Razlike u želučanom gena raka ekspresije potpisa koji su izvedeni iz laserskog snimanja Mikrodisek versushistologic macrodissection

Razlike u želučanom gena raka ekspresije potpisa koji su izvedeni iz laserski snimci Mikrodisek Versus pregled histološki macrodissection pregled apstraktne pregled pozadine
želučane uzoraka raka dobivenih histološku macrodissection sadrže relativno visok strome sadržaj koji može značajno utjecati profila genske ekspresije. Razlike između ekspresije gena potpisom dobivenim iz macrodissected uzoraka raka želuca i potpisom dobivenim iz izoliranih epitelnih stanica karcinoma želuca od istih biopsija pomoću laserskog hvatanje mikrodisekcijom (LCM) su ispitani u pogledu njihove potencijalne eksperimentalnih pristranosti.
Metode
RNA izoliran je iz uzorka smrznute tkiva želuca biopsija raka od 20 pacijenata koji koriste oba histološki macrodissection i LCM tehnike. RNA iz LCM je predmet dodatnog kruga T7 RNA pojačanje. Izraz profiliranje provedena je pomoću Affymetrix HG-U133A polja. Geni u ovim ekspresije potpisa svaku metodu prerade tkiva uspoređeni su sa skupa gena sadržanih u kromosomskim regijama nađeno sklanjanje broj kopija aberacija u uzorcima tumora poljem CGH i na proteine ​​ranije identificirana kao povećana kod raka želuca. Pregled Rezultati
Geni pokazali da imaju povećan broj kopija u rak želuca, također su pronađeni biti izraženo u uzorcima dobivenim macrodissection (LS P
vrijednost < 10 -5), ali ne u array podataka generira korištenjem Mikrodisek , Skup 58 prethodno identificiranih gena izraženo u rak želuca, također je obogaćen u potpis gena utvrđene macrodissection (LS P izvoznici < 10 -5), ali ne u potpis identificiran mikrodisekcijom (LS P
= 0.013). Nasuprot tome, 66 gena ranije izvijestili da se underexpressed kod raka želuca su obogaćeni u potpis gena identificiran mikrodisekcijom (LS P izvoznici < 10 -5), ali ne u potpis utvrđene macrodissection (LS P
= 0,89). pregled Zaključci
tehnika uzorkovanja tumor opruga potiskuje rezultate microarray. LCM može biti osjetljiviji prikupljanje i obrada metoda za identifikaciju potencijalnih kandidata tumor supresor gena u karcinomu želuca koriste izraz profiliranje. Pregled Pozadina
Glavni cilj analize mikropolja je identifikacija različito izraženi gena u podskupove klinički uzorci da odgovaraju specifičnim terapije za tumor podtipova. Međutim, kvantitativno izražavanje polje analizu kliničkim uzorcima raka s visokim sadržajem strome je zahtjevan jer omjer epitelnih stanica na stromalnim stanicama može vrlo varirati. Kontaminira stroma mogu pomiješati microarray-based izražavanje i kopirati analizira broj. Laser hvatanje Mikrodisek (LCM) vrijedan je tehnika koja omogućuje da izolirati epitelne stanice od stanica strome, čime će se obogatiti za epitela sadržaja. Količina uzorka i RNK dobivene LCM je često vrlo ograničena, međutim, i zahtijeva pojačanje korak generirati dovoljno materijala za analizu mikropostrojima. Ovaj proces pojačanje mogu utjecati na rezultate i dovesti do iskrivljenog skupa različito izraženim genima [1]. Histološka macrodissection (uzorci prikupljeni od tkivnim vođeni mikroskopskom analizom obojenog serijskog dijela) pruža veću količinu materijala uzorka u odnosu na LCM koje mogu otkloniti potrebu za dodatnom krugu RNA pojačanje. Međutim, macrodissected uzorci sadrže znatno više sadržaja strome stanica od uzoraka dobivenih mikrodisekcijom.
Prethodne studije su u usporedbi ove dvije metode obrade tkiva za kliničkim uzorcima karcinoma. Na temelju podataka iz 14 rektalne uzoraka adenokarcinoma, Bruin sur pregled. preferiraju macrodissection preko mikrodisekcijom zbog relativno niske doprinos strome komponenti macrodissected uzoraka iz ovog tipa tumora i zategnutim ekspresije gena rezultata microdissected uzoraka uslijed amplifikacije RNA potrebnog za tim uzorcima [2]. S druge strane, Klee i sur pregled. predložio da Mikrodisek profiliranje jedinstveno identificirati velik broj različito izraženim genima nije drugačije pronađene pomoću uzorkovanje bulk tkiva, na temelju podataka iz 10 plućnih adenokarcinoma i 6 susjednih normalnih uzoraka [3]. Ove studije su ograničene malene uzorke i, prema tome, zahtijevaju dodatnu provjeru. Također je nejasno da li su geni identificirani jedinstveno koristeći microdissected uzorke predstavljaju korisne biomarkera. Bias je rezultat RNA pojačanje mora biti uravnotežena u odnosu na korist obogaćivanja uzorke za epitelne sadržaja u razmatranju je li Mikrodisek je prednost za ekspresiju profiliranje tumora s visokim sadržajem strome, kao što su želučani ili gušterače adenokarcinoma. Pregled Mikrodisek je osobito korisno za obogaćivanje želuca tumorske stanice raka dobivena iz endoskopske uzorku biopsije, naročito od difuznih tipa raka želuca koja se sastoji od raspršene tumorskih stanica pomiješanih s upalnim stanicama i fibroze. Pad u ukupnom učestalosti želučanog karcinoma u SAD-u tijekom ovog stoljeća čini se da je u velikoj mjeri pripisati smanjenje crijevne tipa lezija, dok je pojava difuznog tipa je mislio da su ostali isti. [4] Koristeći uzorke dobivene LCM, Wu i sur
. izvijestio je da zloćudna odnosu benignih epitelnim stanicama želuca može se razlikovati s točnošću od 99% na temelju [5] prediktor na 504 gena. Ovo predviđanje uključuje poznatih gena ekspresiranih u želučanom epitelu uključujući trolista faktora 1, 2 i 3 [5]. Koristeći LCM, Jinawath sur pregled. identificirali 46 gena koji mogu predstavljati različite molekularne potpise za dva histoloških tipova karcinoma želuca - difuzni-tipa i crijevni tipa želučanog raka [6]. Međutim, nijedna studija nije provedena do sada izravno uspoređivanje macrodissection vs Netlogu. Fact metode koje koriste isti skup uzoraka raka želuca.
U ovom istraživanju smo nastojali procijeniti razlike između ekspresije profila dobivenih iz istih tumora koje su obrađene od strane macrodissection i LCM za analizu mikropostrojima. S obzirom na poteškoće u potvrđivanju svih različito izraženim genima identificirane primjenom svaku vrstu uzimanja uzorka, usporedili smo gene identificiranih kroz microarray analiza s proteinima se zna da su povećana kod raka želuca. Osim toga, utvrdili smo da li ekspresija gena identificiranih u svakom potpisu korelaciji s promjenama u broju gena kopija koje su utvrđene niz komparativna genomska hibridizacije (CHG) iz istog tumora. Prethodne studije raka želuca su pokazali visoku korelaciju između polja CGH i izraz array podataka [7]. Broj kopija promjene su procijenjene pomoću macrodissected tumora DNA kako bi se izbjegla pristranost iz cijelog genoma pojačanja. Mi i dalje odlučan u tome da u gen potpisi smo dobili iz svakog prikupljanja i obrade uzorka metodom obogaćeni su za proteine ​​koji su prethodno prijavili za dereguliran gena u raka želuca. Naši rezultati pokazuju da je metoda LCM osjetljivija za identifikaciju gena koji su underexpressed u karcinoma u usporedbi sa normalnim tkivom (potencijalni supresori tumora), a macrodissection identificira više gena koji povećana kod raka. Dakle, macrodissection i LCM Mikrodisek pojavljuju korisni za proučavanje različitih aspekata biologije raka.
Metode pregled pacijenata
Dvadeset pacijenata koji su analizirani u ovom istraživanju je dio 96 pacijenata koji su sudjelovali u prospektivne studije, a čiji uzorci korišteni su kao skup ekspresije trening razviti kemo-odgovor prediktor [8]. Dio izražavanja i CGH array podatke od svojih macrodissected uzoraka ranije bio prijavljen [8, 9]. Uzorak skupljanje, obradu i praćenje su provedeni u skladu s protokolom koji je odobrio Institutional Review Board (IRB) iz National Cancer Center Hospital u Goyang, Koreja (NCCNHS01-003). Svi pacijenti su potpisali IRB-odobreni obrazac informiranog pristanka. Pravo na upis na studije uključene sljedeće parametre: 1) starosnu ≥ 18 godina; 2) histološki potvrđene želučane adenokarcinom; 3) klinički dokumentirano udaljenih metastaza; 4) nema prethodnih ili popratne zloćudne bolesti osim raka želuca; 5) bez prethodnog povijest kemoterapije, bilo pomoćno sredstvo ili palijativna; i 6) odgovarajuća funkcija svih glavnih organa. Pacijenti su primili cisplatin 60 mg /m 2 IV na dan 1 i fluorouracil 1,000 mg /m 2 IV na dane 1-5 rasporeda od 3 tjedna. Pregled tkiva obradu pregled prije macrodissection, tumor uzorci bio je medijan tumora jezgre 50% (raspon 30-60%). Macrodissection se obavlja kao što je ranije opisano [10]. Macrodissection dovesti do prosječne 60% tumorskih jezgara u gornjem slajdu (raspon interquartile, 60-72,5%). Za mikrodisekcijom, i tumorskog tkiva za uzorke kriosekcijama su rezani na 10 um, te uskladišteni zamrznuti na -80 ° C. Stakalca su dehidratirana koristeći nuclease-free HistoGene (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) reagensima u skladu s preporukama proizvođača. Mikrodisek provedena je pomoću PixCell II (Arcturus bioznanosti, Mountain View, CA). Dehidracija i LCM je ograničeno na 15 minuta ili manje za svaki uzorak prikupljeni. Ukupno 10.000 laserskih snimki (točka veličine 15 um u promjeru) prikupljeni su pomoću CapSure Makro LCM Kape za svaki uzorak. RNA je izolirana pomoću izolacijskog kompleta PicoPure RNA (Molecular Devices). Ukratko, epitelne stanice su inkubirane sa 50 ul pufera za ekstrakciju u 0,5 ml epruvetu za mikrocentrifugiranje na 42 ° C tijekom 30 minuta. DNase (QIAGEN, Valencia, CA), obrada je izvedena izravno u kolonu za pročišćavanje i RNA je izolirana pomoću volumena elucije 8 uL (Molecular Devices). Pet uL RNA iz stanične populacije microdissected se prevede biotiniliranog, antisense cRNA cilja pomoću Affymetrix dva ciklusa metode označavanja (Santa Clara, CA). Svi biotinom ciljevi bili fragmentirani i 15μ pregled g svaki je hibridizirana HG-U133A GeneChip microarrays slijedeći protokol proizvođača. Skenirane array slike su pregledani i pretvara u signal podataka putem Affymetrix MAS 5,0 algoritam. Pregled Array CGH pregled Genska DNA je izvađen iz uzoraka pomoću TRI reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA), u skladu s uputama proizvođača, a dodatno pročišćava pomoću QIAamp DNA Micro kita (Qiagen). Za array CGH eksperimenata, korišteni su Agilent 4x44k HD-CGH Microarrays sadrže 44.000 značajke (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). 0.5-1 ug tumorskih genomska DNA uzorcima i istu količinu ljudske genomske DNA iz različitih anonimnim ženskih donatora (Promega, Madison, WI), digerirani su s Alui (50 jedinica), i RsaI (50 jedinica) tijekom 2 sata na 37 ° C , 5 ul Random Primjer se pomiješa s digestiranom DNA kalupa. Referenca i uzorak DNA su označene korištenjem Agilent je Labeling Kit PLUS, koji uključuje 5x pufera, 10x dNTP, Cy-3/5 dUTP (1,0 mM), i egzo-Klenowim fragmentom. Sonda mješavina Cy3 označen uzorak DNK, Cy5 obilježeni referentni DNA (39 ul), 5 ul ljudske Cot-1 DNA (Invitrogen), 11 jal Agilent 10 × agensa koji blokira i 50 ul Agilent 2 × hibridizacije puferu je denaturiranog na 95 ° C 3 min i inkubira na 37 ° C tijekom 30 minuta. Sonda primijenjen je na niz pomoću Agilent mikropločicama hibridizaciju komoru i hibridizirana tijekom 21 sata pri 65 ° C u rotirajućoj peći na 20 okretaja u minuti. Nizovi se ispiru u skladu s preporukama proizvođača, umočen u Agilent-a za stabilizaciju i rješenja za sušenje i skeniraju pomoću Agilent 2565AA DNA microarray skener. U Agilent je skeniranje program Control Program 7.0 i Agilent je značajka ekstrakcija softver program 9.5.1 su se koristili za obradu podataka. Array CGH podaci su analizirani pomoću Agilent je CGH Analytics softvera (verzija 3.5.14). ADM-2 algoritam s praga 6, s fuzzy nula i centralizacije o, je korišten za identifikaciju aberacije. Kriteriji za filtriranje aberacije su minimalni sonde 5, najmanja prosječna apsolutna log 2 Omjer 0,5, a maksimalna odstupanja od 1.000.000. Odstupanja utvrđene za svaki uzorak su navedene i grafički prikazani.
Želučane gene raka u literaturi Netlogu generirati niz gena korisnički definiranih za analizu naše usporedba gena, tražili smo PubMed baze podataka za gena s želučane stanica specifičnih proteina raka izraz, koristeći ključne riječi "rakom želuca", "imunohistokemijski" i "ekstracelularne" ili "gubitak izražavanja". Za naše gene set usporedba analize gena simboli određenih gena raka želuca su mapirani sonda set ID na HG-U133A niz (http:.. //Www NetAffx com). Bilo je 178 ( "hipereksprimirani") i 327 ( "gubitak ekspresije") članaka u PubMed u vrijeme pisanja. Pregled, Statistička analiza ekspresije array podataka
microarray podatke ekspresije Affymetrix HG-U133A gena su analizirani gen set usporedba analiza algoritmi BRB ArrayTools (verzija 3.8, National Cancer Institute. http:... //Linus NCI NIH gov /BRB-ArrayTools html) [11]. Gen postaviti usporedbu alat analizira korisnički definirane skupove gena za diferencijalne ekspresije među unaprijed definiranim klasama (tj pregled., Rak vs Netlogu. Normalno) izvora podataka. Korisnički definirana gena setovi koji se koriste u ovom istraživanju su U133A sonda postavlja odgovara genima s promjenom broja kopija odgovara želučane gena raka u literaturi. Geni čija tumor /normalan log 2 omjer je veći od 0,5 u barem jednom od 20 uzoraka bolesnika bili su uključeni u popis gena s brojem kopija dobitak. Isto tako, geni s gubitkom broj kopija (log 2 omjer < -0.5) su na popisu. Ove korisnički definirane seta gena analizirani su diferencijalne ekspresije između 20 uzoraka raka i 6 normalnih uzoraka (tj pregled., 3 macrodissected i 3 microdissected uzoraka).
Za svaki izvor naziv, P pregled-vrijednost je izračunati za svaki gen povezala razinu ekspresije za diferencijalne ekspresije između predefiniranih klasa, koja proizvodi rangirani popis gena danog BRB-ArrayTools projekta. Za skup od N pregled genima, najmanjih kvadrata (LS) Statistika se definira kao srednji negativan prirodni logaritam P
-values ​​odgovarajućih jednom genu univarijatne testove [12]. Sažetak statistike računa se da sumira ove P
vrijednosti preko korisnik-definiran set gena; statistika sažetak je prosjek log (P pregled) za sažetak LS kako p pregled vrijednosti razlikuju od jednolike raspodjele za LS [12]. Statistika sažetak se odnosi na distribuciju zbirnih statističkih podataka za slučajne uzorke n pregled gena, uzorkovana od onih predstavljeni u nizu. Ovdje N pregled je broj gena u korisnički definiranim skupom gena. 100.000 slučajnih seta gena uzorkovane su izračunati ovu distribuciju. LS P pregled vrijednost je udio slučajnih kompleta n pregled gena s manjim prosječnim skraćenom statistiku od LS sažecima izračunatim za stvarnim podacima.
BRB-ArrayTools procijenjene LS P
vrijednosti za obogaćivanje su 4 gena setovi u našoj želučanog karcinoma transcriptome potpis identificirati svaku metodu prerade tkivo kako slijedi. Prvo, kako bi se usporedili 2,324 gene povezane s brojem kopija dobitak s našim želučanog karcinoma transcriptome potpis prepoznati po mikrodisekcijom, LS statistika 2,324 pojačanih gena procijenjena je izračunavanjem prosječne negativan prirodni logaritam P
vrijednostima jedan gen univarijantna testovi za diferencijalne ekspresije svake od 2,324 gena između 20 microdissected uzoraka želuca raka i 6 normalnih uzoraka. Zatim BRB-ArrayTools izračunava udio slučajnih kompleta 2,324 gena s manjim prosječnim skraćenom statistiku od LS sažecima izračunatim za stvarne podatke (LS P pregled vrijednosti). Želučana raka transcriptome potpis prepoznati po mikrodisekcijom je također u usporedbi s 677 gena povezanih s gubitkom broj kopija, 58 proteini se navodi da su povećana kod raka želuca, a 66 proteini se navodi da su underexpressed kod raka želuca, s odgovarajućim LS P Netlogu vrijednosti. LS P pregled vrijednost manja od 0,01 smatrana značajnom. Iste analize ponavlja za rak želuca transcriptome potpis prepoznati po metodi macrodissection. Pregled Imunohistokem pregled TFF1 imunohistokemijski je izvedena pomoću uzoraka kirurški ili endoskopskih biopsija tkiva iz 16 bolesnika s karcinomom želuca (16 raka i 2 susjedna uzorka normalnog tkiva), i 4 zdravi dobrovoljci, koji nisu bili uključeni u ovaj DNA microarray studije. Glomazno-normalni uzorci želučane sluznice tkiva su prikupljeni iz želučanog antruma zdravih volontera pomoću slijepa tehnike biopsija, uz informirani pristanak [9]. Parafin uklopljenih formalin fiksiranih slajdovi tkiva (4 um debljine) su obojene 13734-1-AP (ProteinTech grupe, Chicago, IL) na 1:50 kroz 60 minuta na sobnoj temperaturi i Predvidjeti peroksidaza protukunićji hrena (K4003, DAKO , Carpinteria, CA) tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je vizualizirana primjenom diaminobenzidinu (K3468, DAKO), uz kontrastnu boju hematoksilin. TFF1 izraz je ocijenjena polu-kvantitativno pri 200x
uvećanja, na temelju postotka pozitivno obojenih stanica ( "-" = imunološkeg u ≤ 10% stanica, "+" = 11-50%; "++" = 51- 75%; "+++" = 76-100%) [13, 14]. Imunološko bez primarnog protutijela i normalne želuca epitela mikročipa za kontrolu tkiva služili kao negativne i pozitivne kontrole, odnosno [15]. Citoplazmatski mrlju koja je nedvosmisleno dublje od pozadina je broje kao pozitivni.

• BariSurg suđenje: Sleeve gastrektomija odnosu Roux-en-Y želudac zaobići u pretilih bolesnika s BMI 35-60 kg /m2 - multi-centar nasumično strpljivi i promatrač slijepi ne-inferiornost trial
• Izražavanje profil mucina (MUC2, MUG5AC i MUC6) u Helicobacter pylori zaražena prije neoplastični i neoplastični ljudskog želuca epithelium