Stomach Health > skrandžio sveikatos >  > Stomach Knowledges > tyrimai

Skirtumai skrandžio vėžio genų ekspresijos parašų, gautų iš lazerio surinkimo microdissection versushistologic macrodissection

Skirtumai skrandžio vėžio genų ekspresijos parašų, gautų iš lazerio surinkimo microdissection Versus
histologinio macrodissection
tezės
Background pervežimas skrandžio vėžio mėginių, gautų histologinis macrodissection gana didelis stromos turinio, kuris gali žymiai įtakoti genų ekspresijos profilius. Skirtumai tarp genų ekspresijos parašu, gautų iš macrodissected skrandžio vėžio mėginiai ir parašo, gautų iš izoliuotų skrandžio vėžio epitelio ląstelių iš tų pačių biopsijų naudojant lazerio užfiksuoti microdissection (LCM) buvo įvertinti dėl jų galimo eksperimentinių paklaidų.
Metodai
RNR buvo išskirta iš šaldytų audinių mėginių skrandžio vėžio biopsijos iš 20 pacientų, naudojant abi histologinio macrodissection ir LCM metodus. RNR nuo LCM buvo taikomas papildomas turo T7 RNR stiprinimas. Išraiška profiliavimas buvo atliekama naudojant Affymetrix HG-U133A masyvus. nustatytos išraiškos parašų iš kiekvienos audinių apdorojimo metodą genai buvo palyginti su genų, esančių chromosomų regionai, per rinkinį nustatyta, kad uosto kopijos numeris aberacijų navikų mėginiuose pagal masyvo CGH ir baltymų anksčiau atpažįstami kaip ekspresija skrandžio vėžio.
rezultatai
genai įrodyta, kad padidėjęs kopijos numeris skrandžio vėžiu, taip pat buvo nustatyta, kad ekspresija mėginiuose gautų macrodissection (LS P pervežimas vertės < 10 -5), bet ne masyvo duomenų generuojami naudojant microdissection , Iš 58 iki šiol išskirtų genų rinkinys ekspresija skrandžio vėžio buvo praturtintas genų pasirašymo žymimas macrodissection (Lt P
< 10 -5), bet ne į parašą žymimas microdissection (LS, p
= 0,013). Priešingai, 66 genai anksčiau pranešė, kad turi būti underexpressed į skrandžio vėžio buvo praturtintas į genų parašu žymimas microdissection (LS P
< 10 -5), bet ne į parašo žymimas macrodissection (LS P
= 0,89).
Išvados
navikas ėmimo metodas spyruoklinis mikrogardeliq rezultatus. LCM gali būti jautresni rinkimas ir apdorojimas metodas potencialių navikas slopintuvas genų kandidatų skrandžio vėžio naudojant ekspresijos identifikuoti.
Faktai
Pagrindinis tikslas mikrogardeliq analizė yra skirtingai išreikštas genų identifikavimas pogrupių klinikinis mėginiai, kad atitiktų specifinius gydymo būdų potipių auglio. Tačiau kiekybinę išraišką masyvo analizė klinikinių vėžio mėginiai su dideliu stromos turinys yra sudėtingas, nes epitelio vėžinių ląstelių santykis stromos ląstelėse gali labai skirtis. Pavojingumo stromos gali sumaišykime mikrogardeliq pagrindu išraišką ir kopijos numerius analizes. Lazerinis surinkimo microdissection (LCM) yra vertingas metodas, kuris įgalina izoliuoti epitelio ląsteles nuo stromos ląstelėse, todėl praturtinti epitelio turinį. Bandinio ir RNR, gautą LCM kiekis yra dažnai gana ribotas, tačiau, ir reikalauja, kad amplifikacijos žingsnį generuoti pakankamai medžiagos Mikrogardelė analizę. Tai amplifikacija procesas gali šališkumo rezultatus ir sukelti iškreiptas rinkinį skirtingai išreikštas genų [1]. Histologinę macrodissection (surinktos iš audinių skyriuose vadovaujasi mikroskopinę analizę tam tamsintas serijos skyriuje mėginiai) suteikia didesnį kiekį mėginio medžiagos, palyginti su LCM, kad galite išvengti už papildomą raundą RNR amplifikacijos poreikį. Tačiau macrodissected mėginiai yra žymiai daugiau STROMA turinį, nei mėginių, gautų microdissection.
Ankstesni tyrimai palyginti šiuos du audinių apdorojimo metodus klinikinių vėžio pavyzdžius. Remiantis duomenimis, gautais iš 14 tiesiosios žarnos adenokarcinoma pavyzdžių, Bruin ir kt
. pirmenybė macrodissection per microdissection dėl to, kad santykinai nedidelė dalis trakto stromos komponentų macrodissected mėginių iš šio naviko tipą ir šališkose ekspresijos rezultatų iš microdissected mėginių dėl to, kad RNR yra būtini šioms [2] mėginių amplifikacijos. Kita vertus, klijai ir kt
. pasiūlė, kad microdissection profiliavimas identifikuoti didelį skaičių skirtingai išreikštas genų kitaip rasti naudojantis urmu audinių mėginius, remiantis duomenimis iš 10 plaučių adenokarcinomos ir 6 gretimuose normaliuose mėginių [3]. Šie tyrimai buvo ribojama mažų imčių dydžių, ir todėl reikalauja tolesnio patvirtinimo. Taip pat neaišku, ar nustatyti unikaliai naudojant microdissected mėginius genai atstovauti naudingų biologinių žymeklių. Paklaida atsiranda RNR stiprinimas turi būti suderinta su praturtinti mėginius epitelio turinio atsižvelgiant naudai ar microdissection yra naudinga ekspresijos auglių su dideliu stromos turinio, pavyzdžiui, skrandžio ar kasos adenokarcinomos.
Microdissection yra ypač naudinga praturtinti skrandžio vėžys naviko ląstelių, gautų iš endoskopiniais biopsijos mėginiuose, ypač iš difuzinis-tipo skrandžio vėžio, kuris yra sudarytas iš pavienių vėžinių ląstelių, sumaišytų su uždegiminių ląstelių ir fibrozės. Į bendras dažnumas buvo skrandžio karcinoma JAV mažėjimas šiame amžiuje atrodo, kad iš esmės priskirtinas žarnyno tipo pažeidimų sumažėjo, o difuzinio tipo įvykis yra manoma, kad buvo toks pats, [4]. Naudojant mėginių, gautų LCM, Wu et al pervežimas. Pranešama, kad piktybiniai palyginti gerybinių skrandžio epitelinių ląstelių gali būti išskiriami su 99% tikslumu, paremtos 504 genų [5] prognozuoti. Tai prognozuoti įtraukti gerai žinomų genų, išreikštas skrandžio epitelio įskaitant Trójliść veiksniai 1, 2, ir 3 [5]. Naudojant LCM, Jinawath kt
. nustatė 46 genų, kurie gali atstovauti skirtingas molekulines parašus dviejų histologinių tipų skrandžio vėžiu - difuzinis-tipo ir žarnyno tipo skrandžio vėžio [6]. Tačiau jokių tyrimų neatlikta iki šiol tiesiogiai lyginant macrodissection vs
. LCM metodai, naudojant tuos pačius skrandžio vėžio mėginiai.
Šiame tyrime siekėme įvertinti tarp ekspresijos profilius kilę iš tų pačių navikų, kurie buvo perdirbti tiek macrodissection ir LCM už Mikrogardelė analizuoja skirtumus. Atsižvelgiant į tai, sunku patvirtinti visi skirtingai išreikštas genų nustatytas naudojant kiekvieną mėginių ėmimo tipo, mes palyginti genus nustatytus per mūsų microarray analizuoja su baltymais žinomoms ekspresija skrandžio vėžio. Be to, mes nustatyti, ar genų nustatytų kiekvienoje koreliuoja su pokyčiais geno kopijų skaičiaus, kurie buvo žymimas masyvo lyginamoji genomo hibridizacijos (CGH) Parašas iš tos pačios navikų. Ankstesni tyrimai skrandžio vėžio parodė aukštą koreliaciją tarp masyvo CGH ir išraiška masyvo duomenų [7]. Kopijuoti numeris pokyčiai buvo vertinami naudojant macrodissected naviko DNR, siekiant išvengti šališkumo iš viso genomo stiprinimas. Mes taip pat nustatyti, ar genų parašai mes gauti iš kiekvieno mėginio surinkimo ir apdorojimo metodas buvo praturtinti baltymais, kurie anksčiau buvo pranešta, kad dysregulated genų skrandžio vėžio. Mūsų rezultatai rodo, kad LCM metodas yra daugiau jautrus nustatyti genus, kurie yra underexpressed į vėžio, palyginti su normalaus audinio (galimos naviko slopintuvai), kadangi macrodissection identifikuoja daugiau genų, kurie yra aktyvuojami vėžio. Todėl macrodissection ir LCM microdissection būti naudinga studijuoti įvairius vėžio biologija.
Metodai
Pacientų
Dvidešimt pacientai, kurie buvo analizuojami šio tyrimo yra 96 ​​pacientų dalis, kuriems dalyvavo perspektyvų studiją ir kurių mėginiai buvo naudojamas kaip išraiška mokymo komplekto sukurti Chemoterapija reagavimo Predictor [8]. Dalis saviraiškos ir CGH masyvo duomenis iš jų macrodissected mėginių buvo pranešta anksčiau [8, 9]. Pavyzdys surinkimas, apdorojimas ir tolesnė buvo atliekamas pagal protokolą pagal institucinius ekspertizės valdyba (IRB) Nacionalinės Cancer Center Hospital Goyang, Korėja (NCCNHS01-003) patvirtintą įgaliojimą. Visi pacientai pasirašė IRB-patvirtintą informuoto sutikimo formą. Tinkamumas įtraukimo į tyrimą įtraukti šiuos parametrus: 1) amžius ≥ 18 metų; 2) histologiškai patvirtintas skrandžio adenokarcinoma; 3) kliniškai dokumentais toli metastazių; 4) nėra kitų nei skrandžio vėžio ankstesnius arba kartu vartojami piktybinių navikų; 5) ne anksčiau buvo chemoterapijos, arba adjuvantinis arba paliatyvi; 6) pakankama funkcija visų pagrindinių organų. Pacientai vartojo cisplatina 60 mg /m 2 IV nuo dieną 1 ir fluorouracilu 1000 mg /m 2 IV dienomis 1-5 3 savaičių grafiką.
Audinių apdorojimo
Prieš macrodissection, naviko mėginiai buvo medianines auglio branduolius 50% (interkvartilinis intervalas, 30-60%). Macrodissection buvo atliktas kaip buvo aprašyta anksčiau [10]. Macrodissection sukelti vidutiniškai 60% naviko branduolių viršuje skaidrės (interkvartilinis diapazone, 60-72,5%). Dėl microdissection, naviko ir normalių audinių pavyzdžių šaldomuoju mikrotomu atpjautuose buvo sumažinti ne 10 mikronų, ir laikyti užšaldytus -80 ° C temperatūroje. Skaidrės buvo dehidratuota naudojant nukleazinis be HistoGene (molekulinė prietaisai, Saniveilas, CA) reagentai pagal gamintojo rekomendacijas. Microdissection buvo atliekama naudojant PixCell II (Arcturus biologijos, Mountain View, CA). Dehidratacija ir LCM buvo apribotas iki 15 min arba mažiau kiekvienai Paimtas mėginys. 10.000 lazerinių kadrų iš viso (vietoje dydis 15 mkm skersmens) buvo renkami naudojant CapSure Makro LCM rinktinėje kiekvieno mėginio. RNR buvo išskirta naudojant PicoPure RNR išskyrimas Kit (molekulinė įrenginiais). Trumpai tariant, epitelinės ląstelės buvo inkubuojamos su 50 pL gavybos buferis 0,5 ml, skirtą naudoti mikrocentrifugoje vamzdį 42 ° C temperatūroje 30 min. Dezoksiribonukleazė (QIAGEN, Valensija, CA) Apdorojimas buvo atliekamas tiesiogiai per gryninimo skiltyje, ir RNR buvo išskirtas naudojant eliuavimo tūris 8 pL (molekulinė prietaisams). Penki įxL RNR nuo microdissected ląstelių populiacijų buvo konvertuojami į Biotinilinta, Priešprasminis Juodos taikinį, naudojant Affymetrix dviejų pakopų ženklinimo metodą (Santa Clara, Kalifornija). Visi Biotinilinta tikslai buvo fragmentiški ir 15μ
g kiekvienas buvo kryžminosi HG-U133A GeneChip mikrogardelių pagal gamintojo protokolą. Nuskaityti masyvo vaizdai buvo peržiūrimi ir konvertuojami į signalo duomenis per Affymetrix MAS 5.0 algoritmą.
Masyvas CGH
Genomo DNR buvo išskirta iš mėginių, naudojant TRI reagentą (Invitrogen, Karlovi Varai, Kalifornija), pagal gamintojo protokolą, ir papildomai išgrynintas naudojant QIAamp DNR Micro rinkinį (QIAGEN). Dėl matricų CGH eksperimentuose buvo naudojami "Agilent 4x44k HD CGH Mikrogardelių sudėtyje yra 44.000 funkcijų (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija). 0,5-1 mikrogramų naviko genomo DNR pavyzdžių ir tą pačią sumą žmogaus genomo DNR iš kelių anoniminių moterų donorų (Promega, Madison, WI) buvo suardomas AluI (50 vienetų) ir RsaI (50 vnt) 2 h 37 ° C temperatūroje , 5 mikrol, atsitiktinės atrankos būdu gruntu buvo sumaišyti su Virškinant DNR šabloną. Palyginamuoju ir su bandinio DNR buvo ženklinami naudojant Agilent ženklinimo Kit PLUS, kuris apima 5x buferis, 10x trifosfato, CY-3/5 dUTP (1,0 mm), ir egzo-Klenow fragmentas. Zondas mišinys Cy3 paženklinti mėginio DNR, Cy5 paženklinti informacinė DNR (39 pl), 5 įxL žmogaus Lopšys-1 DNR (INVITROGEN), 11 įxL Agilent 10 × blokatorius ir 50 įxL Agilent 2 × hibridizacijos buferio buvo denatūruotas ne 95 ° C temperatūroje 3 min ir inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 30 min. Zondas buvo taikomas masyvo, naudojant Agilent Mikrogardelė hibridizacijos kamerą, ir hibridizuoti 21 h 65 ° C temperatūroje, besisukančio džiovinimo spintoje, esant 20 apsisukimų per minutę. Masyvai buvo plaunami pagal gamintojo rekomendacijas, artimųjų Agilent stabilizuoti ir džiovinimo tirpalu ir nuskaityti naudojant "Agilent 2565AA DNR mikrogardeliq skaitytuvas. Agilent anketa Scan programos kontrolės programa 7.0 ir Agilent požymių išskyrimas programa 9.5.1 buvo naudojamas duomenų apdorojimo. Array CGH duomenys buvo analizuojami naudojant Agilent CGH Analytics "programinė įranga (Versija 3.5.14). ADM-2 algoritmą su slenksčiu 6 Apytikslė nulio ir centralizacijos apie, buvo naudojami siekiant nustatyti aberaciją. Kriterijai aberacijos filtravimo buvo minimalūs zondai 5, minimalus vidutinis absoliutus žurnalas 2 santykis 0,5 ir maksimalus aberacijos 1.000.000. nustatyti kiekvieno mėginio aberacijos buvo įtrauktos ir grafiškai rodomas.
skrandžio vėžio genus literatūroje
generuoti vartotojo nustatytą genų rinkinį mūsų genų palyginimas analizes, mes ieškoma PubMed duomenų bazę genų su skrandžio vėžio ląstelėms būdingas baltymų išraiška, naudojant raktažodžius "skrandžio vėžiu", "imunohistocheminiu" ir "ekspresija" arba "praradimo išraiška". Juk mūsų genų rinkinys palyginimas analizes, genų simboliai skrandžio vėžio konkrečių genų buvo priskirta zondas užsibrėžtų ID apie HG-U133A masyvo (http:.. //Www NetAffx com). Nebuvo 178 ( "ekspresija") ir 327 ( "nuostolis išraiškos") straipsnių PubMed rašymo metu.
Statistiniai analizė išraiška masyvo duomenų
Affymetrix HG-U133A genų ekspresijos microarray duomenis buvo analizuojama genų rinkinys palyginimas analizės algoritmai Brb ArrayTools (versija 3.8, Nacionalinis vėžio institutas, http:.... //Linus NVI NIH valst /BRB-ArrayTools HTML) [11]. Genas nustatytas palyginimas įrankis analizuoja vartotojo apibrėžtos genų rinkiniai diferencinė ekspresija tarp anksto apibrėžtų klasių (t.y.
., Vėžys vs
. Normalus) iš šaltinio duomenų rinkinį. Vartotojo nustatyti genų rinkiniai, naudojami šiame tyrime apima U133A zondas rinkiniai atitinka genų kopiją skaičiaus pokytis ir atitinkantis skrandžio vėžio genų literatūroje. Genai, kurių naviko /normalus log 2 santykis yra didesnis nei 0,5 bent vieną iš 20 paciento mėginius, buvo įtrauktas į genų su kopijų skaičiaus padidėjimas sąraše. Be to, genai, kurių kopijų skaičiaus praradimo (log 2 santykis < -0.5) buvo išvardyti. Šie user-defined genų rinkiniai buvo analizuojami diferencinė ekspresija tarp 20 vėžio mėginiai ir 6 normalių pavyzdžių (ty
., 3 macrodissected ir 3 microdissected mėginiai).
Už kiekvieną source rinkinį, P
-Pridėtinės yra skaičiuojamas už kiekvieną geną abipusiškai susieti sąvoką lygį skirtumo išraiška tarp anksto apibrėžtų klasių, kuriantį eiliškumo genų sąrašą tam tikrą BRB-ArrayTools projektą. Norėdami gauti n
genų rinkinys, mažiausių kvadratų (Lt) statistika yra apibrėžiamas kaip vidutinis neigiamas natūralusis logaritmas P
k dydžiai nuo atitinkamų vieno geno Vienaveiksnės bandymų [12]. Santrauka statistika yra skaičiuojama, kad apibendrina šiuos P
verčių per vartotojo nustatytą genų rinkinį; santrauka statistika vidutinis log (P
) už LS santrauką, kaip P
reikšmės skiriasi nuo vienodo paskirstymo LS [12]. Santrauka statistika yra susijusi su statistikos suvestinė atsitiktinių imčių N
genų, atrinktų iš tų, atstovaujama masyvo platinimo. Čia N
yra genų vartotojo apibrėžta genų skaičių rinkinyje. 100.000 Atsitiktinės genų rinkiniai buvo imami apskaičiuoti šį paskirstymą. LS P
vertė yra atsitiktinių rinkinių N
genų su mažesniais vidutiniais suvestinių statistinių duomenų, nei LS santraukos apskaičiuotas realių duomenų dalis.
BRB-ArrayTools apskaičiuotus LS P
vertes turtinimo 4 genų rinkiniai mūsų skrandžio vėžys transcriptome pasirašymo identifikuoti kiekvieno audinių apdorojimo metodą taip. Pirma, siekiant palyginti 2,324 genus, susijusius su kopijų skaičiaus padidėjimas mūsų skrandžio vėžys transcriptome pasirašymo nustatytai microdissection, LS statistika 2,324 sustiprina genų buvo įvertintas apskaičiuojant vidutinį neigiamą natūraliojo logaritmo P
vertybių vieno geno Vienmatės testai diferencinė ekspresija kiekvienas 2,324 genų tarp 20 microdissected skrandžio vėžio mėginiai ir 6 normalių pavyzdžių. Tada BRB-ArrayTools apskaičiavo atsitiktinių rinkinių 2,324 genų su mažesniais vidutiniais suvestinių statistinių duomenų, nei LS santraukos skaičiuojamą realius duomenis (Lt P
vertė) dalį. Skrandžio vėžys transcriptome parašas atpažinti pagal microdissection taip pat buvo lyginamas su 677 genų, susijusių su kopijų skaičiaus kritimas, 58 baltymai Pranešama, kad ekspresija skrandžio vėžio ir 66 baltymai Pranešama, kad underexpressed skrandžio vėžys, su atitinkamomis LS P
vertybes. LS P
vertė mažesnė nei 0,01 buvo laikomas reikšmingu. Tie patys tyrimai buvo pakartoti skrandžio vėžys transcriptome pasirašymo nustatytai macrodissection metodu.
Imunohistocheminis
TFF1 imunohistocheminis buvo atliekama naudojant chirurgines ar endoskopinę biopsiją audinio mėginiai iš 16 skrandžio vėžiu sergančių pacientų (16 vėžio ir 2 gretimuose normaliuose audiniuose mėginių), ir 4 sveikiems savanoriams, kurie nebuvo įtraukti į šią DNR mikrogardeliq tyrimas. Šiurkščiai normalus skrandžio gleivinės audinio mėginiai buvo imami iš skrandžio antralinėje dalyje sveikų savanorių, naudojant slaptąją biopsijos technika, informuoto sutikimo [9]. Parafino įterptųjų formalino fiksuoto audinio skaidres (4 mkm storio) buvo tamsintas su 13734-1-AP (ProteinTech grupės, Čikaga, IL), esant 1:50 60 min kambario temperatūroje ir Įsivaizduoti kovos su triušio krienų peroksidazės (K4003, DAKO , Carpinteria, CA) 30 min kambario temperatūroje. Reakcija buvo ryškinamos naudojant diaminobenzidinas (K3468, DAKO) ir counterstained hematoksilinu. TFF1 išraiška buvo vertinama pusiau kiekybiškai ne 200x pervežimas priartinimas, remiantis procentais teigiamai tamsintas ląstelių ( "-" = imunodažymu per ≤ 10% ląstelių; "+" = 11-50%; "++" = 51- 75%; "+++" = 76-100%) [13, 14]. Imunodažymu be pirminio antikūno ir normalus skrandžio epitelio kontrolinio audinio microarray tarnavo kaip Teigiamų ir neigiamų kontrolių, atitinkamai [15]. Citoplazmos dėmių, kurios buvo vienareikšmiškai giliau nei fonas buvo laikomas teigiamu.
Rezultatai
nustatymas pasaulio genų ekspresijos parašų iš macrodissected ir LCM mėginių
1 lentelė apibrėžia Klinikos-patologinis charakteristikos pacientams ir savanoriams įtraukti į šį Mikrogardelė tyrimas. Mikrogardeliq duomenys buvo gauti tiek LCM ir macrodissected mėginių iš tų pačių 20 biopsijų (1A pav.) Nors priimtinos kokybės, mikrogardeliq duomenys LCM pavyzdžių apskritai buvo mažesnės "Šis kvietimas", nei macrodissected mėginių (duomenys nerodomas
). Pagrindinis komponentas analizė pasaulio genų išraiškos būdus, gautų iš mikro ir makro-išpjaustytų skrandžio vėžio, ir įprastą mėginių parodė aiškų atskyrimą kiekvieno mėginio grupės (1b pav.) Mediana Pearsono koreliacija tarp dviejų perdirbimo metodų buvo 0,75 (interkvartilinis asortimentas, 0,71-0,81) .table 1 Klinikos-patologinis charakteristikos pacientams ir savanoriams įtraukta mikrogardeliq analizės

pacientai (n = 20)
Savanoriai (n = 6)
Pradinė Klinikos-patologinis charakteristikos

amžiumi metų
mediana
59
52
interkvartiliniais asortimentas
54-69
43-61
Lytis - ne. (%)
Vyras
16 (80%)
3 (50%)
Moteris
4 (20%)
3 (50%)
būklės (PS ) - ne. (%)
ECOG1 PS 0 arba 1
20 (100%)
histologinis tipas - ne. (%)
Lauren anketa žarnyno
6 (30%)
Lauren anketa Difuzinė
14 (70%)
Miestas pirminės pažeidimo - ne. (%)
Aukštutinė 1/3
4 (20%)
Vidurio 1/3
6 (30%)
Apatinis 1/3
10 (50%)
Tolima metastazės - ne. (%)
20 (100%)
apdorojimas ir rezultato
chemoterapijos - ne. (%)
Cisplatinos /fluorouracilu
20 (100%)
Bendras išgyvenamumas -. Mėnesį
mediana
8,0
interkvartiliniais asortimentą
5.6-14.7
laikas iki ligos progresavimo -. mėnesį
mediana
3,5
interkvartiliniais asortimentas
2,3-6,2
1Eastern kooperatinės onkologijos grupės
1 pav (A), studija schema mėginio paėmimo ir mikrogardeliq apdorojimo (B) pagrindinis komponentas analizė genų ekspresijos profilius mikro ir makro-išpjaustytų navikų mėginiuose iš 20 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams ir 6 normalių pavyzdžių iš sveikų savanorių.
Stalai 2 ir 3 Rodyti genai aktyvuojami ir mikro ir makro-išpjaustytų skrandžio vėžio mėginiuose funkcija atrankos P
< 10 -6. Ląstelių morfologija
(AIF1, E2F1, E2F3, KIR2DL1, KIRREL, NPR1, RUNX2 TRIO
) buvo labiausiai praturtino funkcionalus kategorija 42 genų ekspresija per microdissected mėginių, palyginti su įprastų bandinių (funkcija pasirinkimas p
< 10 -6), kaip nustatė išradingumo kelią analizė (IPA) (2 lentelė). Naviko morfologija
(APOE, BIRC5, CD14, COL1A1, COL1A2, CYR61, FKBP1A, IL8, MCAM, daugiašalio tarpbankinio atsiskaitymo mokesčių, RHOB
) buvo labiausiai praturtintas funkcionalus kategorijoje tarp 73 genų ekspresija per macrodissected mėginių (funkcija atranka P
< 10 -6) pagal IPA (3 lentelė). Tarpląsteliniame genai, pavyzdžiui, COL6A2, COL1A1, COL1A2
ir COL5A2
, buvo ryškus macrodissected pavyzdžių ir turbūt prisidėjo stromos ląstelėse. 4 lentelė rodo genus underexpressed į mikro ir makro-išpjaustytų skrandžio vėžio pavyzdžius funkcija atrankos P
< 10 -6.Table 2 Genai ekspresija į microdissected skrandžio vėžiu funkcija atrankos P
< 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

BMP3
38.52
HIST1H4C
6.3
BGN
30.3
LEPRE1
5.9
TRIO
18.5
ETNK2
5.6
GADD45GIP1
17.2
TRIP6
5.3
MIER2
16.7
FAM125B
5.3
KIFC3
16.4
NPR1
5.3
217318_x_at
13.7
DSCC1
5.3
217219_at
13.2
CLUL1
5.0
RUNX2
12.5
HMGB3
4.5
SMARCD1
12.0
E2F3
4.3
KIRREL
12.0
AIMP2
4.2
215621_s_at
12.0
ATAD5
4.0
GRM2
10.0
E2F1
3.8
FJX1
10.0
FKSG49
3.7
AIF1
10.0
DVL2
3.7
THY1
9.1
TIPRL
2.9
CARD10
9.1
EIF2C3
2.9
SIM2
9.1
NAT10
2.8
AIF1
9.1
MED27
2.7
APOBEC3G
8.3
PIN4
2.7
RHAG
8.3
CTPS
2.6
1fold kaita, apibrėžta išraiškos santykis vėžio normalus (= vėžio /normalus)
2All šie genai buvo klaidinga atradimas norma < 0,001
3 lentelė Genai ekspresija į macrodissected skrandžio vėžiu funkcija atrankos P
. < 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

LY6E
24.42
SRM
6.7
IL8
22.7
NGLY1
6.7
CA12
20.0
RHOB
6.3
SBNO2
19.2
ACTN1
5.9
UBE2S
17.2
LOXL2
5.9
CYR61
17.2
COL5A2
5.9
ANGPT2
15.9
TRIM28
5.6
COL6A2
14.3
218982_s_at
5.6
BOP1
13.2
C7orf44
5.3
COL1A1
13.2
UBE2C
5.3
LPL
13.0
CEP76
5.3
MFGE8
12.8
BIRC5
5.3
APOE
12.2
PNO1
5.0
G6PC3
10.9
FSTL1
5.0
215900_at
10.3
GRINA
4.8
NUP62
10.0
MRTO4
4.8
MRPL4
10.0
STC1
4.8
GNL3L
10.0
MRPL12
4.5
MCAM
9.1
FKBP1A
4.5
PDLIM7
9.1
IFI30
4.5
216472_at
9.1
KPNA6
4.3
ACTN1
9.1
216532_x_at
4.3
BYSL
9.1
CENPI
4.2
GNAI2
8.3
PPM1G
4.2
NCAPH2
8.3
ICT1
3.7
CD14
8.3
SFRS14
3.6
EXOSC4
8.3
CTPS
3.6
OBFC2B
8.3
IMP4
3.3
PPP1R15A
7.7
UBE2G2
3.2
COL1A2
7.7
ISG20L2
3.2
GPX1
7.7
EIF4A1
3.1
MIF
7.7
HDGF
2.6
NME1
7.1
PSMD14 2.6
PPIL2
7.1
220856_x_at
2.4
CCDC85B
7.1
CNOT3
2.4
SPARC
6.7
GLT25D1
2.0
C8orf55
6.7
1fold kaita, apibrėžta išraiškos santykis vėžio normalus (= vėžys /normalus)
2All šie genai buvo klaidinga atradimas norma. ≪ 0,001
4 lentelė Genai underexpressed į mikro ir makro lygio išpjaustytų skrandžio vėžį funkcija atranka P
< 10-6
Microdissected

Macrodissected

Gene

FC1

Gene

FC

HPGD
-25.02
208498_s_at
-11.1
HRASLS2
-20.0
SIDT2
-7.7
ABCC3
-20.0
MUC5AC
-5.9
SLC25A37
-16.7
CTAGE5
-5.0
ABHD2
-14.3
GNA11
-3.8
VIPR1
-10.0
ARFIP1
-3.4
CYTIP
-9.1
214316_x_at
-3.3
GALNT6
-9.1
222149_x_at
-3.3
SULT1A2
-9.1
OAS1
-8,3
PDCD4
-7,1
NR3C2
-7,1
DOCK6
-6,3
SULT1A1
-5,9
ZFYVE26 UAB - 5,9
213212_x_at
-5,6
DSCR3
-5,3
TMEM131
-5,3
ECHDC2
-5,0
DENND1B
-5,0
KIAA0141
-4,8
RNF103
-4,8
PDCD4
-4,5
CABIN1
-4,5
222371_at
-4,3
RRBP1
-4,0
CC2D1A
-3,8
216438_s_at
-3,8
SGSM3
-3,8
ARPC2
-3,7
TRAK1
-3,6
GNA11
-3,6
PAFAH1B1
-3,4
CNDP2
-3,2
SPOP
-3,1
PARP4
-3,1
ERLIN1
-2,9
1fold pakeisti, apibrėžia išraiškos santykis normalus neigiamas vėžio (= - (normalus /vėžio))
2All šie genai buvo klaidinga atradimas norma < 0,001
palyginimas tarp žodžio ir masyvo CGH duomenis.
masyvas CGH analizė atlikta naudojant genomo išskirtą DNR iš macrodissected pavyzdžių kurių sudėtyje yra > 50% naviko ląstelių (naudojamas ankstesnių tyrimų kriterijus [16, 17]), nes pakanka DNR gali būti gauta be visą genomą amplifikacijos poreikį, kaip reikalaujama microdissected mėginių. Visa genomo DNR amplifikacija potencialiai gali pristatyti artefakto šališkumo masyvo CGH rezultatus [18]. Pavaizduota 2 paveiksle yra DNR kopijų skaičiaus aberaciją dažnis tarp visų su 20 bandinių. Mūsų kopijų skaičiaus aberacijos duomenys paprastai atitiko anksčiau pateiktų duomenų [7, 16, 17, 19-23]. Keturi iš 20 pacientų stiprinimas iš chr8 q24.13-q24.21 (126357475-128822596), kurioje pateikiamas Myc
onkogeno. Antra labiausiai paplitusi amplifikacija lokusas buvo CHR17 q21.2 (36.109.939-36.230.163), kuris buvo papildytas 3 pacientams. Septyni pacientai turėjo neaptinkama chromosomų aberacijas. Šie 7 mėginiai buvo numatyta 70% vėžinių ląstelių medianą, o kitos 13 pacientų mediana 60% vėžinių ląstelių (p
vertė = 0,1). Taigi, aptikti chromosomų aberacijų 7 pavyzdžių trūkumas buvo ne dėl mažesnę procentinę naviko ląstelių tose mėginių. 2 pav grafinį vaizdą iliustruojantis proc dažnį zondai aptiktas (aberacijos) tarp visų 20 mėginių.
Nebuvo 2,324 unikalių genų, kurie buvo susiję su kopijų skaičiaus padidėjimas bent vieną iš 20 pacientų, ir 677 genai, susiję su kopijų skaičiaus praradimas. Naudojant genų rinkinio palyginimą analizes, lyginome šiuos genų rinkinius su mūsų transcriptome parašų, kuriuos nustatė įvairios pavyzdys izoliavimo metodai. Mes iškėlė hipotezę, kad dysregulated genus, susijusius su kopija skaičius aberacijos yra labiau linkę dalyvauti kaip prisidedančių prie onkogenezėje, o ne tiesiog "pašalinius asmenis". Taigi, 2,324 genai esančias per regionuose kopijų skaičiaus prieaugis buvo analizuojami atsižvelgiant į jų išraiškos masyvo duomenų, gautų naudojant macrodissection metodą (funkcija atranka P
< 0,05). Sutampa tarp genų regionuose stiprinimas ir turtinimo jų raiškos sąrašą mėginiuose, kurie buvo macrodissected buvo statistiškai reikšmingas (Lt P
vertė = 10 -5, žr metodai statistinės aprašymą). Tačiau ši asociacija nebuvo pastebėta, kai išraiška duomenys buvo analizuojami microdissected mėginių (funkcija atranka P
< 0,05; LS P
vertė = 0,41) (3a pav.) Taigi, ten buvo stipresnis ryšys tarp egzemplioriaus numeris padidėjimas ir genų ekspresijos modelio tik mėginiuose, kurie buvo macrodissected. Pavyzdžiui, MYC
, dažniausiai amplifikuotas genas mūsų pacientų mėginiams, buvo nustatyta, kad tai gerokai aktyvuojami macrodissected mėginiuose, tačiau ne tie, kurie buvo microdissected, nors šis rezultatas gali būti dėl santykinai mažos imties arba heterogeniškumo per navikas. 3 pav skaičius genų persidengiančių tarp LCM ir macrodissected išraiška masyvo duomenų rinkinių ir matrica CGH duomenimis, gautais iš tos pačios rūšies 20 pacientų.
A 677 genų buvo nustatytas regionuose, sąrašas, kur DNR kopijų skaičiaus sumažėjimo, kurios yra bent vienas iš 20 tyrime dalyvavusių pacientų. Šių genų ekspresija buvo analizuojama makro ir mikro-išpjaustytų masyvo duomenų rinkinių. Nemaža asociacija buvo nustatyta tarp genų, kurių praradimas kopijų skaičiaus ir jų raiškos abiejų makro ir mikro-išpjaustytų mėginiais. (LS P
vertės, 0,009 ir 0.006 už LCM ir macrodissected pavyzdžių, atitinkamai) (3b pav.)
Atitiktis genų parašų su genais buvo pranešta anksčiau, turi būti susijęs su skrandžio vėžiu
PubMed literatūra paieška buvo atlikta nustatyti anksčiau pranešė, perkarbamilinto ir nepilnai išreikštas genus ir baltymų skrandžio vėžio (raktinių žodžių: imunohistocheminiu, skrandžio vėžio, ir ekspresija ir arba jo praradimo išraiška). 58 baltymai aktyvuojami skrandžio vėžio buvo nustatyti tokiu būdu. buvo rasta genų ekspresijos šių 58 baltymais praturtintas išraiška duomenimis iki macrodissection surinktų mėginių (Lt P
< 10 -5), bet ne į laisvę iš 58 genų pagerinimas buvo už kuriuos surinktų mėginių rasti microdissection (Lt P
= 0,013). Priešingai, 66 baltymai Pranešama, kad underexpressed skrandžio vėžio buvo prisodrintas raiškos masyvo duomenimis iki microdissection surinktų mėginių (Lt P
< 10 -5), bet ne nuo iki macrodissection surinktų mėginių (LS, p
= 0,89) (5 lentelė) .table 5 skrandžio vėžio genų literatūroje, kurios buvo skirtingai išreikštos tarp 20 vėžiui ir 6 normaliomis pavyzdžius funkcija atrankos P
< 0,05 pagal microarray duomenų generuojami naudojant kiekvieną audinių apdorojimo metodą
ekspresija genų vėžio
Underexpressed genų cancer

LCM&Macro1

LCM

Macro

LCM&Macro

LCM2

Macro

APOE
EGFR
AKT1
ANXA10
ANXA7
CDKN2B
AURKA
HGF
ANXA2
CASP6
BAD
FHIT
CCNE1
MET
CALR
CASP7
HLA-B
CDC20
RHOA
CCNB1
CDH1
ŽLA-El
CDC25B
TNS4
EEF2
CTNNA1
ŽLA-G
CXCR4
ESM1
GSN
PRSS8
E2F1
HIF1A
ŽLA-F
PTEN
EGR1
MINA
IQGAP2
SDHB
Grb2
PHB
KCNE2
SH3GLB1
HK2
KLF4
TFF1
ICAM1
MUC6
INHBA
RaRb
LOXL2
SMAD4
MCM3
PTMA
SPARC
1Previously pranešė ekspresija baltymus skrandžio vėžiu, kuris taip pat buvo ekspresija mūsų microdissected (LCM) ir macrodissected vėžio mėginių, palyginti su normaliomis mėginių
2Previoulsy pranešta underexpressed baltymus skrandžio vėžiu, kuris taip pat buvo underexpressed mūsų microdissected (LCM) vėžio mėginiai, bet ne macrodissected vėžio mėginių
įteisinant mikrogardeliq duomenų
siekiant patvirtinti mūsų microarray duomenis, mes atliekame imunohistocheminis analizę genų nustatyti kaip underexpressed į microdissected vėžio mėginiai iš 16 pacientų ir 4 savanoriai, kurie nėra įtraukti į DNR mikrogardeliq tyrimo. TFF1
buvo pasirinkta šiam imunohistocheminis tinkamumo patvirtinimo tyrimą, nes ji yra žymiai underexpressed į LCM mėginių (p
= 0,0036), bet ne macrodissected mėginių (P
= 0,09), lyginant su normaliu skrandžio gleivinę. TFF1 reaktyvumas į vėžio buvo įvertintas kaip -, +, ++, ir +++ 7 (43,8%), 3 (18,7%), 4 (25,0%), ir 2 (12,5%), atitinkamai. Priešingai, visi 6 normaliomis skrandžio gleivinės mėginiai (4 sveikų savanorių ir 2 normalios gretimų audinių mėginiai) konservuoti TFF1 reaktyvumas (+++) (4 pav.) Taigi, skrandžio vėžio mėginiai buvo žymiai mažesnis TFF1 reaktyvumas nei normalus skrandžio gleivinę, nuosekliai su ankstesnėmis ataskaitomis [13, 14] (P
už chi kvadrato = 0,007). 4 pav atstovas TFF1 imunohistocheminį dažymo rezultatai (A), skrandžio adenokarcinoma parodant TFF1 išraiška, ir (B) normalus skrandžio gleivinę nuo sveikos savanorio išreiškiant TFF1 skrandžio epitelinių ląstelių nykimą. (Didinimas = 200x)
Šie rezultatai rodo, kad macrodissection pagrindu genų ekspresijos analizė aplenkė genų ekspresiją analizuoja iš LCM mėginių nustatant genus ekspresija skrandžio vėžio.

Other Languages