Rozdiely v žalúdočnom génovej expresie rakoviny podpisov získaných z laserového zachytenie mikrodisekcii versushistologic macrodissection

Rozdiely v žalúdočných génovej expresie rakoviny podpisov získaných z laserového zachytenie mikrodisekcii Versus
histologické macrodissection
abstraktné
pozadia
žalúdočné karcinómov získaných histologické macrodissection obsahujú relatívne vysoký obsah stromálne, ktoré môžu významne ovplyvniť profilov génovej expresie. Rozdiely medzi génovej expresie podpisu odvodené od macrodissected vzoriek s karcinómom žalúdka a podpis získané z izolovanej žalúdočné rakovina epitelových buniek z rovnakých biopsiou s použitím laserovej snímania mikrodisekcii (LCM) boli hodnotené z hľadiska ich možných experimentálnych chýb.
Metódy
RNA bol izolovaný zo vzoriek zmrazených tkanivových biopsiou s karcinómom žalúdka z 20 pacientov užívajúcich oba histologické macrodissection a LCM techník. RNA z LCM bol predmetom ďalšieho kola RNA amplifikácie T7. Expresia profilovanie sa vykonáva za použitia Affymetrix U133A HG-matice. Gény identifikované v expresných podpisov z každej z metód spracovania tkaniva boli porovnané so súborom génov obsiahnutých v chromozómových regiónoch bolo zistené, že skrývajú počet kópií aberácií v nádorových vzoriek pomocou array CGH a na proteíny skôr rozpoznateľné, že sú nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka.
sa tiež zistilo Výsledky
Gény, ukázalo sa, že zvýšený počet kópií v karcinómu žalúdka, ktoré majú byť nadmerne exprimovaný vo vzorkách získaných macrodissection (LS P
hodnota < 10 -5), ale nie v dátach pole generované pomocou mikrodisekcii , Sada 58 predtým identifikovaných génov nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka bol tiež obohatený podpisu génu identifikovaného macrodissection (LS P
< 10 -5), ale nie v podpise identifikovaný mikrodisekcii (LS P
= 0,013). Naproti tomu 66 gény skôr popísané, že underexpressed v karcinómu žalúdka boli obohatené v podpise génu identifikovaného mikrodisekcii (LS P
< 10 -5), ale nie v podpise identifikovaný macrodissection (LS P
= 0,89).
Závery
technika odberu vzoriek nádoru predopínať výsledky microarray. LCM môže byť citlivejší zber a spracovanie metódy na identifikáciu potenciálnych kandidátov nádorový supresor génu rakoviny žalúdka za použitia expresného profilovanie.
Pozadie
Hlavným cieľom analýzy mikročipov je identifikácia odlišne exprimovaných génov v podskupín klinickej vzorky, aby spĺňal špecifické terapiou nádorových podtypov. Avšak, kvantitatívna analýza expresie rad klinických vzoriek s rakovinou s vysokým obsahom strómovými je náročné, pretože pomer epiteliálnych nádorových buniek do buniek strómy sa môže značne líšiť. Kontaminujúcich stróma môže zmiasť výraz microarray-založené a čísla kópie analýzy. Laser zachytenie mikrodisekcii (LCM) je cenným technika, ktorá umožňuje, kto izolovať epitelové bunky z buniek strómy, obohacuje tak pre epiteliálne obsah. Množstvo vzorky a RNA získané LCM je často veľmi obmedzený, však, a vyžaduje krok amplifikácie, za účelom generovania dostatočného množstva látky pre microarray analýzy. Tento amplifikačný postup môžu ovplyvniť výsledky a vedie k asymetrickej sady odlišne exprimovaných génov [1]. Histologické macrodissection (vzorky odobraté z tkanivových rezoch vedených mikroskopickou analýzou postriekané sériového časti) poskytuje väčšie množstvo materiálu vzorky v porovnaní s LCM, ktoré môžu znížiť potrebu ďalšie kolo amplifikácie RNA. Avšak, macrodissected vzorky obsahujú podstatne viac obsahu stromálnych buniek ako vzorky získanej mikrodisekcii.
Predchádzajúce štúdie v porovnaní týchto dvoch metód spracovania tkaniva pre klinické vzorky s rakovinou. Na základe údajov zo 14 vzoriek rektálny adenokarcinóm, Bruin et al
. zvýhodnený macrodissection nad mikrodisekcii vzhľadom k relatívne nízkym podielom stromálnych zložiek v macrodissected vzoriek z tohto typu nádoru a skreslené výsledky expresie génov z microdissected vzoriek vzhľadom k amplifikácii RNA potrebné pre tieto vzorky [2]. Na druhej strane, Klee a kol
. navrhol, že profilovanie mikrodisekcii jednoznačne identifikovať veľký počet odlišne exprimovaných génov nie je uvedené inak nájdené pomocou vzorkovania hromadnej tkaniva, na základe údajov z 10 pľúcnych adenokarcinómov a 6 susedných vzoriek normálne [3]. Tieto štúdie boli obmedzené malou veľkosťou vzorky, a preto vyžadujú ďalšie overenie. Rovnako nie je jasné, či sú gény jednoznačne identifikujú pomocou microdissected vzorky predstavujú užitočné biomarkery. Skreslenie v dôsledku amplifikácie RNA musí byť v rovnováhe s prospech obohatenia vzoriek pre epitelové obsah pri posudzovaní, či mikrodisekcii je výhodné pre expresiu profilovanie nádorov s vysokým obsahom strómovými, ako je žalúdočné alebo pankreasu adenokarcinómov.
Mikrodisekcii je obzvlášť užitočné pre obohatenie žalúdočné nádorové bunky rakoviny získané z endoskopických bioptických vzoriek, a to najmä na rakovinu žalúdka difúzny typu, ktorá sa skladá z rozptýlených nádorových buniek v zmesi s zápalových buniek a fibrózy. Iba v priebehu tohto storočia pokles celkový výskyt karcinómu žalúdka v USA sa zdá byť do značnej miery pripísať zníženiu lézií črevných typu, pričom výskyt difúzneho typu je myšlienka, aby zostali rovnaké [4]. Použitím vzoriek získaných LCM, Wu et al
. uvádzajú, že malígny proti benígnej žalúdkovej epitelových buniek môže byť odlíšený s presnosťou 99%, vztiahnuté na 504 génov prediktor v [5]. Tento prediktor zahrnuté dobre známe gény exprimované v žalúdočnej epitel vrátane Trefoil faktory 1, 2, 3 a [5]. Použitie LCM, Jinawath et al
. identifikoval 46 génov, ktoré môžu predstavovať rôzne molekulárne podpisy pre dvoch histologických typov rakoviny žalúdka - difúzna typ a karcinómov žalúdka črevného typu [6]. Avšak, žiadne štúdie boli vykonané do dnešného dňa priamo porovnaním macrodissection vs
. LCM metódy využívajúce rovnakej sady vzoriek s karcinómom žalúdka.
V tejto štúdii sme sa snažili vyhodnotiť rozdiely medzi profilmi expresie odvodené od rovnakým nádorom, ktoré boli spracované ako macrodissection a LCM pre microarray analýzy. Vzhľadom k tomu, že je ťažké overovanie všetkých odlišne exprimovaných génov identifikovaných za použitia každého typu odberu vzoriek sme porovnávali génov identifikovaných v našej microarray analýzy s proteínmi, je známe, že je nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka. Ďalej sme zistili, či expresie génov identifikovaných v každom podpise v korelácii so zmenami v počte kópií génu, ktorá bola identifikovaná rad komparatívna genomická hybridizácia (CGH) z rovnakým nádorom. Predchádzajúce štúdie rakoviny žalúdka, ktoré preukázali vysokú koreláciu medzi array CGH a dát výraz pole [7]. zmeny počtu kópií boli hodnotené za použitia macrodissected nádorové DNA, aby sa zabránilo skresleniu z celého amplifikácie genómu. Ďalej sme rozhodnutí, či génové podpisy sme získali z každej vzorky zberu a spracovania metódy boli obohatené o bielkoviny, ktoré už predtým boli hlásené byť ich poškodeniu génov v rakovine žalúdka. Naše výsledky naznačujú, že spôsob LCM je citlivejšia na identifikáciu génov, ktoré sú underexpressed v karcinómu v porovnaní s normálnou tkanív (potenciálny nádorové supresorové), vzhľadom k tomu, macrodissection identifikuje viac génov, ktoré sú nadmerne exprimované u rakoviny. Preto macrodissection a LCM mikrodisekcii objavia užitočné pre štúdium rôznych aspektov biológie rakoviny.
Metódy
pacientov
Dvadsať pacientov, ktorí boli analyzované v tejto štúdii je súčasťou 96 pacientov, ktorí sa zúčastnili v prospektívnej štúdii a ktorých vzorky boli použité ako expresné trénovacej množiny vyvinúť prediktor chemo-odozvy [8]. Časť prejavu a dát pole CGH zo svojich macrodissected vzoriek bolo oznámené predtým [8, 9]. Vzorka zber, spracovanie a sledovanie boli vykonané podľa protokolu schváleného Institutional Review Board (IRB) Národného nemocnice Cancer Center v Goyang, Južná Kórea (NCCNHS01-003). Všetci pacienti podpísali IRB schválený Formulár informovaného súhlasu. Spôsobilosť na zápis do štúdie zahrnuté nasledujúce parametre: 1) vo veku ≥ 18 rokov; 2) histologicky potvrdených prípadov adenokarcinóme žalúdka; 3) klinicky zdokumentované vzdialených metastáz; 4) žiadne predchádzajúce alebo súbežná malignity iné ako rakoviny žalúdka; 5) bez predchádzajúcej histórie chemoterapie, a to buď adjuvantnej alebo paliatívnej; a 6) zodpovedajúce funkcie všetkých dôležitých orgánov. Pacienti dostávali cisplatinu 60 mg /m 2 IV v deň 1 a fluorouracilom 1000 mg /m 2 IV v dňoch 1-5 3-týždenného rozvrhu.
Spracovanie Tissue
Pred macrodissection, nádor vzorky mali stredný zhubný nádor jadra vo výške 50% (kvartily rozsah, 30 - 60%). Macrodissection bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [10]. Macrodissection viedlo k priemernému 60% nádorových jadier na hornom snímke (rozmedzie medzi kvartily, 60 - 72,5%). Pre mikrodisekcii, nádorových a normálnych vzoriek zmrazených rezoch tkaniva boli narezané na 10 um, a skladované v zmrazenom stave pri teplote -80 ° C. Sklíčka sa odvodňuje za použitia nukleázy prosté HistoGene (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), činidlá podľa odporúčania výrobcu. Mikrodisekcii bola vykonaná pomocou PixCell II (Arcturus Bioscience Mountain View, CA). Dehydratácia a LCM bola obmedzená na 15 minút alebo menej, pre každú vzorku. Celkom 10.000 laserových pulzov (bodová veľkosť 15 um v priemere) boli zhromaždené pomocou CapSure Makro LCM Viečka pre každú vzorku. RNA bola izolovaná s použitím PicoPure RNA Isolation Kit (Molecular Devices). Stručne, epitelové bunky boli inkubované s 50 ul extrakčného pufra v 0,5 ml mikrocentrifugačných skúmavke pri teplote 42 ° C počas 30 minút. Liečba DNase (QIAGEN, Valencia, CA) sa uskutočnila priamo v kolóne pre čistenie, a RNA bola izolovaná za použitia elučný objem 8 ul (Molecular Devices). Päť ul RNA z populácií microdissected buniek sa prevedie na biotinylizované, antisencie Crna cieľ, pomocou Affymetrix dvojstupňového spôsobu označovania (Santa Clara, CA). Všetky biotinylizované ciele boli roztrieštené a 15μ
g každý bol hybridizován HG-U133A GeneChip mikročipov po protokolu výrobcu. Naskenované poľa snímky boli preskúmané a prevedený na signál dát pomocou Affymetrix MAS 5.0 algoritmus.
Array CGH
genómovej DNA bola extrahovaná zo vzoriek za použitia činidla TRI (Invitrogen, Carlsbad, CA), podľa návodu výrobcu, a navyše čistí pomocou QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN). Pre pole CGH experimenty, Agilent 4x44k HD-CGH čipy obsahujúce 44.000 vlastnosti (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) boli použité. 0,5-1 ug genómovej nádorových vzoriek DNA a s rovnakým množstvom ľudskej genomickej DNA z niekoľkých anonymných darcovských (Promega, Madison, WI) sa štiepi Alul (50 jednotiek) a Rsal (50 jednotiek) počas 2 hodín pri teplote 37 ° C , 5 ul Random Primer sa zmieša s trávené DNA templátu. Referenčné a vzorku DNA boli označené za použitia Agilent Labeling Kit Plus, ktorý zahŕňa 5x vyrovnávacej pamäte, 10x dNTP, Cy-3/5 dUTP (1,0 mm), a Exo-Klenowovým fragmentom. Zmes sonda Cy3 značených vzoriek DNA, Cy5 značeného referenčnej DNA (39 ul), 5 ul ľudského Cot-1 DNA (Invitrogen), 11 ul Agilent 10 x činidla blokujúceho a 50 ul Agilent 2 x hybridizačného pufru bola denaturovaná pri 95 ° C po dobu 3 minút a inkubujú sa pri teplote 37 ° C počas 30 minút. Sonda bola použitá na pole pomocou Agilent microarray hybridizačnej komory, a hybridizovány po dobu 21 hodín pri teplote 65 ° C v rotačnej peci pri 20 otáčkach za minútu. Pole sa prať podľa odporúčania výrobcu, máčané v Agilent je stabilizačný a sušenie riešenia, a kontrolované pomocou Agilent 2565AA DNA čipu skener. Scan Ovládanie programu Program Agilent je 7,0 a Agilent Feature Extraction Software Program 9.5.1 boli použité pre spracovanie dát. Array CGH Dáta boli analyzované s použitím softvéru Agilent CGH Analytics (verzia 3.5.14). ADM-2 algoritmus s prahom 6, s Fuzzy nulou a centralizáciu na, sa používa na identifikáciu odchýlku. Kritériá pre filtrovanie aberácie boli minimálne sondy 5, minimálny priemerný absolútna log 2 pomer 0,5 a maximálne odchýlky 1.000.000. Výnimky ustanovenej pre každú vzorku boli uvedené aj graficky zobraziť.
Žalúdočné gény rakoviny v literatúre
Pre generovanie gén sadu užívateľom definované pre náš porovnanie génovej analýzy, sme hľadali databázu PubMed génov s žalúdočnej proteínu karcinómu buniek špecifické výrazom, pomocou kľúčových slov o "rakoviny žalúdka", "imunohistochemicky" a "nadmerne vystavený" alebo "strata výrazu". Pre naše gen set porovnaní analýz génovej symboly špecifických génov rakoviny žalúdka boli mapované sondovať nastavené ID na HG-U133A pole (http :. //Www. NetAffx com). Bolo 178 ( "nadmerne vystavený") a 327 ( "strata výrazu"), článkov v PubMed v čase písania.
Štatistická analýza dát výraz pole
dát Affymetrix U133A HG-génovej expresie microarray boli analyzované gen set porovnanie analýzy algoritmy BRB ArrayTools (verzia 3.8, National Cancer Institute, http: .... //Linus NCI NIH gov /BRB-ArrayTools html) [11]. Gen set porovnaní nástroj analyzuje užívateľsky definované génovej sady pre rozdielnu expresiu medzi vopred definovaných tried (tj
., Rakovina vs
. Normálny) zo zdroja dátovej sady. Užívateľom definované sady génov použité v tejto štúdii zahŕňajú U133A sady sond zodpovedajúce gény so zmenou počtu kópií a zodpovedajúce karcinómu žalúdka génov v literatúre. Gény, ktorých nádor /normálny log 2 pomer vyšší ako 0,5 aspoň v jednom z 20 vzoriek od pacientov boli zaradené do zoznamu génov s počtu kópií zisk. Podobne, gény so stratou počtu kópií (log 2 pomer < -0.5) boli uvedené. Tieto génové sady užívateľom definované boli analyzované rozdielnu expresiu medzi 20 vzoriek s rakovinou a 6 vzoriek normálne (tj
., 3 macrodissected a 3 microdissected vzorky).
Každý zdroj dátovej sady, P-hodnota
vypočítajú pre každý gén korelovať hladiny expresie pre rozdielnu expresiu medzi vopred definovaných tried, vytvára zoznam podľa poradia génu daného projektu BRB-ArrayTools. Pre sadu N
génov sa najmenších štvorcov (LS) štatistika je definovaný ako priemerný negatívny prirodzený logaritmus P
-hodnoty z príslušných jednogenových jednorozmerných testy [12]. Súhrn štatistika je počítaný, ktorý sumarizuje tieto P
hodnoty cez sadu génov užívateľom definované; súhrnné štatistiky je priemerné log (P
) pre zhrnutie LS ako aplikácia P
hodnoty sa líši od rovnomerného rozloženia LS [12]. Súhrnná štatistika sa týka rozdelenia súhrnných štatistík pre náhodných vzoriek n
génov vo vzorke od tých zastúpených v poli. Tu N
je počet génov v sade géne definované užívateľom. 100.000 náhodné sady génov boli odobraté vzorky na výpočet tejto distribúcie. The
hodnota LS P je podiel náhodných sád n
génov s menšími priemernými súhrnné štatistiky ako súhrny LS počítaných pre reálnymi dátami.
BRB-ArrayTools odhadovanej LS P
hodnoty pre obohatenie so 4 génové sady v našej žalúdočné rakovina transkriptomu podpisu možno identifikovať podľa každú metódu spracovania tkaniva takto. Po prvé, za účelom porovnaní s 2,324 génmi so vzťahom k počtu kópií zisk s našou žalúdočné rakovina transkriptomu podpisu identifikovaného mikrodisekcii, štatistická LS z 2,324 amplifikovaných génov bola stanovená výpočtom priemernej negatívny prirodzených logaritmov P
hodnotami jediného génu jednorozmerné testy pre diferenciálnej expresie každej z 2,324 génov medzi 20 microdissected vzoriek žalúdočnej rakovinou a 6 normálnych vzoriek. Potom BRB-ArrayTools vypočíta podiel náhodných sád 2,324 génov s menšími priemernými súhrnné štatistiky ako súhrny LS počítaných pre reálnymi dátami (LS P
hodnoty). Žalúdočné rakovina transkriptomu podpis identifikované mikrodisekcii sa tiež v porovnaní s 677 génov spojených so stratou počtu kópií, 58 proteíny, ktoré majú byť hlásené nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka, a 66, ktoré majú byť hlásené proteíny underexpressed v karcinómu žalúdka, s príslušnou LS P
hodnoty. LS P
hodnota menšia ako 0,01 bola považovaná za významnú. Rovnaká analýza bola opakovať pre žalúdočné rakovina transkriptomu podpisu identifikovaný metódou macrodissection.
Imunohistochémia
TFF1 imunohistochémia bola vykonaná za použitia vzoriek, chirurgické alebo endoskopické biopsia tkaniva od 16 pacientov s rakovinou žalúdka (16 rakovinou a 2 priľahlých vzoriek normálneho tkaniva), a 4 zdravých dobrovoľníkov, ktorí neboli zaradení do tejto DNA mikročipov štúdie. Hrubo-normálne vzorky žalúdočnej sliznice tkaniva boli odobraté z žalúdočnej dutine zdravých dobrovoľníkov za použitia slepého bioptické techniky, s informovaným súhlasom [9]. šmykľavky tkaniva formalínom fixované parafínových (4 um silná) boli zafarbené 13734-1-AP (Proteintech Group, Chicago, IL) v 1:50 po dobu 60 minút pri teplote miestnosti a Envision anti-králičie chrenovou peroxidázou (K4003, Dako , Carpinteria, CA) po dobu 30 minút pri teplote miestnosti. Reakčná zmes sa vizualizované za použitia Diaminobenzidine (K3468, Dako) a kontrastne hematoxylínom. TFF1 expresia bola hodnotená semikvantitatívne pri 200x zväčšení
, na základe percenta pozitívne zafarbených buniek ( "-" = imunobarvením v £ 10% buniek, "+" = 11 až 50%, "++" = 51- 75%, "+++" = 76 až 100%) [13, 14]. Imunologické bez primárnej protilátky a normálne žalúdočnej epitelu ovládanie mikroskopické sústavy tkanív slúžili ako negatívne a pozitívne kontroly, respektíve [15]. Cytoplazmatický škvrnu, ktorá bola jednoznačne hlbšie ako pozadie bol počítaný ako pozitívne.
Výsledky
Stanovenie globálnej génovej expresie podpisov macrodissected a LCM vzoriek
Tabuľka 1 vymedzuje klinicko-patologické charakteristiky pacientov a dobrovoľníkov zahrnuté v tomto microarray štúdie. Microarray dáta bola získaná pre LCM a macrodissected vzoriek rovnakých 20 biopsiou (obrázok 1A). Hoci prijateľnú kvalitu, microarray dáta zo vzoriek LCM mal vo všeobecnosti nižšie "Táto výzva" ako macrodissected vzoriek (dáta nie sú uvedené
). Analýza hlavných komponentov z globálnych génovej expresie vzory odvodenými od mikro- a karcinómov žalúdka makro-členitý a normálne vzorky preukázali jasné rozdelenie každej vzorky skupiny (obr 1B). Medián Pearson korelácia medzi oboma metódami spracovania bolo 0,75 (rozsah medzikvartilové, 0,71-0,81) .Table 1 klinicko-patologické charakteristiky pacientov a dobrovoľníkov zahrnuté v analýze mikročipov

Pacienti (n = 20)
Volunteers (n = 6)
Baseline klinicko-patologické charakteristiky
Vekom rok
Median
59
52
medzikvartilové rozsah
54-69
43-61
Sex - no. (%)
Male
16 (80%) Sims 3 (50%)
Žena
4 (20%) Sims 3 (50%) Stav
Výkon (PS ) - no. (%)
ECOG1 PS 0 alebo 1
20 (100%)
Histologické typ - no. (%)
Lauren črevnej
6 (30%)
Lauren difúznych
14 (70%)
Umiestnenie primárne lézie - no. (%)
Horná tretiny
4 (20%)
Stredná tretina
6 (30%)
dolnej 1/3
10 (50%)
vzdialenej metastázy - no. (%)
20 (100%)
liečbu a výsledok
chemoterapie - no. (%)
Cisplatina /Fluorouracil
20 (100%)
celkový čas prežitia. - Mesiac
Median
8,0
medzikvartilové rad
5.6-14.7
čas do progresie -. mesiac
Median
3,5
medzikvartilové rozsah
3 /2-2 /06
1Eastern Cooperative Oncology Group
Obrázok 1 (a) Študijný plán vzoriek zberu a spracovania mikročipov (B) hlavnú zložku analýza profilov génovej expresie mikro- a nádorových vzoriek makro-členitý z 20 pacientov s rakovinou žalúdka a 6 normálnych vzoriek od zdravých dobrovoľníkov.
Tabuľky 2 a 3 ukazujú génov nadmerne vystavený u mikro- a makro-členitý vzoriek s karcinómom žalúdka pri výbere príznakov P Hotel < 10 -6. Morfológia buniek
(AIF1, E2F1, E2F3, KIR2DL1, KIRREL, NPR1, RUNX2, TRIO
) bola najviac obohatil funkčné kategórie zo 42 génov nadmerne exprimovaný v microdissected vzorkách v porovnaní s normálnymi vzorkami (výber funkcie P
< 10 -6), ako je stanovené v vynaliezavosťou Pathway analýzy (IPA) (tabuľka 2). Tumor morfológia
(APOE, BIRC5, CD14, COL1A1, COL1A2, CYR61, FKBP1A, IL8, MCAM, MIF, rhoba
) bol najviac obohatený funkčné kategórie medzi 73 génov nadmerne vystavený v macrodissected vzoriek (výber funkcie P Hotel < 10 -6), IPA (tabuľka 3). Extracelulárnej matrix gény, ako je COL6A2, COL1A1, COL1A2 stroje a COL5A2
boli prominentnú v macrodissected vzoriek a pravdepodobne prispel stromálnych buniek. Tabuľka 4 ukazuje gény underexpressed v mikro- a makro-členitý vzoriek rakoviny žalúdka pri výbere funkcie P Hotel < 10 2 -6.Table Gény nadmerne vystavený v microdissected rakoviny žalúdka pri výbere funkcie P Hotel < 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

BMP3
38.52
HIST1H4C
6.3
BGN
30.3
LEPRE1
5.9
TRIO
18.5
ETNK2
5.6
GADD45GIP1
17.2
TRIP6
5.3
MIER2
16.7
FAM125B
5.3
KIFC3
16.4
NPR1
5.3
217318_x_at
13.7
DSCC1
5.3
217219_at
13.2
CLUL1
5.0
RUNX2
12.5
HMGB3
4.5
SMARCD1
12.0
E2F3
4.3
KIRREL
12.0
AIMP2
4.2
215621_s_at
12.0
ATAD5
4.0
GRM2
10.0
E2F1
3.8
FJX1
10.0
FKSG49
3.7
AIF1
10.0
DVL2
3.7
THY1
9.1
TIPRL
2.9
CARD10
9.1
EIF2C3
2.9
SIM2
9.1
NAT10
2.8
AIF1
9.1
MED27
2.7
APOBEC3G
8.3
PIN4
2.7
RHAG
8.3
CTPS
2.6
1fold zmena definovaná výskytom pomeru rakoviny k normálu (= rakovina /normálne)
2All tieto gény mal falošné objav rýchlosť < 0,001
Tabuľka 3 Gény nadmerne vystavený v macrodissected rakoviny žalúdka u hraného výberového P
. < 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

LY6E
24.42
SRM
6.7
IL8
22.7
NGLY1
6.7
CA12
20.0
RHOB
6.3
SBNO2
19.2
ACTN1
5.9
UBE2S
17.2
LOXL2
5.9
CYR61
17.2
COL5A2
5.9
ANGPT2
15.9
TRIM28
5.6
COL6A2
14.3
218982_s_at
5.6
BOP1
13.2
C7orf44
5.3
COL1A1
13.2
UBE2C
5.3
LPL
13.0
CEP76
5.3
MFGE8
12.8
BIRC5
5.3
APOE
12.2
PNO1
5.0
G6PC3
10.9
FSTL1
5.0
215900_at
10.3
GRINA
4.8
NUP62
10.0
MRTO4
4.8
MRPL4
10.0
STC1
4.8
GNL3L
10.0
MRPL12
4.5
MCAM
9.1
FKBP1A
4.5
PDLIM7
9.1
IFI30
4.5
216472_at
9.1
KPNA6
4.3
ACTN1
9.1
216532_x_at
4.3
BYSL
9.1
CENPI
4.2
GNAI2
8.3
PPM1G
4.2
NCAPH2
8.3
ICT1
3.7
CD14
8.3
SFRS14
3.6
EXOSC4
8.3
CTPS
3.6
OBFC2B
8.3
IMP4
3.3
PPP1R15A
7.7
UBE2G2
3.2
COL1A2
7.7
ISG20L2
3.2
GPX1
7.7
EIF4A1
3.1
MIF
7.7
HDGF
2.6
NME1
7.1
PSMD14 2.6
PPIL2
7.1
220856_x_at
2.4
CCDC85B
7.1
CNOT3
2.4
SPARC
6.7
GLT25D1
2.0
C8orf55
6.7
1fold zmena definovaná výskytom pomeru rakoviny k normálu (= rakovina /normálne)
2All tieto gény sa falošné objav rýchlosť. ≪ 0,001
Tabuľka 4 Gény underexpressed v mikro a makro-členitý rakoviny žalúdka u znaku P Voľba Hotel < 10-6
Microdissected

Macrodissected

Gene

FC1

Gene

FC

HPGD
-25.02
208498_s_at
-11.1
HRASLS2
-20.0
SIDT2
-7.7
ABCC3
-20.0
MUC5AC
-5.9
SLC25A37
-16.7
CTAGE5
-5.0
ABHD2
-14.3
GNA11
-3.8
VIPR1
-10.0
ARFIP1
-3.4
CYTIP
-9.1
214316_x_at
-3.3
GALNT6
-9.1
222149_x_at
-3.3
SULT1A2
-9.1
OAS1
8,3
PDCD4
-7,1
NR3C2
-7,1
DOCK6
-6,3
SULT1A1
-5,9
ZFYVE26
- 5,9
213212_x_at
-5,6
DSCR3
-5,3
TMEM131
-5,3
ECHDC2
-5,0
DENND1B
-5,0
KIAA0141
-4,8
RNF103
-4,8
PDCD4
-4,5
CABIN1
-4,5
222371_at
-4,3
RRBP1
-4,0
CC2D1A
-3,8
216438_s_at
-3,8
SGSM3
-3,8
ARPC2
-3,7
TRAK1
-3,6
GNA11
-3,6
PAFAH1B1
-3,4
CNDP2
-3,2
SPOP
-3,1
PARP4
-3,1
ERLIN1
-2,9
1fold meniť definovaná zápornú expresného pomere normálu k rakovine (= - (normálny /rakovina))
2All tieto gény mal falošné objav rýchlosť < 0,001
Porovnanie prejavu a array CGH dát.
Array CGH analýza bola vykonávaná s použitím genómovej DNA extrahovanej z macrodissected vzoriek obsahujúcich > 50% nádorových buniek (kritériá používané v predchádzajúcich štúdiách [16, 17]), keďže dostatok DNA, ktorú možno získať bez nutnosti celej amplifikácie genómu, ako je požadované pre microdissected vzoriek. zosilnenie celý genóm DNA môže potenciálne zaviesť artifactual zaujatosť v array CGH výsledkov [18]. Je to znázornené na obrázku 2, je frekvencia počtu kópií génov aberácií u všetkých 20 vzoriek. Naše počtu kópií aberácie dáta boli celkovo v súlade s už skôr oznámených údajov [7, 16, 17, 19-23]. Štyri z 20 pacientov malo zosilnenie chr8 q24.13-q24.21 (126357475-128822596), ktorý obsahuje myc
onkogénu. Druhou najčastejšou amplifikácia lokusu bola chr17 q21.2 (36109939-36230163), ktorá bola amplifikovaná u 3 pacientov. Sedem pacientov nemal žiadne zistiteľné aberácie. Tieto vzorky obsahovali 7 medián nádorových buniek 70%, zatiaľ čo ostatné 13 Medián 60% nádorových buniek (P
hodnota = 0,1). Z tohto dôvodu, nedostatok detekovateľné chromozómy v 7 vzoriek nebol v dôsledku nižšie percento nádorových buniek v týchto vzorkách. Obrázok 2 grafický obrázok znázorňujúci percentuálny frekvencia sondy detekovaný (aberácie) pri všetkých 20 vzoriek.
Tam bolo 2,324 unikátne gény, ktoré boli spojené s počtu kópií zisk aspoň v jednom z 20 pacientov, a 677 génov spojených s počtom kópií strata. Použitie gen set porovnaní analýzy sme porovnávali tieto génové sady s našimi transcriptome podpisy sú označené rôznymi spôsobmi izolácie vzorky. Predpokladali sme, že ich poškodeniu génov spojených s počtom kópií aberácií je väčšia pravdepodobnosť, aby sa zapojili do nich prispievajú skôr ako jednoducho onkogenézy ako "okoloidúcich". Preto, 2,324 gény obsiahnuté v oblasti počtu kópií zisky boli analyzované s ohľadom na ich vyjadrenia z poľa dát získaných pomocou metódy macrodissection (výber funkcie P Hotel < 0,05). Vo vzorkách presah medzi zoznamom génov v regiónoch zosilnenie a obohatenie ich pripomienky boli v macrodissected bol štatisticky významný (LS P
hodnota = 10 -5; pozri metód štatistického opisu). Avšak, táto asociácia nebola pozorovaná, keď bol výraz údaje analyzované z microdissected vzoriek (výber funkcie P Hotel &0,05; LS P
hodnota = 0,41) (obrázok 3A). Tak, že je silnejší väzba medzi vzoru počtu kópií zisku a génovej expresie len u vzoriek, ktoré boli macrodissected. Napríklad, MYC
, najčastejšie amplifikovanej gén v našich vzorkách pacientov, bolo určené, že výrazne nadmerne exprimovaný v macrodissected vzorkách, ale nie v tých, ktoré boli microdissected, aj keď tento výsledok môže byť vzhľadom na relatívne malej veľkosti vzorky, alebo v heterogénne nádor. Obrázok 3 Počet génov prekrývajúcich medzi LCM a macrodissected výraz matice dátových súborov a dát array CGH z rovnakej skupiny 20 pacientov.
Zoznam 677 génov boli identifikované v regiónoch, kde sa úbytok počtu kópií DNA nachádza v aspoň jednej z 20 štúdie pacientov. Expresie týchto génov bol analyzovaný v makro- a mikro-členitý poľa dátovej sady. Významná súvislosť bola zistená medzi génmi so stratou počtu kópií a ich vyjadrenia v oboch makro a mikro-členitý vzoriek. (LS P
hodnoty, 0,009 a 0,006 pre LCM a macrodissected vzoriek, v uvedenom poradí) (obrázok 3B).
Zhoda génových podpisov s génmi skôr oznámených byť spájaný s rakovinou žalúdka
PubMed rešerše bola vykonaná identifikovať už bolo skôr oznámené príliš alebo nedostatočne vyjadrený gény a proteíny na rakovinu žalúdka (kľúčové slová: imunohistochémia, rakovina žalúdka a nadmerne vystavený a alebo strata expresie). 58 proteíny nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka boli identifikované týmto spôsobom. Bolo zistené, génová expresia týchto proteínov, 58, ktoré majú byť obohatený v expresných dát zo vzoriek zhromaždených macrodissection (LS P
< 10 -5), ale žiadne obohatenie v expresii 58 génov bolo zistené u vzoriek odobratých mikrodisekcii (LS P
= 0,013). Naproti tomu 66 proteíny, ktoré majú byť hlásené underexpressed v karcinómu žalúdka boli obohatené v dátach expresných poľa zo vzoriek odobratých mikrodisekcii (LS P
< 10 -5), nie však zo vzoriek odobratých macrodissection (LS P
= 0,89) (tabuľka 5) .Table 5 rakovina žalúdka génov v literatúre, ktoré boli odlišne exprimované medzi 20 rakovinou a 6 normálnych vzoriek pri výbere funkcií P Hotel < 0,05 podľa microarray dát generované pomocou jednotlivých metód spracovania tkaniva
nadmerne vystavený génov pri karcinóme
Underexpressed gény cancer

LCM&Macro1

LCM

Macro

LCM&Macro

LCM2

Macro

APOE
EGFR
AKT1
ANXA10
ANXA7
CDKN2B
AURKA
HGF
ANXA2
CASP6
BAD
FHIT
CCNE1
MET
CALR
CASP7
HLA-B
CDC20
RhoA
CCNB1
CDH1
HLA-E
cdc25B
TNS4
EEF2
CTNNA1
HLA-G
CXCR4
ESM1
GSN
PRSS8
E2F1
HIF1A
HLA-F
Ptení
EGR1
MINA
IQGAP2
SDHB
GRB2
PHB
KCNE2
SH3GLB1
VO2
KLF4
TFF1
ICAM1
MUC6
INHBA
R aR b
LOXL2
SMAD4
MCM3
PTMA
SPARC
1Previously hlásená nadmerne vystavený bielkoviny pre rakovinu žalúdka, ktoré boli tiež nadmerne vystavený v našej microdissected (LCM) a macrodissected vzoriek s nádorovým ochorením v porovnaní s normálnymi vzorkami
2Previoulsy hlásených underexpressed bielkoviny pre rakovinu žalúdka, ktoré boli tiež underexpressed v našej microdissected (LCM) vzoriek rakoviny, ale nie v macrodissected karcinómov
validáciu dát microarray
pre potvrdenie naše dáta microarray, sme vykonali imunohistochemické analýzy na gén identifikovaný ako underexpressed v microdissected karcinómov z 16 pacientov a 4 dobrovoľníci, ktorí neboli zaradení do DNA microarray štúdia. TFF1
bol vybraný pre túto imunohistochemického overovacej štúdie, pretože je podstatne underexpressed vo vzorkách LCM (P = 0,0036
), ale nie v macrodissected vzorkách (P
= 0,09), v porovnaní s normálnou žalúdočnú sliznicu. TFF1 imunoreaktivita v rakovine bola hodnotená ako -, +, ++, +++ a u 7 (43,8%), 3 (18,7%), 4 (25,0%) a 2 (12,5%), v danom poradí. Na rozdiel od všetkých 6 vzoriek normálne žalúdočnej sliznice (4 zdravých dobrovoľníkov a 2 vzoriek normálne susedné tkaniva), konzervované TFF1 imunoreaktivitu (+++) (obrázok 4). Tak vzorky rakovina žalúdka mal výrazne nižšia TFF1 imunoreaktivitu ako normálne žalúdočnej sliznice, v súlade s predchádzajúcimi správami [13, 14] (s Apartmán V chi-kvadrát = 0,007). Obrázok 4 Reprezentatívne TFF1 Imunohistochemické farbenie výsledky pre (A) adenokarcinóme žalúdka preukazuje stratu TFF1 expresie, a (B) Normálny žalúdočnej sliznice od zdravého dobrovoľníka exprimujúce TFF1 v žalúdočných epiteliálnych bunkách. (Zväčšenie = 200x)
Tieto výsledky ukazujú, že expresia génu macrodissection na základe analýzy prekonal analýzy génovej expresie vzoriek z LCM pre identifikáciu génov nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka.

• BariSurg trial: Rukávy gastrektómia proti Roux-en-Y žalúdočnej bypass u obéznych pacientov s BMI 35-60 kg /m2 - multicentrickej, randomizovanej pacienta a pozorovateľ slepý neinferioritu trial
• Expresie profil mucínu (MUC2, MUC5AC a MUC6) v Helicobacter pylori infikovaných preneoplastické a neoplastické humánne gastrický epithelium