Las distinciones en gástricas firmas de expresión génica del cáncer derivados de captura por láser microdisección macrodissection versushistologic

Las distinciones en gástricas firmas de expresión génica del cáncer derivados de láser de microdisección de captura contra
histológico macrodissection
Resumen Antecedentes

muestras de cáncer gástrico obtenidos por macrodissection histológico contienen un contenido relativamente alto del estroma que pueden influir significativamente en los perfiles de expresión génica. Se evaluaron las diferencias entre la expresión genética derivada de macrodissected muestras de cáncer gástrico y de la firma obtenida a partir de células epiteliales de cáncer gástrico aisladas de las mismas biopsias utilizando láser captura microdissection (LCM) por sus potenciales sesgos experimentales.
Métodos
ARN fue aislado de muestras de tejido congeladas de biopsias de cáncer gástrico de 20 pacientes que utilizan ambas técnicas histológicas macrodissection y LCM. ARN de LCM fue objeto de una nueva ronda de amplificación de ARN de T7. De perfiles de expresión se realizó con Affymetrix arrays HG-U133A. Los genes identificados en las firmas de expresión de cada método de procesado de tejido se compararon con el conjunto de genes contenidos dentro de regiones cromosómicas encontró que el puerto de copia aberraciones numéricas en las muestras tumorales de matriz CGH y a las proteínas previamente identificadas como se sobreexpresa en el cáncer gástrico.
también se encontraron resultados
Los genes que han demostrado tener mayor número de copias en el cáncer gástrico que se sobreexpresa en las muestras obtenidas por macrodissection (LS P
valor < 10 -5), pero no en la serie de datos generados usando microdisección . Un conjunto de 58 genes identificados previamente sobreexpresa en el cáncer gástrico también se enriqueció en la firma de genes identificados por macrodissection (LS P
< 10 -5), pero no en la firma identificado por microdisección (LS P
= 0,013). En contraste, 66 genes se informó anteriormente para ser underexpressed en el cáncer gástrico fueron enriquecidos en la firma de genes identificados por microdisección (LS P
< 10 -5), pero no en la firma identificado por macrodissection (LS P
= 0,89). Conclusiones
comentario El tumor técnica de muestreo sesga los resultados de microarrays. LCM puede ser un método de recogida y tratamiento más sensible para la identificación de potenciales candidatos gen supresor tumoral en el cáncer gástrico utilizando perfiles de expresión.
Antecedentes
Un objetivo importante de análisis de microarrays es la identificación de genes expresados ​​diferencialmente en subconjuntos de clínica muestras para que coincida con terapias específicas a los subtipos de tumores. Sin embargo, análisis cuantitativo de expresión gama de muestras de cáncer clínicos con alto contenido estromal es difícil, puesto que la proporción de células tumorales epiteliales de células del estroma pueden variar en gran medida. La contaminación de estroma puede confundir expresión basado en microarrays y copiar analiza número. de captura láser microdissection (LCM) es una técnica valiosa que permite a uno para aislar las células epiteliales a partir de células estromales, enriqueciendo así para el contenido epitelial. La cantidad de muestra y el ARN obtenido por LCM es a menudo muy limitada, sin embargo, y requiere una etapa de amplificación para generar material suficiente para análisis de microarrays. Este proceso de amplificación puede sesgar los resultados y dar lugar a un conjunto sesgada de los genes expresados ​​diferencialmente [1]. macrodissection histológico (muestras recogidas de las secciones de tejido guiadas por análisis microscópico de una sección de serie manchado) proporciona una mayor cantidad de material de muestra en comparación con LCM que puede obviar la necesidad de una ronda adicional de amplificación del ARN. Sin embargo, las muestras macrodissected contienen significativamente más contenido de células del estroma que las muestras obtenidas por microdisección.
Estudios previos han comparado estos dos métodos de procesamiento de tejido para muestras clínicas de cáncer. Con base en datos de 14 muestras de adenocarcinoma de recto, Bruin et al
. favorecido macrodissection sobre microdisección debido a la relativamente baja contribución de los componentes del estroma en muestras macrodissected de este tipo de tumor y la expresión parcial de genes resultados de las muestras microdissected debido a la amplificación del RNA se requiere para esta [2] muestras. Por otro lado, Klee et al
. sugirió que los perfiles de microdisección la identificación exclusiva de un gran número de genes expresados ​​diferencialmente que no se encuentran de otro modo mediante un muestreo de tejido grueso, basado en datos de 10 adenocarcinomas de pulmón y 6 muestras normales adyacentes [3]. Estos estudios fueron limitados por el pequeño tamaño de la muestra, y, por lo tanto, requieren una validación adicional. Tampoco está claro si los genes identificados utilizando únicamente las microdisecciones representan biomarcadores útiles. Bias resultante de la amplificación del ARN debe equilibrarse con el beneficio de enriquecer las muestras para el contenido epitelial en considerar si la microdisección es ventajoso para perfiles de expresión de los tumores con un alto contenido del estroma, tales como adenocarcinomas gástricos o pancreáticos.
Microdisección es particularmente útil para enriquecer gástrico células tumorales de cáncer obtenidas a partir de muestras de biopsia endoscópica, especialmente de cáncer gástrico de tipo difuso que se compone de células tumorales dispersas mezcladas con células inflamatorias y fibrosis. La disminución de la incidencia global del carcinoma gástrico en EE.UU. durante este siglo parece ser atribuible en gran medida a una disminución de las lesiones de tipo intestinal, mientras que la ocurrencia de tipo difuso se cree que han mantenido la misma [4]. A partir de muestras obtenidas por LCM, Wu et al
. informó de que maligno frente a las células epiteliales gástricas benignas podían distinguirse con una precisión de 99% en base a un predictor 504 genes [5]. Este predictor incluye genes conocidos expresados ​​en el epitelio gástrico incluyendo Trefoil factores 1, 2, y 3 [5]. El uso de LCM, Jinawath et al
. identificado 46 genes que pueden representar firmas moleculares distintos para los dos tipos histológicos de cáncer gástrico - difusa de tipo y el cáncer gástrico de tipo intestinal [6]. Sin embargo, ningún estudio ha sido realizado hasta la fecha se comparó directamente los macrodissection vs
. métodos LCM utilizando el mismo conjunto de muestras de cáncer gástrico.
En este estudio, se han tratado de evaluar las diferencias entre los perfiles de expresión derivados de los mismos tumores que fueron procesadas por tanto macrodissection y LCM para el análisis de microarrays. Dada la dificultad en la validación de todos los genes expresados ​​diferencialmente identificados con cada tipo de recogida de muestras, se compararon los genes identificados a través de nuestro análisis de microarrays con proteínas conocidas que se sobreexpresa en el cáncer gástrico. Además, se determinó si la expresión de los genes identificados en cada firma correlacionado con alteraciones en el número de copias de genes que fueron identificados por matriz de hibridación genómica comparada (CGH) de los mismos tumores. Los estudios previos de cáncer gástrico han demostrado una alta correlación entre la matriz de expresión serie de datos CGH y [7]. cambios de número de copias de ADN se evaluaron utilizando tumor macrodissected con el fin de evitar el sesgo de la amplificación de todo el genoma. Nos determinó además si las firmas de genes que obtuvimos de cada método de recolección y procesamiento de las muestras fueron enriquecidas para las proteínas que han sido previamente informado que están alteradas genes en el cáncer gástrico. Nuestros resultados indican que el método LCM es más sensible para la identificación de genes que están underexpressed en el cáncer, en comparación con el tejido normal (potenciales supresores de tumor), mientras que macrodissection identifica más genes que se sobreexpresan en el cáncer. Por lo tanto, macrodissection y microdisección LCM parecen útiles para el estudio de diferentes aspectos de la biología del cáncer.
Métodos Pacientes

Veinte pacientes que fueron analizados en este estudio es una parte de 96 pacientes que participaron en un estudio prospectivo y cuyas muestras se utilizaron como un conjunto de entrenamiento expresión para desarrollar un predictor quimio-respuesta [8]. Parte de expresión y de datos de la matriz CGH de sus muestras macrodissected se informó anteriormente [8, 9]. La recogida de muestras, el tratamiento y el seguimiento se realizaron según un protocolo aprobado por el Comité de Revisión Institucional (IRB) del Hospital Nacional del Centro del Cáncer en Goyang, Corea (NCCNHS01-003). Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado aprobado por el IRB. La elegibilidad para la inscripción en el estudio incluyó los siguientes parámetros: 1) edad ≥ 18 años; 2) histológicamente confirmados adenocarcinoma gástrico; 3) clínicamente documentado metástasis a distancia; 4) no hay enfermedades malignas previas o concomitantes que no sean el cáncer gástrico; 5) sin historial previo de quimioterapia, ya sea adyuvante o paliativo; y 6) la función adecuada de todos los órganos importantes. Los pacientes recibieron cisplatino 60 mg /m 2 IV el día 1 y fluorouracilo 1000 mg /m 2 IV en los días 1-5 de un horario de 3 semanas.
Procesamiento de tejidos
Antes macrodissection, tumor muestras tenían núcleos tumorales mediana de 50% (rango intercuartílico, 30-60%). Macrodissection se realizó como se describe anteriormente [10]. Macrodissection conducir a una media del 60% de los núcleos tumorales en la parte superior deslizante (rango intercuartil, 60 a 72,5%). Para la microdisección, tumor y criosecciones normales muestra de tejido se cortaron a 10 micras, y se almacenó congelado a -80 ° C. Los portaobjetos se deshidrataron utilizando HistoGene libre de nucleasa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) los reactivos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Microdisección se realizó utilizando PixCell II (Arcturus Bioscience, Mountain View, CA). La deshidratación y la LCM se limitó a 15 min o menos para cada muestra recogida. Un total de 10.000 disparos de láser (tamaño de punto de 15 micras de diámetro) se recogieron usando CaPSURE Caps LCM Macro para cada muestra. RNA fue aislado utilizando PicoPure Kit Aislamiento de ARN (Molecular Devices). Brevemente, las células epiteliales se incubaron con 50 l de tampón de extracción en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml a 42 ° C durante 30 min. ADNasa (QIAGEN, Valencia, CA) de tratamiento se realizó directamente dentro de la columna de purificación, y el ARN se aisló utilizando el volumen de elución de 8 l (Molecular Devices). Cinco l de ARN a partir de poblaciones de células microdissected se convirtió en biotinilado, objetivo antisentido cRNA, usando el de dos ciclos método de etiquetado Affymetrix (Santa Clara, CA). Todos los objetivos biotinilados fueron fragmentados y se hibridó 15μ
g de cada uno para microarrays GeneChip HG-U133A siguiendo el protocolo del fabricante. conjunto de imágenes escaneadas fueron revisados ​​y convertidos en señal de datos utilizando el algoritmo de Affymetrix MAS 5.0.
array CGH
ADN genómico fue extraído de muestras utilizando el reactivo TRI (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con el protocolo del fabricante, y, además, se purificó usando el Kit QIAamp DNA Micro (QIAGEN). Por CGH array experimentos, se utilizaron Agilent 4x44k HD-CGH microarrays que contienen 44.000 características (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). 0,5-1 g de muestras de ADN genómico de tumores y la misma cantidad de ADN genómico humano a partir de múltiples donantes femeninos anónimos (Promega, Madison, WI) fueron digeridos con AluI (50 unidades) y RsaI (50 unidades) durante 2 horas a 37 ° C . 5 l de Random Primer se mezclaron con la plantilla de ADN digerido. La referencia y la muestra de ADN se marcaron utilizando de Agilent Labeling Kit PLUS, que incluye tampón 5x, 10x dNTP, Cy-3/5 dUTP (1,0 mM), y Exo-Klenow Fragment. La mezcla de sondas de Cy3 etiquetados ADN de la muestra, Cy5 etiquetados ADN de referencia (39 l), 5 l de ADN Cot-1 humano (Invitrogen), 11 l de Agilent 10 × agente de bloqueo y 50 l de Agilent 2 x tampón de hibridación se desnaturalizó a 95 ° C durante 3 min y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. La sonda se aplicó a la matriz mediante una cámara de hibridación de microarrays Agilent, y se hibridó durante 21 horas a 65 ° C en un horno que gira a 20 rpm. Las matrices fueron lavados de conformidad con las recomendaciones del fabricante, sumergido en la estabilización de Agilent y la solución de secado, y digitalizadas mediante un escáner de microarrays de ADN 2565AA Agilent. Programa de Control de la exploración de programa de la Agilent 7.0 Extracción y Programa de software 9.5.1 Característica de Agilent fueron utilizados para el procesamiento de datos. CGH array de datos fueron analizados utilizando el software CGH Analytics de Agilent (versión 3.5.14). ADM-2 algoritmo con umbral 6, con cero difusa y centralización en, se utilizó para identificar aberración. Criterios para el filtrado de la aberración eran sondas mínimas de 5, mínimo absoluto medio de registro 2 ratio de 0,5, y aberraciones máximo de 1.000.000. Aberraciones identificadas para cada muestra se enumeran y se muestra gráficamente.
Genes del cáncer gástrico en la literatura
Para generar un conjunto de genes definidos por el usuario para el análisis de nuestra comparación de genes, se realizaron búsquedas en la base de datos PubMed de los genes con proteínas de células específicas de cáncer gástrico expresión, palabras clave de "cáncer gástrico", "inmunohistoquímica" y "sobreexpresado" o "pérdida de la expresión" utilizando. Para los análisis de nuestra comparación conjunto de genes, se mapearon los símbolos de genes de genes específicos de cáncer gástrico para sondear ID de conjuntos de la matriz de HG-U133A (http:.. //Www NetAffx com). Hubo 178 ( "sobreexpresado") y 327 ( "pérdida de expresión") artículos en el Pubmed en el momento de la escritura. El análisis estadístico
de expresión serie de datos
datos de microarrays de expresión génica Affymetrix HG-U133A se analizaron con conjunto de genes algoritmos de análisis de comparación de ArrayTools BRB (versión 3.8, del Instituto Nacional del cáncer, http:.... //Linus NCI NIH gov /BRB-ArrayTools html) [11]. La herramienta de comparación de conjunto de genes análisis de conjuntos de genes definidos por el usuario para la expresión diferencial entre las clases predefinidas (es decir
., Cáncer vs
. Normal) de un conjunto de datos de origen. conjuntos de genes definidos por el usuario utilizadas en este estudio incluyen U133A sonda fija que corresponde a los genes con el cambio de número de copias y que corresponde a los genes de cáncer gástrico en la literatura. Los genes cuyo tumor /log-normal 2 ratio es superior a 0,5 en al menos una de las 20 muestras de pacientes fueron incluidos en la lista de genes con el aumento de número de copias. Del mismo modo, los genes con la pérdida del número de copias (log 2 ratio < -0,5) fueron enumerados. Estos conjuntos de genes definidos por el usuario se analizaron para determinar la expresión diferencial entre las 20 muestras de cáncer y 6 muestras normales (es decir,
., 3 macrodissected y 3 de las microdisecciones).
Para cada conjunto de datos fuente, un P-valor es
calculado para cada gen para correlacionar el nivel de expresión para la expresión diferencial entre las clases predefinidas, generando una lista de genes clasificados de un proyecto BRB-ArrayTools dado. Para un conjunto de N
genes, el de mínimos cuadrados (LS) estadística se define como el logaritmo natural negativo media de los P-valores
de las pruebas univariadas solo gen adecuadas [12]. Un resumen estadístico se calcula que resume estos valores P
sobre el conjunto de genes definidos por el usuario; la estadística de resumen es promedio diario (P
) para el resumen de cómo el LS P
valores difieren de una distribución uniforme de LS [12]. La estadística de resumen está relacionada con la distribución de los estadísticos de resumen para muestras aleatorias de N
genes, incluidos en la muestra a partir de los representados en la matriz. Aquí
N es el número de genes en el conjunto de genes definidos por el usuario. 100.000 conjuntos de genes al azar se tomaron muestras para calcular esta distribución. El Sitio valor LS P es la proporción de juegos al azar de N
genes con un resumen estadístico promedio más pequeño que el LS resúmenes calculados para los datos reales.
BRB-ArrayTools valores estimados LS P Opiniones sobre enriquecimiento de los 4 conjuntos de genes en nuestra firma gástrica transcriptoma del cáncer identificados por cada método de procesado de tejido de la siguiente manera. En primer lugar, con el fin de comparar los 2.324 genes asociados con el aumento de número de copias con nuestra firma gástrica transcriptoma del cáncer identificados por la microdisección, la estadística de LS de 2.324 genes amplificados se estimó mediante el cálculo de un logaritmo natural negativo media de los valores P
de la pruebas univariadas un solo gen para la expresión diferencial de cada uno de los 2.324 genes entre 20 microdissected muestras de cáncer gástrico y 6 muestras normales. Entonces BRB-ArrayTools calculan la proporción de juegos al azar de 2.324 genes con un resumen estadístico promedio más pequeño que el LS resúmenes calculados para los datos reales (LS P
valor). La firma transcriptoma cáncer gástrico identificada por la microdisección también se comparó con 677 genes asociados con la pérdida del número de copias, 58 proteínas reportados que se sobreexpresa en el cáncer gástrico, y 66 proteínas reportados para ser underexpressed en el cáncer gástrico, con respectivo LS P
valores. LS P
valor inferior a 0,01 fue considerado significativo. Los mismos análisis se repitieron para gástrico firma transcriptoma cáncer identificado por el método macrodissection.
Inmunohistoquímica
inmunohistoquímica TFF1 se realizó utilizando muestras de tejido de biopsia quirúrgica o endoscópica de 16 pacientes con cáncer gástrico (16 cáncer y 2 muestras de tejidos normales adyacentes), y 4 voluntarios sanos, que no fueron incluidos en este estudio de microarrays de ADN. muestras evidentemente normal del tejido de la mucosa gástrica se recogieron del antro gástrico de voluntarios sanos utilizando una técnica de biopsia ciega, con el consentimiento informado [9]. diapositivas de tejido fijado en formol e incluidos en parafina (4 m de espesor) fueron teñidas con AP-13734-1 (Grupo Proteintech, Chicago, IL) a las 1:50 durante 60 minutos a temperatura ambiente y Envision peroxidasa de rábano picante anti-conejo (K4003, Dako , Carpinteria, CA) durante 30 min a RT. La reacción se visualizó utilizando diaminobencidina (K3468, Dako) y contratinción con hematoxilina. expresión TFF1 se evaluó semi-cuantitativamente en 200x
ampliación, basado en el porcentaje de células teñidas positivamente ( "-" = inmunotinción en ≤ 10% de las células; "+" = 11-50%; "++" = 51- 75%; "+++" = 76 a 100%) [13, 14]. La inmunotinción sin anticuerpo primario y el epitelio gástrico normal de un microarray de tejido de control sirvió como controles positivos y negativos, respectivamente [15]. mancha citoplasmática que era inequívocamente más profunda que el fondo se consideró como positivo.
Resultados
Determinación de las firmas globales de expresión génica de muestras macrodissected y LCM
Tabla 1 delinea las características clínico-patológicas de los pacientes y voluntarios incluidos en este estudio de microarrays. Se obtuvo los datos Microarray tanto para LCM y macrodissected muestras de los mismos 20 biopsias (Figura 1A). A pesar de una calidad aceptable, datos de microarrays de LCM muestras tenían generalmente más bajos "presente convocatoria" que macrodissected muestras (datos no mostrados
). Análisis de componentes principales de los patrones de expresión génica global derivados de la micro y macro-cánceres gástricos diseccionado, y las muestras normales demostró una clara separación de cada grupo de muestra (Figura 1B). La mediana de correlación de Pearson entre los dos métodos de tratamiento fue de 0,75 (intervalo intercuartílico, 0,71 a 0,81) .table 1 Características clínico-patológicas de los pacientes y voluntarios incluidos en el análisis de microarrays

Los pacientes (n = 20) guía empresas voluntarios (n = 6) guía empresas de línea de base las características clínico-patológicas
Edad años
La mediana
59
52
rango intercuartil 54-69

43-61 Sexo seguro - no. (%)
Hombre
16 (80%) página 3 (50%)
Mujer página 4 (20%) página 3 (50%) de estado
Rendimiento (PS ) - no. (%)
ECOG1 PS 0 ó 1

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