96 patienter, der deltog i et prospektivt studie, og hvis prøver blev anvendt som udtryk træningssæt til at udvikle en kemo-respons prædiktor [8]. En del af udtryk og CGH array-data fra deres macrodissected prøver blev tidligere rapporteret [8, 9]. Sample indsamling, behandling og opfølgning blev udført i overensstemmelse en protokol godkendt af Institutional Review Board (IRB) af National Cancer Center Hospital i Goyang, Sydkorea (NCCNHS01-003). Alle patienter underskrevet en IRB-godkendt informeret samtykke formular. Berettigelse til optagelse i studiet omfattede følgende parametre: 1) alder ≥ 18 år; 2) histologisk bekræftet gastrisk adenocarcinom; 3) klinisk dokumenteret fjernmetastaser; 4) ingen andre end den mavekræft tidligere eller samtidige maligniteter; 5) ingen forudgående historie med kemoterapi, enten adjuvans eller palliativ; og 6) passende funktion af alle større organer. Patienterne fik cisplatin 60 mg /m 2 IV på dag 1 og fluorouracil 1000 mg /m 2 IV på dag 1-5 i en 3-ugers tidsplan.
Tissue behandling
Før macrodissection, tumor prøver havde median tumor kerner på 50% (interkvartile interval, 30-60%). Macrodissection blev udført som tidligere beskrevet [10]. Macrodissection føre til gennemsnitligt 60% af tumor kerner på toppen slide (interkvartile område, 60-72,5%). For mikrodissektion, tumor og normale vævsprøve kryosnit blev skåret ved 10 um, og opbevaret frosset ved -80 ° C. Slides blev dehydreret ved anvendelse af nuclease-frit HistoGene (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) reagenser ifølge producentens anbefalinger. Mikrodissektion blev udført ved hjælp PixCell II (Arcturus Bioscience, Mountain View, CA). Dehydrering og LCM var begrænset til 15 min eller mindre for hver prøve indsamlet. I alt 10.000 laser shots (spot størrelse på 15 um i diameter) blev indsamlet ved hjælp CapSure Macro LCM Caps for hver prøve. RNA blev isoleret under anvendelse PicoPure RNA Isolation Kit (Molecular Devices). Kort beskrevet blev epitelceller inkuberet med 50 pi ekstraktionsbuffer i et 0,5 ml mikrocentrifugerør ved 42 ° C i 30 minutter. DNase (QIAGEN, Valencia, CA) behandling blev udført direkte i oprensningen kolonnen, og RNA blev isoleret under anvendelse af elueringsvolumen på 8 pi (Molecular Devices). Fem pi af RNA fra Mikrodissekterede cellepopulationer blev omdannet til biotinyleret, antisense cRNA target, ved hjælp af Affymetrix to-cycle mærkning metode (Santa Clara, CA). Alle biotinylerede mål var fragmenterede og 15μ
g hver blev hybridiseret til HG-U133A GeneChip mikroarrays efter fabrikantens protokol. Scannede array-billeder blev revideret og konverteret til signalere data ved hjælp af Affymetrix MAS 5.0 algoritmen.
Array CGH
Genomisk DNA blev ekstraheret fra prøver under anvendelse TRI-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol, og derudover oprenset ved anvendelse af QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN). For array-CGH eksperimenter blev Agilent 4x44k HD-CGH Microarrays indeholdende 44.000 funktioner (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) anvendes. 0,5-1 ug af tumor genomisk DNA-prøver og den samme mængde humant genomisk DNA fra flere anonyme kvindelige donorer (Promega, Madison, WI) blev fordøjet med Alu I (50 enheder) og Rsal (50 enheder) i 2 timer ved 37 ° C . 5 pi Random Primer blev blandet med det fordøjede DNA-template. Henvisningen og prøve DNA blev mærket ved hjælp Agilents Mærkning Kit PLUS, som omfatter 5x buffer, 10x dNTP, Cy-3/5 dUTP (1,0 mM), og Exo-Klenow Fragment. Sonden blanding af Cy3 mærkede prøve-DNA, Cy5 mærket reference-dna (39 pi), 5 pi human Cot-1-DNA (Invitrogen), 11 pi Agilent 10 × blokerende middel og 50 pi Agilent 2 × hybridiseringspuffer blev denatureret ved 95 ° C i 3 minutter og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Proben blev påført på array ved hjælp af en Agilent microarray hybridisering kammer og hybridiseret i 21 timer ved 65 ° C i en roterende ovn ved 20 omdrejninger i minuttet. Arrays blev vasket i henhold til producentens anbefalinger, dyppet i Agilents stabiliserende og tørring løsning, og scannes ved hjælp af en Agilent 2565AA mikromatrice scanner. Agilent Scan Program Kontrol Program 7.0 og Agilents Feature Extraction Softwaren 9.5.1 blev anvendt til databehandling. Array CGH blev analyseret ved hjælp af Agilents CGH Analytics-software (version 3.5.14). ADM-2 algoritme med tærskelværdien 6, med fuzzy nul og centralisering på, blev anvendt til at identificere aberration. Kriterier for aberration filtrering var minimale sonder af 5, minimum gennemsnitlig absolut log 2-forhold på 0,5, og maksimale afvigelser for millioner. Afvigelser identificeret for hver prøve blev opført og grafisk.
Mavekræft gener i litteraturen
For at generere en brugerdefineret gen sæt til vores gen sammenligning analyser, vi søgte PubMed database for gener med mavekræft celle-specifikt protein udtryk, ved hjælp af søgeord i "mavekræft", "immunhistokemi" og "overudtrykt" eller "tab af udtryk". Til vores gen sæt sammenligning analyser, blev gen-symboler på gastrisk kræft specifikke gener kortlagt til probe sæt id'er på HG-U133A array (http:.. //Www NetAffx com). Der var 178 ( "overudtrykte") og 327 ( "tab af udtrykket") artikler i Pubmed på i skrivende stund.
Statistisk analyse på udtryk array-data
Affymetrix HG-U133A genekspression microarray data blev analyseret med gen sæt sammenligning analyse algoritmer af BRB ArrayTools (version 3.8, National Cancer Institute, http:.... //Linus NCI NIH gov /BRB-ArrayTools html) [11]. Genet sæt sammenligning værktøj analyserer brugerdefinerede gen sæt til differential udtryk blandt foruddefinerede klasser (dvs.
., Kræft vs
. Normal) af en kilde datasæt. Brugerdefinerede gen-apparater, der anvendes i denne undersøgelse omfatter U133A probe sæt svarende til gener med kopi nummer forandring og som svarer til mavekræft gener i litteraturen. Gener, hvis tumor /normal log 2-forholdet er større end 0,5 i mindst én af 20 patientprøver blev inkluderet i listen over gener med kopital gevinst. Tilsvarende gener med kopi nummer tab (log 2 forholdet < -0,5) blev noteret. Disse brugerdefinerede gen sæt blev analyseret for differentiel ekspression mellem 20 kræft prøver og 6 normale prøver (dvs.
., 3 macrodissected og 3 Mikrodissekterede prøver).
For hver kilde datasæt, en P
-værdi er beregnet for hvert gen til at korrelere ekspressionsniveauet for den differentielle ekspression mellem foruddefinerede klasser, generere en rangeret gen liste over en given BRB-ArrayTools projekt. For et sæt af N
gener, er de mindste kvadraters (LS) statistik defineret som den gennemsnitlige negative naturlige logaritme af P
-værdier af de relevante enkelt gen univariate test [12]. En sammenfatning statistik beregnes der opsummerer disse P
værdier over brugerdefinerede gen sæt; resuméet statistik er gennemsnitlig log (P
) til LS resumé af, hvordan P
værdier adskiller sig fra en ensartet fordeling for LS [12]. Resuméet statistik er relateret til fordelingen af ​​de sammenfattende statistik for tilfældige prøver af N
gener, stikprøven fra dem repræsenteret i array. Her N
er antallet af gener i den brugerdefinerede gensæt. 100.000 tilfældige gen sæt blev udtaget til at beregne denne fordeling. LS P
værdi andelen af ​​tilfældige sæt af N
gener med mindre gennemsnitlig oversigtsstatistikker end LS resuméer beregnet for de reelle data.
BRB-ArrayTools estimerede LS P
værdier for berigelse af de 4 gen sætter ind vores mavekræft transkriptom signatur identificeret ved hvert væv forarbejdningsmetode som følger. Dels med det formål at sammenligne de 2.324 gener associeret med kopiantal gevinst med vores gastrisk cancer transkriptom signatur identificeret af mikrodissektion blev LS statistik af 2.324 opformerede gener anslås ved at beregne en gennemsnitlig negativ naturlige logaritme af P Salg værdier enkelt gen univariate test for differentiel ekspression af hvert af 2.324 gener mellem 20 Mikrodissekterede mavekræft prøver og 6 normale prøver. Så BRB-ArrayTools beregnet andelen af ​​tilfældige sæt af 2.324 gener med mindre gennemsnitlig oversigtsstatistikker end LS resuméer beregnet for de reelle data (LS P
værdi). Den mavekræft transkriptom signatur identificeret af mikrodissektion blev også sammenlignet med 677 gener, der er forbundet med kopien nummer tab, 58 proteiner indberettet som overudtrykt i mavekræft, og 66 proteiner indberettet som underexpressed i mavekræft, med respektive LS P
værdier. LS P Drømmeholdet værdi mindre end 0,01 blev betragtet som signifikant. De samme analyser blev gentaget for mavekræft transkriptom signatur identificeret ved macrodissection metoden.
Immunhistokemi
TFF1 immunohistokemi blev udført ved hjælp af kirurgiske eller endoskopiske biopsi vævsprøver fra 16 patienter mavekræft (16 kræft og 2 tilstødende normale vævsprøver), og 4 raske frivillige, som ikke indgik i denne mikromatrice undersøgelse. Groft-normale ventrikelslimhinder vævsprøver blev indsamlet fra gastriske antrum af raske frivillige ved anvendelse af en blind biopsi teknik, med informeret samtykke [9]. Paraffinindlejrede formalin-fikserede væv slides (4 um tyk) blev farvet med 13.734-1-AP (Proteintech Gruppen, Chicago, IL) ved 1:50 i 60 minutter ved stuetemperatur og Envision anti-kanin peberrodsperoxidase (K4003, DAKO , Carpinteria, CA) i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktionen blev visualiseret ved anvendelse af diaminobenzidin (K3468, DAKO) og modfarvet med hematoxylin. TFF1 ekspression blev vurderet semikvantitativt ved 200x
forstørrelse, baseret på procentdelen af ​​positivt farvede celler ( "-" = immunofarvning i ≤ 10% af cellerne; "+" = 11-50%; "++" = 51- 75%; "+++" = 76-100%) [13, 14]. Immunfarvning uden primært antistof og normal gastrisk epitel af en kontrol væv microarray tjente som negative og positive kontroller, henholdsvis [15]. Cytoplasmatisk bejdse som var utvetydigt dybere end baggrund blev regnet som positive.
Resultater
Bestemmelse af globale genekspression signaturer fra macrodissected og LCM prøver
Tabel 1 skildrer de klinisk-patologiske karakteristika for de patienter og frivillige i denne microarray undersøgelse. Microarray data blev opnået for både LCM og macrodissected prøver fra samme 20 biopsier (figur 1A). Selv af acceptabel kvalitet, microarray data fra LCM prøver havde generelt lavere "nuværende call" end macrodissected prøver (data ikke vist
). Principal komponent analyse af de globale genekspression mønstre afledt af mikro- og makro-dissekeret gastrisk kræft, og de normale prøver viste en klar adskillelse af hver prøve gruppe (figur 1B). Medianen Pearson korrelation mellem de to forarbejdningsmetoder var 0,75 (interkvartile interval, 0,71-0,81) .table 1 klinisk-patologiske karakteristika patienter og frivillige indgår i microarray analyse

Patienter (n = 20)
Volunteers (n = 6)
Baseline klinisk-patologiske karakteristika
Age-års
Median
59
52
Interquartile sortiment
54-69
43-61
Sex - nej. (%)
Male
16 (80%)
3 (50%)
Female
4 (20%)
3 (50%)
performance status (PS ) - nej. (%)
ECOG1 PS 0 eller 1
20 (100%)
Histologisk typen - nej. (%)
Laurens tarm
6 (30%)
Laurens diffuse
14 (70%)
Placering af primær læsion - nej. (%)
Øvre 1/3
4 (20%)
Mellemøsten 1/3
6 (30%)
Lavere 1/3
10 (50%)
Distant metastase - nej. (%)
20 (100%)
Behandling og resultatet
kemoterapi regime - nej. (%)
Cisplatin /fluoruracil
20 (100%)
Samlet overlevelse -. Måned
Median
8,0
Interquartile sortiment
5,6-14,7
Tid til progression -. måned
Median
3,5
Interquartile sortiment
2,3-6,2
1Eastern Cooperative Oncology Group
figur 1 (A) Undersøgelse arrangement med prøvetagning og microarray behandling (B) Principal komponent analyse af genekspression profiler af mikro- og makro-dissekeres tumor prøver fra 20 patienter mavekræft og 6 normale prøver fra raske frivillige.
tabel 2 og 3 viser gener overudtrykt i mikro- og makro-dissekeret mavekræft prøver på funktionen udvælgelse P
< 10 -6. Cellemorfologi
(AIF1, E2F1, E2F3, KIR2DL1, KIRREL, Npr1, RUNX2, TRIO
) var den mest beriget funktionelle kategori af de 42 gener overudtrykt i de Mikrodissekterede prøver sammenlignet med de normale prøver (feature valg P
< 10 -6) som identificeret ved Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (tabel 2). Tumor morfologi
(ApoE, BIRC5, CD14, COL1A1, COL1A2, Cyr61, FKBP1A, IL8, MCAM, MIF, RHOB
) var den mest berigede funktionelle kategori blandt de 73 gener overudtrykt i de macrodissected prøver (feature valg P
< 10 -6) af IPA (tabel 3). Ekstracellulære matrix gener, såsom COL6A2, COL1A1, COL1A2
, og COL5A2
, var fremtrædende i de macrodissected prøver og formentlig bidraget med de stromale celler. Tabel 4 viser gener underexpressed i mikro- og makro-dissekerede prøver gastrisk kræft ved funktionen P Valg
< 10 -6.Table 2 Gener overudtrykt i mikrodissekeret mavekræft ved funktionen P Valg
< 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

BMP3
38.52
HIST1H4C
6.3
BGN
30.3
LEPRE1
5.9
TRIO
18.5
ETNK2
5.6
GADD45GIP1
17.2
TRIP6
5.3
MIER2
16.7
FAM125B
5.3
KIFC3
16.4
NPR1
5.3
217318_x_at
13.7
DSCC1
5.3
217219_at
13.2
CLUL1
5.0
RUNX2
12.5
HMGB3
4.5
SMARCD1
12.0
E2F3
4.3
KIRREL
12.0
AIMP2
4.2
215621_s_at
12.0
ATAD5
4.0
GRM2
10.0
E2F1
3.8
FJX1
10.0
FKSG49
3.7
AIF1
10.0
DVL2
3.7
THY1
9.1
TIPRL
2.9
CARD10
9.1
EIF2C3
2.9
SIM2
9.1
NAT10
2.8
AIF1
9.1
MED27
2.7
APOBEC3G
8.3
PIN4
2.7
RHAG
8.3
CTPS
2.6
1fold forandring, defineret ved udtrykket forholdet mellem kræft til normal (= cancer /normal)
2AII disse gener havde falsk opdagelse sats < 0,001
Tabel 3 Gener overudtrykt i macrodissected mavekræft ved funktionen P Valg
. < 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

LY6E
24.42
SRM
6.7
IL8
22.7
NGLY1
6.7
CA12
20.0
RHOB
6.3
SBNO2
19.2
ACTN1
5.9
UBE2S
17.2
LOXL2
5.9
CYR61
17.2
COL5A2
5.9
ANGPT2
15.9
TRIM28
5.6
COL6A2
14.3
218982_s_at
5.6
BOP1
13.2
C7orf44
5.3
COL1A1
13.2
UBE2C
5.3
LPL
13.0
CEP76
5.3
MFGE8
12.8
BIRC5
5.3
APOE
12.2
PNO1
5.0
G6PC3
10.9
FSTL1
5.0
215900_at
10.3
GRINA
4.8
NUP62
10.0
MRTO4
4.8
MRPL4
10.0
STC1
4.8
GNL3L
10.0
MRPL12
4.5
MCAM
9.1
FKBP1A
4.5
PDLIM7
9.1
IFI30
4.5
216472_at
9.1
KPNA6
4.3
ACTN1
9.1
216532_x_at
4.3
BYSL
9.1
CENPI
4.2
GNAI2
8.3
PPM1G
4.2
NCAPH2
8.3
ICT1
3.7
CD14
8.3
SFRS14
3.6
EXOSC4
8.3
CTPS
3.6
OBFC2B
8.3
IMP4
3.3
PPP1R15A
7.7
UBE2G2
3.2
COL1A2
7.7
ISG20L2
3.2
GPX1
7.7
EIF4A1
3.1
MIF
7.7
HDGF
2.6
NME1
7.1
PSMD14 2.6
PPIL2
7.1
220856_x_at
2.4
CCDC85B
7.1
CNOT3
2.4
SPARC
6.7
GLT25D1
2.0
C8orf55
6.7
1fold forandring, defineret ved udtrykket forholdet mellem kræft til normal (= cancer /normal)
2AII disse gener havde falsk opdagelse sats. ≪ 0,001
Tabel 4 Gener underexpressed i mikro- og makro-dissekeret mavekræft ved funktionen P valg
< 10-6
mikrodissekeres

Macrodissected

Gene

FC1

Gene

FC

HPGD
-25.02
208498_s_at
-11.1
HRASLS2
-20.0
SIDT2
-7.7
ABCC3
-20.0
MUC5AC
-5.9
SLC25A37
-16.7
CTAGE5
-5.0
ABHD2
-14.3
GNA11
-3.8
VIPR1
-10.0
ARFIP1
-3.4
CYTIP
-9.1
214316_x_at
-3.3
GALNT6
-9.1
222149_x_at
-3.3
SULT1A2
-9.1
OAS1
-8,3
PDCD4
-7,1
NR3C2
-7,1
DOCK6
-6,3
SULT1A1
-5,9
ZFYVE26
- 5.9
213212_x_at
-5,6
DSCR3
-5,3
TMEM131
-5,3
ECHDC2
-5,0
DENND1B
-5,0
KIAA0141
-4,8
RNF103
-4,8
PDCD4
-4,5
CABIN1
-4,5
222371_at
-4,3
RRBP1
-4,0
CC2D1A
-3,8
216438_s_at
-3,8
SGSM3
-3,8
ARPC2
-3,7
TRAK1
-3,6
GNA11
-3,6
PAFAH1B1
-3,4
CNDP2
-3,2
SPOP
-3,1
PARP4
-3,1
ERLIN1
-2,9
1fold ændre, defineret af den negative af udtrykket forholdet mellem normal til kræft (= - (normal /kræft))
2AII disse gener havde falsk opdagelse sats < 0,001
Sammenligning mellem udtryk og array CGH data.
Array CGH-analyse blev udført under anvendelse af genomisk DNA ekstraheret fra macrodissected prøver indeholdende > 50% tumorceller (kriterier, der anvendes af tidligere undersøgelser [16, 17]), da tilstrækkelig DNA kunne opnås uden behov for hele genomamplifikation som krævet for Mikrodissekterede prøver. Hele genomet DNA-amplifikation kan potentielt indføre kunstig skævhed i Array CGH resultater [18]. Afbildet i figur 2 er frekvensen af ​​DNA kopital aberrationer blandt alle de 20 prøver. Vores eksemplar nummer aberration data var generelt i overensstemmelse med tidligere rapporterede data [7, 16, 17, 19-23]. Fire ud af 20 patienter havde amplifikation af CHR8 q24.13-q24.21 (126.357.475-128.822.596), som indeholder MYC
oncogen. Den næsthyppigste forstærkning locus var CHR17 q21.2 (36.109.939-36.230.163), som blev forstærket i 3 patienter. Syv patienter havde ingen påviselige kromosomafvigelser. Disse 7 prøver indeholdt en median på 70% tumorceller, mens de øvrige 13 patienter havde en median 60% tumorceller (P Drømmeholdet værdi = 0,1). Derfor manglen på detekterbare kromosomafvigelser i de 7 prøver var ikke på grund af en lavere procentdel af tumorceller i disse prøver. Figur 2 grafisk billede, der illustrerer den procentvise hyppighed af prober detekteret (aberrationer) blandt alle 20 prøver.
Der var 2.324 unikke gener, der var forbundet med kopital gevinst i mindst én af de 20 patienter, og 677 gener associeret med kopital tab. Brug gen sæt sammenligning analyser, vi sammenlignet disse gen-sæt med vores transkriptom underskrifter identificeret ved de forskellige prøve isolation metoder. Vi antager, at dysregulerede gener forbundet med kopi nummer afvigelser er mere tilbøjelige til at blive involveret som bidragydere til onkogenese snarere end blot som "tilskuere." Derfor blev de 2.324 gener indeholdt i regioner af kopital gevinster analyseret med hensyn til deres udtryk fra array-data opnået ved hjælp af den macrodissection metode (funktion P Valg
< 0,05). Overlappet mellem listen over gener i områder af forstærkning og berigelse for deres udtryk i prøver, der blev macrodissected var statistisk signifikant (LS P Drømmeholdet værdi = 10 -5, se Metoder til statistisk beskrivelse). Men denne forening ikke observeret, når udtryk data blev analyseret fra Mikrodissekterede prøver (funktionen P Valg
< 0,05; LS P Drømmeholdet værdi = 0,41) (figur 3A). Der var således stærkere sammenhæng mellem mønstret af kopital forstærkning og genekspression kun i prøver, som blev macrodissected. For eksempel MYC
, den hyppigst amplificeret gen i vores patientprøver, blev bestemt til at være signifikant overudtrykt i macrodissected prøver, men ikke i dem, der blev mikrodissekeres, selv om dette resultat kan skyldes relativt lille prøvestørrelse eller heterogenitet inden tumoren. Figur 3 Antal gener overlappende mellem LCM og macrodissected ekspressionsarray datasæt og matrix CGH data fra det samme sæt af 20 patienter.
En liste over 677 gener blev identificeret i regioner, hvor DNA-kopital tab blev fundet i mindst én af de 20 studie patienter. Udtrykket af disse gener blev analyseret i de makro- og mikro-dissekeret array-datasæt. En signifikant sammenhæng blev fundet mellem de gener med tab af antal kopier og deres udtryk i både makro- og mikro-dissekeret prøver. (LS P
værdier, 0,009 og 0,006 for LCM og macrodissected prøver henholdsvis) (figur 3B).
Concordance af gen signaturer med gener tidligere er rapporteret at være forbundet med mavekræft
En PubMed litteratursøgning blev udført at identificere tidligere rapporteret over- og under-udtrykt gener og proteiner til gastrisk cancer (nøgleord: immunhistokemi, gastrisk cancer og overudtrykt og eller tab af ekspression). 58 proteiner overudtrykt i mavekræft blev identificeret på denne måde. blev fundet genekspression for disse 58 proteiner, som skal beriges i udtryk data fra prøver indsamlet af macrodissection (LS P
< 10 -5), men ingen berigelse i ekspression af de 58 gener blev fundet for prøver indsamlet af mikrodissektion (LS P
= 0,013). I modsætning hertil blev der 66 proteiner indberettet som underexpressed gastrisk kræft beriget med udtryk array-data fra prøver indsamlet af mikrodissektion (LS P
< 10 -5), men ikke fra prøver indsamlet af macrodissection (LS P
= 0,89) (tabel 5) .table 5 mavekræft gener i litteraturen, der var differentielt udtrykte mellem 20 kræft og 6 normale prøver på funktionen P valg
< 0.05 ifølge microarray data genereret ved hjælp af hvert væv forarbejdningsmetode
overudtrykt gener i cancer
Underexpressed gener i cancer

LCM&Macro1

LCM

Macro

LCM&Macro

LCM2

Macro

APOE
EGFR
AKT1
ANXA10
ANXA7
CDKN2B
AURKA
HGF
ANXA2
CASP6
BAD
FHIT
CCNE1
MET
CALR
CASP7
HLA-B
CDC20
RhoA
CCNB1
CDH1
HLA-E
Cdc25B
TNS4
EEF2
CTNNA1
HLA-G
CXCR4
ESM1
GSN
PRSS8
E2F1
HIF1A
HLA-F
PTEN
EGR1
MINA
IQGAP2
SDHB
Grb2
PHB
KCNE2
SH3GLB1
HK2
KLF4
TFF1
ICAM1
MUC6
INHBA
RaRb
LOXL2
Smad4
MCM3
PTMA
SPARC
1Previously rapporterede overudtrykte proteiner til mavekræft, som også blev overudtrykt i vores mikrodissekeret (LCM) og macrodissected kræft prøver i forhold til normale prøver
2Previoulsy rapporterede underexpressed proteiner til mavekræft, som også blev underexpressed i vores Mikrodissekterede (LCM) kræft prøver, men ikke i macrodissected prøver kræft
Validering af microarray data
for at validere vores microarray data, vi udførte immunhistokemiske analyser på et gen identificeret som underexpressed i Mikrodissekterede kræft prøver fra 16 patienter og 4 frivillige, der ikke indgik i mikromatrice undersøgelse. TFF1
blevet udvalgt til denne immunhistokemi valideringsundersøgelse fordi det er betydeligt underexpressed i LCM prøver (P
= 0,0036), men ikke i macrodissected prøver (P Salg = 0,09) sammenlignet med normal gastrisk mucosa. TFF1 immunoreaktivitet i kræft blev evalueret som -, +, ++, og +++ i 7 (43,8%), 3 (18,7%), 4 (25,0%) og 2 (12,5%), henholdsvis. I modsætning hertil alle de 6 normale maveslimhinden prøver (4 raske frivillige og 2 normale tilstødende vævsprøver) konserverede TFF1 immunoreaktivitet (+++) (figur 4). Således mavekræft prøver havde signifikant lavere TFF1 immunoreaktivitet end normalt maveslimhinden, i overensstemmelse med tidligere rapporter [13, 14] (P
for chi-kvadrat = 0,007). Figur 4 repræsentant TFF1 immunhistokemisk farvning resultater for (A) en gastrisk adenocarcinom demonstrerer tabet af TFF1 ekspression, og (B) normal maveslimhinden fra en rask frivillig udtrykker TFF1 i gastriske epitelceller. (Forstørrelse = 200x)
Disse resultater viser, at macrodissection-baserede genekspression analyser Bedre end genekspression analyser fra LCM prøver til at identificere gener overudtrykt i mavekræft.

• BariSurg retssagen: Sleeve gastrektomi versus Roux-en-Y gastrisk bypass hos overvægtige patienter med BMI 35-60 kg /m2 - et multicenter randomiseret patient og observatør blinde noninferioritet tria…
• Ekspressionsprofil af muciner (MUC2, MUC5AC og MUC6) i Helicobacter pylori inficerede præneoplastiske og neoplastiske humane gastrisk epithelium